Resultados e Discussão

8.1 Avaliações celulares, preliminares à superexpressão da proteína CAPRIN1

Como os experimentos de superexpressão de proteínas estavam sendo realizados pela primeira vez no laboratório, alguns parâmetros referentes às células em cultura foram inicialmente avaliados.

Tempo de dobramento de células HEK293T

As células HEK293T plaqueadas no tempo zero foram contadas a cada 24 horas e plotadas em curva de crescimento (Figura 5). Os resultados individuais das contagens e os cálculos da razão entre os números de células dos tempos sucessivos, são mostrados na Tabela 2. Para as condições descritas acima em nosso laboratório, observou-se que a cada 24h o número de células foi bem próximo da duplicação (razão de 1.9, 1.9 e 1.8), condizendo com o que é encontrado na literatura, utilizando-se células em suspensão mantidas em Erlenmeyer (Cervera et al40). Surpreendentemente, poucos laboratórios mencionam tempos de

dobramento em artigos e nós achamos importante certificarmos em nossas condições laboratoriais.

Figura 5. Curva de crescimento das células HEK293T em cultura demostrando dobramento em 24h. No tempo zero as células foram plaqueadas na densidade de 1,4 x 104

células/cm2. Sucessivamente as células foram contadas a cada 24h conforme representação. Cada ponto representa a média da contagem de células de duas placas a cada 24h.

Tabela 2. Contagem de células HEK293T para determinação do tempo de dobramento.

Número de células HEK293T contadas por placa nos tempos indicados e média do número de células nas duas placas. A última coluna mostra o cálculo da razão para o tempo de dobramento, próximo a 2, portanto o tempo de dobramento foi estipulado como 24h.

Horas Número de células x10_células/ml 5 Número de células x10_células/ml 5 _dobramento Razão

Placa 1 Placa 2 Média

24 11 14 13

48 25 24 25 25/13=1,9

72 31 65 48 48/25=1,9

96 46 126 86 86/48=1,8

Avaliação da eficiência de transfecção como base para os experimentos de superexpressão da proteína de interesse

Em seguida, para otimizar a concentração ideal de Lipofectamina 2000 (Invitrogen cat 1353709) em nossas condições laboratoriais, foram testadas três quantidades crescentes na cultura de células HEK293T. Para verificação da eficiência, foi transfectado um plasmídeo controle expressando GFP (pcDNA 3.1).

0   20   40   60   80   100   0   24   48   72   96   C él u las /mL ( x10E5) Tempo (horas)

O número total de células contadas em cada poço e o número de células GFP+ está representado na Tabela 3. Para as concentrações crescentes de lipofectamina observamos as seguintes proporções de células GFP+: 57% (4,5ug de Lipofectamina) 50% (7,5ug de Lipofectamina) e 45% (10,5ug de Lipofectamina). Nesse caso, a concentração crescente de lipofectamina não aumentou a eficiência de transfecção, portanto, nos experimentos seguintes, foram usados 4.5uL de lipofectamina para 2.5 ug de DNA.

No controle negativo (não-transfectado), as células apresentaram-se com aspecto saudável e sem células verdes (GFP+). Houve perda de uma pequena parcela de células durante a lavagem com PBS, explicada pela menor aderência de células HEK293T em relação às células HEK293 em confluência alta.

Tabela 3. Teste de quantidades crescentes de lipofectamina para transfecção em células HEK293T. Foram contadas as células totais e em seguida as células transfectadas

expressando GFP (GFP+). A última coluna representa a porcentagem das células transfectadas (células GFP+/total de células) que foi, em média, de 50%.

Quantidade de lipofectamina x104 _células totais/mL x104 _células GFP+/mL % de células transfectadas 0ug 17 0 0 4,5ug 7 4 57 7,5ug 12 6 50 10,5ug 11 5 45

Para todos os experimentos de transfeção de CAPRIN1 foi realizada, em paralelo, uma placa transfectada com plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP para que esta servisse de controle de transfecção, por contagem de células GFP+. Após 48h, as células desta placa foram

trispinizadas e contadas manualmente, sob fluorescência. Nos diversos experimentos, a eficiência média obtida foi de 60%, ou seja, aproximadamente 60% das células contadas apresentavam fluorescência verde. Esta eficiência representa um nível bom, no entanto o protocolo de lipofectamina afirma fornecer até 80% de eficiência. Por este motivo, em complementação às contagens manuais, foi realizada a contagem de células GFP+ por citometria de fluxo pelo LacTad (Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida) que mostrou eficiência de 75,4%, o que está mais próximo da eficiência de lipofectamina (figura 6). A diferença de aproximadamente 15% pode ser devida a não visualização de células fracamente verdes na inspeção manual.

Figura 6. Eficiência de transfecção avaliada por FACS. Foram realizadas três placas para

contagem em FACS. Por esta analise, a eficiência de transfecção foi de aproximadamente 75,4%. (FACS utilizado no LaCTAD - Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida).

Após os testes iniciais, foram realizados os experimentos de clonagem e transfecção para a superexpressão da proteína CAPRIN1.

8.2 Clonagem da ORF correspondente a proteína CAPRIN1

A fim de se obter o cDNA de CAPRIN1 para a clonagem, uma duplicata de RNA total de células humanas HEK293T foram extraídas e avaliadas em gel de agarose. As amostras apresentaram-se íntegras, com bandas definidas equivalentes a 18S e 28S (Figura 7).

Figura 7. Amostras de RNA íntegras. Foi analisado 1ug de RNA total extraído de células

HEK293T. O RNA total se apresentou íntegro, com visualização das bandas ribossomais 28S e 18S.

Pelo fato das duas amostras de RNA apresentarem igual qualidade, a amostra 1 (RNA1) foi utilizada para o passo seguinte de transcrição reversa e PCR. Após a reação de PCR, o produto referente à CAPRIN1 foi verificado e uma banda única correspondente à aproximadamente 2131pb foi observada (Figura 8). Para a purificação do produto de PCR, a reação foi submetida a eletroforese e a banda correspondente foi cortada do gel, purificada, digerida nas extremidades com enzimas de restrição BamHI e XhoI e novamente purificadas.

Figura 8. Produto de PCR correspondente ao cDNA de CAPRIN1. A banda de PCR

correspondendo a CAPRIN1 apresenta o tamanho correto de aproximadamente 2131pb, marcador 1Kb Plus.

Concomitantemente, o plasmídeo pcDNA-FLAG foi preparado. O plasmídeo foi linearizado por digestão com as enzimas BamHI e XhoI, resultando num produto equivalente a 5389pb. Este pode ser visualizado no gel de agarose abaixo (Figura 9). O fragmento liberado após a digestão é de 50pb e quase não pode ser visualizado neste gel. Para conferir a integridade do inserto após ser digerido, uma parte desta reação também foi analisada neste gel.

tamanho esperado (5439pb) e banda referente ao inserto digerido com as mesmas enzimas apresentando também o tamanho esperado (2131pb). Marcador 1Kb plus (M).

Após a purificação dos produtos digeridos (Figura 10), a concentração do vetor obtida foi de 15ng/uL e a do produto de PCR para CAPRIN1 foi de 10ng/uL. O plasmídeo e o inserto digeridos e purificados foram então combinados para a reação de ligação na proporção 3:1 (inserto:plasmídeo) (Figura 10) e posteriormente transformados em bactérias quimiocompetentes.

Figura 10. Inserto e plasmídeo purificados, utilizados para a ligação. Verificação dos

passos finais de preparo do inserto e vetor para a clonagem, bem como da ligação. As bandas se apresentaram íntegras e nos tamanhos esperados

A transformação resultou em 1 colônia na placa controle de ligação contendo vetor vazio e 20 colônias na ligação do vetor + inserto.

Para a triagem das colônias, foi realizado PCR para 20 colônias, com objetivo de encontrarmos as que continham inserto (Figura 11).

Figura 11. Triagem por PCR de colônia para fragmento de CAPRIN1. Total de 20 colônias

foram testadas para presença do inserto com o produto esperado de 627pb. 14 colônias apresentaram a banda de tamanho esperado após submissão à reação de PCR. Marcador 1kbPlus (M).

Das colônias obtidas, 14 apresentaram bandas do tamanho esperado para produto de PCR interno a CAPRIN1 627pb: colônias 2 ,4 a 6 e 10 a 20. Foram escolhidas aleatoriamente as colônias 4 e 11 para a confirmação por sequenciamento com 2 primers, como a colônia 11 apresentou melhor qualidade de read, o sequenciamento total do inserto foi realizado com esta colônia.

As sequências obtidas a partir do sequenciamento com quatro primers, como descrito em métodos, foram montadas manualmente e alinhadas contra o genoma no programa UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), a sequência foi alinhada corretamente à sequência correspondente ao cDNA de CAPRIN1 e não foram detectadas mutações, como mostrado na Figura 12.

Figura 12. Alinhamento das sequências de CAPRIN1 obtidas contra o banco de dados de sequências humanas UCSC. Em preto (marcado SEQUENCIAM), a sequência obtida das

montagem das reads de sequenciamento do inserto clonado. A sequência alinhou corretamente com a sequência do gene de interesse CAPRIN1 em azul, com exceção da porção em vermelho que continha alguns nucleotídeos de baixa qualidade, mas permitindo verificação dos nucleotídeos.

Figura 13. Eletroferograma de duas das reads confirmando sequenciamento de CAPRIN1.

e formato dos picos, sua qualidade. O cromatograma mostra a alta qualidade das reads e baixo ruído (ausência de picos baixos).

8.3 Avaliação da superexpressão das proteínas GFP e CAPRIN1

Pelo fato de os experimentos de supreexpressão serem usados como base para o projeto, as células HEK293T foram inicialmente transfectadas com o plasmídeo controle expressando GFP (pcDNA-FLAG-GFP) em comparação com controle negativo de células não transfectadas. As transfecções foram seguidas de avaliação por Western blot. Para investigar a superexpressão, as células foram lisadas e as proteínas coletadas para Western blot 48h após a transfecção. Como controle housekeeping foi utilizado o anticorpo anti-tubulina.

Na revelação do Western blot foi confirmada a superexpressão da proteína de fusão FLAG- GFP indicado pela banda de aproximadamente 26kDa (Figura 14). Verificamos também que 10ug de amostra de proteínas totais são o suficiente para a visualização da superexpressão da proteína no Western blot. A banda correspondente ao controle interno de Tubulina apresenta o peso de aproximadamente 50 kDa e teve sua expressão detectada em todas as amostras, como esperado. O protocolo de expressão pôde ser usado sem necessidade de muitas modificações para a construção com CAPRIN1, mantendo os anticorpos e as concentrações usadas nesse teste. O sinal equivalente à expressão de GFP em lanes de células não transfectadas (nas lanes 2-4) é decorrente do vazamento de amostra da lane 5.

Figura 14. Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-GFP em células HEK293T.

Foram testados 10, 20 e 30ug de proteína extraída das células HEK293T sem transfecção ou células transfectadas com pFLAG-GFP respectivamente. A banda de aproximadamente 50kDa é equivalente a expressão do controle interno TUBULINA e a de ~30kDa é equivalente a FLAG-GFP. As bandas confirmam a superexpressão de GFP e apresentam o peso molecular esperado. O marcador Page Ruler foi usado na lane 1. Gel PAGE 8%.

Após a confirmação da expressão de FLAG-GFP, o experimento foi realizado com o lisado de células transfectadas com o plasmídeo pcDNA-FLAG-CAPRIN1, usando as mesmas concentrações de anticorpos.

Para a superexpressão de CAPRIN1, porém, testamos 20, 30, 40 e 50ug de proteína, já que a eficiência de tranfecção de GFP poderia ser maior que a de CAPRIN1.

Como no teste anterior, foi confirmada a expressão da proteína FLAG-CAPRIN1 em relação as células não transfectadas (Figura 15). A concentração mais baixa testada, de 20ug de proteínas totais, foi suficiente para visualização da banda no Western blot. O controle GAPDH apresentou bandas correspondentes ao peso esperado (37KDa) tanto nas amostras com superexpressão quanto no controle.

Após a aquisição do anticorpo para a proteína CAPRIN1 endógena, os testes foram repetidos com este anticorpo (Figura 15) e, novamente, confirmaram a superexpressão da proteína.

Figura 15. Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-CAPRIN1 em células HEK293T. Foram testados 20, 30, 40 e 50ug de proteína dos lisados de células com e sem

superexpressão de CAPRIN1, respectivamente. As bandas em vermelho correspondem ao sinal do anticorpo secundário para anti-FLAG e em verde as bandas correspondentes ao anticorpo secundário ao controle interno anti-GAPDH. As bandas apresentam os pesos esperados tanto para GAPDH quanto para FLAG-CAPRIN1, confirmando a superexpressão de CAPRIN1. Os testes foram repetidos com o anticorpo para a proteína endógena (membrana no canto direito).

8.4 Avaliação da localização celular da proteína CAPRIN1 em comparação a GFP

Para a confirmação da localização da proteína CAPRIN1 superexpressa e confirmação da indução de grânulos citoplasmáticos, foi utilizado anticorpo anti-FLAG e células transfectadas com pcDNA-FLAG-CAPRIN1 em comparação com células transfectadas com pcDNA-FLAG- GFP. Para controle de background de fluorescência, foram utilizadas células sem transfecção, como descrito em métodos.

Após submeter as células à microscopia confocal, verificou-se que a proteína CAPRIN1 superexpressa se localiza predominantemente no citoplasma em comparação com o controle

20ug 30ug 40ug 50ug M 20ug 30ug 40ug 50ug HEK 293T FLAG-CAPRIN1 O/E HEK 293T

CAPRIN1 (αFLAG)

GAPDH

M

com GFP (Figura 16). A expressão de FLAG-GFP apresenta um padrão predominantemente nuclear. Em contraste, a expressão de CAPRIN1 apresentou um padrão granular, sugerindo formação de grânulos de estresse ou de agregados de proteínas causados pela superexpressão. O controle de células não transfectadas não apresentou autofluorescência (imagem não mostrada pois apresenta ausência de sinal).

A marcação utilizada para o núcleo, DAPI, não pôde ser observada concomitantemente na microscopia confocal, pois o laser para excitação requerida não está disponível no microscópio que foi utilizado, portanto, as células não transfectadas foram identificadas em tons de cinza (painel inferior) e posteriormente foi avaliada a fluorescência.

Figura 16. CAPRIN1 está localizada no citoplasma celular e apresenta padrão granular.

Imunofluorescência utilizando anticorpo anti-FLAG em células transfectadas com FLAG-GFP,

com FLAG-CAPRIN1, e sem transfecção (painel inferior). Foi observada localização predominantemente nuclear da proteína GFP enquanto CAPRIN1 apresenta padrão granular citoplasmático, podendo ser decorrente da formação de grânulos de estresse.

8.5 Imunoprecipitação com proteína teste GFP

Como teste de padronização, o mesmo lisado proteico de células transfectadas com o plasmídeo pCDNA-FLAG-GFP usado para o Western blot, foi submetido a imunoprecipitação da proteína FLAG e comparado com o controle negativo de células não transfectadas. A imunoprecipitação foi realizada por meio de beads magnéticas com anticorpo anti-FLAG como descrito nos métodos.

Após a coloração do gel de poliacrilamida por prata (Figura 17), foi visualizada a banda correspondente ao peso esperado da proteína de fusão FLAG-GFP (29,52 KDa) tanto no eluído quanto no tampão das beads fervidas, significando que a imunoprecipitação e as lavagens funcionaram como esperado, porém o precipitado não foi inteiramente eluído.

Figura 17. Verificação da Imunoprecipitação de FLAG-GFP por gel corado com prata. A

amostra controle representa as células não submetidas à superexpressão e a amostra GFP+, células com superexpressão da proteína teste FLAG-GFP. Os controles de Input são formados por lisado proteico não submetido à Imunoprecipitação. Os eluídos, são formados pelos complexos purificados das beads após a imunoprecipitação. As amostras denominadas Beads, são formadas por tampão das beads após serem fervidas e as denominadas Sobrenadante por proteínas que não foram ligadas as beads na imunoprecipitação. M

eluição deve ser otimizada, pois a banda com o peso correspondente à proteína FLAG-GFP se apresentou mais intensa no fervido de beads.

8.6 Imunoprecipitação da proteína CAPRIN1

8.6.1 Transfecção

Como controle de eficiência de transfecção, uma placa de 6cm foi transfectada com o plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP. 48h após a transfecção, as células de cada placa foram tripsinizadas e contadas 4 vezes. A tabela 4 mostra as médias obtidas com as contagens de cada placa, neste caso a eficiência foi de aproximadamente 52%.

Tabela 4. Eficiência de transfecção nas condições do experimento de imunoprecipitação.

Foram contadas as células totais e em seguida as células expressando GFP. A última coluna representa a porcentagem das células transfectadas (células GFP+/total de células), nessas condições, de aproximadamente 52%

X104 células totais/mL X104 células GFP+/mL % de células Transfectadas

Placa1 344 175 51

Placa2 188 101 54

8.6.2 Imunoprecipitação

Para a purificação dos complexos proteicos, os lisados celulares de três placas de 10cm de diâmetro transfectadas com FLAG-CAPRIN1 foram submetidos à imunoprecipitação da proteína FLAG e comparado com o controle negativo de células transfectadas com o plasmídeo contendo FLAG-GFP. A imunoprecipitação foi realizada como descrito nos métodos.

Após a coloração do gel de poliacrilamida por prata (Figura 18), foi visualizada uma banda única correspondente ao peso esperado da proteína de fusão FLAG-GFP (29,52 KDa) no

eluído, significando que a imunoprecipitação e as lavagens funcionaram como esperado. A imunoprecipitação da proteína CAPRIN1 resultou em uma banda correspondente a aproximadamente 120KDa, maior que o resultante da tradução de sua sequência de nucleotídeos (78KDa), porém se aproxima do peso encontrado por Sabile e colaboradores41 bem como por Grill e colaboradores20. O arraste e outras bandas visualizadas nas lanes de IP são correspondentes a proteínas do complexo a serem analisadas por espectrometria de massas.

Figura 18. Gel de prata demonstrando a complexidade da amostra de IP de CAPRIN1. As

amostras usadas foram a proteína de interesse CAPRIN1 e o controle de espectrometria FLAG-GFP. Nas amostras Eluídos, estão representados os complexos purificados das beads após a imunoprecipitação, com bandas nos pesos esperados e bandas de proteínas interagentes em CAPRIN1. Os inputs são formados por proteínas do lisado anteriormente à Imunoprecipitação e os sobrenadantes pelo restante de proteínas após a imunoprecipitação. A imunoprecipitação e as lavagens funcionaram corretamente, bem como a eluição dos complexos. M representa o marcador Page Ruler.

Para uma análise especificamente da IP, as amostras foram submetidas ao Western blot com anticorpos para FLAG. Na revelação da membrana (Figura 19) pôde-se identificar as bandas correspondentes aos controles antes da imunoprecipitação (input) mais intensas que os controles após imunoprecipitação (sobrenadante), indicando a eficiência da

imunoprecipitação. As bandas de amostras eluídas das beads apresentaram pesos moleculares corretos equivalentes a FLAG-CAPRIN1 e FLAG-GFP e quantidade de amostra suficiente para espectrometria de massas.

Figura 19. Confirmação de imunoprecipitação de CAPRIN1 e GFP, utilizando-se anticorpo anti-FLAG. As amostras e controles de imunoprecipitação para FLAG-CAPRIN1 e controle

FLAG-GFP foram submetidas ao Western blot com anticorpo anti-FLAG. As bandas do controle input, que representa as proteínas totais das células transfectadas, confirma a superexpressão das proteínas FLAG-CAPRIN1 e FLAG-GFP. O controle sobrenadante, formado de proteínas depletadas da imunoprecipitação, confirma a ligação das proteínas de interesse às beads. Os eluídos, constituídos pela eluição do complexo das beads, apresenta bandas de tamanhos esperados para as duas amostras.

8.7 Espectrometria de massas

Após a confirmação da imunoprecipitação por Western blot, uma amostra de imunoprecipitação de FLAG-CAPRIN1 e uma de FLAG-GFP foram digeridas e dessalinizadas como descrito em métodos. As amostras prontas foram então injetadas no espectrômetro Orbitrap Velos ETD do Laboratório Nacional de Biociências (LnBio). A análise dos peptídeos encontrados foi realizada pelo LnBio.

Foram identificadas 226 proteínas, das quais se excluiu as proteínas comuns ao complexo de controle FLAG-GFP e ao complexo de CAPRIN1 por serem inespecíficas. Proteínas com menos de 3 peptídeos únicos identificados na amostra, também foram cortadas, já que a confiabilidade de que estes peptídeos sejam pertencentes à proteína identificada diminui. O complexo foi então caracterizado com 62 proteínas candidatas à interação com CAPRIN1 (Tabela 5).

Tabela 5. Interagentes de CAPRIN1 identificados por espectrometria de massas. Após

analises iniciais, 63 proteínas foram identificadas como possíveis interagentes de CAPRIN1. Os símbolos dos genes correspondentes são representados abaixo com a frequência de peptídeos encontrada na amostra (score).

Após análises iniciais, a lista de proteínas foi clusterizada por função molecular no software cytoscape (app BINGO). Observou-se que das funções menos especificas, as que estavam mais enriquecidas nesta amostra eram de ligação a RNA, ligação a ácidos nucleicos e ligação a proteínas (figura 20). Para direcionar a análise, as proteínas foram então, submetidas à

Official gene symbol Unique peptides Official gene symbol Unique peptides Official gene symbol Unique peptides

caprin1 19 DHX9 5 HNRNPK 4 HSPA1A 12 G3BP1 5 DDX17 4 HSPA8 11 TUBB 5 SRRM2 4 YBX1 10 SERBP1 5 RPL7 3 EIF4B 9 HNRNPR 5 DDX5 3 HNRNPC 9 MAP1B 4 RPS3A 3 PRMT5 8 RPS6 4 RPS3 3 RPLP2 8 WDR77 4 IGF2BP3 3 YBOX3 8 PABPC1 4 PPM1B 3 HNRPD 7 HNRNPH1 4 RPS17 3 SRSF1 7 PRMT1 4 NCL 3 ILF3 7 RPLP0 4 RBMX 3

IGF2BP1 7 PABPC4 4 HSPA9 3

Syncrip 6 TUBB4A 4 EIF2S3 3

RPL7A 6 XRCC6 4 TUBA1B 3 SF3B3 6 HNRNPL 4 SPTBN1 3 HNRNPA1 5 HNRNPA2B1 4 NCBP1 3 RPL12 5 RPL21 4 ILF2 3 KIF11 5 RPS9 4 FLNA 3 RPS8 5 HNRNPH2 4 BCLAF1 3 HNRNPU 5 RPL23 4 RTCB 3

análise de enriquecimento no banco de dados DAVID Bioinformatics Resources 6.7, que mostrou que a maior parte das proteínas candidatas, 63,2%, são classificadas como RBPs (figura 21). Uma das proteínas identificadas foi a G3BP1, um marcador de grânulos de estresse bem estabelecido. Esses resultados indicam a formação e a consequente precipitação de grânulos de estresse, já que nesses complexos há enriquecimento dessa classe de proteínas. O marcador de grânulos de estresse mais comum, TIA1, não foi identificado, porém, na imunoprecipitação não foi usado inibidor de RNase, portanto componentes mais distantes podem ter sido perdidos.

Figura 20. Enriquecimento da amostra em funções de ligação. Por meio do software

cytoscape, a clusterização mostrou as funções moleculares mais enriquecidas (mais escuras). As setas estão na direção da função mais geral para mais específica. A análise mostra que proteínas com funções de ligação (à RNAs, à ácidos nucleicos ou à proteínas) aparecem mais na amostra.

Tabela 6. Proteínas de ligação à RNA representam 63,2% da amostra. O banco de dados