UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
ANDREIA NAVARRO CERONE
CARACTERIZAÇÃO DA VIA DE
CAPTURA/ASSIMILAÇÃO DO SULFATO EM
Mycobacterium tuberculosis
: ESTRATÉGIAS PARA O
DESENVOLVIMENTO DE INIBIDORES E POTENCIAIS
ALVOS PARA VACINA E DIAGNÓSTICO.
CHARACTERIZATION OF THE SULFATE
CAPTURE/ASSIMILATION PATHWAY IN Mycobacterium
tuberculosis
: STRATEGIES FOR THE DEVELOPMENT OF
INHIBITORS AND POTENTIAL VACCINAL AND
DIAGNOSIS TARGESTS.
CAMPINAS 2019
ANDREIA NAVARRO CERONE
CARACTERIZAÇÃO DA VIA DE CAPTURA/ASSIMILAÇÃO DO
SULFATO EM Mycobacterium tuberculosis: ESTRATÉGIAS PARA
O DESENVOLVIMENTO DE INIBIDORES E POTENCIAIS
ALVOS PARA VACINA E DIAGNÓSTICO.
CHARACTERIZATION OF THE SULFATE
CAPTURE/ASSIMILATION PATHWAY IN Mycobacterium
tuberculosis
: STRATEGIES FOR THE DEVELOPMENT OF
INHIBITORS AND POTENTIAL VACCINAL AND DIAGNOSIS
TARGESTS.
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética de Microorganismos.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetic and Molecular Biology, in the area of Genetics of Microrganisms.
Orientador: Profa. DOUTORA ANDREA BALAN FERNANDES
CAMPINAS 2019 ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ANDREIA NAVARRO CERONE E ORIENTADA PELA DOUTORA ANDREA BALAN FERNANDES.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia
Ana Maria Rabetti - CRB 8/2471
Cerone, Andreia Navarro,
C335c CerCaracterização da via de captura/assimilação de sulfato em Mycobacterium tuberculosis : estratégias para o desenvolvimento de inibidores e potenciais alvos para vacina e diagnóstico / Andreia Navarro Cerone. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
CerOrientador: Andrea Balan Fernandes.
CerTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Cer1. Tuberculose. 2. Transportadores de cassetes de ligação de ATP. 3. Sulfatos - Captura. 4. Sulfatos - Assimilação. 5. Proteínas. 6. Enzimas. I. Fernandes, Andrea Balan, 1969-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Characterization of the sulfate capture/assimilation pathway in
Mycobacterium tuberculosis : strategies for the development of inhibitors and potential vaccinal and diagnosis targets
Palavras-chave em inglês:
Tuberculosis
ATP-Binding cassette transporters Sulfate - Capture
Sulfate - Assimilation Protein
Enzyme
Área de concentração: Genética de Microorganismos Titulação: Doutora em Genética e Biologia Molecular Banca examinadora:
Andrea Balan Fernandes [Orientador] Ana Carolina de Mattos Zeri
Adriana Santos Soprano Carla Cristina Polo
Juliana Helena Costa Smetana
Data de defesa: 10-07-2019
Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-3732-9208 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/5954214416658992
Campinas, 10 de julho de 2019.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Andrea Balan Fernandes Profa. Dra. Ana Carolina De Mattos Zeri Profa. Dra. Juliana Helena Costa Smetana Profa. Dra. Carla Cristina Polo
Profa. Dra. Adriana Santos Soprano
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno
DEDICATÓRIA
Aos meus dois filhos: Luiza (in memorium) e Pedro. Deus me presenteou com vocês. Tenham meu eterno amor.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, gostaria de agradecer 3 pessoas de fundamental importância na minha vida e que merecem conjuntamente o meu título de Doutora:
Á minha mãe Josefina, sem a qual eu conseguiria se quer realizar qualquer atribuição exigida pelo doutorado. Meu amor e gratidão por amar e cuidar dos meus filhos.
Ao meu marido, Álvaro, que representa todo o companheirismo que alguém pode desejar. Sem você apoiando, auxiliando, torcendo, empurrando e assumindo os cuidados com nosso pequeno na minha ausência, não seria possível chegar até aqui. Ao meu amado filho, que é meu aprendizado diário de amor. Perdoe-me pela ausência, mas ela é necessária para eu ser uma melhor versão de mim, para ser uma melhor versão de mãe.
Meu agradecimento especial á professora Dra. Andrea Balan. Gostaria de agradecer a oportunidade de realizar o doutorado com um tema tão instigante que me proporcionou uma melhor visão da pesquisa. Agradeço por aceitar a minha pretensão em ser cientista dividida com a dinâmica da minha maternidade. Minha gratidão.
A agência FAPESP/CAPES pela concessão da bolsa de doutorado com número de processo 2014/20921-6 fornecendo o suporte financeiro necessário a realização de todo o projeto presente neste manuscrito apresentado para a obtenção do meu título de Doutora.
Ao Instituto de Biomédicas-USP e CNPEM- LNBio por disponibilizar as instalações para execução de diversos experimentos necessários a realização do projeto.
Ao Professor Marko Hyvonen, da Universidade de Cambridge por permitir a execução de parte do meu projeto em seu laboratório e cessão da Biblioteca de Fragmentos.
Ao Professor Dr. Luís Carlos Ferreira e a todos seus alunos por ceder a utilização de equipamentos em seu laboratório e conhecimento de várias técnicas.
A amiga e técnica do laboratório de cristalização de proteína - LNBio, Givanil Garrido, por cuidar dos meus cristais.
Á Dra. Ana Carolina Ramos Moreno por todas as análises imunológicas e pela receptividade em sanar minhas dúvidas.
Aos pesquisadores Dra. Silvana Rocco e Dr. Maurício Sforça por ajudar-me a desvendar os mistérios do NMR. Imensamente grata.
Ao pesquisador Dr. Andrey Fabricio Ziem Nascimento por me ensinar a resolver a minha primeira estrutura.
Á amiga Cristiane Tambascia, que meu deu suporte emocional nos momentos de inquietude da vida acadêmica. E logicamente, obrigada pelas gargalhadas proporcionadas.
Aos companheiros do grupo LBEA pela ajuda e convivência em todo o período de doutorado.
Aos membros da Banca de Qualificação: Dr. Jorg Kobarg, Dra. Juliana Oliveira e Dra Anete Pereira de Souza pela valiosa avaliação do trabalho.
Aos membros da banca de defesa pela disponibilidade para a arguição do trabalho. Ao programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular e á UNICAMP pela oportunidade e apoio burocrático de obtenção deste título.
Á minha querida irmã que mesmo com seu jeito silencioso, demonstra torcer pelas minhas conquistas
Á todos que contribuíram para a realização dessa tese. Obrigada!!
Este projeto foi desenvolvido no Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas II da Universidade de São Paulo. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e financiado por bolsa de estudos concedida pela agênciafinanciadora FAPESP/CAPES, número processo 2014/20921-6, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
“Não importa o que aconteça, continue a nadar.” (Walters, Graham; Procurando Nemo, 2003.
RESUMO
A Tuberculose é uma doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis e considerada um grave problema mundial devido à sua alta incidência na população, características peculiares do patógeno e tratamento de difícil sucesso. Estima-se que atualmente 2 bilhões de pessoas estejam infectadas, valor que abrange cerca de 30% da população global. A poliquimioterapia empregada contra o bacilo de Koch, crescentemente torna-se ineficaz devido à proliferação de cepas multirresistentes. O presente projeto objetiva identificar novos alvos para o desenvolvimento de drogas que sejam mais efetivas no bloqueio deste patógeno. Considerando que os sistemas de transporte do tipo ABC (ATP-Binding Cassette) têm papel fundamental na captação e transporte de diversas substâncias essenciais à sobrevivência dos organismos, e que são pouco caracterizados em M. tuberculosis, a elucidação de estruturas e modelos moleculares de ação focando em uma possível inibição da viabilidade do microrganismo tornam-se prioridade como caminho para obtenção de novos alvos. Neste cenário, o alvo de estudo escolhido foi o sistema ABC envolvido na captação do sulfato (SubICysWTA1) e sua via de assimilação consistindo de 8 proteínas (CysHDNK1K2MA2NirA). Sulfato está envolvido no metabolismo de enxofre, fundamental para a bactéria e cuja importância para infecção e patogênese tem sido demonstrada funcionalmente. No desenvolver do projeto, duas proteínas tornaram-se alvos principais: SubI e CysA2. SubI, uma proteína captadora de sulfato, foi expressa e purificada e teve sua estrutura tridimensional resolvida na presença do ânion, bem como a análise biofísica da interação. Adicionalmente, utilizando-se técnicas de deslocamento térmico, fluorescência, termoforese e ressonância magnética, foram identificadas pequenas moléculas capazes de interagir com a proteína para sua inibição. Experimentos de acoplamento molecular de ligantes foram usados para a caracterização da localização das interações. CysA2 previamente descrita como sulfurtransferase, atua de forma secundária na via de óxido-redução do sulfato no citoplasma celular. Após a caracterização cinética da proteína, foi demonstrada sua capacidade de utilização dos substratos tiossulfato e 2-mercaptopiruvato, até então desconhecida. Adicionalmente, a proteína foi avaliada com relação ao potencial imunogênico e vacinal. CysA2 apresentou-se como uma proteína altamente imunogênica e um excelente alvo vacinal e de diagnóstico para o tratamento da doença.
ABSTRACT
Tuberculosis is a disease caused by Mycobacterium tuberculosis and it is considered a serious worldwide problem due to its high incidence in the population, peculiar characteristics of the pathogen and treatment of difficult success. It is estimated that currently 2 billion people are infected, a figure that covers about 30% of the global population. The poli-therapy used against Koch's bacillus is increasingly ineffective due to the proliferation of multi-resistant strains. The present project aims to identify new targets for the development of drugs that are more effective in blocking this pathogen. Considering that ABC transport systems (ATP-Binding Cassette) type importers plays a fundamental role in the uptake and transport of several substances essential to the survival of organisms, which are poorly characterized in M. tuberculosis, the elucidation of structures and molecular models of action focusing in a possible inhibition of the viability of the microorganism become an alternative to obtain new targets. In this scenario, the targets chosen were the ABC system involved in sulfate uptake (SubICysWTA1) and its assimilation pathway consisting of 8 proteins (CysHDNK1K2MA2NirA). Sulfate is involved in sulfur metabolism, fundamental to bacterium and whose importance for infection and pathogenesis has been functionally demonstrated. In developing the design, two proteins became major targets: SubI and CysA2. SubI was expressed and purified and had its three-dimensional structure solved in the presence of the anion as well as the biophysics of the sulfate interaction. Additionally, using thermalshift, fluorescence, thermophoresis and nuclear magnetic resonance techniques, small molecules capable of interacting with the protein were identified for their inhibition. Docking experiments were used to characterize the location of the interactions. CysA2 previously described as sulfurtransferase, acts secondary in the oxide-reducing pathway of sulfate in the cellular cytoplasm. After the kinetic characterization of the protein, its ability to use previously unknown thiosulphate and 2-mercaptopyruvate substrates was demonstrated. Additionally, the protein was evaluated for immunogenic and vaccine potential. CysA2 has been shown to be a highly immunogenic protein and an excellent vaccinal and diagnostic target for the treatment of the disease.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...15
1.1 Justificativa...15
1.2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...17
1.2.1 Tuberculose...17
1.2.2 Epidemiologia e Grupos de Riscos...23
1.2.3 Tratamento: vacina BCG, drogas anti-tuberculose e resistência a drogas...25
1.2.4 Descoberta de drogas baseadas em fragmentos (Fragment-Based Drug Discovery, FBDD)...32
1.2.5 Importância do enxofre para sobrevivência da M. tuberculosis. ...36
2. OBJETIVOS...42
3. MATERIAIS E MÉTODOS...43
3.1 Amplificação dos genes da via de metabolismo de enxofre de M. tuberculosis...43
3.2 Clonagem dos genes: Ligação no vetor de clonagem pGEM® T-easy e Sub-clonagem no vetor de expressão pET28a...45
3.3 Teste de Expressão...46
3.4 Purificação de proteínas recombinantes...47
3.5 Dicroísmo Circular...47
3.6 Thermal shift...47
3.7 Fluorescência intrínseca de triptofanos...48
3.8 Termoforese por microescala para quatificar interações biomoleculares...49
3.9 Testes de cristalização ...50
3.10 Irradiação e difração dos cristais...51
3.11 Análises dos dados, substituição molecular e refinamento da estrutura da SubI de M. tuberculosis. ...51
3.12 Análise dinâmica de espalhamento de luz (DLS) ...51
3.13 Ensaios cinéticos...51
3.14 Ensaios Imunológicos……...52
3.14.1 Ensaio de ligação de células de camundongo TC-1 pulmonares...52
3.14.2 Ensaio de ativação de linhagem celular de células dendríticas e macrófagos murinos...52
3.14.3 Interação de CysA2 com células macrofágicas humanas...53
3.15 STD-RMN...54
3.16 Acoplamento Molecular dos ligantes...54
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...56
4.1 A via metabolica de captação e assimilação de sulfato em M. tuberculosis...57
4.1.1. A via metabólica do sulfato em M. tuberculosis...59
4.1.2 Obtenção e seleção das proteínas-alvo...60
4.2 Proteína CysH, uma adenosina 5’-fosfosulfato redutase...64
4.3 Proteína CysK1, uma O-acetil serina sulfidrilase...70
4.4 Proteína CysM, uma cisteína sintase B...74
4.5 SubI, proteína periplasmática ligadora de sulfato...79
4.5.1 Produção da proteína SubI de M. tuberculosis...79
4.5.2 Caracterização da função de SubI – proteína ligadora de sulfato... ..81
4.5.3 Análise do comportamento da proteína SubI por fluorimetria de varredura diferencial – determinação de tampões ótimos para a cristalização...87
4.5.4 Obtenção de cristais de SubI de M. tuberculosis...88
4.5.5 Resolução da estrutura tridimensional da proteína SubI de M. tuberculosis ...90
4.5.6 Cristalização da proteína SubI com os fragmentos e predição da localização dos mesmos na estrutura da proteína SubI por docagem molecular (Molecular Docking)..113
4.6 CysA2 é uma enzima tiossulfato sulfurtransferase que apresenta excelente potencial para o diagnóstico e vacinal...121
4.6.1 Bioinformática e análises estruturais...121
4.6.2 Purificação e Caracterização Biofísica...127
4.6.3 Ensaios Enzimáticos...129
4.6.4 Análise da Imunogenicidade da Proteína CysA2 ...136
5.CONCLUSÕES...140
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...142
7. ANEXOS...148
ANEXO 1. Tabela I. Características dos Antimicrobianos que possuem ação contra Mycobacterium tuberculosis...148
ANEXO 2. Tabela com 96 soluções diferentes utilizadas na técnica de termal shift...151 ANEXO 3 . Tabela de Biblioteca de Fragmentos...152 ANEXO 4. Figura STD-NMR de fragmentos que não interagiram com a protéina SubI...161 ANEXO V. DOCUMENTOS DE BIOSSEGURANÇA, BIOÉTICA...163 ANEXO VI DECLARAÇÃO DE DIREITOS AUTORAIS...166
15
1. INTRODUÇÃO
1.1 Justificativa
A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa e contagiosa, causada pela bactéria
Mycobacterium tuberculosis que embora tenha sua cadeia epidemiológica e tratamento
conhecidos há longo tempo, persiste como problema de saúde pública em muitos países. Esta enfermidade esteve durante muitos anos associada a condições de pobreza, entretanto, nas últimas décadas enfrentamos um aumento em sua incidência global pela coinfecção do bacilo da tuberculose com o HIV e de outras doenças que debilitam o sistema imunológico. Atualmente a tuberculose afeta mais de 1.9 bilhões de pessoas no mundo (1/4 da população mundial), das quais estima-se que 2 milhões virão à óbito em decorrência de complicações ocasionadas por esta infecção [1]. Neste cenário, a Organização Mundial de Saúde (OMS) classificou-a como endemia de emergência mundial, tornando o seu combate prioritário em países em desenvolvimento e colocando países desenvolvidos em alerta quanto à sua disseminação [2].
A terapêutica básica preconizada como quimioprofilática para Tuberculose (TB), envolve o uso de um coquetel de drogas chamadas de primeira linha [3], porém a eficiência no combate da doença enfrenta a irregularidade ou abandono completo do tratamento por parte do paciente, principalmente pelo longo tempo exigido e dos muitos efeitos adversos do uso da medicação. Este fato não só promove remissivas da doença, levando ao insucesso terapêutico, como ao desenvolvimento de cepas resistentes como as multirresistentes (multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB) e as extensivamente resistentes
(extensively-drug resistant tuberculosis, XDR-TB). A principal preocupação com essas cepas
resistentes consiste em menor resposta aos ativos disponíveis e prolongamento do tratamento resultando em frequentes e variados efeitos colaterais [4]. Assim, a obtenção de novas drogas que atuem em vias vitais do microrganismo de forma mais eficiente, segura e rápida é urgentemente necessária.
Neste contexto, a procura de um bom alvo resultou no estudo de uma via metabólica fundamental para o microrganismo, o qual era responsável pela captação do enxofre. O enxofre é um elemento essencial à vida de M. tuberculosis sendo sua via de assimilação imprescindível para a viabilidade e patogenicidade da bactéria [5]. A procura de moléculas inibitórias para esta via é promissora por ser providencialmente ausente em humanos, tornando-as drogas alvo específicas e consequentemente menos tóxicas para células do
16 hospedeiro. A assimilação do enxofre é promovida através das moléculas de sulfato (SO4
2-), por um sistema de transporte do tipo ABC, que consiste em uma proteína ligadora periplasmática (SubI), duas permeases que formam um poro de passagem na membrana (CysT e CysW), e duas ATPases ancoradas à membrana no lado citoplasmático, que geram energia para o transporte (CysA12). Após a internalização do sulfato, um conjunto de
enzimas (CysD, CysN, CysC, CysH, CysI, CysJ, CysG e CysA2) são responsáveis pela sua redução até sulfito (S2-). Esta forma mais reduzida do enxofre é então utilizada para a
biossíntese de várias moléculas como cisteína, metionina, coenzimas e micotiol, composto equivalente à glutationa e que em micobactérias está associado à proteção contra agentes tóxicos oxidantes e antibióticos [6].
O projeto iniciou-se com a tentativa de produção de todas as proteínas envolvidas na via e acessórias para definição de suas funções (aquelas ainda não estabelecidas) e estruturas tridimensionais. Como alvos interessantes, SubI se destacou por ser a primeira proteína da via, cujo bloqueio da atividade seria comprometedor para o desenvolvimento do microrganismo, e também por estar localizada no periplasma, o que facilitaria o reconhecimento por inibidores sem o problema de cruzar a membrana celular, como frequentemente ocorre em estudos clínicos. Por outro lado, as enzimas citoplasmáticas também se mostraram interessantes por interromper a síntese do sulfito, composto celular essencial. CysA2 surgiu como promissora por ser uma das poucas que não tinha caracterização funcional e por ter sido identificada em todas as análises de proteoma como uma proteína secretada com potencial imunogênico. Considerando-se que os métodos de diagnósticos atuais para M. tuberculosis exibem baixa sensibilidade e especificidade além de exigirem longo tempo para crescimento das culturas microbiológicas, avaliar CysA2 com este enfoque seria muito interessante.
Há de se mencionar que para o desenvolvimento do projeto foram valiosas as colaborações do grupo da Dra. Ana Carolina Ramos Moreno do Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas coordenado pelo Prof. Dr. Luis Carlos Ferreira de Souza, ICB2 - USP, e do Dr Marko Hyvonen, do Laboratório de Biologia Estrutural e Desenvolvimento de Inibidores do Departamento de Bioquímica da Universidade de Cambridge, especializado no uso da técnica de Descoberta de Drogas Baseada em Fragmentos (Fragment-Based Drug Discovery - FBDD).
17
1.2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.2.1 Tuberculose
A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa que representa um grave problema de saúde pública mundial, cujas complicações levam à morte de milhares de pessoas no mundo [1].
Há hipóteses que a origem da bactéria do gênero Mycobacterium tenha mais de 150 milhões de anos, sendo um progenitor de M. tuberculosis, o responsável pela infecção de hominídeos no continente africano há cerca de 3 milhões de anos [7]. Acredita-se que um ancestral comum das modernas cepas tenha aparecido entre 15.000-20.000 anos atrás, sendo reconhecida como uma das doenças transmissíveis mais antigas do mundo, afetando o homem desde a pré-história [8]. Constatou-se que a doença estava presente no antigo Egito por meio de análises de deformidades encontradas em múmias, típicas da progressão de um doente com tuberculose. Entretanto, registros escritos dessa enfermidade só apareceram na Índia e China por volta de 3000 A.C., sendo também encontrado em documentos Hebreus datados do mesmo período [9]. Os primeiros relatos de autores sugerindo a tuberculose como uma doença infecciosa foram escritos na Grécia e Roma, e sua primeira grande dispersão ocorrendo após o declínio do Império Romano. Relatos durante a Idade Média mostram as primeiras tentativas de obtenção de cura e entendimento da doença [9].
No século XVIII, a tuberculose tornou-se epidêmica com uma alta taxa de mortalidade, sendo responsável pela morte de 1% dos habitantes por ano. Sua disseminação foi rápida na Europa, sendo intensificada pelas aglomerações em centros urbanos e desdobramentos da Revolução Industrial que causaram problemáticas sociais, como ambientes de trabalho precários, alojamentos mal ventilados e superlotados, saneamento primitivo, desnutrição e outros fatores de risco [10]. Expansão semelhante da doença aconteceu no Brasil Imperial. No decorrer do século XIX e até meados do século XX, a tuberculose representou grande preocupação como doença endêmica, principalmente entre as classes mais pobres. Por volta de 1880, após descoberto que se tratava de uma doença contagiosa, melhorias na saúde pública foram adotadas e reduziram sua incidência mesmo antes do surgimento de tratamentos efetivos [11].
18 O principal agente etiológico da doença é o M. tuberculosis, primeiramente identificado pelo bacteriologista Robert Koch que foi capaz de isolar o bacilo, cultivar e reproduzir em laboratório, apresentado os resultados em 1882, e chamando-o de Bacilo de Koch [12].
M. tuberculosis foge à classificação genérica das bactérias baseada no envoltório
celular, em Gram-positivas e Gram-negativas, desenvolvida por Hans Christian Joachin Gram (microbiologista dinamarquês), em 1884. Isso porque não possuem membrana externa conhecida como as Gram-negativas, e também não apresentam a grossa camada de peptídeoglicanos das Gram-positivas [13].
M. tuberculosis é da classe das micobactérias é uma das características particulares
das micobactérias é a composição e estrutura do envoltório celular que possui três componentes estruturais: uma membrana plasmática, uma parede celular e uma matriz compacta. A membrana plasmática é uma membrana bacteriana típica, com 4 a 4.5 nm de espessura, que embora vital para as micobactérias, possui um pequeno papel em processos patológicos. A parede celular micobacteriana é composta por peptidoglicano ligado covalentemente a polissacáridos de arabinogalactano esterificados com 5 ácidos micólicos, formando o complexo ácidos micólicos-arabinogalactano-peptidoglicano. O peptidoglicano é um dos mais comuns encontrados nas bactérias, no entanto nas micobactérias os resíduos de ácido murâmico são glicosilados em oposição à N-acetilação encontrada em outros gêneros bacterianos. Estes grupos glicosil favorecem um reforço da estrutura do peptidoglicano ao proporcionarem ligações adicionais por pontes de hidrogênio [14].
Os ácidos micólicos são ácidos graxos de cadeia longa α–metil-β-ramificados, encontrados maioritariamente nos gêneros Mycobacterium, Norcardia, Rhodococcus, e
Corynebacterium [15]. As micobactérias possuem ácidos micólicos distintos dos outros
gêneros, compostos geralmente por 70 a 90 átomos de carbono em oposição aos 40 a 60 átomos das restantes bactérias [15]. Estes ácidos graxos são responsáveis pela manutenção da estrutura celular rígida e contribuem para a baixa permeabilidade e consequente resistência intrínseca a compostos hidrofílicos [15]. O elevado teor em 6 ácidos micólicos confere ainda às micobactérias a característica álcool-ácido resistência, isto é, a capacidade de reter corantes na presença de uma mistura de ácido e álcool [13]. Na parede celular micobacteriana encontram-se ainda associados diversos componentes, a maioria
19 desempenhando a função de antígeno ou toxina, como: (i) lípidios ligados não covalentemente ao complexo ácido micólicos-arabinogalactano-peptidoglicano, como glicolípidios fenólicos, glicopeptidolípidios, trealoses aciladas, sulfolípidios e glicerofosfolípidios proteínas e lipoarabinomano, passíveis de serem removidos através da ação de solventes; (ii) proteínas, denominadas porinas, algumas das quais responsáveis pela construção da parede celular durante a vida do bacilo e outras que formam canais hidrofílicos que permitem a passagem de soluções aquosas; e (iii) lipoarabinomano, um polissacarídeo altamente imunogênico, descrito como um possível fator de virulência envolvido na persistência das micobactérias no interior dos fagócitos mononucleados (Figura 1) [14].
Figura 1. Representação esquemática do envoltório celular micobacteriano. (Adaptado de Fundação Oswaldo Cruz, 2008 [13]. Proteínas Âncora de fosfatidilinositol Arabinano Manano Lipoarabinomano Manose Camada de ácidos micólicos Peptidoglicano Membrana celular Galactano Lipídeos intercalado MurNac/Gc GlcNac Man Gal Ara L-ramnose Arabinogalactano Arabinano
20 O M. tuberculosis compromete principalmente os pulmões, podendo, entretanto, manifestar-se clinicamente de inúmeras maneiras e em diversos órgãos. Ele é um parasita humano que apresenta morfologia bacilar, não esporulado, não encapsulado, e sem produção de toxinas e formadores de colônias de dimensões variando entre 0.2 e 0.6 por 1 a 10 micras. Formam agrupamentos característicos de ramos alongados e tortuosos, conhecidos como coras, importantes para a visualização e diferenciação do bacilo em análises microscópias. Um elemento essencial da sua morfologia é a parede celular, a qual promove uma função protetora contra agentes químicos, fornecendo condições para sua sobrevivência em objetos por semanas. A parede celular possui alto teor de lipídeos e despende tempo e energia do metabolismo do patógeno para sua duplicação, sendo que o crescimento de bactérias do gênero varia de 3 horas a 48 horas [16].
A constituição de sua parede é de grande relevância, composta principalmente por ácidos micólicos, formando uma barreira hidrofóbica que confere resistência à dessecação e à descoloração por álcool e ácido, sendo esta propriedade a mais importante característica de diagnóstico do bacilo, além de ser responsável pelos importantes efeitos biológicos do parasita como a indução da formação do granuloma (coleções organizadas de macrófagos e linfócitos formados para eliminar substâncias estranhas) [17].
Sua infecção possui baixa morbidade, o que aliado a seu crescimento lento, proporciona uma manifestação patológica de curso lento e crônico em indivíduos de baixa imunidade. Tem preferência pela colonização dos pulmões, já que sendo um aeróbio estrito encontra neste órgão melhores condições de crescimento e transmissão. Durante a infecção, o bacilo é exposto a diversos contextos ambientais, dependendo do estágio e da severidade da doença, possuindo a capacidade de sobreviver em situações extremamente hostis para outras bactérias, como dentro do fagossomo de macrófagos [17].
O ciclo da doença origina-se com um indivíduo com a forma pulmonar da tuberculose ativa, denominado indivíduo índice. Estima-se que o processo de infecção necessite de 100-200 horas, sendo o tempo de exposição, a intensidade do contato pela proximidade com o novo hospedeiro e do ambiente e principalmente o estado bacilífero de M.
tuberculosis no indivíduo índice. As gotículas de Flügge, como são conhecidas as gotas
contaminadas expelidas pela fala, o espirro, e principalmente a tosse, são lançadas no ar. As mais pesadas são depositadas no ambiente (que em geral não desempenham papel importante na transmissão), as mais leves estão suspensas no ar. As gotículas desistradatas,
21 denominadas núcleos de Weels, iniciam o processo infeccioso quando atingem os bronquíolos e alvéolos pulmonares e são implantados nesses tecidos [18].
O processo infeccioso inicia-se pela inalação de partículas contendo o bacilo, as quais provocarão respostas imunes para combater a infecção envolvendo macrófagos e granulócitos alveolares; em alguns casos, haverá remoção dos bacilos e em outros, estes organismos seguirão até os pulmões, onde a doença se estabelecerá. De metabolismo aeróbico, tem tempo de duplicação em 18 a 48 horas, sendo um parasita intracelular facultativo, com preferência pela infecção de macrófagos. Pode permanecer em estado de dormência sem se dividir, dificultando a erradicação da doença e propiciando, clinicamente, a recidiva de infecções antigas subclínicas [19].
A replicação dentro do macrófago induz a produção de citocinas que são responsáveis pelo início do processo inflamatório no pulmão, na qual macrófagos e linfócitos migram para o local infectado e formam o granuloma. O granuloma é mantido no indivíduo infectado estimulando as células do sistema imune de forma crônica, o que serve como base da lesão tuberculosa. O mesmo mecanismo que é responsável pela morte da bactéria no organismo infectado contribui para a debilidade ou morte do hospedeiro. Outros órgãos podem ser afetados, devido à disseminação dos macrófagos e linfonodos através da via hematogênica e linfática [19]. Entretanto, os macrófagos alveolares e extracelularmente, os granulomas, podem formar os fagolisossomos, os quais promovem um controle da replicação do bacilo ao mesmo tempo que evita sua detecção pelo sistema imunológico. Consequentemente, os tecidos infectados não são destruídos, resultando em hospedeiros incubadores, com células que propiciam a sobrevivência e crescimento do microrganismo, mas que são assintomáticos [20]. O balanço dinâmico entre patógeno e hospedeiro envolve a correlação entre diversos processos de ativação da bactéria, como a produção de IL-10 (interleucina 10 humana) que suprime as respostas antimicrobianas, contra um espectro de respostas imunológicas dadas pelo interferon-y, interleucina (IL)-6 e IL-1β, a qual age de forma antagônica, pois tem a capacidade de mantê-lo em dormência, porém pode intensificar a replicação do bacilo; a latência da doença ou manifestação de seus sintomas dependerá da continuidade do equilíbrio dessa relação [20]. Em acréscimo, diversos estudos mostram alteração no perfil de genes expressos em macrófagos e células “natural killer” (NK) entre paciente com a doença no quadro ativo e latente e ausente da doença [19]. Recentemente, outros estudos sugerem o termo persistente ao invés de latente,
22 ao considerarem que o bacilo pode permanecer ativo em um ambiente envolto por uma camada protetora do tipo biofilme e invade as células hospedeiras em momentos mais promissores e oportunos [20].
Essas características produzem o desenvolvimento da doença logo após o contato respiratório com o patógeno ou ao longo do primeiro ano de exposição em uma minoria de indivíduos. Entretanto, a maioria (90%) dos indivíduos infectados não manifestam imediatamente a doença, mas hospedam a bactéria por longos períodos [21], reativando uma infecção subclínica ocorrida vários anos antes e dificultando a erradicação da doença.
M. tuberculosis pertence ao chamado complexo Mycobacterium tuberculosis
(MTBC), conjuntamente como M. bovis, M. microti, M. africanum e M. canetti, fenotipicamente e genotipicamente similares, compartilhando cerca de 99% de seus genes, e marcados pela presença nos genomas do fragmento IS6110, um elemento de inserção exclusivo de membros desse complexo, ferramenta importante para diagnóstico de contaminação para essas espécies. Outras espécies de micobactérias, não pertencentes ao complexo do M. tuberculosis, são responsáveis por 10-30% das linhagens isoladas em laboratório, constituindo um grupo extremamente heterogêneo e de difícil caracterização, com diferentes níveis de patogenicidade, sendo as linhagens mais importantes constituídas pelo M. leprae, M. avium, M kansaii e M. scrofulaceum (Figura 2) [22].
Figura 2. Principais bactérias do gênero Mycobacterium. Micobactérias patológicas são as bactérias que acometem o homem com tuberculose pertencente ao complexo M. tuberculosis: M. bovis M. africanum M. microti M. canetii, M. pinnipeddi; e M. leprae; Micobactérias não tuberculosas, mas patogênicas em potencial: M. kansasii, M. marinum, M. avium, M. paratuberculosis, M. ammoense, M. simiae, M. scrofulaceum, M. azulgai, M. chelonae, M. abscessos e M. massiliense de modo geral provocam nódulos na pele em pacientes imunossuprimidos, infecções ósseas, pele e tecidos moles , adenopatias e osteomielites,
23 doenças broncopulmonares e infecções ósseas. As bactérias: M. gordonae, M. flavenscens, M. gastri, M. nonchromogenicum, M. thermoresistible, M. triviale, M. phlei, M. smegmatis e M. vaccae são saprófitas, que se alimentam de matéria orgânica originária de processos de decomposição.
1.2.2 Epidemiologia e Grupos de Riscos
Há duas décadas a Organização Mundial da Saúde (OMS) promove um monitoramento global em relação á tuberculose. Estudos abrangendo 205 países, os quais englobam 99% da população mundial, apontam que em 2014 houve 9.6 milhões de novos casos, onde 58% ocorreram na Ásia, 28% estão no continente africano, 8% na região mediterrânea oriental, seguido de 3% de casos dentro da Europa e 3% nas Américas. Dentro desta distribuição, 22 países apresentam maior registro de doentes, sendo responsáveis por 83% dos casos mundiais [2].
Para o período de 2016 a 2020 foi definida uma nova classificação de países prioritários, segundo características epidemiológicas. A distribuição dos países está em listas, sendo que alguns deles aparecem em mais de uma lista, somando, assim, um total de 48 países prioritários para a abordagem da tuberculose. O Brasil encontra-se em duas dessas listas, ocupando a 20ª posição quanto à carga da doença (TB) e a 19ª no que se refere à coinfecção tuberculose-HIV (TB-HIV). No país, no período de 2005 a 2014, foram diagnosticados, em média, 73 mil casos novos de tuberculose por ano, e em 2013, ocorreram 4.577 óbitos. O País tem destaque, ainda, por sua participação no BRICS (bloco formado por Brasil, Rússia, Índia, China e África do Sul), cujos países somam cerca de 50% dos casos de tuberculose no mundo e mobilizam mais de 90% dos recursos necessários para as ações de controle da tuberculose por meio de fontes domésticas de financiamento (Figura 3) [1].
A manifestação de novos casos e persistência na alta incidência de tuberculosos, está intimamente ligada a características peculiares apresentadas pelo bacilo de Koch no controle dos mecanismos imunes celulares. Condições adicionais como o HIV, a subnutrição, o alcoolismo, o diabetes mellitus, a insuficiência renal crônica, a quimioterapia antineoplásica e o uso de imunossupressores em transplantes, podem levar à deterioração da resposta imune. Dentre esses fatores, pacientes com HIV são extremamente
24 predispostos a apresentar uma coinfecção por tuberculose, seja por já possuir o bacilo em estado latente em seu organismo ou por estar mais suscetível e ser infectado por ele [23].
Entre os casos de tuberculoses apresentados, 1.1-1.3 milhões de pessoas no mundo apresentam um quadro de coinfecção com HIV. No Brasil, em 2014, os resultados da testagem para HIV entre os novos casos de tuberculose apontaram para a existência de 10,4% de pessoas com a coinfecção TB-HIV [23].
Figura 3. Classificação de países prioritários ao combate para o período de 2016 a 2020. Fonte: CGPN CT/SVS. Adaptado da Organização Mundial da Saúde, 2018 [1].
O estado de imunossupressão determinado pela Aids estabelece uma condição favorável tanto para o contágio como para o adoecimento. Logo, a evolução do estado de infecção para a manifestação clínica da tuberculose é muito diferente entre o indivíduo imunocompetente e aquele infectado pelo HIV. Nesse contexto, a chance de que a infecção pelo bacilo evolua para doença tuberculosa em imunocompetentes é de 10% ao longo de sua vida, enquanto chega a ser de 10% ao ano em infectados pelo HIV. Além disso, é
25 importante destacar que a tuberculose é a mais prevenível, curável e transmissível de todas as infecções que acompanham a infecção pelo HIV, sendo uma doença contagiosa que também é infectante, e que pode ser transmitida a indivíduos soronegativos [24]. No Brasil, o Ministério da Saúde estima anualmente uma prevalência de 58 casos/100.000 habitantes, com cerca de 111.000 casos novos, um coeficiente de incidência de 47,2/100.000 e 6.000 óbitos, com maior concentração entre as faixas etárias entre 20 e 49 anos. Esses números variam de acordo com os diferentes estados da União, onde os valores de incidências variam de 29,6/100.000 na região Centro-Oeste, para 53,1/100.000 nas regiões Nordeste e Sudeste. Nesse cenário, ao considerar os números de taxa de incidência por 100.000 habitantes, o Brasil encontra-se na 92º posição mundial, entretanto, há uma clara tendência de diminuição dos níveis de incidência no país durante o decorrer destas últimas décadas, com queda dos números de 53/100.000 em 1990 para 48/100.000 no ano de 2020 [23, 24]. Estima-se que, nas primeiras duas décadas do século vinte e um, um bilhão de pessoas estarão infectadas com tuberculose, das quais 200 milhões terão a doença na forma ativa e 35 milhões destes casos virão a óbito, podendo chegar até 70 milhões [2].
1.2.3 Prevenção e tratamento: vacina BCG, drogas anti-tuberculose e resistência a drogas
A primeira ação registrada ao combate da doença foi realizada em 1907 por Oswaldo Cruz, segregando os doentes dos demais indivíduos da sociedade. Nos próximos anos, segue-se uma preocupação com ações profiláticas, cuidados hospitalares e diagnósticos laboratoriais, mas sem nenhuma metodologia de cura [2].
Um controle sobre a proliferação da doença aconteceu quando a vacina BCG (Bacilo de Calmette-Guérin) foi desenvolvida de cepas atenuadas não virulentas do M. bovis após mutações genéticas e com propriedades imunogênicas protetoras contra a tuberculose e utilizada pela primeira vez em 1921 [26]. As vacinas BCG modernas utilizadas mundialmente correspondem a outras cepas cultivadas ao longo dos anos em diferentes laboratórios no mundo, as quais diferem entre si por características genotípicas e fenotípicas, com distintas expressões em relação à viabilidade, imunogenicidade, reatogenicidade e virulência residual. O calendário de vacinação é variável no mundo e
26 sabe-se que a proteção é apenas contra as formas mais agressivas da tuberculose, e somente em crianças, já que a proteção em adultos varia de 0 a 80% [26]. A vacina é preparada com bacilos vivos, a partir de cepas do M. bovis, atenuadas com glutamato de sódio. A subcepa utilizada no Brasil é a Moureau-Rio de Janeiro, mantida sob sistema de lote-semente no Status Serum Institut de Copenhagen, na Dinamarca. Foi instituída em 1925 e atualmente é obrigatória para menores de 1 ano de acordo com a Ministério da Saúde (MS) [27]. É considerada de boa potência quando comparada com outras estirpes de BCG produzidas no mundo, possuindo similaridades com outras cepas, o que foi demonstrado através de técnicas de fragmentação do DNA. Caracteriza-se, ainda, por alta virulência residual, ou seja, capacidade de gerar reação tuberculínica (teste intradérmico por injeção da tuberculina, um produto obtido de um filtrado de cultivo de sete cepas selecionadas do
M. tuberculosis esterilizado e concentrado) mais intensa e por tempo prolongado. Vários
estudos foram realizados sobre a perda do efeito protetor da vacinação com BCG ao longo do tempo e em locais do globo com diferentes características. Países como a Inglaterra, Noruega e Índia identificaram a ausência de proteção em pessoas previamente vacinadas; outros países como Rússia, Portugal, Chile e Hungria empregaram o uso de doses repetidas da vacina para controlar a TB pulmonar. Entretanto, estudos mais recentes realizados a partir de 2000 em países asiáticos demonstraram que a segunda dose de BCG não mostrava proteção extra [28]. A revacinação BCG foi introduzida no Brasil em 1994, como reforço à vacinação feita ao nascer, através de recomendação do Ministéria da Saúde (MS) [26]. O propósito era propiciar reforço imunogênico às crianças que haviam sido vacinadas ao nascer, permitir a vacinação daquelas que não haviam sido vacinadas ou das que haviam recebido a vacina de forma inadequada e, assim, aumentar a cobertura vacinal e oferecer proteção contra a hanseníase, a qual é causada por bactéria pertencente ao genêro Mycobacterium com características genéticas próximas [29]. Estudos posteriores avaliando a eficácia da revacinação mostraram que não houve nenhum aumento da proteção contra a TB em adolescentes revacinados, contudo, a eficácia vacinal foi de 37% nas formas extrapulmonares de TB, principalmente ganglionar periférica e pleural [30]. A noção de que a vacina BCG possa conferir proteção após alguns anos de sua aplicação ensejou um estudo derivado do BCG-Revac que permitiu concluir que a primeira dose da vacina BCG empregada no Brasil é capaz de conferir proteção mais duradoura do que se admitia há cerca de 20 anos. Neste contexto, em 2006 o Programa Nacional de Imunizações
27 do Minstério da Saúde suspendeu a revacinação BCG em crianças de 6 a 10 anos no país [30].
Considerando esse cenário, a atual vacina BCG apresenta várias limitações em sua proteção contra TB: a) reativação endógena da TB; b) não há proteção de pessoas já infectadas por outras micobactérias ou por HIV; c) duração limitada; d) grande variabilidade de cepas em uso; e) dificuldade de interpretação do teste tuberculínico em vacinados [29]. Há uma tendência atual em considerar que a melhor imunização contra a TB poderia ser alcançada em duas instâncias: uma vacina preparada com micobactéria levaria inicialmente a resposta de citocinas do tipo Th-1 contra o M. tuberculosis e, uma segunda vacina, desencadearia o efeito booster, ou de reforço, da primeira. Assim, alguns investigadores buscam desenvolver uma vacina que gere o efeito booster nas pessoas que receberam BCG ao nascer, obrigatória em muitos países em desenvolvimento [29]. Vários modelos experimentais de vacinas são baseados em: a) DNA; b) subunidades usando antígenos secretados ou recombinantes; c) microorganismos vivos; d) vetorizadas por sistemas de liberação controlada como microesferas e lipossomas; e) micobactérias atenuadas, saprófitas e BCG recombinante [29].
No Brasil, há estudos promissores com a vacina de DNA recombinante DNAhsp65, que por suas características de eficácia e segurança é uma das cinco candidatas em nível internacional para entrar em estudos clínicos de fase 1 em humanos [29]. Além da prevenção, esta vacina mostrou a propriedade de curar casos de TB, de TB crônica, TB latente e de TB multiressistente. Também impediu a reativação da doença em animais imunossuprimidos e, associada à quimioterapia, reduziu o tempo de tratamento [29]. Apesar de resultados promissores, ainda há a necessidade da intensificação de pesquisas que auxiliem o combate a essa doença.
A fase quimioterápica ao combate da tuberculose inicia-se com a descoberta do antibiótico estreptomicina (SM), em 1944, seguida de outros fármacos mais específicos como isoniazida (INH), ácido para-amino-salicílico (PAS) e pirazinamida [30]. O sucesso utilizando esses medicamentos foi breve e constatou-se rapidamente que as cepas bacterianas adquiriam resistência e a monoterapia não era mais eficiente. Na década seguinte o tratamento migrou para uma combinação desses fármacos por 24 meses e posteriormente a substituição do PAS pelo etambutol possibilitou a diminuição em 12 meses para a eliminação da doença. Outro avanço à terapêutica foi a introdução da
28 rifampicina que reduziu o tempo para metade, recebendo o nome de tratamento de curta duração. Esse fármaco tem ação potente, impedindo a fase de multiplicação rápida do bacilo, e proporcionando uma manutenção na fase remissiva [30].
Com esses resultados e a evolução do tratamento, a tuberculose passou a ser considerada como uma doença típica de países subdesenvolvidos, havendo a perspectiva da erradicação global da doença na década de 70 [31]. Entretanto, o advento da HIV e a coinfecção com tuberculose, além da progressiva ineficiência do tratamento contrariou as expectativas de decréscimo da doença [31].
Pouco foi modificado no emprego e tipo de fármacos nos tratamentos atuais, os quais estão divididos em dois grandes grupos com base em sua segurança e efetividade. Os agentes de primeira escolha, são o mesmo coquetel de 4 fármacos utilizados desde a década de 70, os quais representam custo relativamente baixo que varia de US$ 10 a 20 para um período de seis meses de tratamento. Em casos de resistência a esses medicamentos, outras combinações de administração são empregadas, utilizando os chamados fármacos de segunda escolha: amicacina, capreomicina, ciprofloxacino, cicloserina, etionamida, canamicina, ofloxacino, ácido p-aminosalicílico e protionamida. Os custos são extremamente altos (US$ 1500 a 3000), a duração da ingestão destes medicamentos aumenta para 18 até 24 meses e maiores efeitos colaterais são observados [32].
O sucesso da poliquimioterapia e o longo tempo de tratamento são comprometidos com características peculiares do bacilo de Koch. Dependendo do tipo de ambiente, onde o bacilo está alojado, ele tem concentrações diferentes de oxigênio e por consequência modulação em seu tempo de replicação. Dessa forma, o esquema medicamentoso deve conter fármacos que atuem, tanto no pH ácido como no neutro, em altos ou baixos teores de oxigênio e em qualquer grau de atividade metabólica bacteriana. A ação dos medicamentos apresentados baseia-se no metabolismo ativo, na fase de multiplicação, ou seja, se o bacilo estiver em fase latente não haverá ação das drogas [32].
As dificuldades em combater as especificidades da bactéria em questão provocam o expressivo aumento do número de casos de tuberculose multirresistente (TB-MDR) e de tuberculose extensivamente resistente (TB-XDR), tornando essas formas da doença um grave problema de saúde pública mundial [33].
M. tuberculosis apresenta lipídeos na superfície da célula denominados de ácidos
29 vez que tornam a bactéria menos permeável a diferentes compostos como antibióticos e outros agentes quimioterápicos [33]. Mutações genômicas relatadas em genes específicos também conferem resistência às novas cepas: katG, inhA, aphC, kasA, ndh para isoniazida;
rpoB para rifampicina; rpsL e rrs para estreptomicina; emb para ethambutol; pncA para
pirazinamida; e gyr para fluoroquinalona [33].
O surgimento de bactérias resistentes como as TB-MDR (TB-Multiple-drug
resistant) deve-se à resistência natural dos bacilos por mutações ao acaso e conjuntamente
há a resistência adquirida, onde a principal causa é a irregularidade na ingestão dos ativos por parte dos pacientes e não aderência ao tempo determinado para finalização do tratamento. MDR-TB é causada pela resistência de M. tuberculosis à rifampicina e à isoniazida. A geração de cepas resistentes a uma ou mais drogas empregados no tratamento da tuberculose culmina em inúmeros casos de pacientes que não reagem ao coquetel empregado ao combate a doença, mostrando outra linhagem de cepas resistentes e potencialmente perigosas, as TB-XDR (Extensively-drug resistent TB/Drogas contra tuberculose extremamente resistentes), as quais não respondem ao tratamento com fluoroquinolonas e aos chamados fármacos de reserva, que incluem capreomicina, moxifloxacina, ácido para-aminossalicílico e etionamida [33, 34]. O Anexo I apresenta os principais medicamentos utilizados contra tuberculose.
A crescente detecção de pacientes com MDR/XDR-TB requer o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, seja padronizado ou individualizado, utilizando novas e antigas drogas tuberculostáticas: 1) drogas de primeira linha (mais efetivas), de segunda linha (menos efetivas, período mais prolongado de tratamento), e as consideradas de reforço (dependendo de sua eficácia e tolerância) [34]. Basicamente a Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda a distribuição das drogas em cinco categorias para ação medicamentosa (Figura 4).
O custo da terapêutica medicamentosa para pacientes com TB-XDR traz um grande impacto financeiro, onde o valor anual despendido está na casa de US$ 30.000, o qual é 4 vezes maior que um paciente portador de TB-MDR (US$ 6.772) e 103 (US$ 257) vezes maior que um paciente com tuberculose sensível ao esquema básico de tratamento [33, 34]. Os medicamentos utilizados ao longo da história do combate a tuberculose e existentes atualmente estão quase todos representados nos agrupamentos mostrados na Tabela I (Anexo), entretanto alguns fármacos não estão nesta classificação, apresentando
30 outros padrões de identificação, sendo grupos adicionais de antibióticos usados no tratamento contra tuberculose.
Atualmente, promissores fármacos de diferentes classes de compostos estão em desenvolvimento, apresentando potencial aplicação no combate à tuberculose (Tabela II). Como pode ser observado, apesar de abranger diferentes categorias de compostos os novos e velhos fármacos estão ainda englobados em basicamente os mesmos núcleos constituintes comuns, praticamente não alterando o foco de ação ao combate do bacilo. Basicamente temos as classes de rifamicina, fluoroquinolona, oxazolidinona, nitroimidazol [38] contra M. tuberculosis, entretanto a maior parte desses resultados evidenciam que não existe atividade bacteriostáticas ou bactericida. Dessa forma, seria de extrema importância que houvesse busca entre outras novas classes de compostos químicos, os quais poderiam aumentar as possibilidades de inibição de multiplicação e sobrevivência tanto na fase ativa como na latente do bacilo. A observação sobre novos pontos do organismo como um todo deveria ser considerado e a utilização de novas metodologias para buscar moléculas promissoras, diferentes em formulação e ação, bem como eficientes seriam soluções modernas.
Diversos estudos baseados em desenvolvimentos de análogos dos medicamentos existentes são sintetizados buscando uma ação mais potente e direcionada
Tabela II. Importantes compostos em fase de testes clínicos.
Fármaco Classe Laboratório Fase
Clínica
Rifalazila Rifamicina Kaneka Corporation Fase II-
abortado
Rifametano Rifamicina Societa Prodotti
Antibiotici
Fase I
Moxifloxacino Fluoroqunolona Bayer Fase II
Sitafloxacino Fluoroqunolona Daiichi Pharmaceutical LG Chem-SmithKline
Fase III
Gemifloxacino Fluoroqunolona Beecham Fase III
Linezolida Oxazolidinona Pharmacia Corporation Fase I
PA-824 Nitroimidazol PathoGenesis Inc Fase I
31
Figura 4. Grupos de drogas antituberculose propostos pela Organização Mundial de Saúde e a recomendação passo a passo para compor um regime de tratamento para pacientes com tuberculose multirresistente ou extensivamente resistente. Adaptado da [2,35,36].
32
1.2.4 Descoberta de drogas baseadas em fragmentos (Fragment-Based Drug Discovery, FBDD)
Neste cenário a técnica de Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) emergiu na última década como processo altamente promissor da descoberta de modernas drogas, sendo responsável por muitos compostos que atualmente estão na fase de desenvolvimento e teste clínicos. O fluxograma e metodologia empregada resulta em grupos de drogas com êxito final, produção em larga escala na detecção de um novo composto, na análise enzimática e checagem da força de ligação do composto com o alvo. Isto se deve à disponibilidade de testes entre vários tipos de compostos conjuntamente com o conhecimento e elucidação de variadas estruturas de enzimas e proteínas com ou sem ligantes naturais e sintéticos, através do detalhamento tridimensional, permitindo que a química medicinal transponha antigas barreiras para detecção, descoberta e desenvolvimento de novas e melhores drogas [38].
A indústria farmacêutica amplamente utiliza a técnica devido às maiores chances de sucesso, possiblidades de gerar novos medicamentos inclusive com maior especificidade, custos iniciais menores e maior eficiência, com diminuição dos efeitos colaterais bastante comuns e indesejáveis nos produtos anteriormente desenvolvidos disponíveis no mercado [39].
A exploração de um espaço químico e busca de um desenho de drogas baseado na estrutura do alvo enfrentaria um número de moléculas viáveis a serem testadas de uma ordem de grandeza expressiva para ser considerada. A infinidade de opções gerou tentativas para a descoberta de novas drogas nas últimas décadas através do rastreamento de compostos em uma linha de produção (HTS, do inglês high-throughput screening), onde mais de dezenas de milhares de compostos são testados contra um alvo de interesse [40-41].
Com esses estudos e experimentos foi gerada uma coleção de pequenas moléculas agrupadas em uma biblioteca química ou conhecida também como biblioteca de fragmentos, a qual abrangem cerca de 100 milhões de opções. Dessa forma, a redução e finitude de um espaço químico poderia ser completamente explorada. Esse seria um primeiro passo, onde as moléculas são avaliadas para mostrar interação com o alvo, bem
33 como força de ligação adequada. A etapa seguinte envolveria a chamada de fase do “crescimento do fragmento” em química medicinal. Essa fase envolve desenvolver um composto inibitório com destaque para melhorar o acoplamento ou ligação com o sítio de ligação, com posterior etapa de otimização buscando maior potencialidade, hidrofobicidade e baixa toxicidade. Todo esse melhoramento geraria moléculas líderes que finalmente poderiam ser levadas para testes clínicos e serem rechaçadas ou futuramente comercializadas. As características de um fragmento dentro de uma biblioteca sãos definidas como pequenos compostos químicos com peso molecular menor que 300 Da, número de hidrogênios doadores e aceptores menores que 3, área de superfície polar menor que 60Å2 [42-45].
A Figura 6 traz uma representação das diferenças entre as plataformas de descobrimento de drogas pela metodologia HTS, FBDD por ligação de fragmentos e pela FBDD com posterior crescimento de fragmentos. Em resumo: 1) múltiplos compostos com tamanhos variados são escaneados contra um alvo, normalmente uma proteína, que identificará uma molécula que liga imperfeitamente e passará para a fase de otimização através da química medicinal. 2) utilizando somente a biblioteca de fragmentos, alguns fragmentos podem se encaixar próximos entre si e em conexão com o alvo escolhido; eles poderão ser ligados e otimizados. 3) a terceira opção é utilizar FBDD e escolher um fragmento que se ligue ao alvo e a partir dele fazer as alterações necessárias para preenchimento do sítio de ligação [42].
Um dos problemas do FBDD por ligação dos fragmentos é que a ligação química deve ser perfeita, entretanto tamanho e requerimentos geométricos impossibilitam o perfeito posicionamento diminuindo a potencialidade da molécula. O direto crescimento de um único fragmento facilitaria interações com a proteína. Apesar de a técnica de FBDD com crescimento dos fragmentos ser mais eficiente tanto para a exploração de moléculas em um espaço químico, como na concepção final de interação molécula com o alvo, ela só é considerada como usual, prática e eficiente após a resolução da estrutura de proteínas superadas com a crescente inovação e automatização [43, 44].
34
Figura 5. Comparação da técnica de escaneamento de moléculas por HTS, FBDD por ligação de fragmentos e FBDD por crescimento de fragmentos. Adaptado do livro Fragment-Based Drug Discovery and X-Ray Crystallography [42].
Algumas considerações são importantes para iniciar um projeto de FBDD. Muitos fragmentos ligam-se a proteínas com constante de dissociação de 1 mM ou mais alta, porém moléculas orgânicas não são solúveis nestas concentrações. A solubilidade dos fragmentos precisa ser checada em tampões biológicos antes de testá-los contra o alvo. As moléculas podem formar agregados em soluções aquosas em concentrações altas atrapalhando as análises, de forma a promover inibição inespecífica e interferência nos ensaios biofísicos [45-47]. Atualmente, associados aos métodos biofísicos utiliza-se a ressonância magnética nuclear (NMR), cristalografia de protéinas por Raios-X e ressonância plasmônica de superfície (SPR, Surface Plasmon Resonance). Esta técnica permite a caracterização da ligação por imobilização da proteína em um chip com metal revestido por onde ocorre a passagem da biblioteca de fragmentos. Os ligantes que interagem com a proteína causam mudanças nas propriedades de refletividade do metal, as quais estão relacionadas à massa do ligante e da proteína. A associação e dissociação pode ser diretamente determinada, porém nem sempre é possível verificar se houve realmente a ligação, pois a ligação de fragmentos nas proteínas pode ser extremamente rápida para ser medida e registrada [48].
35 Uma variação da técnica de NMR é a Saturation Tranfer Difference (STD) que se tornou a mais popular, a qual baseia-se nas diferenças de relaxação entre pequenas moléculas e grandes moléculas. Esta técnica envolve menor quantidade de proteína e não é afetada pelo tamanho da mesma, embora não forneça diretamente informações sobre o sítio de ligação [49, 50]. A cristalografia e a NMR são as únicas técnicas que podem fornecer informações de como os ligantes interagem com as proteínas. A cristalografia pode ser usada para grandes proteínas e dados de alta resolução. A associação de cristalografia e de ensaios biofísicos é fundamental para o sucesso e confiabilidade dos resultados [50-53]. Outras metodologias também podem ser utilizadas, mas em geral dão complementariedade as outras metodologias que geraram moléculas rastreadas anteriormente como líderes.
Outra técnica bastante utilizada é a calorimetria de titulação isotérmica (ITC,
Isothermal Titration Calorimetry) a qual mede a troca e liberação de calor quando há
interação entre ligante e proteína. A entropia ou entalpia envolvida na ligação pode ser calculada para determinação das constantes de dissociação e associação. É uma técnica que apesar de robusta para detecção da força de ligação envolvida entre proteína e ligante, depende de grandes concentrações de ligante e da proteína limitando seu uso [54, 55].
Uma outra opção de técnica, relativamente nova, é o uso da termoforese de microescala (MST, Microscale Thermophoresis), a qual permite quantificar interações das proteínas em solução com baixo consumo de amostra. Esta técnica é baseada na movimentação direcionada das moléculas em gradientes de temperaturas, com alta sensibilidade para todos os tipos de mudança molecular relacionadas a tamanho, carga, camada de hidratação ou conformação. Essas alterações são visualizadas pelo aquecimento da amostra por laser infravermelho e a mobilidade despertada da amostra é acompanhada através da fluorescência marcado com uma sonda fluorescente [56]. Os métodos computacionais caminham junto com o sucesso de FBDD. Apesar das informações produzidas in silico demonstrarem alta correlação com a realidade experimental, principalmente pela melhoria do poder computacional aumentado nos últimos anos, o conhecimento das interações moleculares é menos quantitativo e se faz necessário suplementar com experimentos laboratoriais, particularmente quando as proteínas são flexíveis. Finalmente, a associação de experimentos in silico de docagem
36 de proteínas (docking) com as demais técnicas pode fornecer informações muito próximas do que acontece in vivo, tendo vários exemplos de sucesso na literatura [57-59].
Figura 7. Representação das etapas envolvidas em um projeto completo para o desenvolvimento de drogas baseadas em fragmentos.
1.2.5 Importância do enxofre para sobrevivência de M. tuberculosis
A maioria dos indivíduos infectados por M. tuberculosis tem a infecção na fase chamada latente, a qual é caracterizada por bactérias dormentes, não replicantes, que persistem dentro de uma massa de células imunes no pulmão [59]. Essas células formam uma barreira protetora entre as bactérias e o tecido circundante, conhecido como granuloma [60, 61]. Quando a imunidade do hospedeiro é comprometida, o granuloma se deteriora, liberando as bactérias confinadas e reativando a doença.
Para provocar um quadro de infecção latente, o bacilo deve suportar a fagocitose por macrófagos alveolares, a principal linha de defesa do hospedeiro contra patógenos transmitidos pelo ar [62]. Evitando processos bactericidas típicos, M. tuberculosis é
37 capaz de se replicar e eventualmente induzir a formação de granuloma [63]. Os mecanismos pelos quais o microrganismo persiste no ambiente hostil do fagossomo e orquestra a transição para a latência são mal definidos. Embora ainda não se conheça em detalhes quais são os genes do patógeno que ativam o sistema imune para a indução da formação do granuloma, é notório que os genes envolvidos no metabolismo do enxofre estão envolvidos na resposta ao estresse oxidativo, escassez de nutrientes, adaptação à dormência (situações presentes no granuloma) e durante a fase de infecção no macrófago [64]. Adicionalmente, o enxofre encontrado em vários estados de oxidação é importante para a virulência, resistência a antibióticos e defesa contra agentes oxidantes [65, 66], sendo crescentes as evidências que consideram os metabólitos contendo enxofre importantes na patogênese do bacilo [67, 68]. Estudos demonstraram que alterações em genes envolvidos no metabolismo de enxofre geraram cepas atenuadas de M. tuberculosis, resultando em organismos incapazes de absorver ou assimilar esse elemento, além de incapacidade de sobreviver dentro de macrófagos [69]. O enxofre está envolvido em inicialização da tradução, manutenção do potencial redox, síntese de vários compostos incluindo os aminoácidos cisteína e metionina, além de ter implicações diretas na virulência [70, 68].
O sulfolipidio-1, glicolipídeo associado à parede celular, é produzido apenas por espécies patogênicas de micobactérias [71, 72], e seu precursor biossintético SL1278 provoca a produção de citocinas em pacientes com tuberculose [73]. Compostos provenientes da redução do enxofre, como a cisteína e a metionina, também contribuem para a patogênese [6]. A desativação de sua biossíntese atenua drasticamente a virulência bacteriana e a persistência durante a fase crônica da infecção em camundongos [74]. Micotiol (MSH) é uma pequena molécula de micobactéria contendo o grupamento tiol localizado na parede celular [75], o qual mostrou-se fundamental na desintoxicação de numerosos agentes bactericidas e confere proteção contra o estresse oxidativo [76, 77]. A biossíntese desses importantes metabólitos contendo enxofre é dependente da via de assimilação do sulfato [17], a qual é composta por um grupo de enzimas que catalisam a captação e o metabolismo do enxofre na forma do íon inorgânico sulfato (SO4), através
da ação de um transportador do tipo ABC denominado SubICysTWA [78], composto pelas proteínas SubI (periplasmática ligadora), CysT e CysW (permeases) e CysA1 (ATPase). Neste sistema, a proteína ligadora de sulfato (SubI) captura a molécula no
