VANESSA REGINA TOFANELLO
“EXPRESSÃO DE GENES DA VIA DE BIOSSÍNTESE DE LIGNINA NO CAULE DE PLANTAS DE EUCALYPTUS GLOBULUS E E. UROGRANDIS
EXPOSTAS A DIFERENTES TEMPERATURAS”
CAMPINAS 2015
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Fátima e José, por me apoiar sempre. Ao meu esposo, Phablo, pelo amor, companheirismo e compreensão.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal.
Ao Departamento de Biologia Vegetal, pela infraestrutura, e a todos do departamento, técnicos, alunos e professores.
A FAPESP pelo apoio financeiro.
Ao Prof. Dr. Paulo Mazzafera, pela orientação e por todo o aprendizado. A Maria Roseli de Melo Secretária do Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal por toda a ajuda.
Aos membros da pré-banca, pelas valiosas sugestões: Profa. Dra. Sara Adrián Lopez Andrade, Dr. Jorge Maurício Costa Mondego e Prof. Dr. Rafael Vasconcelos Ribeiro. E aos membros da banca, por toda atenção e ajuda: Profa. Dra. Sara Adrián López de Andrade e Prof. Dr. Márcio José da Silva.
Ao Dr. Eduardo Kiyota e ao Me. João Benhur Mokochinski pelas análises no espectrômetro de massas.
Ao Prof. Dr. Rafael Vasconcelos Ribeiro, a Ma. Fernanda Castro e ao Me. Luciano Pereira pela ajuda com as medidas de fotossíntese.
À Profa. Dra. Juliana L. S. Mayer pela colaboração.
A todos os colegas do departamento de Fisiologia Vegetal, em especial aos membros do LaFiMP, Adilson, Adriana, Caio, Daniela, Dimitry, Eduardo, Felipe, Flávia, Ilse, Luana, Laerti, Letícia, Luciano, Mariana, Nathalia, Pedro, Rafaela, Sara, Sarah, Tatiana e Uiara que de alguma forma participaram da realização deste trabalho.
À minha família, pais, irmão, primos e tios pelo apoio incondicional.
Ao meu esposo Phablo pelo apoio, incentivo, companheirismo, paciência, amizade e amor.
RESUMO
Sabe-se que espécies vegetais perenes precisam sobreviver a alterações periódicas em seu ambiente, devendo apresentar mecanismos que lhes permitam sobreviver a esta condição inconstante, através de alterações anatômicas, celulares e moleculares. Estresses por extremos de temperaturas configuram-se como um dos principais elementos que limitam a distribuição geográfica e o crescimento sazonal de diversas plantas, afetando a qualidade e a produtividade de inúmeras culturas e plantações florestais. Celulose e lignina são os principais polímeros em plantas. Apesar da lignina desempenhar importante papel na planta ao servir de suporte para microfibrilas de celulose nas paredes celulares, este composto pode ser um problema durante processos industriais pois dificulta a extração de celulose de espécies de importância econômica como é o caso do eucalipto. Genes da via de biossíntese de lignina foram selecionados de um banco de RNAseq. Estes genes foram comparados com aqueles do genoma de E.grandis sendo identificados dois genes codificando para fenilalanina amônia liase (EgrPAL2 e EgrPAL3), um de cinamato 4-hidroxilase (EgrC4H2), um de hidroxicinamoil CoA: shiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase (EgrHCT4), um de cafeoil-CoA O-metiltransferase (EgrCCoAOMT-like17) e um de ferulato 5-hidroxilase (EgrF5H1). A identificação se deu por alinhamento de sequências e construção de árvores filogenéticas. Plantas com 4 a 5 meses de idade de E. globulus e E. urograndis, as mesmas espécies usadas na construção do banco de RNAseq, foram mantidas por 22 dias nas temperaturas 5oC, 10oC, 15oC, 20oC, 25oC, 30oC e 35oC. Analisou-se o crescimento caulinar e nas folhas a fotossíntese, fluorescência da clorofila e teor de pigmentos. No caule analisou-se lignina, os oligômeros solúveis de lignina e a razão S/G. De modo geral as menores temperaturas limitaram o crescimento e diminuíram os teores de clorofila, mas aumentaram os de antocianinas. O efeito das temperaturas mais baixas foi mais pronunciado que das temperaturas mais altas para a mesma espécie, mas E. globulus aparentemente foi menos afetado que E. urograndis, principalmente no crescimento caulinar e na fotossíntese. O teor de lignina pouco variou em E. urograndis, mas foi menor nas temperaturas mais baixas em E. globulus aumentando com as temperaturas intermediárias e caindo nas mais altas. E. globulus apresentou teor médio menor de lignina e maior de S/G. Não houve alteração marcante nos oligômeros ou na relação S/G nas duas espécies com as diferentes temperaturas. Os dados de expressão dos genes mostraram boa concordância com a variação de lignina em E. globulus, com maior pico de expressão entre 10oC e 15oC. Conclui-se que o teor de lignina foi alterado em E. globulus principalmente pelo efeito da temperatura sobre o metabolismo de lignina como um todo, não tendo efeito qualitativo, ou seja, na razão S/G, o que implicaria na alteração de expressão de enzimas específicas. Além disso, os dados mostram que pode haver variação em relação aos genes que seriam responsivos aos tratamentos de temperatura, uma vez que os genes aqui analisados e identificados no genoma de E. grandis como atuantes na biossíntese de lignina não necessariamente responderam como tal, como foi o caso de EgrPAL2 e EgrPAL3, e EgrCCoAMT-like17. Isto abre novas perspectivas para estudos funcionais com os diferentes genes e “genes-like” identificados no genoma do E. grandis em diferentes espécies de eucalipto.
ABSTRACT
It is known that perennial plant species must endure periodic alterations in the environment and frequently find themselves in the need of mechanisms necessary for survival in such inconstant conditions, by means of anatomical, cellular and molecular alterations. Stresses induced by extremes temperature are one of the main limiting factors for geographical distribution and seasonal growth in various groups for plants, affecting quality and productivity in several crops and forests. Cellulose and lignin are the main polymers found in plants. Lignin plays an important role in the plant, supporting cellulose microfibrils in the cell walls, however, when it comes to industrial processes, lignin is an obstacle making it difficult to extract cellulose compounds of economic importance, as observed of eucalyptus plants. Genes acting in the lignin biosynthesis pathway were selected form an RNAseq database. These genes were compared with those from E. grandis genome and two genes were identified for codification of phenylalanine ammonia-lyase (EgrPAL2 and EgrPAL3), one for cinnamic acid 4-hydroxylase (EgrC4H2), one for hydroxycinnamoyl-CoA: shikimate/quinate hydroxycinnmoyl transferase (EgrHCT), one for caffeoyl-CoA O-methyltransferase (EgrCCoAOMT-like17) and one for Ferulate 5-hydroxylase (EgrF5H1). Sequences were identified using sequence alignment and phylogenetic trees. E. globulus and E. urograndis plants – the same species used in the RNAseq database – with 4 to 5 months of age were kept for 22 days in temperatures of 5oC, 10oC, 15oC, 20oC, 25oC, 30oC and 35oC. Analysis of growth was performed for stems, and leaves were analyzed for photosynthesis, fluorescence and pigment content. Total lignin, soluble lignin oligomers and S/G ratio was analyzed in the stems. In a general way, the lowest temperatures limited growth and reduced chlorophyll content, but anthocyanins were increased. The effect of cold was more important than that of higher temperatures for the same species, although E. globulus was apparently less affected E. urograndis, mainly for stem growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence. Lignin content showed little variation in E. urograndis and was smaller for lower temperatures in E. globulus, increasing with intermediate temperatures and decreasing in the highest ones. E. globulus showed the lowest average lignin content and highest S/G ratio. There were no significant alterations in oligomers or S/G ratio in either species regarding different temperatures. Gene expression data were well correlated with variation in lignin content for E. globulus, with the highest expression peak between 10oC e 15oC. The results demonstrate that lignin content was altered in E. globulus mainly for the effect on overall lignin metabolism, without any qualitative effect, considering S/G ratio, which would implicate in alteration in the expression of specific enzymes. Furthermore, data shows there can be variation related to genes responding to temperature treatments, considering the genes analyzed here and identified in the genome of E. grandis as active in the biosynthesis of lignin did not necessarily behave as expected, as was the case for EgrPAL2 and EgrPAL3, and EgrCCoAMT-like17. This opens new perspectives for functional studies with different genes and “gene-like” identified in E. grandis genome for different species of eucalyptus.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 10 1.1 Eucalipto ... 10 1.2 Lignina ... 12 2. OBJETIVOS ... 19 2.1 Objetivo ... 19 2.2 Objetivos específicos ... 19 3. MATERIAL E MÉTODOS... 20
3.1 O banco de transcritos (RNAseq) ... 20
3.2 Material vegetal e tratamentos ... 21
3.3 Determinações de crescimento e fotossíntese ... 22
3.4 Determinações de clorofila e antocianinas ... 22
3.5 Determinações de lignina ... 23
3.6 Identificação dos genes, “anotação” e análises filogenéticas... 24
3.7 Extração de RNA, produção de cDNA e expressão gênica ... 25
3.8 Análises Estatísticas ... 28
4. RESULTADOS... 29
4.1 Estudo Filogenético ... 29
4.2 Parâmetros Fisiológicos ... 32
4.3 Lignina ... 35
4.4 Análise da Expressão Gênica ... 37
5. DISCUSSÃO ... 44
6. CONCLUSÃO ... 53
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1. INTRODUÇÃO 1.1 Eucalipto
O eucalipto produz madeira de qualidade elevada e juntamente com a sua capacidade notável de adaptação e o rápido crescimento, tem contribuído para impulsionar o cultivo desta árvore em mais de 100 países e em seis continentes (Myburg et al., 2014). Sua abrangente finalidade vai desde do uso da madeira propriamente dita até a extração de óleos essenciais para uso na indústria farmacêutica e química (Adorjan e Buchbauer, 2010).
As espécies de eucaliptos mais utilizadas para plantação florestal são Eucalyptus grandis, E. urophylla, E. camaldulensis e E. globulus (Grattapaglia e Kirst, 2008). E. globulus, E. grandis e E. urograndis são as principais espécies fornecedoras de matéria-prima para indústria de papel e celulose na Península Ibérica e América Latina (Neto et al., 2005).
E. globulus ocorre naturalmente nas regiões litorâneas da Tasmânia e Austrália, em altitudes próximas aos 400 m acima do nível do mar (Williams e Potts, 1996). Esta espécie apresenta uma rápida e eficiente adaptação fisiológica para diferentes condições climáticas, no entanto, a alta temperatura limita o seu crescimento (Shvaleva et al., 2006). Embora a espécie não seja adaptada a climas secos e temperaturas elevadas, ainda assim, é a espécie mais utilizada em países de clima Mediterrâneo (Pita e Pardos, 2001). Em virtude de seu rápido crescimento e alto rendimento celulósico, as áreas de plantação de E. globulus têm aumentado significativamente em países como a Austrália, Chile, Portugal e África do Sul para suprir a indústria de papel e celulose (Gamboa et al., 2007). Essa espécie retém as melhores propriedades para produção de celulose e de papel dentre os eucaliptos plantados comercialmente, pois tem um maior comprimento de fibra e maior teor de holocelulose, sendo necessários aproximadamente 25% menos madeira para produzir uma tonelada de celulose em
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relação a outra espécie de eucalipto comumente utilizada para estes propósitos (Grattapaglia, 2004). Além disso, com fibras mais densas e flexíveis, a madeira de E. globulus possui proporcionalmente mais monômero de lignina do tipo S, o que possibilita a remoção mais eficiente da lignina durante o processo de branqueamento da polpa de celulose (Neto et al., 2005), resultando em uma relação positiva entre a quantidade de S e o rendimento da polpa (Elissetche et al., 2011). Consequentemente, há redução dos custos de produção de papel devido à economia de energia e à menor quantidade de reagentes químicos necessários (Neto et al., 2005), gerando um produto distinto e superior ao existente no mercado atual (Grattapaglia, 2004). Comparativamente às outras espécies, E. globulus é o menos cultivado no Brasil. E. grandis é a espécie mais utilizada como matéria-prima na indústria brasileira de papel e pasta de celulose. No Brasil, para a produção de uma tonelada de celulose são necessários 3,9 m3 de madeira de E. grandis, enquanto que apenas 3 m3 de madeira de E. globulus são necessários para o processamento da mesma quantidade de polpa de celulose (Neto et al., 2005). O E. grandis é uma espécie de clima subtropical e tem sido muito utilizado para a produção de polpa devido ao seu rápido crescimento e fácil propagação vegetativa. Porém, essa espécie tem uma baixa taxa de sobrevivência em áreas úmidas e tropicais em decorrência de sua vulnerabilidade às doenças fúngicas (Wingfield et al., 1989). Por outro lado, a espécie E. urophylla é nativa da região tropical das ilhas da Indonésia, sendo mais tolerante às doenças fúngicas do que E. grandis (Kullan et al., 2012). O resultado da hibridização destas duas espécies combinou em um genótipo de crescimento rápido, maior adaptação e tolerância a doenças (Kullan et al., 2012), o E. urograndis, muitas vezes superior em comparação às espécies parentais (Grattapaglia et al., 1996; Verhaegen et al., 1997). Tal híbrido é cultivado principalmente no Brasil (Bison et al., 2006), no Congo (Vigneron et al., 2000) e na África do Sul (Darrow, 1995; Wright, 1997).
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1.2 Lignina
A lignina é um composto fenólico polimérico, amorfo e tridimensional (Sun et al., 2010), encontrada predominantemente nas paredes celulares secundárias e que desempenhou um papel crucial no surgimento de plantas vasculares e sua transição para o habitats terrestres (Weng et al., 2010). A lignina constitui um quarto da biomassa lignocelulósica e é o terceiro biopolímero mais abundante nos organismos vegetais, depois da celulose e da hemicelulose (Shi et al., 2012). Ela tem papéis biológicos fundamentais para as plantas como o de conferir rigidez mecânica, impermeabilidade, resistência à biodegradação, afeta a condutividade da água, além de funções importantes nos mecanismos de defesa em plantas (Bhuiyan et al., 2009).
A lignina é formada pela polimerização oxidativa de subunidades chamadas de monolignóis, sendo formada principalmente por três monolignóis (Figura 1): ρ-hidroxifenil (H), guaiacil (G) e siringil (S), que são formados a partir de três hidroxicinamoil álcoois (monolignóis), ρ-cumaril, coniferil e sinapil, respectivamente, formados na via dos fenilpropanóides, diferindo entre si apenas pelo grau de metoxilação (Boerjan et al., 2003). Além desses três monolignóis outros fenilpropanóides podem ser incorporados ao polímero da lignina em vários níveis, incluindo hidroxicinamatos, hidroxicinamil aldeídos e hidroxicinamil acetatos (Raes et al., 2003).
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Figura 1. Monolignóis precursores da lignina.
A abundância relativa de cada um desses monômeros varia de espécie para espécie, sendo que nas angiospermas dicotiledôneas as principais unidades encontradas são S e a G, e traços de H. Já as angiospermas monocotiledôneas possuem as unidades G e S em quantidades equivalentes e apresentam mais unidades H que as dicotiledôneas. Em pteridófitas e gimnospermas as ligninas são formadas principalmente por G e contém baixos níveis de unidades H (Baucher et al., 1998).
A recalcitrância da lignina é o principal obstáculo para o processamento industrial da madeira na fabricação de papel e celulose, requerendo tratamentos químicos agressivos e dispendiosos (Carocha et al., 2015). A quantidade de lignina, assim como sua composição e os tipos de ligações químicas presentes interferem no processo de aproveitamento da celulose para a produção de papel, definindo as taxas de deslignificação, o consumo de químicos e o rendimento da polpa (Higuchi et al., 1994; Rencoret et al., 2009).
Apesar da quantidade de lignina ser importante do ponto de vista qualitativo no processo de remoção desse polímero durante a produção de celulose, a proporção entre a unidades S e G (relação S/G) interfe nos tipos de reações que cada uma pode estabelecer. O conteúdo de S e a quantidade de ligações β-O-4 foram positivamente correlacionados com o
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rendimento da polpa (Elissetche et al., 2011). Uma menor proporção de unidades G na composição da lignina resulta em menor gasto de energia e de produtos químicos durante a polpação alcalina e o branqueamento durante a produção do papel (Rencoret et al., 2009). Este fato acontece porque a unidade G tem uma posição livre no carbono 5 do anel aromático, que permite ligações intermonoméricas carbono-carbono (8−5, 5−5 e 5−O−4) com elevada resistência ao processo de despolimerização da lignina durante a polpação (Del Río et al., 2005; Rencoret et al., 2009). Devido à sua acentuada estabilidade, as ligações C-C formadas, não se quebram em diversas condições alcalinas (Sun et al., 2010), sendo assim, as unidades G são pouco reativas no processo de polpação (Rencoret et al., 2009). Por outro lado, lignina rica em unidades S caracteriza-se pela ausência de sítios de ligação livres e estabelece ligações de mais fácil clivagem, como a do tipo 8−O−4 (Kiyota et al., 2012). Produzir madeiras contendo lignina, mais rica em S é um dos objetivos almejados no melhoramento genético das espécies arbóreas destinadas à produção de papel (Marita et al., 1999).
Os monômeros da lignina são formados basicamente pela ação de dez enzimas: fenilanalina amônia-liase (PAL), cinamato 4-hidroxilase (C4H), 4-coumarato CoA ligase (4CL), hidroxicinamoil CoA:shiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase (HCT), ρ-cumarato 3-hidroxilase (C3H), cafeoil-CoA O-metiltransferase (CCoAOMT), ferulato 5-hidroxilase (F5H), cafeato O-metiltransferase (COMT), cinamoil-CoA redutase (CCR), cinamil álcool desidrogenase (CAD) (Vanholme et al., 2010). Os monolignoóis são sintetizados no citoplasma e depois são transportados até a parede celular, passando pela membrana celular pela ação de transportadores do tipo ABC (Liu et al., 2011). No apoplasto são oxidados por peroxidases e lacases (Alejandro et al., 2012) e depois polimerizados por acoplamento oxidativo combinatorial (Cesarino et al., 2012) sendo incorporados ao polimero.
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Recentemente Vanholme et al. (2013) descreveram que a enzima cafeoil chiquimato esterase (CSE) faria parte de uma rota alternativa na via de biossíntese de lignina e Carocha et al. (2015) propuseram uma via de biossíntese de lignina especificamente para eucalipto (Figura 2), com base no recente genoma de E. grandis (Myburg et al., 2014).
Figura 2. Via de biossíntese de lignina em Eucalyptus, indicando os genes identificados no genoma de E. grandis (Carocha et al., 2015)
1.3 Resposta fisiológicas e aclimatação a temperaturas extremas
Temperatura é um fator ambiental importante na distribuição das plantas no globo terrestre, limitando a produtividade de inúmeras culturas e plantações florestais, afetando negativamente o crescimento e o desenvolvimento de plantas (Chinnusamy et al., 2007;
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Fernández et al., 2010; Moura et al., 2010). Para sobreviverem, muitas plantas desenvolveram mecanismos que lhes permitem aumentar a tolerância a essa condições adversas de temperatura, através de adaptações físicas e alterações moleculares e celulares (Knight e Knight, 2001; Rivero et al., 2009). Alterações induzidas por temperaturas compreendem mudanças nas concentrações de uma ampla variedade de metabólitos, incluindo açúcares, proteínas de defesa, bem como modificações nas membranas celulares, alterações dos níveis hormonais e alterações na expressão gênica (Fernández et al., 2010; Moura et al., 2010).
O efeito de altas temperaturas em plantas normalmente se encontra associado a outros estresses como seca ou salinidade, causando assim um estresse combinado. Apesar disso, sua caracterização independente é importante sob o ponto de vista fisiológico, já que seus efeitos podem variar dependendo da espécie e do seu estádio (Bita e Gerats, 2013). Temperaturas altas causam vários danos às plantas, indo desde degradação de clorofilas até a abscisão foliar, inibição do crescimento de parte aérea e raízes e diminuição da produtividade de modo geral (Vollenweider e Günthardt-Goerg, 2005). Os efeitos iniciais, ou primários, de temperaturas altas são mudanças na fluidez de membranas, instabilidade de proteínas, instabilidade do citoesqueleto, alterações na estrutura da cromatina e produção aumentada de espécies reativas de oxigênio (ROS) (Bita e Gerats, 2013). Consequentemente, o estresse imposto por alta temperatura afeta vários processos fisiológicos, sendo eles relacionados tanto ao metabolismo primário como secundário, desencadeando uma cascata de sinalização hormonal, em conjunto a processos de sinalização celular mediados por cálcio, fosforilação de proteínas e alterações transcricionais (Bita e Gerats, 2013).
Por outro lado, em baixas temperaturas as plantas enfrentam outros desafios, como a alteração na organização espacial e nas propriedades biofísicas das membranas celulares, assim como um abrandamento de suas reações químicas e bioquímicas. As plantas possuem
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diversos mecanismos para perceber o estresse causado pelo frio, como a perda da fluidez da membrana celular, mudanças na conformação de proteínas, de ácido nucleicos e variações na concentração de metabólitos específicos (Chinnusamy et al., 2007). A perda da fluidez da membrana celular induzida pelo frio seria a mediadora do aumento a concentração Ca2+ citosólico (Vergnolle et al., 2005) o que levaria a sinais secundários, tais como a produção do ácido abscísico e de ROS (Chinnusamy et al., 2007).
Tal qual em temperaturas altas, ROS exercem efeitos diretos em proteínas sensíveis ao estão redox, tais como fatores de transcrição e quinases, desencadeando cascatas de sinalização responsivas ao frio, as quais incluem vários fatores de transcrição, destacando-se MYB e CBF (Chinnusamy et al., 2007). Em resposta ao frio, 3.379 genes de Arabidopsis thaliana tiveram o padrão de expressão alterado, incluindo os referentes a vários fatores de transcrição (Hannah et al., 2005).
Enquanto E. grandis e E. urophylla são intensivamente plantados em regiões tropicais e subtropicais, principalmente Brasil, África do Sul, Congo e China, E. globulus é mais cultivado em regiões temperadas (Portugal, Espanha, Chile e Austrália). Apesar do eucalipto crescer numa vasta escala de temperaturas, as temperaturas mais baixas são as mais limitantes ao seu cultivo em várias regiões do globo (Wisniewski et al., 2014). A espécie mais tolerante ao frio é Eucalyptus gunnii, que cresce nas montanhas da Tasmania e suporta entre -14oC e -18oC, porém, as mais produtivas, como E. grandis e E. globulus, são mais sensíveis, suportando entre -6 a -8oC (Gamboa et al., 2007; Navarro et al., 2011). De modo geral os estudos com eucalipto têm dado mais atenção aos efeitos de baixas temperaturas. Davidson et al. (2004) estudaram o efeito de baixas temperaturas na capacidade fotossintética de eucaliptos, verificando que temperaturas próximas a congelantes afetavam significativamente a fotossíntese. Segundo Fernández et al. (2010), quando exposto a temperaturas baixas, mas
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não congelantes, E. globulus é capaz de aumentar sua resistência ao frio. Moura (2008) observou que, diferentemente de E. grandis, o E. globulus claramente apresenta uma clara tendência de aumento do crescimento quando exposto a 12ºC durante o período noturno.
Costa e Silva et al. (2009) observaram que clones de E. globulus expostos a baixas temperaturas durante à noite (6ºC, 2ºC e -2ºC) apresentaram características de aclimatação ao frio, tais como menores danos à membrana celular e aumento da quantidade de açúcares solúveis e da atividade de enzimas antioxidantes quando comparados com plantas controle.
Pouco se sabe sobre a resposta dos eucaliptos a temperaturas mais altas. Plantas de E. globulus expostas a estresse hídrico combinado a dois regimes de temperatura (28°C/17°C e 32°C/21°C – dia/noite) mostraram que os efeitos prejudiciais da seca eram aumentados pelas temperaturas mais altas (Duan et al., 2013).
No que se relaciona ao efeito da temperatura na biossíntese de lignina, plantas submetidas às baixas temperaturas podem ter seu teor de ligninas alterado (Moura et al., 2010). Hausman et al. (2000) mostraram que plantas de álamo (Populus tremula x tremuloide) submetidas ao estresse por baixa temperatura apresentaram variações na concentração de lignina. Alguns estudos têm relacionado o aumento da expressão de genes da via de biossíntese de lignina em resposta ao frio. A baixa temperatura elevou o aumento da expressão genica da PAL em plantas de Brassica napus (Solecka et al., 1999; Solecka e Kacperska, 1995) e em Glycine max (Janas et al., 2000), e da C3H em rododendro (Wei et al., 2006).
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo
O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão de genes da rota de biossíntese de lignina em caule de duas espécies de eucalipto em resposta a diferentes temperaturas.
2.2 Objetivos específicos
- Identificar os genes do metabolismo de lignina, que foram diferencialmente expressos em um banco de bibliotecas de RNAseq produzidos a partir de plantas de E. globulus e E. urograndis, mantidas em temperatura ambiente (25oC) e temperatura baixa (12oC);
- Avaliar a expressão desses genes em plantas de eucalipto submetidas a diferentes temperaturas, variando de 5oC à 35oC;
- Avaliar a respostas fisiológicas das duas espécies em resposta a temperaturas variando de 5oC à 35oC.
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3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 O banco de transcritos (RNAseq)
Este banco foi desenvolvido no Laboratório de Fisiologia Molecular de Plantas – LaFiMP e os resultados do mesmo foram inseridos em manuscrito submetido a publicação (Araújo et al., 20151). Os RNAs extraídos para se fazer as bibliotecas foram do caule de plantas de 18 meses de idade. De cada planta foi coletado o caule a partir do ápice até a inserção da sexta folha das espécies E. globulus e E. urograndis que haviam sido mantidas por um mês em câmara de crescimento (200 µmol fótons m-2 s-1), com temperatura de 12oC e 25oC (controle). A extração de RNA seguiu o método de Chang et al. (1993) e o sequenciamento realizado em plataforma Illumina pela empresa Fasteris (https://www.fasteris.com/dna/). O alinhamento e mapeamento dos transcritos foram feitas com o auxílio do Dr. Renato Vicentini (CBMEG-Unicamp) e disponibilizado para consulta em http://sysbiol.cbmeg.unicamp.br/eucaliptus/. O genoma de referência utilizado para a construção do transcriptoma foi o de E. grandis (Myburg et al., 2014).
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Araujo et al. Survey of two contrasting Eucalyptus species for cold stress using RNA-seq approach to identify genes. Em preparação.
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3.2 Material vegetal e tratamentos
Foram utilizadas plantas de E. globulus e E. urograndis de 4 a 5 meses de idade para
avaliar a influência da temperatura na biossíntese de lignina. As plantas foram obtidas a partir das sementes adquiridas na empresa Caiçara Comércio de Sementes (Brejo Alegre - SP), e foram cultivadas em recipiente tipo tubetes de 290 cm3 de capacidade, contendo mistura de substrato comercial e vermiculita (3:1, v/v). As plantas foram mantidas em câmaras de crescimento a diferentes temperaturas (5oC, 10oC,15oC, 20oC, 25oC, 30oC e 35oC) por 22 dias, sob fotoperíodo de 12 h e luminosidade de 80 µmols fótons m-2 s-1. A iluminação das câmaras foi realizada com luzes LED vermelhas e azuis (Lablumens). Para os tratamentos de 5oC a 20oC as plantas ficaram em uma câmara com compressor para resfriamento e nas temperaturas de 25oC a 35oC ficaram em câmara sem este tipo de equipamento, para atingir as temperaturas de 30oC e 35oC utilizou-se sistema de aquecimento. Com exceção da temperatura, as demais condições de crescimento foram iguais. Ao final de cada tratamento foram feitas medidas de crescimento e fotossíntese, e a segunda, terceira e quarta folhas, a partir do ápice, foram reservadas para as medidas de pigmentos. Em seguida, coletou-se os primeiros 10 cm do caule a partir do ápice, sendo colocados diretamente em nitrogênio líquido e posteriormente armazenados em freezer -80oC e para posterior maceração em nitrogênio líquido. Parte deste material foi liofilizado para determinação de lignina.
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3.3 Determinações de crescimento e fotossíntese
Nas plantas submetidas aos diferentes tratamentos de temperatura foram avaliadas
alterações no crescimento, fotossíntese e fluorescência do fotossistema II. No início do experimento fez-se uma marca com uma caneta permanente no caule de cada planta, a 0,5 cm do ápice para avaliação do crescimento. No final do experimento mediu-se o comprimento desta marca até o ápice. A taxa de assimilação de CO2 (A) foi medida utilizando-se um analisador de gases por infravermelho (IRGA-Li-Cor, modelo LI-6400). As folhas foram acomodadas na câmara do aparelho e expostas à concentração de CO2 controlada (400µmol mol-1). A intensidade luminosa foi modulada pelo aparelho em 80 µmol de fóton m-2.s-1 e a taxa fotossintética foi medida após a estabilização da concentração de CO2 na câmara de análise (Tsormpatsidis et al., 2010) e coeficiente de variação (CV) < 10% . A fluorescência máxima potencial (Fv/Fm) foi obtida com fluorômetro (Li-Cor, modelo 6400-40 acoplado ao IRGA LI-6400X), sendo examinada a superfície adaxial das folhas, previamente adaptadas ao escuro por 30 min. As medidas de fluorescência e fotossíntese foram feitas na terceira folha a partir do ápice.
3.4 Determinações de clorofila e antocianinas
Para a quantificação de clorofilas (a e b) foram utilizados 10 mg do material em disco foliar fresco aos quais foi adicionado 1 mL de dimetil-sulfóxido (DMSO) em micro tubos. As amostras foram mantidas em agitação por 24 h no escuro (Hiscox e Israelstam, 1979), centrifugadas e no sobrenadante foram determinadas as absorbâncias a 646 nm e 663 nm em espectrofotômetro. A concentração de clorofilas a e b foram determinadas segundo Lichtenthaler e Wellburn (1983).
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A quantificação de antocianina seguiu o protocolo descrito por Hughes e Smith (2007). Aproximadamente 10 mg de material em disco foliar foram extraídos com 2,5 mL de uma solução de 6 M HCl:H2O:metanol (7:23:70, v/v/v), sendo mantidas no escuro sob agitação por 24 h. Após centrifugação, determinou-se a absorbância do sobrenadante a 530 nm e 653 nm e os valores foram inseridos na fórmula C = Abs530 - [0,24] Abs653, onde 0,24 é fator correção do efeito da clorofila por meio da subtração de 24% da absorbância do comprimento de onda máximo da clorofila
3.5 Determinações de lignina
A dosagem de lignina insolúvel seguiu o método de Klason (Rogers et al., 2005) a partir de 200 mg de material macerado e liofilizado. O perfil dos oligômeros de lignina foi obtido por espectrometria de massa, após a separação por cromatografia líquida (UPLC-MS) de extratos obtidos à partir de 50 mg de caule macerado e liofilizado, conforme Kiyota et al. (2012).
Para a determinação da composição monomérica de S e G seguiu-se o método de Mokochinski et. al. (2015). Amostras liofilizadas de 100 mg foram hidrolisadas em 2,0 mL de NaOH 4 M em tubos de ensaio com tampa rosqueada e vedados com fita teflon. Os tubos foram aquecidos por 24 h a 95°C num sistema de aquecimento do tipo banho seco. Após a hidrólise, os tubos foram retirados do sistema de aquecimento para que resfriassem em temperatura ambiente. As amostras foram acidificadas com aproximadamente 1,6 mL de HCl 6 M e agitadas para garantir a neutralização da base. O pH ácido (2-3) foi conferido com fita de papel indicador e em seguida as amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por 5 min. Uma alíquota de 500 µL do sobrenadante foi transferida para micro tubos de 2,0 mL e
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extraída duas vezes com 1,0 mL de acetato de etila, juntando as duas frações da fase orgânica. O solvente foi evaporado sob fluxo de N2 e o conteúdo foi dissolvido em 1,0 mL de água Milli-Q. Em seguida as amostras foram analisadas por UPLC-MS com uma coluna C8 (50 mm × 2,1 mm; 1,7 µm). Como fase móvel utilizou-se água (A) e acetonitrila (B), seguindo o gradiente: 90% A até 4,5 minutos, mudando para 100% B em 8,0 minutos. Essa condição foi mantida constante até 9,0 minutos, e em seguida retornou-se para condição inicial estabilizando em 10,0 minutos. Curvas de calibração feitas com padrões de siringil e guaiacil foram obtidas e usadas na determinação das quantidades presentes nas amostras.
3.6 Identificação dos genes, “anotação” e análises filogenéticas
Para o desenvolvimento dessa etapa utilizou-se o banco de dados de RNAseq citado anteriormente. Os transcritos obtidos foram organizados por funções moleculares pelo Gene Ontology (http://www.geneontology.org) e os genes relacionados à biossíntese de lignina foram alocados em “parede celular”. Além disso, as sequências identificadas nesta categoria funcional foram comparadas com sequências de Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula, Populus, Saccharum officinarum, Sorghum bicolor, Oryza sativa e Zea mays usando a ferramenta BLAST disponível no site do RNAseq. As sequências também foram comparadas com dados do genoma do E. grandis (Myburg et al., 2014) depositados no banco de dados Phytozome (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html).
As sequências dos transcritos diferencialmente expressos em plantas de eucalipto em respostas à temperatura foram usadas para construir árvores filogenéticas, sendo traduzidas em sequência de proteína, assim, foram feitas buscas de proteínas homólogas em bancos de dados de proteínas não redundantes (UNIPROT, http://www.uniprot.org/; TAIR,
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http://www.arabidopsis.org/; NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; MAIZEWALL, http://www.polebio.scsv.ups-tlse.fr/MAIZEWALL/index.html/) usando BLASTp (Altschul et al., 1997). As proteínas preditas foram alinhadas com o programa ClustalW dentro do MEGA 5 (Tamura et al., 2011) e então usadas para construir árvores filogenéticas usando o algoritmo “neighbor-joining” (Saitou e Nei, 1987), com valores de bootstrap de 5.000 replicatas.
Uma vez identificados os genes, eles foram “anotados” no banco de RNAseq, usando referências bibliográficas como fonte de informação. Foram identificados como diferencialmente expressos os genes para as enzimas fenilalanina amônia-liase (PAL; EC 4.3.1.5), cinamato 4-hidroxilase (C4H; EC: 1.11.13.11), hidroxicinamoil CoA: shiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase (HCT; EC: 2.3.1-), cafeoil-CoA O-metiltransferase (CCoAOMT; EC 2.1.1.104) e ferulato 5-hidroxilase (F5H; EC 1.14.13).
A nomenclatura usada para nomear os genes identificados como diferencialmente expressos seguiu a adotada para o genoma do eucalipto (Carocha et al., 2015).
3.7 Extração de RNA, produção de cDNA e expressão gênica
A extração de RNA total foi realizada de acordo com Chang et al. (1993), com modificações (Sassaki, 2008) 100 mg de tecido macerado em nitrogênio líquido foram extraídos em 500 µL do tampão de extração CTAB pré-aquecido em 65oC, ao qual adicionou-se 15 µL de β-metcaptoetanol. Após agitação em vortex o material foi incubado por cerca de 10 a 15 min a 65oC e, em seguida, adicionou-se 500 µL de CIA (clorofórmio:álcool isoamílico, 24:1, v/v), homogeneizou-se a solução em vortex e o extrato foi centrifugado a 12.000 xg por 10 min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi reservado e repetiu-se o passo anterior. Os sobrenadantes recuperados foram combinados e adicionou-se um volume
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de LiCl 5 M, mantendo-se em seguida a mistura a 4°C por no mínimo 1 h. Após precipitação do RNA, fez-se centrifugação a 12.000 g, por 30 min em centrífuga refrigerada (4°C). A partir desse ponto as amostras foram mantidas no gelo. Ao precipitado foi adicionado 200 µL de TE-SDS 1%, 100 µL de NaCl 5 M e 300 µL de isopropanol. Depois de homogeneização em vortex, o RNA foi precipitado durante 30 min a -20°C e recuperado por centrifugação a 12.000 xg por 20 min (4°C). Em seguida, o RNA precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 70%, centrifugado a 1.200 xg por 5 min (4°C) e seco em temperatura ambiente mantendo o tubo invertido. O RNA foi solubilizado em 12 µL de água Milli-Q autoclavada tratada com Dietilpirocarbonato (DEPC).
Os RNAs obtidos foram tratados com rDNase I (DNase-Free, Amblicon) e quantificados em espectrofotômetro pela leitura da absorbância a 260 nm. A qualidade foi verificada em eletroforese em gel de agarose 1% com brometo de etídio, com visualização sob luz UV e registro em fotodocumentador (Gel Doc 2000, BIO RAD). Para a síntese da primeira fita de cDNA utilizou-se o Kit Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis.
Para as análises de expressão foram desenhados primers (Tabela 1) para fenilalanina amônia-liase (PAL; EC 4.3.1.5), cinamato 4-hidroxilase (C4H; EC: 1.11.13.11), hidroxicinamoil CoA: shiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase (HCT; EC: 2.3.1-), cafeoil-CoA O-metiltransferase (CCoAOMT; EC 2.1.1.104) e ferulato 5-hidroxilase (F5H; EC 1.14.13). Os primers foram desenhados utilizando-se o programa Primer3Plus (Rozen e Skaletsky, 1999) e a eficiência foi determinada pela curva de eficiência, que ficou entre 90% e 110%. A amplificações foram feitas por qPCR, utilizando-se o aparelho Step One (Applied Biosystems) em um volume final de 10 µL, sendo 5 µl de “QuantiFastTM SYBR Green – PCR Mix” (Qiagen), 0,4 µM (concentração final) de cada um dos primers (forward e reverse), 3 µL
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de cDNA e 1,6 µL de água milliQ autoclavada. As condições de termociclagem tiveram um passo inicial de 95°C por 3 min, seguidos por 40 ciclos de 95°C por 10 s, 60°C por 30 s. As reações foram feitas em triplicatas biológicas, e para cada réplica biológica foram feitas triplicatas técnicas. O método de 2-∆Ct de Livak e Schmittgen (2001) foi utilizado para a determinação dos níveis de expressão, sendo a expressão relativa do gene alvo calculada com base na expressão de um gene normalizador, no caso isocitrato desidrogenase (IDH), conforme sugerido em eucalipto por Moura et al. (2012).
Tabela 1. Sequências dos primers para os genes diferencialmente expressos – Sequência 5´3´.
* Anotação referente ao genoma de E. grandis (Myburg et al., 2014); ** Anotação baseando-se em Carocha et al. (2015).
Gene ID* Anotação** Forward Reverse
EUGRSUZ_C03570 EgrPAL2 CATGTCAGAAGATGGCTTGC GCAGTTTGGGCAATAGAACG
EUGRSUZ_G02848 EgrPAL3 TTTCATGGTCGAGAAACTGC CACCGATGAAGTTCCAAGTC
EUGRSUZ_F03978 EgrHCT4 TGTCAAAGGGTCGACTATGG TCGGTAGAAGTACACGCTTGG
EUGRSUZ_H04650
EgrCCoAMT-like17 AAGCCGGAGTCGATCATAAG AAGTCGTCCTTCTTGGCATC
EUGRSUZ_C00065 EgrC4H2 GGCAGCCACTATTTTGGAAC CACTGGCTTTATAGCGTCTGC
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3.8 Análises Estatísticas
Para estas análises utilizou-se o programa estatístico ASSISTAT (http://www.assistat.com/). Para os dados de crescimento caulinar, trocas gasosas, ligninas, foram utilizadas cinco réplicas biológicas e para clorofila, antocianina e expressão gênica utilizou-se triplicata biológica. Todos os dados obtidos foram submetidos à análise da variância (ANOVA) e teste de Tukey a 5%. Para as análises de expressão foi usado o teste T de Student para avaliar as diferenças entre as espécies em cada temperatura. Para os dados não paramétricos (Fv/Fm) foi utilizado o teste Kruskal-Wallis para comparação de médias.
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4. RESULTADOS
Nas buscas no banco de RNAseq procurou-se identificar genes diferencialmente expressos da biossíntese de celulose, hemicelulose e lignina, sendo identificados apenas genes codificando para enzimas da biossíntese de lignina. Foram elas: fenilalanina amônia-liase (PAL; EC 4.3.1.5), cinamato 4-hidroxilase (C4H; EC: 1.11.13.11), hidroxicinamoil CoA: shiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase (HCT; EC: 2.3.1-), cafeoil-CoA O-metiltransferase (CCoAOMT; EC 2.1.1.104) e ferulato 5-hidroxilase (F5H; EC 1.14.13).
4.1 Estudo Filogenético
Além da comparação por alinhamento das sequências de nucleotídeos identificadas no banco de RNAseq com aquelas do banco de dados disponíveis, fez-se o estudo filogenético usando-se as proteínas traduzidas a partir dessas sequências. Para a construção das árvores filogenéticas foram usadas sequências obtidas em bancos de dados de proteínas não redundantes.
De maneira geral, as árvores filogenéticas analisadas reproduzem o agrupamento das espécies seguindo a classificação segundo o Angiosperm Phylogeny Group (APG III). Dessa forma, observa-se a formação de um clado de enzimas de espécies do grupo das Rosideas (Fabales, Malpighiales, Brassicales e Mytales) e deMonocotiledôneas, representadas por espécies de Poales (Figuras 3 a 7).
Com o estudo filogenético, confirmou-se a anotação automática feita no banco de RNAseq, assim como o alinhamento de nucleotídeos. Foram identificados dois genes codificando para fenilalanina amônia liase (EgrPAL2 e EgrPAL3), um de cinamato 4-hidroxilase (EgrC4H2), um de hidroxicinamoil CoA: shiquimato/quinato hidroxicinamoiltransferase (EgrHCT4), um de cafeoil-CoA O-metiltransferase
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(EgrCCoAOMT-like17) e um de ferulato 5-hidroxilase (EgrF5H1). Os genes EgrPAL2, EgrC4H2 e o EgrCCoAOMT-like17 não agruparam com os genes de Rosidea.
Figura 3 - Árvore filogenética da fenilalanina amônia liase - PAL. Os genes estudados neste trabalho estão destacados em vermelho.
Figura 4 - Árvore filogenética da cinamato 4-hidrolixase – EgrC4H2. O gene estudado neste trabalho está destacado em vermelho.
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Figura 5 - Árvore filogenética da hidroxicinamoil CoA: shiquimato/quinato
hidroxicinamoiltransferase - EgrHCT4. O gene estudado neste trabalho está destacado em vermelho.
Figura 6 - Árvore filogenética da cafeoil-CoA O-metiltransferase – EgrCCoAOMT-like17, e alinhamento da sequência protéica traduzida com outros dois genes de eucalipto identificados
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Figura 7 - Árvore filogenética da ferulato 5-hidroxilase - F5H1. O gene estudado neste trabalho está destacado em vermelho.
4.2 Parâmetros Fisiológicos
Ao final dos diferentes tratamentos térmicos, avaliou-se o crescimento apical do caule, fotossíntese e pigmentos. As medidas de crescimento caulinar mostraram que temperaturas baixas (5oC e 10oC) prejudicaram o crescimento das plantas das duas espécies, mas que na temperatura mais alta (35oC) somente E. globulus teve o crescimento diminuído, o que não foi observado em E. urograndis (Figura 8). As duas espécies tiveram queda de crescimento a 20oC comparativamente a 15oC e 25oC.
Figura 8. Crescimento caulinar apical médio por dia de E. globulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C. As barras verticais mostram o erro padrão das médias de cinco réplicas e as letras as diferenças estatísticas a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey dentro
de cada espécie. S te m g r o w th ( m m .d a y -1 ) E . g l o b u l u s E . u ro g ra n d i s 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 5 º C 1 0 º C 1 5 º C 2 0 º C 2 5 º C 3 0 º C 3 5 º C d b c d b c d c d a b c a a b d c d b c c d b a a
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A eficiência máxima potencial do fotossistema II (Fv/Fm) e a assimilação de CO2 são mostrados nas Figura 9. Percebe-se pelos valores de Fv/Fm que os fotossistemas foram afetados na temperatura de 5oC em ambas espécies, mas de forma mais acentuada em E. urograndis. A 35oC E. globulus mostrou maior tendência à diminuição quando comparado a 30oC. A 5oC a assimilação de CO2 foi drasticamente afetada em E. urograndis, gerando valores negativos (respiração), mas nem tanto em E. globulus (Figura 9B). Já a 35oC a assimilação de CO2 estabilizou em E. urograndis mas diminuiu em E. globulus.
Figura 9. Eficiência quântica potencial do fotossistema II (A) e Taxa de assimilação de CO2 (B) em plantas de E. urograndis e E. globulus nas temperaturas de 5°C a 35°C. As barras
verticais mostram o erro padrão das médias de cinco réplicas e as letras, as diferenças estatísticas a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey em cada espécie. Para os dados de E.
urograndis foram utilizados testes estatísticos não paramétricos.
A figura 10A mostra uma tendência de aumento no teor de clorofila total com o aumento da temperatura. O teor de antocianinas foi claramente mais alto em plantas mantidas
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a 5oC (Figura 10B e 10C). É possível verificar analisando a figura 10C que nas temperaturas mais altas ocorre intenso acúmulo de cera na superfície das folhas de E. globulus tornando-as esbranquiçadas.
Figura 10. Teor de clorofila total (A), antocianina (B) e aspecto visual (C) de plantas de E. glubulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C. As barras verticais mostram o erro
padrão das médias de cinco réplicas e as letras, as diferenças estatísticas a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey em cada espécie.
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4.3 Lignina
De modo geral não houve variação no teor de lignina (Figura 11) havendo a tendência de ser o teor de lignina foi menor em E. globulus do que em E. urograndis a 5oC. Também houve tendência à redução de lignina com o aumento da temperatura em E. globulus.
Nas análises dos oligômeros solúveis de lignina (Tabela 2 e Figura 12) foram identificados um aldeído (sinapil aldeído), um monolignol (S), um dímero e quatro trímeros, sendo que três deles (m/z = 583, 613 e 643) apresentaram esteroisomeria. A Figura 12 mostra que de maneira geral, as diferentes temperaturas não provocaram alterações marcantes no perfil dos oligômeros, mas percebe-se que houve tendência na redução de sinapil aldeído e do trímero S(8-O-4)S(8-5)G com o aumento da temperatura.
Figura 11. Conteúdo de lignina em E globulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C. As barras verticais mostram o erro padrão das médias de cinco réplicas e as letras, as
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Tabela 2. Tempo de retenção e massa (m/z) dos monolignóis, aldeídos e oligômeros identificados nas amostras de E. globulus e E. urograndis submetidas a temperaturas de 5°C a 35°C.
m/z Retention Time (min) Structure
207 3.26 Sinapil aldeído 209 2.75 Sinapil álcool (S) 405 3.2 G(8-O-4)S 583 3.57; 3.66 G(8-O-4)S(8-8)G 613 3.52; 4.34; 3.87 S(8-O-4)S(8-5)G 631 3.65 G(8-O-4)S(8-O-4)S 643 3.82; 4.2 S(8-O-4)S(8-8)S
Figura 12. Frequência de distribuição dos oligômeros (m/z) identificados em plantas de E. globulus e E. urograndis submetidas a temperaturas de 5°C a 35°C. As diferentes intensidades de verde indicaram a frequência de distribuição ou ausência no caso de branco.
De modo geral houve a tendência da relação S/G ser maior em plantas de E. globulus que em E. urograndis, mas sem haver diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos para a primeira espécie. Por outro lado, S/G foi menor em 15°C em E. urograndis, havendo tendência de redução nas temperaturas maiores (Figura 13).
Sinapyl aldehyde Sinapyl alcohols (S) G(8-O-4)S G(8-O-4)S(8-8)G S(8-O-4)S(8-5)G G(8-O-4)S(8-O-4)S S(8-O-4)S(8-8)S 5°C 10°C 15°C 20°C 25°C 30°C 35°C
Sinapyl aldehyde Sinapyl alcohols (S) G(8-O-4)S G(8-O-4)S(8-8)G S(8-O-4)S(8-5)G G(8-O-4)S(8-O-4)S S(8-O-4)S(8-8)S 5°C 10°C 15°C 20°C 25°C 30°C 35°C 0x= 1x= 2x= 3x= E. globulus E. urograndis
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Figura 13. Relação S/G em E. globulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C. As barras verticais mostram o erro padrão das médias de cinco réplicas e as letras, as diferenças
estatísticas a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey em cada espécie.
4.4 Análise da Expressão Gênica
De maneira geral, as diferentes temperaturas provocaram alterações na expressão dos genes selecionados da via de biossíntese de lignina. Entretanto, um gene ou outro mostrou maior ou menor grau de expressão dependendo da espécie e do tratamento. Uma vez que os genes estudados foram escolhidos do banco de RNAseq com base na expressão diferencial em duas temperaturas (12oC e 25oC) e nas espécies E. globulus e E. urograndis, as figuras de expressão são acompanhadas do número de “reads” de cada gene neste banco de dados para comparação.
Para EgrPAL2 (Figura 14A) observou-se aumento da expressão em E. globulus entre 5oC e 15oC, mas havendo redução posterior nas temperaturas mais altas. Por outro lado, a expressão de EgrPAL2 foi maior em E. urograndis a 5oC, diminuindo nas temperaturas mais altas e voltando a aumentar a 35oC. A comparação entre as expressões nas diferentes temperaturas entre as espécies mostra os níveis foram semelhantes entre elas. A comparação do número de “reads” no banco de RNAseq mostra que existe concordância entre as
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temperaturas baixas, ou seja, as duas espécies tiveram expressão semelhante a 10oC e um número de “reads” próximo a 12o
C (Figura 14B). Entretanto, a 25oC o número de “reads” foi mais alto em E. urograndis, os níveis de expressão.
Figura 14. Expressão de EgrPAL2 em E. globulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C (A) e número de “reads” obtidos no banco de RNAseq com as temperaturas de 12°C a
25°C (B). As barras verticais mostram o erro padrão das médias de três réplicas e os asteriscos indicam diferenças significativas com base no teste t (P ≤ 0,05 *; ** p≤0.01) entre
39
Os dados de expressão de EgrPAL3 (Figura 15A) confirmam o que foi observado no ensaio de RNAseq (Figura 15B), onde plantas de E. urograndis apresentaram maior expressão (maior número de reads) em relação a espécie E. globulus para as temperaturas usadas. No ensaio com temperaturas de 5oC a 35oC observou-se que sempre foi muito maior em E. globulus. Na menor temperatura a expressão foi menor, aumentando até 20oC, mas curiosamente reduzindo em 25oC e depois aumentando de novo. Em E. globulus a expressão foi praticamente ausente na menor temperatura aumentando e se mantendo praticamente estável nas outras temperaturas.
Figura 15. Expressão de EgrPAL3 em E. globulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C (A) e número de “reads” obtidos no banco de RNAseq com as temperaturas de 12°C a
25°C (B). As barras verticais mostram o erro padrão das médias de três réplicas e os asteriscos indicam diferenças significativas com base no teste t (P ≤ 0,05 *; ** p≤0.01) entre
40
O padrão de expressão de EgrC4H2 foi bastante semelhante nas duas espécies, sendo menor a 5oC e aumentando entre 10oC e 20oC, e depois reduzindo em temperaturas mais altas. (Figura 16A). Os dados de expressão concordam de certa forma com os dados do RNAseq (Figura 16B), onde se verifica que a 12oC E. urograndis tinham maior número de “reads” que E. globulus e depois diminuindo a 25oC. Porém, a 12oC a quantidade de “reads” em E. globulus foi menor que a 25oC, o que não é coincidente com as temperaturas de 10oC a 25oC nos ensaios de expressão.
Figura 16. Expressão de EgrC4H2 em E. globulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C (A) e número de “reads” obtidos no banco de RNAseq com as temperaturas de 12°C a
25°C (B). As barras verticais mostram o erro padrão das médias de três réplicas e os asteriscos indicam diferenças significativas com base no teste t (P ≤ 0,05 *; ** p≤0.01) entre
as espécies para cada temperatura.
Os dados de expressão de EgrHCT4 mostram um padrão bastante semelhante entre as duas espécies, com aumento entre 5oC e 10oC e depois diminuindo à medida que a
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temperatura aumentou. Em todas as temperaturas a expressão foi maior em E. globulus (Figura 17A). Os dados de RNAseq e de expressão são coincidentes no sentido de que mais “reads” foram encontrados em E. globulus, porém, mas sem mostrar que há queda de expressão (número de “reads”) quando se compara as temperaturas de 12o
C a 25oC (Figura 17B).
Figura 17. Expressão de EgrHCT4 em E. globulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C (A) e número de “reads” obtidos no banco de RNAseq com as temperaturas de 12°C a
25°C (B). As barras verticais mostram o erro padrão das médias de três réplicas e os asteriscos indicam diferenças significativas com base no teste t (P ≤ 0,05 *; ** p≤0.01) entre
as espécies para cada temperatura.
A expressão de EgrCCoAMT-like17 também teve padrão semelhante entre as duas espécies, com aumento entre 5oC e 10oC e depois diminuindo à medida que a temperatura aumentou (Figura 18A). Entretanto, enquanto que o pico de expressão acontece a 15℃ em E. globulus, em E. urograndis ocorreu em 10oC e também em 20oC. Os dados do banco de RNAseq são concordantes com os de expressão se levado em conta que E. globulus teve
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maior número de “reads” que E. urograndis, mas não quando comparadas as temperaturas. Ou seja, no RNAseq, o número de “reads” foi maior a 12o
C que 25oC em E. globulus, mas o contrário em E. urograndis (Figura 18B).
Figura 18. Expressão de EgrCCoAMT-like17 em E. globulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C (A) e número de “reads” obtidos no banco de RNAseq com as temperaturas de
12°C a 25°C (B). As barras verticais mostram o erro padrão das médias de três réplicas e os asteriscos indicam diferenças significativas com base no teste t (P ≤ 0,05 *; ** p≤0.01) entre
as espécies para cada temperatura.
Exceto para a temperatura de 5oC, quando a expressão foi semelhante para as duas espécies, e a 15oC, quando a expressão em E. globulus foi maior do que em E. urograndis, notou-se a clara tendência de que a expressão de EgrF5H1 foi maior na segunda espécie (Figura 19A). A comparação entre o número de “reads” obtidos do banco de RNAseq com os
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dados de expressão são plenamente concordantes, ou seja, E. urograndis mostrou maiores valores e de certa forma foram semelhantes entre 10oC/12oC e 25oC/25oC.
Figura 19. Expressão de EgrF5H1 em E. globulus e E. urograndis nas temperaturas de 5°C a 35°C (A) e número de “reads” obtidos no banco de RNAseq com as temperaturas de 12°C a
25°C (B). As barras verticais mostram o erro padrão das médias de três réplicas e os asteriscos indicam diferenças significativas com base no teste t (P ≤ 0,05 *; ** p≤0.01) entre
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5. DISCUSSÃO
Identificação dos genes diferencialmente expressos
Inicialmente este trabalho visava estudar a expressão de qualquer gene que estivesse relacionado com a biossíntese de componentes estruturais da parede celular, ou seja, celulose, lignina, hemicelulose e pectina. Entretanto, o trabalho foi conduzido apenas para genes relacionados com a biossíntese de lignina, uma vez que as buscas no banco de RNAseq não mostraram diferenças de expressão para os demais genes de parede celular.
A construção das árvores filogenéticas foi de suma importância para a identificação das sequências, sendo as mesmas inseridas no clado das Rosideas, onde ocorre a família Myrtaceae, à qual pertence o eucalipto. Na sequência do seu posicionamento na via de biossíntese de lignina, foram identificados dois genes para a enzima PAL, e um gene para as enzimas C4H, HCT, CCOAOMT e F5H (ver figura 2). A identificação desses genes seguiu a nomenclatura da anotação do genoma E. grandis (Carocha et al., 2015). A identificação dos genes em E. grandis por Carocha et al. (2015) foi feita por estudos com clados “bona fide” deduzidos de genes que tinham sido funcionalmente caracterizados em outras espécies.
Para a enzima PAL foram identificados os genes, EgrPAL2 e EgrPAL3, entre os 9 identificados recentemente em E. grandis (Carocha et al., 2015). Esta enzima catalisa a primeira reação da via de biossíntese de lignina, desaminando o aminoácido fenilalanina para ácido trans-cinâmico (Figura 2). Tal qual observado por Carocha et al. (2015), EgrPAL2 ficou distante das outras enzimas agrupadas em dois clados, de Rosidae e Monocotiledôneas, sendo portanto claramente divergente das outras proteínas. EgrPAL2 apresenta apenas 57–61% de identidade na sua sequência de aminoácidos com as outras oito PALs identificadas sendo mais próxima de gimnospermas. Carocha et al. (2015) estudaram a expressão desses 9 genes em vários tecidos de E. grandis e concluíram que de acordo com o padrão de expressão
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provavelmente apenas duas estariam relacionadas à biossíntese de lignina, sendo EgrPAL3 e EgrPAL9. EgrPAL2 era bastante expresso em flores e folhas novas, tendo fraca expressão no xilema. EgrPAL9 foi o gene mais expresso, porém, apesar de ser detectada sua expressão no xilema, não era tão específico a este tecido. EgrPAL3 por outro lado, era bastante específico ao xilema e provavelmente o gene que deu origem aos genes EgrPAL4, 5, 6 e 7, cujas proteínas apresentam entre 97 a 99% de identidade. Assim, identificou-se em nossa busca o gene EgrPAL3 que codifica a enzima PAL mais específica ao processo de lignificação.
O ácido trans-cinâmico formado por ação da PAL é hidroxilado a ácido 4-hidroxi-cinâmico (ácido p-coumárico) pela enzima C4H, que é uma citocromo P450 pertencente à família CYP73A, que pode ser subdividida em duas classes, I e II (Alber e Ehlting, 2012). Os membros da classe I tem sequências bastante conservadas, com proteínas de alta similaridade e que se mantém na maior parte das espécies estudadas, sendo o contrário observado naquelas da classe II, na qual as sequências são mais divergentes. Este importante aspecto evolutivo tem levado a se pensar que esta similaridade na classe I estaria ligada a função essencial, como é o caso da lignina em plantas (Alber e Ehlting, 2012). Por outro lado, sugere-se que C4Hs da classe II poderiam estar relacionadas a diferentes funções além da lignificação, atuando em resposta a estresses (Carocha et al., 2015). Isto, no entanto, também é válido para um gene de C4H isolado de Hibiscus cannabinus que foi responsivo a estresses por dano mecânico, ácido salicílico, NaCl, frio, H2O2 e ácido abscísico (Kim et al., 2013). O fato é que a C4H participa em vários outros pontos do metabolismo dos fenilpropanóides, produzindo uma série de substâncias, sendo que várias delas têm sua produção estimulada por uma série de estresses bióticos e abióticos, tais como patógenos, dano mecânico, UV, deficiência de nutrientes e seca entre outros (Dixon et al., 2002; Ehlting et al., 2006; Vogt, 2010).
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No genoma de E. grandis foram encontrados dois genes codificando para C4H, EgrC4H1 e EgrC4H2, que apresentaram 61% de identidade, sendo que o primeiro teve homologia com sequências pertencentes à classe I (Carocha et al., 2015). Os dois genes foram preferencialmente expressos no xilema, mas EgrC4H1 teve expressão 12 vezes maior que EgrC4H2. Apesar de não excluir EgrC4H2 como participante no processo de lignificação, os autores consideraram que EgrC4H1 seria o gene mais atuante na lignificação em eucalipto.
O gene identificado aqui como diferencialmente expresso foi EgrC4H2. Uma vez que as plantas de E. globulus e E. urograndis usadas para se fazer o RNAseq foram estressadas com temperatura (12oC e 25oC – controle) há certa coerência na identificação desse gene, uma vez que sua expressão tem sido associada a estresses (Carocha et al., 2015).
HCT catalisa a conversão de p-coumaril-CoA e cafeoil-CoA para seus correspondentes ésteres de shikimato ou quinato, sendo as reações reversíveis (Figura 1). Em E. grandis foram encontrados cinco genes codificando HCT. EgrHCT1 a 3 são expressos preferencialmente em folhas, sendo que as expressões de EgrHCT4 e 5 foram altas e específicas ao xilema (Carocha et al., 2015). Entretanto, entre as duas, a maior expressão foi da EgrHCT5 que se mostrou divergente das outras quatro HCTs, com 66–69% de identidade na sequência de aminoácidos. EgrHCT4 e EgrHCT5 foram consideradas relacionadas à biossíntese de lignina em eucalipto (Carocha et al., 2015). No banco de RNAseq a sequência encontrada com expressão diferencial foi a EgrHCT4.
CCoAOMT faz a metilação de cafeoil CoA para gerar feruloil CoA (Figura 2). Carocha et al. (2015) encontraram dois genes dessa metiltransferase em eucalipto, sendo que ambas mostraram forte expressão e preferencial no xilema. EgrCCoAOMT2 teve o dobro de expressão que EgrCCoAOMT1 e ambas foram consideradas como participantes da biossíntese de lignina em eucalipto. No presente trabalho o gene diferencialmente expresso no banco de
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RNAseq foi identificado seguindo a anotação de Carocha et al. (2015) como sendo EgrCCoAOMT-like17. No total, foram identificados 15 genes “like” para CCoAOMT. O alinhamento das sequências traduzidas de aminoácidos mostra que as proteínas são divergentes sendo que a identidade de aminoácidos de EgrCCoAOMT-like17 com os dois genes identificados EgrCCoAOMT1 e 2 foi de 50% e 49%, respectivamente. Uma vez que este gene foi considerado como “like” sua expressão não foi analisada por Carocha et al. (2015), não podendo ser inferida sua função em relação à biossíntese de lignina.
F5H também pertence à superfamília das citocromo P450, família CYP84A, e está no final da rota de biossíntese de lignina, na ramificação que forma álcool sinapil, que gerará a unidade S (Figura 2). F5H hidroxila coniferaldeído e álcool coniferil a 5-hidroxiconiferaldeído e álcool 5-hidroxiconiferil, respectivamente. E. grandis possui dois genes codificando para F5H, EgrF5H1 e EgrF5H2, sendo que ambas possuem 84% de similaridade na sequência de aminoácidos e a primeira tem alta e preferencial expressão no xilema. EgrF5H2 tem baixa expressão praticamente restrita a raízes. O gene diferencialmente expresso e identificado na biblioteca de RNAseq foi o EgrF5H1, que tem alta similaridade (99,6%) com o gene de E. globulus (García et al., 2014).
Portanto, de modo geral os genes identificados aqui se relacionam com a biossíntese de lignina, sendo exceções EgrPAL2 e CCoAMT-like17.
Avaliações fisiológicas e bioquímicas
Com o intuito de verificar se as temperaturas impostas alteraram as condições fisiológicas das plantas, foram feitas algumas medidas de crescimento, fotossíntese e pigmentos. De modo geral o que se observou é que temperaturas mais baixas diminuíram
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todos esses parâmetros. Em algumas medidas (crescimento do caule, fotossíntese) notou-se que houve diminuição na temperatura mais alta, de 35oC, em E. globulus. Também foi observado que a fotossíntese em E. urograndis foi mais afetada a 5oC, sendo negativa (respiração maior que assimilação de CO2). Da mesma forma, a eficiência quântica potencial do fotossistema II foi menor nesta espécie, mostrando que este fotossistema foi de alguma forma danificado neste tratamento. A relação verifica a quantidade máxima de energia que pode ser utilizada pelo fotossistema. Desta forma, aparentemente a menor temperatura testada afetou mais E. urograndis que E. globulus.
Nas duas espécies notou-se que houve grande redução do teor de clorofila e acúmulo de antocianinas nas folhas na menor temperatura. Temperaturas baixas ou altas podem reduzir a biossíntese de clorofila (Tewari e Tripathy, 1998). Plantas de milho crescidas em baixa temperatura apresentaram redução no acúmulo de clorofila e houve desenvolvimento anormal dos tilacoides (Hodgins e Van Huystee, 1986; Van Hasselt e Strikwerda, 1976). Guo et al. (2006) observaram degradação da clorofila em citrus exposto a alta temperatura, ocasionado pelo aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS).
Antocianinas são pigmentos pertencentes ao grupo dos flavonóides e podem ser acumuladas sob condições de estresse bióticos e abióticos, tais como frio (Bilger et al., 2007; Schulz et al., 2015). Schulz et al. (2015) observam em Arabidopsis que frio induzia o aumento na biossíntese de flavonoides, incluindo antocianina, e uma forte correlação com a transcrição de genes da via de biossíntese destes compostos (flavonóides). Temperaturas mais baixas podem levar as plantas a redução da capacidade fotossintética, aumentando a probabilidade de excesso de excitação nos fotossístemas II (Ottander et al., 1993) e liberação de energia, causando a formação de radicais óxidos deletérios (Apel e Hirt, 2004). Assim, o acúmulo de antocianina pode conferir à planta proteção contra fotoinibição causada pelo excesso de
