LAURA ALONSO
Caracterização do complexo proteico da RBP CAPRIN-1
Campinas 2015
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Gustavo Lebre de Marco - CRB 8/7977
Alonso, Laura,
AL72c AloCaracterização do complexo proteico da RBP CAPRIN-1 / Laura Alonso. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
AloOrientador: Katlin Brauer Massirer.
AloDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Alo1. Grânulos citoplasmáticos. 2. Proteínas de ligação a RNA. 3. Proteína CAPRIN1 humana. I. Massirer, Katlin Brauer. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Characterization of the protein complex of the RBP CAPRIN-1 Palavras-chave em inglês:
Cytoplasmic granules RNA-binding proteins CAPRIN1 protein, human
Área de concentração: Genética Animal e Evolução Titulação: Mestra em Genética e Biologia Molecular Banca examinadora:
Katlin Brauer Massirer [Orientador] Daniel Martins de Souza
Cláudia Vianna Maurer Morelli
Data de defesa: 25-06-2015
Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
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1 Resumo
Proteínas de ligação à RNA (RNA-Binding Proteins RBPs) fazem parte de complexos proteicos a fim de guiar o metabolismo de mRNAs e exercerem regulação de eventos pós-transcricionais como localização de mRNA e tradução. CAPRIN1 é uma RBP citoplasmática capaz de induzir grânulos de estresse citoplasmáticos e está presente em complexos dendríticos com função de transporte para tradução localizada. Para tentar elucidar a função molecular de CAPRIN1 em grânulos citoplasmáticos, foi caracterizado o complexo proteico atuante com CAPRIN1. A fim de identificar os interagentes no complexo, primeiramente foi superexpressa a proteína de fusão FLAG-CAPRIN1 em células humanas HEK293T, posteriormente CAPRIN1 foi imunoprecipitada com anticorpo anti-FLAG e seus interagentes foram analisados por espectrometria de massas. Esta técnica identificou 62 proteínas co-precipitadas, das quais, 63% (36) são RBPs com função enriquecida em processamento de mRNA e regulação de estabilização de mRNA. Como uma das funções sugeridas para grânulos de estresse é a triagem de mRNAs para estabilização e degradação por grânulos de degradação (P-bodies), escolhemos 9 interações com proteínas com função em regulação de estabilização para avaliarmos as interações. A interação com IGF2BP1 e PABPC1, foram confirmadas por co-imunoprecipitação, e IGF2BP1 interage com CAPRIN1 de modo dependente de RNA. Juntos, estes resultados indicam que CAPRIN1 realiza importante função em estabilização de mRNAs-alvo.
2 Abstract
RNA binding proteins (RBPs) can be part of large protein complexes and they function by guiding mRNA metabolism and by regulating post-transcriptional events such as mRNA localization and translation. CAPRIN1 is a cytoplasmatic RBP capable of inducing cytoplasmic stress granules and present in dendritic complexes for localized translation. In order to understand the molecular role of CAPRIN1 in cytoplasmic granules we characterized its protein complex. To identify the partners in the complex, we first overexpressed FLAG-CAPRIN1 in human HEK293T cells, then immunoprecipitated CAPRIN1 with a anti-FLAG antibody and assayed protein interactors with mass spectrometry. This approach identified 62 co-precipitated proteins, of which 63% (36) are RBPs with an enriched function in mRNA processing and regulation of mRNA stability. As one of the suggested functions of stress granules is mRNAs triage for stabilization or degradation by cellular P-bodies, we have chosen 9 interactors with function in regulating stability for binding evaluation. The interaction with IGF2BP1 and PABPC1, were confirmed by co-immunoprecipitation, and IGF2BP1 interacts with CAPRIN1 in a RNA-dependent manner. Taken together, these results indicate that CAPRIN1 functions importantly in mRNA stabilization.
Índice Geral
1 Resumo ... vii
2 Abstract ... ix
DEDICATÓRIA ... xv
AGRADECIMENTOS ... xvii
3 ABREVIATURAS E SIGLAS ... xxiii
4 Introdução ... 1
4.1 Proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins – RBPs) ... 1
4.2 Perfil de Expressão e fenótipos relacionados a RBP CAPRIN1 ... 2
4.3 Funções propostas para CAPRIN1 ... 3
4.4 CAPRIN1 e a formação de grânulos citoplasmáticos de RNA ... 5
5 Objetivos ... 7
5.1 Objetivo Geral ... 7
5.2 Objetivos específicos ... 7
6 Métodos ... 8
6.1 Condições de cultivo de células HEK293T ... 8
6.2 Teste de eficiência de transfecção ... 9
6.3 Clonagem da ORF correspondente a proteína CAPRIN1 ... 10
6.4 Obtenção do cDNA referente a proteína CAPRIN1 ... 10
6.4.1 Extração de RNA ... 10
6.4.2 Transcrição reversa (RT) ... 10
6.4.4 Purificação do gel ... 12
6.4.5 Digestão do produto de PCR para clonagem ... 12
6.5 Preparação do plasmídeo ... 13
6.5.1 Digestão do plasmídeo para clonagem e purificação ... 13
6.5.2 Ligação do inserto ao vetor ... 13
6.5.3 Transformação em bactéria DH5-‐alpha ... 14
6.5.4 PCR de colônia para verificação da presença de inserto ... 14
6.5.5 Purificação dos plasmídeos (miniprep) ... 14
6.5.6 Sequenciamento ... 15
6.6 Superexpressão da proteína teste GFP e avaliação de eficiência de transfecção. ... 15
6.6.1 Padronização de Transfecção e Eficiência de Transfecção ... 15
6.6.2 Extração de proteínas ... 16
6.6.3 Quantificação das proteínas ... 16
6.6.4 Western Blot ... 16
6.7 Imunoprecipitação com proteína teste GFP ... 17
6.8 Avaliação da localização da proteína CAPRIN1 em comparação a GFP ... 18
6.8.1 Transfecção ... 18
6.8.2 Imunofluorescência ... 19
6.9 Superexpressão da proteína CAPRIN1 e avaliação de eficiência de transfecção ... 19
6.9.1 Transfecção ... 19
6.9.2 Extração de proteínas ... 20
6.10 Imunoprecipitação da proteína CAPRIN1 para análise por espectrometria de massas ... 20
6.11 Preparação de Amostras Para Espectrometria de massas ... 21
6.11.1 Digestão proteica ... 21
6.11.3 Espectrometria de massas ... 22
6.12 Validação e caracterização de interações proteicas ... 22
6.12.1 Co-‐imunoprecipitação da proteína CAPRIN1 superexpressa ... 23
6.12.2 Co-‐Imunoprecipitação de proteínas endógenas e tratamento com RNase ... 23
7 Resultados e Discussão ... 25
7.1 Avaliações celulares, preliminares a superexpressão da proteína CAPRIN1 ... 25
7.2 Clonagem da ORF correspondente a proteína CAPRIN1 ... 29
7.3 Avaliação da superexpressão das proteínas GFP e CAPRIN1 ... 34
7.4 Avaliação da localização celular da proteína CAPRIN1 em comparação a GFP ... 36
7.5 Imunoprecipitação com proteína teste GFP ... 38
7.6 Imunoprecipitação da proteína CAPRIN1 ... 39
7.6.1 Transfecção ... 39
7.6.2 Imunoprecipitação ... 39
7.7 Espectrometria de massas ... 41
7.8 Validação e caracterização de interações proteicas ... 45
8 Conclusões e Perspectivas. ... 50
9 Referências Bibliográficas ... 51
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha família:
Minha mãe Mafisa Vaz por todas as conversas, pelas noites mal-dormidas, pelas preocupações e por me ajudar a ser e entender o que sou.
Meu pai José Rubens Alonso pelos valiosos conselhos, pelo incentivo, por sempre me fazer ser uma pessoa melhor e por entender a minha ausência.
Meu irmão Marcelo Augusto Vaz Alonso por todo o companheirismo, amizade incondicional, pelo carinho e incentivo.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha família pelo incentivo e carinho
Aos meus amigos que me ampararam em momentos de dificuldade
A minha orientadora Dra. Katlin B. Massirer pela oportunidade, pela paciência e por me guiar e acreditar em mim
Ao Dr. Mario Bengston por todas as conversar inspiradoras e pela sua ajuda em momentos críticos
Aos professores e colegas do grupo Network, por todas as dicas e ajudas no decorrer do trabalho
Aos colegas de laboratório, em especial a Natacha A. Migita, Felipe E. Ciamponi e Michael T. Lovci, que participaram diretamente deste trabalho
A Dra Adriana Franco Paes Leme, Bianca Alves Pauletti, Romênia Ramos Domingues e Sami Yokoo do LnBio, pela espectrometria de massas e ajuda nos protocolos
Índice De Figuras
Figura 1. Expressão gênica nos diferentes tecidos. ... 3
Figura 2. Representação esquemática dos domínios de CAPRIN1 ... 4
Figura 3. Ligação prefencial de CAPRIN1 a regiões 3’UTR de mRNAs-alvo por experimento de CLIP-seq ... 5
Figura 4. Primers usados para clonagem ... 12
Figura 5. Curva de crescimento das células HEK293T em cultura demostrando dobramento em 24h 26
Figura 6. Eficiência de transfecção avaliada por FACS ... 28
Figura 7. Amostras de RNA íntegras. ... 29
Figura 8. Produto de PCR correspondente ao cDNA de CAPRIN1 ... 30
Figura 9. Plasmídeo pcDNA 3.1(+)-FLAG e inserto cDNA CAPRIN1 digeridos para clonagem 30
Figura 10. Inserto e plasmídeo purificados, utilizados para a ligação ... 31
Figura 11. Triagem por PCR de colônia para fragmento de CAPRIN1 ... 32
Figura 12. Alinhamento das sequências de CAPRIN1 obtidas contra o banco de dados de sequências humanas UCSC ... 33
Figura 13. Eletroferograma de duas das reads confirmando sequenciamento de CAPRIN1 33
Figura 14. Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-GFP em células HEK293T 35
Figura 15. Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-CAPRIN1 em células HEK293T 36
Figura 16. CAPRIN1 está localizada no citoplasma celular e apresenta padrão granular. 37
Figura 17. Verificação da Imunoprecipitação de FLAG-GFP por gel corado com prata.38
Figura 18. Gel de prata demonstrando a complexidade da amostra de IP de CAPRIN1 40
Figura 19. Confirmação de imunoprecipitação de CAPRIN1 e GFP, utilizando-se anticorpo anti-FLAG ... 41
Figura 20. Enriquecimento da amostra em funções de ligação ... 43
Figura 21. Proteínas de ligação à RNA representam 63,2% da amostra. ... 43
Figura 22. Proteínas envolvidas em processamento de RNA estão enriquecidas na amostra . 45
Figura 23. Teste de anticorpos adiquiridos ... 47
Figura 24. PaBPC1 e IGF2BP1 co-precipitam com CAPRIN1 ... 48
Índice De Tabelas
Tabela 1. Amostras de co-imunoprecipitação. ... 24
Tabela 2. Contagem de células HEK293T para determinação do tempo de dobramento 26
Tabela 3. Teste de quantidades crescentes de lipofectamina para transfecção em células HEK293T ... 27
Tabela 4. Eficiência de transfecção nas condições do experimento de imunoprecipitação 39
Tabela 5. Interagentes de CAPRIN1 identificados por espectrometria de massas ... 42
4 ABREVIATURAS E SIGLAS
RBP proteínas de ligação à RNA (no inglês RNA Binding Protein)
‘ minutos
“ segundos
TA temperatura ambiente
pb pares de bases nitrogenadas
KDa Kilo Daltons
ORF Open Reading Frame
5 Introdução
5.1 Proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins – RBPs)
Durante a etapa de transcrição gênica os fatores de transcrição estão presentes nas células como complexos proteicos que reconhecem regiões selecionadas do DNA, envolvendo-o fisicamente. Enquanto isso, etapas de regulação pós-transcricional são reguladas principalmente por proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins - RBPs) e esta é a principal forma de regulação de expressão de genes durante o desenvolvimento1. As RBPs de maneira geral fazem parte de complexos proteicos que se ligam aos RNAs mensageiros precursores (pré-mRNAs) no núcleo e atuam nas etapas subsequentes de processamento de RNA como splicing de regiões intrônicas e splicing alternativo de exons. Outros eventos são predominantemente citoplasmáticos como estabilização de RNAs mensageiros (mRNAs) transcritos e a função de guias para a regulação gênica por RNAs curtos não-codificantes, como microRNAs2–4.
As RBPs exercem funções diversas de acordo com a presença de diversos domínios proteicos para o reconhecimento, ligação e regulação de RNA, como o RRM (RNA Recognition Motif), o RGG Box, DEAD/DEAH box, entre outros1. As RBPs podem atuar de maneira dependente ou independentemente de complexos proteicos como spliceosomo ou complexo de poliadenilação.
Na última década várias descobertas relacionaram falhas no mecanismo de regulação por RPBs à doenças como Parkinson (proteína FAF1)5, autismo (proteína FOX1)6, síndrome do cromossomo X frágil (proteína FMR1)7, esclerose lateral amiotrófica (proteína TDP43)8, leucemia mielóide aguda, Alzheimer (proteína Musashi)8,9 e distrofia muscular miotônica (muscleblind-like protein)10. Fato este, relacionado a importância de muitas RBPs no
desenvolvimento de tecidos somáticos, bem como com a capacidade de uma única RBP regular muitos alvos, sendo assim, fenótipos mutantes podem apresentar falhas na regulação de vários mRNAs1.
Além do envolvimento com doenças, RPBs estão relacionadas ao processo de manutenção da pluripotência celular e da diferenciação em neurônios e outras células, podendo fazer parte de coqueteis de fatores essenciais nos protocolos de reprogramação em células tronco pluripotentes induzidas, como no caso da RPB LIN-28 que é atualmente reconhecida como uma das proteínas-chave na manutenção da pluripotência celular11,12
A partir de um banco de dados de aproximadamente 1200 RBPs, montado e anotado em nosso laboratório estamos definindo um grupo de RBPs que tenham evidência de relação com processos neuronais de regulação de RNA. Neste banco, um subgrupo de interesse para nosso laboratório são proteínas relacionadas ao armazenamanento de RNA e recrutamento rápido de RNA citoplasmáticos. Uma dessas proteínas, com função ainda pouco conhecida na formação de grânulos citoplasmáticos de RNA é a CAPRIN1 (cytoplasmic activation/proliferation-associated protein-1), a qual está sendo estudada nesse projeto.
5.2 Perfil de Expressão e fenótipos relacionados a RBP CAPRIN1
CAPRIN1 é uma proteína citoplasmática altamente expressa em tecidos com alta taxa de proliferação celular, sua expressão também está relacionada a alguns tipos de câncer, como o melanoma, câncer de mama e osteossarcoma13–15. A exceção para este perfil é a alta expressão em tecidos nervosos (Figura 1) que sabidamente apresenta baixa taxa de proliferação celular. Em neurônios, CAPRIN1 se localiza em grânulos citoplasmáticos, onde interage com outras proteínas para transportar mRNAs-alvo do soma para os dendritos para que seja realizada a tradução localizada16–18.
Figura 1. Expressão gênica nos diferentes tecidos. A expressão de CAPRIN1 é elevada
em tecidos com maior proliferação celular e em tecidos nervosos (www.genecards.org).
É sabido que o knockout de CAPRIN1 em camundongos é letal em 20 minutos após o nascimento em decorrência de falhas respiratórias. O knockdown por sua vez, compromete o desenvolvimento normal em camundongos, que apresentam corpo e órgãos menores em comparação com o controle, além de ser observado em cultura primária, neurônios com dendritos menos desenvolvidos e em menor quantidade17. Outra consequência do knockdown relacionada aos tecidos nervosos é a menor localização de mRNAs-alvo de CAPRIN1 nos dendritos, estes alvos ficam retidos no soma e a tradução localizada é prejudicada17.
A superexpressão de CAPRIN1 por outro lado, induz a formação de grânulos de estresse no citoplasma celular19. A indução de grânulos de estresse a partir da superexpressão desta proteína indica importante função na regulação dos alvos recrutados para este tipo de grânulo, função esta, ainda não elucidada.
5.3 Funções propostas para CAPRIN1
A proteína CAPRIN1 apresenta um domínio coiled-coil (Figura 2) relacionado, em geral, à regulação de transcrição. Apresenta ainda tags de sinalização para localização nuclear (NLS)
e exportação nuclear (NES), essenciais para a locomoção para dentro e fora do núcleo, o que se relaciona com o transporte de mRNAs e regulação de eventos pós-transcricionais16,19–21. O RGG motif em seu carboxy-terminal é uma estrutura típica de RBPs que consiste em uma região rica em repetições de arginina e glicina e age como mediador de ligação à estruturas secundárias de seus mRNAs-alvo22. Esta estrutura, juntamente com o coiled-coil em seu N-terminal, parece ser essencial para a fosforilação de eIF-2α, o que desencadeia a formação de grânulos citoplasmáticos de estresse16,19.
Figura 2. Representação esquemática dos domínios de CAPRIN1. CAPRIN1 apresenta um
domíCoiled-coil, domínio envolvido com regulação trascricional, um Nuclear Localization signal (NLS), um Nuclear export signal (NES), tags de sinalização de entrada e saída do núcleo e regiões ricas nos aminoácidos E, Q R e G (E-rich, Q-rich e RGG), típicas de RBPs.
A partir das regiões ricas em arginina e glicina e do RGG motif presentes em sua estrutura, CAPRIN1 exerce regulação pós transcricional se ligando aos mRNAs-alvo. Experimentos de ligação em larga escala realizados por Baltz e colaboradores23 e analisado por nosso grupo, evidenciaram a ligação preferencial de CAPRIN1 à regiões codificantes de mRNAs e 3’UTR (Figura 3), o que indica função no controle de estabilização de RNA e transporte24. O mesmo
set experimental mostrou preferência menor de ligação a íntrons, indicando que CAPRIN1 estaria pouco relacionada a regulação de splicing alternativo23.
Figura 3. Ligação prefencial de CAPRIN1 a regiões 3’UTR de mRNAs-alvo por experimento de CLIP-seq. Analises de mapeamento de sítios de ligação evidenciam a
ligação preferencial de CAPRIN1 a regiões 3’ não codificantes, sugerindo função na estabilização de seus alvos2 3. A baixa preferência a regiões intrônicas sugere pouca ou nenhuma função em splicing alternativo.
O experimento mostrou ainda, que CAPRIN1 se liga preferencialmente a estruturas G-quadruplex de seus alvos. Esta estrutura é formada por repetições de quatro guaninas e está enriquecida nas regiões 5’UTR e 3’UTR participando de diversas etapas no metabolismo de RNAs25. Em 3’UTR, foi demonstrado que a ligação de proteínas à G-quadruplex está relacionada ao transporte de genes repórter em neurônios através da formação de grânulos citoplasmáticos26.
5.4 CAPRIN1 e a formação de grânulos citoplasmáticos de RNA
CAPRIN1 está relacionada à formação de dois tipos de grânulos. Um deles é responsável pelo transporte de alguns mRNAs do soma de neurônios para os dendritos para que ocorra a tradução localizada de proteínas com necessidade de mobilização rápida27. Neste cenário, Shiina e colaboradores caracterizaram a ligação da proteína à região 3’UTR de alguns de seus mRNAs-alvo, tais como synapsin1, FXYD1 e FXYD6, por meio de genes repórter.
3’UTR Distal Intron 5' UTR Proximal Intron Genomic Content (pre-mRNA) (mRNA) Transcriptome Content CDS 5’UTR Proximal intron 3' UTR 5' UTR CDS Exonic Content 3' UTR CDS Distal Intron 5' UTR Proximal Intron Clusters' Content (pre-mRNA) (mRNA) Transcriptome Content 5’ UTR (pre-mRNA) (mRNA) Transcriptome Content
Outro tipo de grânulo são os chamados grânulos de estresse (SG). Esses grânulos são normalmente formados durante situações de estresse celular comochoque térmico, exposição à luz ultra violeta e tratamento com arsenito 28,29, porém podem também ocorrer por meio da superexpressão de algumas proteínas de ligação a RNA, como CAPRIN1, que desencadeiam a fosforilação de eIF2α por meio de kinases como PERK, HRI, GCN2, PKR e Z-DNA
kinase19,30–33. Com a fosforilação de eIF2α, a viabilidade do complexo eIF2α-GTP-tRNA i MET
fica reduzida e a maquinaria de iniciação traducional é bloqueada32. Algumas RBPs e RNAs específicos são recrutados para os grânulos por meio de microtúbulos, porém, sabe-se que estes componentes não são constantes, podendo ainda haver diferenças de acordo com tipo de estresse e tipo de células33. Em neurônios, foram observados componentes essenciais para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas como a proteína TDP43 e Fus, fatores relacionados com a esclerose lateral amiotrófica (ALS)8,33–35, assim como a proteína FMRP, associada a síndrome do X frágil36. Há proteínas específicas deste tipo de grânulo, mas há outras que são compartilhadas com os P-bodies (processing bodies), responsáveis pela degradação de RNAs30. Dentre estas, estão proteínas como XRN1, DHH1 e TTP29,33,37, o que indica que componentes específicos parecem exercer funções específicas nos grânulos de estrese. A relação com os P-bodies, é um indício de que os SGs são formados para realizar a triagem de mRNAs específicos. Não há, porém, um consenso quanto a função destes grânulos, quanto ao conjunto de seus mRNAs-alvo e de seus componentes nestas situações. Sendo assim, a elucidação da função dos grânulos, bem como de seus componentes, é essencial para o entendimento de doenças neurológicas que apresentam a formação de SGs que em algum momento se tornam patológicos, tais como ALS e síndrome do X-frágil35,36.
6 Objetivos
6.1 Objetivo Geral
O presente trabalho teve como objetivo principal compreender a função da proteína CAPRIN1, pela identificação das proteínas que interagem com CAPRIN1 e caracterizando-se assim, o complexo de regulação em células de mamífero HEK293T.
6.2 Objetivos específicos
I. Otimização dos protocolos de cultura celular, superexpressão, imunoprecipitação e clonagem.
II. Determinação dos componentes do complexo por espectrometria de massas.
III. Validação de duas proteínas interagentes de CAPRIN1 por co-imunoprecipitação seguida de Western blot.
7 Métodos
7.1 Condições de cultivo de células HEK293T
Condições de cultivo das células de mamífero: para todos os experimentos, as células transformadas *HEK293T (human embryonic kidney cells) foram mantidas em meio de cultura DMEM 1x + glutaMax (Gibco cat 10566016) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco cat 12657029) e mantidas em incubadora a 37°C em 5% de CO2. Para a realização de passagens, as células foram tripsinizadas da seguinte maneira: o meio de cultura foi removido, as células foram lavadas uma vez com PBS 1X, seguido da adição de 3mL de 0,25% tripsina-EDTA (Gibco cat: 25200-072) para frasco T-75 (7,5cm2) e incubação a 37°C por 5’. Para neutralizar o EDTA, foi adicionado meio de cultura com soro e as células soltas foram centrifugadas por 5’ a 2000xg. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de células foi ressuspendido.
Para 1L de PBS:
8g NaCl (137mM), 0,2g KCl (2.7mM), 1,44g Na2HPO4 (10mM), 0,24g KH2PO4 (1.8mM)
Determinação do tempo de dobramento de células HEK293T: as célula foram tripsinizadas e ressuspendidas em meio de cultura. Para calcular o volume de células a serem plaqueadas para a curva de crescimento, as células foram diluídas 10 vezes em meio de cultura e 15uL foram usados para contagem na câmara de Neubauer. O volume correspondente a 1,42 x105 células foi plaqueado em placas de 10cm2 (1,42 x 104 células/cm2), em duplicata para cada
ponto de coleta. Após 24, 48, 72 e 96 horas de crescimento, as células foram tripsinizadas e contadas para se determinar o tempo de dobramento.
*As celulas HEK293T são células modificadas que expressam o SV40 large T antigen e resistência a neomicina. Escolhemos as células HEK293T pois elas apresentam expressão aumentada de plasmídeos transfectados em relação à linhagem HEK293 e são adequadas se quisermos gerar células transfectantes estáveis futuramente.
7.2 Teste de eficiência de transfecção
As células foram mantidas e tripsinizadas como mencionado acima e o volume equivalente a 5 x105 células foi plaqueado em 4 poços de uma placa de 6 poços (5 x104 células/cm2) . Após 24h, foram preparados 5 tubos, no primeiro tubo, 10ug (2.5 ug de DNA x 4 poços) do plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP foram diluídos em meio OptiMEM (gibco cat 31985-062). No segundo tubo, que serviu como controle, não foi colocada Lipofectamina (apenas 100uL de optiMEM). E nos tubos seguintes foram colocadas as concentrações crescentes de Lipofectamina 2000 (4,5ug, 7,5ug e 10,5ug). Após homogeneizar delicadamente por inversão, os tubos foram incubados por 5’ a TA. Em seguida, o equivalente a 2,5ug de DNA diluído do primeiro tubo foram adicionados aos tubos contendo Lipofectamina 2000 para a formação dos complexos e incubados por 20’ a TA. Os complexos foram adicionados a cada poço contendo as células. Após 48h as células foram tripsinizadas, ressuspendidas em meio DMEM + FBS e contadas na câmara de Neubauer. Em microscópio com fluorescência foi contado o número de células totais e o número de células verdes (que receberam o plasmídeo com GFP).
7.3 Clonagem da ORF correspondente a proteína CAPRIN1
Previamente à superexpressão em células de mamífero, foi necessário clonar o cDNA da proteína CAPRIN1 no plasmídeo pcDNA 3.1 (+).
7.4 Obtenção do cDNA referente a proteína CAPRIN1
7.4.1 Extração de RNA
Duas placas de 10 cm2 contendo células HEK293T foram submetidas a extração de RNA pelo reagente TRIzol (Ambion cat:15596018) segundo recomendações do fabricante. Os RNAs foram armazenados a -80°C até o uso. A quantificação foi feita em Nanodrop (GE) e em seguida foi feito um gel de agarose 1% para verificar a integridade e viabilidade do RNA extraído.
7.4.2 Transcrição reversa (RT)
Para a síntese de cDNA, foram usados 5ug de RNA total das células HEK293T. O RNA foi combinado com 0,7mM de cada nucleotídeo em dNTP mix (Denville) e a concentração final de 4uM de Oligo(dt) (sequência: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN). A reação foi aquecida a 65°C por 5’ e incubada em gelo por 1’ para desnaturação do RNA e dos oligos. Foi feita uma centrifugação breve e foi adicionado à reação Buffer da enzima Super Script III para 1X, 1uL de DTT 0,1M (Invitrogen cat: y00147) e 200 unidades de SuperScript III (Invitrogen cat:
56575). A reação foi homogeneizada e incubada a 50°C por 30’, seguida de inativação a 70°c por 15’. Em seguida, foram adicionadas 2 unidades de RNase H (Invitrogen cat:y01220) e a reação foi incubada a 37°C por 20’ para digestão de RNA restante na reação.
7.4.3 PCR
A reação de RT foi utilizada para o PCR, realizado com a Enzima processiva Phusion High fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific cat: F530S) que possui a baixa taxa de erro de 4,4 x 10-7. A reação foi preparada com 1X de Pol buffer, 0,2mM de cada nucleotídeo em dNTP mix, 0,5uM de cada primer para CAPRIN1, 1 unidade de Phusion DNA polimerase e 2 uL de cDNA. A reação foi centrifugada brevemente e o PCR foi realizado utilizando-se 30 ciclos com anelamento de 30’’ a 64°C e extensão de 2’30’’ a 72°C.
Os primers usados para esta etapa estão representados abaixo, em azul a parte da sequência de CAPRIN1 (do inicio da sequência para o Forward e do final para o reverse). Em vermelho os sítios das enzimas de restrição usadas, foram adicionados nucleotídeos extras (X) como sítios de flanqueamento.
Figura 4. Primers usados para clonagem: em azul, parte da sequência de CAPRIN1 para
alinhamento dos primers no cDNA. Em vermelho estão representados os sítios das enzimas de restrição usadas e seus nomes. Em verde, sítios de flanqueamento utilizados para facilitar as reações seguintes
7.4.4 Purificação do gel
A banda correspondente ao produto de PCR foi purificada utilizando-se o Kit da Thermo Scientific GeneJET Gel extraction #K0692 segundo recomendações do fabricante.
7.4.5 Digestão do produto de PCR para clonagem
O produto de PCR foi digerido de modo a resultar em extremidades coesivas (sticky ends) na seguinte reação: 1ug do produto de PCR purificado com 20 unidades das enzimas BamHI (NEB cat:R0136) e XhoI (NEB cat: R0146) por 6 horas a 37°C seguida de purificação.
7.5 Preparação do plasmídeo
7.5.1 Digestão do plasmídeo para clonagem e purificação
O plasmídeo pcDNA contendo uma sequência tag que resulta em 10 aminoácidos de comprimento (FLAG) foi utilizado para a clonagem. A adição da sequencia FLAG é uma estratégia utilizada no laboratório, a fim de possibilitar o uso do anticorpo geral anti-FLAG para as imunoprecipitações de proteínas expressas. Isso evita que tenhamos que comprar vários anticorpos específicos. Para se obter o plasmídeos linearizado para a clonagem, foi utilizado 1ug do plasmídeo e 20 unidades das enzimas BamHI (NEB cat:R0136) e XhoI (NEB cat: R0146) por 6 horas a 37°C. A seguir foram adicionadas 10 unidades de fosfatase alcalina (BioLabs: M0290S) para a etapa de defosforilação, impedindo, assim, que o plasmídeo linearizado pudesse novamente circularizar. A purificação do plasmídeo do gel foi realizada com o mesmo kit utilizado para o produto de PCR.
7.5.2 Ligação do inserto ao vetor
A ligação do inserto ao plasmídeo foi realizada com 100ng de vetor pFLAG, 100ng de inserto (razão molar ~3:1 Inserto 2.1kb vetor 5.4kb), em concentração final de buffer da T4 DNA Ligase (Fermentas cat:EL0011) 1x e 5 unidades de T4 DNA ligase. Foi feito um controle com as mesmas condições mas sem inserto (vetor vazio). As reações foram homogeneizadas e centrifugadas brevemente, depois incubadas a 16°C durante a noite.
7.5.3 Transformação em bactéria DH5-alpha
Após a inativação da ligase a 70°C durante 15’, a construção foi transformada em bactérias
E.coli DH5α quimicamente competentes. Para isso, 4uL da ligação e do vetor vazio foram
adicionados cada um em um tubo de 50uL de bactérias competentes.
7.5.4 PCR de colônia para verificação da presença de inserto
Para selecionar as colônias candidatas a serem sequenciadas, 20 colônias foram submetidas ao PCR de colônia utilizando-se primers desenhados dentro da sequência de CAPRIN1 resultando em 627pb (buffer a 1X, 0,4mM de cada nucleotídeo em dNTP mix, 3mM de MgCl2 2, 1,25 unidades de Taq DNA polimerase (Thermo scientific cat:EP0405) e 0,2uM de cada
primer (Forward: 5’-TCCATTCACCTGTGGGACCT-3’ Reverso: 5’-
ACCAGAAGCGACACAGGTTCC-3’)). Como controle positivo foi realizada uma reação de PCR com as mesmas condições contendo 50ng do inserto e como controle negativo, a reação foi realizada com água. As amostras foram submetidas a 30 ciclos com anelamento de 58°C por 30’’ e extensão de 72°C por 1’.
7.5.5 Purificação dos plasmídeos (miniprep)
As colônias contendo tamanho esperado no gel foram inoculadas em 5mL de LB com 50ug/uL de ampicilina para seleção de bactérias transformadas. Após incubação a 37°C por 12h os plasmídeos foram extraídos utilizando-se o kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification Sustem
7.5.6 Sequenciamento
Foi realizado pelo laboratório LACTAD-UNICAMP, utilizando-se o BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit e Sequenciador 3730xL DNA Analyzer (Applied Biosystems) para sequenciamento Sanger (eletroforese capilar). Foram usados quatro primers (Anexo Tabela 1), dois primers localizados no plasmídeo, serviram para confirmar o posicionamento correto do inserto e sequenciar o começo e o final do mesmo.
7.6 Superexpressão da proteína teste GFP e avaliação de eficiência de transfecção.
7.6.1 Padronização de Transfecção e Eficiência de Transfecção
Para verificar a expressão proteica a partir do plasmídeo nas células HEK293T, foi usado o plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP, que expressa GFP podendo ser visualizado pela submissão das células à microscopia de fluorescência ou que pode ser investigada por reconhecimento de anticorpo em Western blot. Com este controle, foram testadas as condições do Western blot e do anticorpo anti-FLAG. As células mantidas em cultura foram tripsinizadas e contadas como no teste de transfecção e a seguir foi plaqueado o volume correspondente a 3x 106 células por placa de 6 cm (5x105 células/cm2), no total 3 placas foram usadas. Após 24h foi realizada a transfecção de duas placas, deixando-se uma placa não transfectada como controle: 11ug de DNA (5,5ug para cada placa) foram diluídos em meio Opti-mem (Gibco Cat:31985-062) para volume final de 500uL. Em tubo separado, a Lipofectamina 2000 foi diluída em 6:1 em optimem. Os dois tubos foram incubados por 5’ a TA, misturados e
incubados por 20’ novamente a TA. Após a incubação, os complexos foram adicionados nas placas que foram então mantidas em incubadora nas mesmas condições descritas anteriormente. O meio de cultura das placas foi trocado após 24h. Após 48h as células de uma das placas transfectadas foram contadas como no teste de eficiência de transfecção. As células transfectadas das placas restantes, foram então lisadas para investigação da expressão.
7.6.2 Extração de proteínas
As duas placas restantes, controle e transfectada, foram colocadas em gelo e o meio de cultura foi aspirado. Após a lavagem com PBS gelado, a lise foi realizada com 200uL de RIPA 1X (Millipore cat:92590) contendo inibidor de protease (Roche). As células foram então raspadas das placas, homogeneizadas e transferidas para um tubo de 1,5mL. Os tubos foram centrifugados por 20’ a 4°C a 12000rpm e o pellet restante descartado.
7.6.3 Quantificação das proteínas
A quantificação de proteínas do lisado a serem utilizadas para Western Blot foi realizada pelo método de Bradford (Bio-Rad cat:500-0006) e a placa usada foi lida em espectrofotômetro no comprimento de onda de 620nm.
7.6.4 Western Blot
Foi seguido o protocolo de Sambrook, 1989 com algumas modificações e a parte do protocolo da ligação de anticorpos foi realizada conforme recomendações do fabricante do aparelho Odyssey (Licor).
(para tampão 5x: 60mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol, 0,01% bromophenol blue) para concentração 1X e Ripa 1X. Após a eletroforese, o gel foi equilibrado por 15’ em tampão de transferência (Tris 25mM /Glicina192mM/SDS0,1% /Metanol 20%). Uma membrana de PVDF foi ativada em metanol 100% e então equilibrada em Transfer buffer. As proteínas foram transferidas para membrana em sistema molhado (BioRad Mini Trans-blot electrophoretic transfer cell) com tampão de transferência a 200mA por 2 horas mantido em gelo. Depois da transferência a membrana foi bloqueada em solução blocking buffer Odyssey (cat n. 927-40000) sob agitação durante a noite à 4°C. A membrana foi então lavada 3 vezes com TBS-T (200mM tris, 1,5M NaCl, 1% tween20) com suave agitação por 10’. A membrana foi incubada com anticorpo primário (anti-FLAG antibody, Sigma cat:F3165) em diluição 1:10000 durante 1 hora e meia. Em seguida foi realizada mais uma lavagem com TBS-T (3 vezes por 10’). Foi feita nova incubação com anticorpo primário para controle (anti-tubulina antibody ABCAM cat:ab4074). A lavagem foi realizada novamente, depois a membrana foi incubada com dois anticorpos secundários em diluição 1:15000 (Goat anti-rabbit Odyssey cat:926-32211 e Goat anti-mouse Odyssey cat:926-68070) durante 45’ com agitação suave. Depois de lavada novamente, conforme descrito anteriormente, a membrana foi revelada segundo protocolo de fabricante do Odyssey CLx (Li-Cor, USA).
7.7 Imunoprecipitação com proteína teste GFP
A fim de testar as condições da imunoprecipitação e das beads anti-FLAG, o experimento foi primeiramente realizado a partir do lisado proteico anteriormente utilizado para Western blot.
Seguindo as recomendações do fabricante, as beads magnéticas com anticorpo anti-FLAG já incorporado (sigma-M8823-1) foram equilibradas e lavadas 3 vezes com TBS-T 1X (para 1L: 20mM Tris base, 0,15M NaCl, 0,1% tween-20) e uma vez com tampão de lise (para 50mL:
50mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA pH8, 140mM NaCl, 1% triton). 550ug de proteína foram adicionados as beads e os tubos foram incubados por aproximadamente 12h sob rotação à 4oC para que o complexo proteico fosse ligado ao anticorpo contido nas beads. Usando estante magnéticas, as beads foram lavadas com tampão de lise e TBS-T de modo que proteínas inespecíficas não permanecessem ligadas. Por competição, as proteínas foram eluídas com 10ug de 3x FLAG peptídeo (Sigma-F4799). Para confirmar a imunoprecipitação e a eluição, uma parte do sobrenadante resultante da imunoprecipitação, do eluído, do tampão das beads fervidas e do lisado de proteínas (como controle) foram aplicados em gel de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS) a 10%.
Um gel de acrilamida com as mesmas condições do gel de Western blot foi usado para coloração com prata SilverQuest (invitrogen-LC6070), permitindo visualizar a superexpressão e a complexidade da amostra imunoprecipitada.
7.8 Avaliação da localização da proteína CAPRIN1 em comparação a GFP
Para avaliar a localização da proteína CAPRIN1 após sua superexpressão em células HEK293T, foi realizado o protocolo de imunofluorescência da seguinte maneira:
7.8.1 Transfecção
Inicialmente, 0,5x105 células foram plaqueadas em 6 poços de uma placa de 24 poços (0,25x105células/cm2), previamente cobertos com lamínulas estéreis. 24h depois, foram realizadas transfecções como descrito anteriormente. Dois poços de células foram transfectados com o plasmídeo pcDNA-FLAG-CAPRIN1, dois poços foram mantidos sem transfecção como controle e dois foram transfectados com pcDNA-FLAG-GFP.
7.8.2 Imunofluorescência
48h após a transfecção, o meio de cultura dos poços usados foi descartado. As células foram lavadas com PBS (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 1.8mM) e fixadas com 3,7% formaldeído por 5’.
As células foram lavadas novamente e então permeabilizadas com 0,1% triton em PBS 2mg/mL BSA por 5’. O bloqueio foi então realizado por 1h em 0.05% Tween 20 em PBS 2mg/ml BSA (Blocking Buffer).
As células foram incubadas durante a noite com o anticorpo primário anti-FLAG em diluição 1:1000.
Após aproximadamente 16h, o anticorpo foi retirado e foram realizadas 4 lavagens de 10’ com Blocking Buffer seguidas de incubação com anticorpo secundário (invitrogen 488 anti-mouse) por 2h. novamente foram realizadas 3 lavagens de 10’ com PBS. As lâminas foram montadas com uma gota de SlowFade com Dapi (Invitrogen S36939) e vedadas com esmalte.
7.9 Superexpressão da proteína CAPRIN1 e avaliação de eficiência de transfecção
7.9.1 Transfecção
Após a padronização, os testes foram realizados para a proteína CAPRIN1
Concomitantemente à superexpressão da proteína CAPRIN1 para posterior análise por espectro de massa, verificamos a expressão proteica a partir do plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP nas células HEK293T, como descrito acima.
As células mantidas em cultura foram plaqueadas com o correspondente à 2,2x 106 por placa de 10cm para o teste de transfecção, no total 5 placas de 10cm foram usadas. Após 24h foi
realizada a transfecção do plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP em duas placas de 10cm para controle de imunoprecipitação e em uma placa de 6cm para eficiência de transfecção, e do plasmídeo pcDNA-FLAG-CAPRIN1 em 3 placas de 10cm usando 10ug de DNA
Após 48h as células da placa de 6cm foram contadas como no teste de eficiência de transfecção. As células transfectadas foram então lisadas para investigação da expressão e imunoprecipitação.
7.9.2 Extração de proteínas
A extração das proteínas das placas restantes, controle de imunoprecipitação e superexpressão de CAPRIN1, foi realizada como descrito anteriormente, porém com 1mL de tampão de lise 1X (para 50mL: 50mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA pH8, 140mM NaCl, 1% triton) contendo inibidor de protease (Roche).
7.10 Imunoprecipitação da proteína CAPRIN1 para análise por espectrometria de massas
A imunoprecipitação para análise por espectrometria de massas foi realizada com algumas alterações devido à sensibilidade da maquina a ser usada.
500ug de proteína foram submetidos à imunoprecipitação. após a ligação dos complexos às beads, foram realizadas 5 lavagens com TBS-T para que não restassem resíduos de detergentes, o que poderia prejudicar o desempenho do espectrômetro. A eluição foi otimizada para 10mg de 3x FLAG peptídeo (Sigma-F4799) por 2h em banho seco à 30ºC. Uma segunda eluição foi realizada nas mesmas condições por 1h e uma terceira, com 5mg de 3x FLAG peptídeo por 30’ à 30ºC.
Para confirmar a imunoprecipitação, uma parte do lisado anterior a imunoprecipitação (INPUT) e do sobrenadante resultante da imunoprecipitação foram aplicados em gel de poliacrilamida-SDS (PAGE-poliacrilamida-SDS) a 10%.
A análise da superexpressão foi realizada como descrito para a proteína teste.
7.11 Preparação de Amostras Para Espectrometria de massas
Após a confirmação de imunoprecipitação por Western blot, 100ul dos complexos purificados foram preparados para espectrometria de massas.
7.11.1 Digestão proteica
Para a redução das pontes dissulfeto foi adicionado DTT para 5mM final e as soluções foram incubadas durante 25’ à 56ºC. a redução foi seguida de alquilação com IAA para 14mM e incubação por 30’ à temperatura ambiente e protegida da luz. Em seguida, DTT para 5mM foi adicionado para reprimir a ação de IAA restante, as soluções foram novamente incubadas por 15’ a TA protegidas da luz. CaCl2 para 1mM foi adicionado seguido de digestão com 1ug de
tripsina, as soluções foram incubadas durante a noite a 37ºC.
Após aproximadamente 16h, a reação foi parada com TFA para 1%.
7.11.2 Dessalinização
A dessalinização foi realizada com a coluna C18 SepPack (Waters, WAT 054960).
A coluna foi ativada com 3mL de ACN 100% e equilibrada com 1mL de solução 50/50 ACN/água com 0,1% ácido fórmico e 3mL de TFA 0,1%. A solução foi passada pela coluna e os peptídeos, lavados com 3mL de TFA 0,1%. A amostra foi equilibrada com 0,1% de ácido fórmico e então eluída com 2mL de solução 50/50 ACN/água com 0,1% ácido fórmico e 1mL
de solução 80/20 ACN /água com 0,1% ácido fórmico. As amostras foram então secas por evaporador.
7.11.3 Espectrometria de massas
A espectrometria foi realizada pelo Laboratório Nacional de biociências com a máquina LTQ Orbitrap Vellos EDT da Thermo Scientific, com ionização por eletrospray e detecção por Ion Trap.
Os peptideos liofilizados foram separados por cromatografia com C18 (100mm 6100mm) RP-nanoUPLC (nanoAcquity, Waters) acoplado a espectrômetro de massas Q-Tof Ultima (Waters) com nanoeletrospray com taxa de injeção de 0,6ml/min. O gradiente usado foi de 2-90% acetonitrila em 0,1% ácido fórmico por 45 minutos.
As voltagens usadas foram: do eletrospray foi de 3,5kV para eletrospray e 30V para o cone com fonte de temperatura de 100uC.
O aparelho foi utilizado em modo “top three”, onde um espectro é adquirido seguido do MS/MS dos 3 picos mais intensos. A exclusão de íons foi feita em 60s.
Para as análises dos interagentes encontrados foram usados os programas DAVID Bioinformatic Database38 e o Cytoscape para clusterização de funções moleculares através do aplicativo BINGO do gene ontology39.
7.12 Validação e caracterização de interações proteicas
Após a espectrometria de massas, foi escolhido um grupo de 9 proteínas com função enriquecida na amostra e que tivesse ligação às funções propostas para grânulos de estresse
7.12.1 Co-imunoprecipitação da proteína CAPRIN1 superexpressa
Para a validação, primeiramente a imunoprecipitação de CAPRIN1 por meio das beads magnéticas conjugadas com o anticorpo anti-FLAG foi repetida, porém a quantidade de proteínas totais foi elevada a 1mg a fim da identificação das bandas correspondentes à proteínas interagentes por Western blot ser facilitada. A eluição foi realizada fervendo as beads magnéticas com tampão beta para concentração de 1x.
O Western blot foi realizado como descrito anteriormente e as membranas foram incubadas com os anticorpos primários em diluição recomendada pelo fabricante (Anexo Tabela 2), por 2h e com os anticorpos secundários por 45’.
7.12.2 Co-Imunoprecipitação de proteínas endógenas e tratamento com RNase
Após o teste inicial de co-imunoprecipitação, as proteínas com interações confirmadas no primeiro teste foram precipitadas com as beads magnéticas Dynabeads Protein A (Life Tecnologies 10001D).
7.12.2.1 Cross Link
Para que o anticorpo seja conjugado às beads de forma estável, foi necessário realizar o cross linking.
Para isso, o tampão das beads foi removido e 1ug de cada anticorpo, diluído em 200uL de PBS/0,02% tween-20, foi acrescentado às beads que foram incubadas durante 10` à temperatura ambiente com rotação.
O tampão foi então removido e a beads foram lavadas uma vez com PBS/0,02% tween-20 e duas vezes com 0,2M triethanolamina pH8,2.
As beads foram ressuspendidas em 1mL de 20mM DMP em 0,2M triethanolamina pH8,2 e incubadas com rotação durante 30’ à 20˚C. O tampão foi removido e as beads foram lavadas 3 vezes com PBS/0,02% tween-20.
7.12.2.2 Tratamento com RNase
Após a lise das amostras descrita anteriormente, foi realizado o tratamento com RNase A (Qiagen 158922) em 1mg de cada amostra. 1mg de cada amostra se manteve sem tratamento para comparação (Tabela 1).
A RNase foi adicionada à 10ug/100ul e as amostras foram incubadas em gelo durante 1h.
Tabela 1. Amostras de co-imunoprecipitação. Para a validação dos interagentes, cada IP foi
realizada nas condições de superexpressão (OE) da proteína CAPRIN1 em comparação a superexpressão de GFP e com e sem tratamento com RNase
7.12.2.3 Imunoprecipitação
A imunoprecipitação foi realizada com 1mg das amostras descritas acima. A proteína foi adicionada às beads após o cross link e tratamento com RNase e as amostras foram incubadas com rotação à 4˚C durante aproximadamente 16h. Depois foram lavadas 5 vezes com PBS1x e os complexos foram eluídos com tampão beta para concentração 1x a 80˚C por 5’ seguido de Western blot para análise de interagentes.
GFP$OE CAPRIN1$OE +"RNase +"RNase ("RNase ("RNase +"RNase +"RNase ("RNase ("RNase IP$IGF2BP1 IP$PaBPC1
8 Resultados e Discussão
8.1 Avaliações celulares, preliminares à superexpressão da proteína CAPRIN1
Como os experimentos de superexpressão de proteínas estavam sendo realizados pela primeira vez no laboratório, alguns parâmetros referentes às células em cultura foram inicialmente avaliados.
Tempo de dobramento de células HEK293T
As células HEK293T plaqueadas no tempo zero foram contadas a cada 24 horas e plotadas em curva de crescimento (Figura 5). Os resultados individuais das contagens e os cálculos da razão entre os números de células dos tempos sucessivos, são mostrados na Tabela 2. Para as condições descritas acima em nosso laboratório, observou-se que a cada 24h o número de células foi bem próximo da duplicação (razão de 1.9, 1.9 e 1.8), condizendo com o que é encontrado na literatura, utilizando-se células em suspensão mantidas em Erlenmeyer (Cervera et al40). Surpreendentemente, poucos laboratórios mencionam tempos de
dobramento em artigos e nós achamos importante certificarmos em nossas condições laboratoriais.
Figura 5. Curva de crescimento das células HEK293T em cultura demostrando dobramento em 24h. No tempo zero as células foram plaqueadas na densidade de 1,4 x 104
células/cm2. Sucessivamente as células foram contadas a cada 24h conforme representação. Cada ponto representa a média da contagem de células de duas placas a cada 24h.
Tabela 2. Contagem de células HEK293T para determinação do tempo de dobramento.
Número de células HEK293T contadas por placa nos tempos indicados e média do número de células nas duas placas. A última coluna mostra o cálculo da razão para o tempo de dobramento, próximo a 2, portanto o tempo de dobramento foi estipulado como 24h.
Horas Número de células x10células/ml 5 Número de células x10células/ml 5 dobramento Razão
Placa 1 Placa 2 Média
24 11 14 13
48 25 24 25 25/13=1,9
72 31 65 48 48/25=1,9
96 46 126 86 86/48=1,8
Avaliação da eficiência de transfecção como base para os experimentos de superexpressão da proteína de interesse
Em seguida, para otimizar a concentração ideal de Lipofectamina 2000 (Invitrogen cat 1353709) em nossas condições laboratoriais, foram testadas três quantidades crescentes na cultura de células HEK293T. Para verificação da eficiência, foi transfectado um plasmídeo controle expressando GFP (pcDNA 3.1).
0 20 40 60 80 100 0 24 48 72 96 C él u las /mL ( x10E5) Tempo (horas)
O número total de células contadas em cada poço e o número de células GFP+ está representado na Tabela 3. Para as concentrações crescentes de lipofectamina observamos as seguintes proporções de células GFP+: 57% (4,5ug de Lipofectamina) 50% (7,5ug de Lipofectamina) e 45% (10,5ug de Lipofectamina). Nesse caso, a concentração crescente de lipofectamina não aumentou a eficiência de transfecção, portanto, nos experimentos seguintes, foram usados 4.5uL de lipofectamina para 2.5 ug de DNA.
No controle negativo (não-transfectado), as células apresentaram-se com aspecto saudável e sem células verdes (GFP+). Houve perda de uma pequena parcela de células durante a lavagem com PBS, explicada pela menor aderência de células HEK293T em relação às células HEK293 em confluência alta.
Tabela 3. Teste de quantidades crescentes de lipofectamina para transfecção em células HEK293T. Foram contadas as células totais e em seguida as células transfectadas
expressando GFP (GFP+). A última coluna representa a porcentagem das células transfectadas (células GFP+/total de células) que foi, em média, de 50%.
Quantidade de lipofectamina x104 células totais/mL x104 células GFP+/mL % de células transfectadas 0ug 17 0 0 4,5ug 7 4 57 7,5ug 12 6 50 10,5ug 11 5 45
Para todos os experimentos de transfeção de CAPRIN1 foi realizada, em paralelo, uma placa transfectada com plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP para que esta servisse de controle de transfecção, por contagem de células GFP+. Após 48h, as células desta placa foram
trispinizadas e contadas manualmente, sob fluorescência. Nos diversos experimentos, a eficiência média obtida foi de 60%, ou seja, aproximadamente 60% das células contadas apresentavam fluorescência verde. Esta eficiência representa um nível bom, no entanto o protocolo de lipofectamina afirma fornecer até 80% de eficiência. Por este motivo, em complementação às contagens manuais, foi realizada a contagem de células GFP+ por citometria de fluxo pelo LacTad (Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida) que mostrou eficiência de 75,4%, o que está mais próximo da eficiência de lipofectamina (figura 6). A diferença de aproximadamente 15% pode ser devida a não visualização de células fracamente verdes na inspeção manual.
Figura 6. Eficiência de transfecção avaliada por FACS. Foram realizadas três placas para
contagem em FACS. Por esta analise, a eficiência de transfecção foi de aproximadamente 75,4%. (FACS utilizado no LaCTAD - Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida).
Após os testes iniciais, foram realizados os experimentos de clonagem e transfecção para a superexpressão da proteína CAPRIN1.
8.2 Clonagem da ORF correspondente a proteína CAPRIN1
A fim de se obter o cDNA de CAPRIN1 para a clonagem, uma duplicata de RNA total de células humanas HEK293T foram extraídas e avaliadas em gel de agarose. As amostras apresentaram-se íntegras, com bandas definidas equivalentes a 18S e 28S (Figura 7).
Figura 7. Amostras de RNA íntegras. Foi analisado 1ug de RNA total extraído de células
HEK293T. O RNA total se apresentou íntegro, com visualização das bandas ribossomais 28S e 18S.
Pelo fato das duas amostras de RNA apresentarem igual qualidade, a amostra 1 (RNA1) foi utilizada para o passo seguinte de transcrição reversa e PCR. Após a reação de PCR, o produto referente à CAPRIN1 foi verificado e uma banda única correspondente à aproximadamente 2131pb foi observada (Figura 8). Para a purificação do produto de PCR, a reação foi submetida a eletroforese e a banda correspondente foi cortada do gel, purificada, digerida nas extremidades com enzimas de restrição BamHI e XhoI e novamente purificadas.
Figura 8. Produto de PCR correspondente ao cDNA de CAPRIN1. A banda de PCR
correspondendo a CAPRIN1 apresenta o tamanho correto de aproximadamente 2131pb, marcador 1Kb Plus.
Concomitantemente, o plasmídeo pcDNA-FLAG foi preparado. O plasmídeo foi linearizado por digestão com as enzimas BamHI e XhoI, resultando num produto equivalente a 5389pb. Este pode ser visualizado no gel de agarose abaixo (Figura 9). O fragmento liberado após a digestão é de 50pb e quase não pode ser visualizado neste gel. Para conferir a integridade do inserto após ser digerido, uma parte desta reação também foi analisada neste gel.
tamanho esperado (5439pb) e banda referente ao inserto digerido com as mesmas enzimas apresentando também o tamanho esperado (2131pb). Marcador 1Kb plus (M).
Após a purificação dos produtos digeridos (Figura 10), a concentração do vetor obtida foi de 15ng/uL e a do produto de PCR para CAPRIN1 foi de 10ng/uL. O plasmídeo e o inserto digeridos e purificados foram então combinados para a reação de ligação na proporção 3:1 (inserto:plasmídeo) (Figura 10) e posteriormente transformados em bactérias quimiocompetentes.
Figura 10. Inserto e plasmídeo purificados, utilizados para a ligação. Verificação dos
passos finais de preparo do inserto e vetor para a clonagem, bem como da ligação. As bandas se apresentaram íntegras e nos tamanhos esperados
A transformação resultou em 1 colônia na placa controle de ligação contendo vetor vazio e 20 colônias na ligação do vetor + inserto.
Para a triagem das colônias, foi realizado PCR para 20 colônias, com objetivo de encontrarmos as que continham inserto (Figura 11).
Figura 11. Triagem por PCR de colônia para fragmento de CAPRIN1. Total de 20 colônias
foram testadas para presença do inserto com o produto esperado de 627pb. 14 colônias apresentaram a banda de tamanho esperado após submissão à reação de PCR. Marcador 1kbPlus (M).
Das colônias obtidas, 14 apresentaram bandas do tamanho esperado para produto de PCR interno a CAPRIN1 627pb: colônias 2 ,4 a 6 e 10 a 20. Foram escolhidas aleatoriamente as colônias 4 e 11 para a confirmação por sequenciamento com 2 primers, como a colônia 11 apresentou melhor qualidade de read, o sequenciamento total do inserto foi realizado com esta colônia.
As sequências obtidas a partir do sequenciamento com quatro primers, como descrito em métodos, foram montadas manualmente e alinhadas contra o genoma no programa UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), a sequência foi alinhada corretamente à sequência correspondente ao cDNA de CAPRIN1 e não foram detectadas mutações, como mostrado na Figura 12.
Figura 12. Alinhamento das sequências de CAPRIN1 obtidas contra o banco de dados de sequências humanas UCSC. Em preto (marcado SEQUENCIAM), a sequência obtida das
montagem das reads de sequenciamento do inserto clonado. A sequência alinhou corretamente com a sequência do gene de interesse CAPRIN1 em azul, com exceção da porção em vermelho que continha alguns nucleotídeos de baixa qualidade, mas permitindo verificação dos nucleotídeos.
Figura 13. Eletroferograma de duas das reads confirmando sequenciamento de CAPRIN1.
e formato dos picos, sua qualidade. O cromatograma mostra a alta qualidade das reads e baixo ruído (ausência de picos baixos).
8.3 Avaliação da superexpressão das proteínas GFP e CAPRIN1
Pelo fato de os experimentos de supreexpressão serem usados como base para o projeto, as células HEK293T foram inicialmente transfectadas com o plasmídeo controle expressando GFP (pcDNA-FLAG-GFP) em comparação com controle negativo de células não transfectadas. As transfecções foram seguidas de avaliação por Western blot. Para investigar a superexpressão, as células foram lisadas e as proteínas coletadas para Western blot 48h após a transfecção. Como controle housekeeping foi utilizado o anticorpo anti-tubulina.
Na revelação do Western blot foi confirmada a superexpressão da proteína de fusão FLAG-GFP indicado pela banda de aproximadamente 26kDa (Figura 14). Verificamos também que 10ug de amostra de proteínas totais são o suficiente para a visualização da superexpressão da proteína no Western blot. A banda correspondente ao controle interno de Tubulina apresenta o peso de aproximadamente 50 kDa e teve sua expressão detectada em todas as amostras, como esperado. O protocolo de expressão pôde ser usado sem necessidade de muitas modificações para a construção com CAPRIN1, mantendo os anticorpos e as concentrações usadas nesse teste. O sinal equivalente à expressão de GFP em lanes de células não transfectadas (nas lanes 2-4) é decorrente do vazamento de amostra da lane 5.
Figura 14. Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-GFP em células HEK293T.
Foram testados 10, 20 e 30ug de proteína extraída das células HEK293T sem transfecção ou células transfectadas com pFLAG-GFP respectivamente. A banda de aproximadamente 50kDa é equivalente a expressão do controle interno TUBULINA e a de ~30kDa é equivalente a FLAG-GFP. As bandas confirmam a superexpressão de GFP e apresentam o peso molecular esperado. O marcador Page Ruler foi usado na lane 1. Gel PAGE 8%.
Após a confirmação da expressão de FLAG-GFP, o experimento foi realizado com o lisado de células transfectadas com o plasmídeo pcDNA-FLAG-CAPRIN1, usando as mesmas concentrações de anticorpos.
Para a superexpressão de CAPRIN1, porém, testamos 20, 30, 40 e 50ug de proteína, já que a eficiência de tranfecção de GFP poderia ser maior que a de CAPRIN1.
Como no teste anterior, foi confirmada a expressão da proteína FLAG-CAPRIN1 em relação as células não transfectadas (Figura 15). A concentração mais baixa testada, de 20ug de proteínas totais, foi suficiente para visualização da banda no Western blot. O controle GAPDH apresentou bandas correspondentes ao peso esperado (37KDa) tanto nas amostras com superexpressão quanto no controle.
Após a aquisição do anticorpo para a proteína CAPRIN1 endógena, os testes foram repetidos com este anticorpo (Figura 15) e, novamente, confirmaram a superexpressão da proteína.
Figura 15. Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-CAPRIN1 em células HEK293T. Foram testados 20, 30, 40 e 50ug de proteína dos lisados de células com e sem
superexpressão de CAPRIN1, respectivamente. As bandas em vermelho correspondem ao sinal do anticorpo secundário para anti-FLAG e em verde as bandas correspondentes ao anticorpo secundário ao controle interno anti-GAPDH. As bandas apresentam os pesos esperados tanto para GAPDH quanto para FLAG-CAPRIN1, confirmando a superexpressão de CAPRIN1. Os testes foram repetidos com o anticorpo para a proteína endógena (membrana no canto direito).
8.4 Avaliação da localização celular da proteína CAPRIN1 em comparação a GFP
Para a confirmação da localização da proteína CAPRIN1 superexpressa e confirmação da indução de grânulos citoplasmáticos, foi utilizado anticorpo anti-FLAG e células transfectadas com CAPRIN1 em comparação com células transfectadas com pcDNA-FLAG-GFP. Para controle de background de fluorescência, foram utilizadas células sem transfecção, como descrito em métodos.
Após submeter as células à microscopia confocal, verificou-se que a proteína CAPRIN1 superexpressa se localiza predominantemente no citoplasma em comparação com o controle
20ug 30ug 40ug 50ug M 20ug 30ug 40ug 50ug HEK 293T FLAG-CAPRIN1 O/E HEK 293T
CAPRIN1 (αFLAG)
GAPDH
M
com GFP (Figura 16). A expressão de FLAG-GFP apresenta um padrão predominantemente nuclear. Em contraste, a expressão de CAPRIN1 apresentou um padrão granular, sugerindo formação de grânulos de estresse ou de agregados de proteínas causados pela superexpressão. O controle de células não transfectadas não apresentou autofluorescência (imagem não mostrada pois apresenta ausência de sinal).
A marcação utilizada para o núcleo, DAPI, não pôde ser observada concomitantemente na microscopia confocal, pois o laser para excitação requerida não está disponível no microscópio que foi utilizado, portanto, as células não transfectadas foram identificadas em tons de cinza (painel inferior) e posteriormente foi avaliada a fluorescência.
Figura 16. CAPRIN1 está localizada no citoplasma celular e apresenta padrão granular.
Imunofluorescência utilizando anticorpo anti-FLAG em células transfectadas com FLAG-GFP,
