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As autoras deste livro e a EDITORA ROCA empenharam seus melhores esforços para assegurar que as informações e os procedimentos apresentados no texto estejam em acordo com os padrões aceitos à época da publicação, e todos os dados foram atualizados pelas
autoras até a data da entrega dos originais à editora. Entretanto, tendo em conta a evolução das ciências da saúde, as mudanças
regulamentares governamentais e o constante fluxo de novas informações sobre terapêutica medicamentosa e reações adversas a fármacos, recomendamos enfaticamente que os leitores consultem sempre outras fontes fidedignas, de modo a se certificarem de que as informações contidas neste livro estão corretas e de que não houve alterações nas dosagens recomendadas ou na legislação regulamentadora. Adicionalmente, os leitores podem buscar por possíveis atualizações da obra em http://genio.grupogen.com.br.
As autoras e a editora se empenharam para citar adequadamente e dar o devido crédito a todos os detentores de direitos autorais de qualquer material utilizado neste livro, dispondose a possíveis acertos posteriores caso, inadvertida e involuntariamente, a identificação de algum deles tenha sido omitida. Direitos exclusivos para a língua portuguesa Copyright © 2015 by EDITORA GUANABARA KOOGAN LTDA. Publicado pela Editora Roca, um selo integrante do GEN | Grupo Editorial Nacional Travessa do Ouvidor, 11 Rio de Janeiro – RJ – CEP 20040040 Tels.: (21) 35430770/(11) 50800770 | Fax: (21) 35430896 www.grupogen.com.br | [email protected] Reservados todos os direitos. É proibida a duplicação ou reprodução deste volume, no todo ou em parte, em quaisquer formas ou por quaisquer meios (eletrônico, mecânico, gravação, fotocópia, distribuição pela Internet ou outros), sem permissão, por escrito, da EDITORA GUANABARA KOOGAN LTDA. Capa: Bruno Sales Produção digital: Geethik Ficha catalográfica B513 Biologia molecular / organização Alexsandro Macedo Silva, Luciane Maria Ribeiro Neto; coordenação Monica V. N. Lipay, Bianca Bianco. 1. ed. Rio de Janeiro: Roca, 2015. 254 p. : il.; 24 cm. (Análises clínicas e toxicológicas : métodos e interpretação) Inclui bibliografia e índice ISBN 9788527727679 1. Biologia molecular 2. Citologia. I. Silva, Alexsandro Macedo. II. Ribeiro Neto, Luciane Maria. III. Lipay, Monica V. N. IV. Bianco, Bianca. V. Série. 1522189 CDD: 571.6 CDU: 576
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Colaboradores
Ana Claudia Trocoli Torrecilhas
Professora. Especialista em Parasitologia pela Universidade de São Paulo (USP). Mestre em Relação Patógeno hospedeiro pela Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Doutora em Relação Patógenohospedeiro pela USP. Professora Adjunta da disciplina Parasitologia e Imunologia Clínica do Departamento de Ciências Biológicas da Unifesp.
Carla Peluso de Paiva
Biomédica. Especialista em Genética pelas Faculdades Metropolitanas Unidas. Mestre em Ciências da Saúde pela Faculdade de Medicina do ABC (FMABC). Professora Aulista da disciplina Genética do Departamento de Fisioterapia da FMABC.
Carolina Tosin Bueno
Farmacêutica. Doutoranda da Faculdade de Medicina da USP (FMUSP).Denise Maria Christofolini
Geneticista. Mestre e Doutora em Genética pela Unifesp. Professoraassistente da disciplina Genética do Departamento de Morfologia da FMABC.Eny Maria Goloni Bertollo
Professora Universitária. Geneticista. Especialista em Genética e em Biologia Molecular pelo Conselho Regional de Biologia de São Paulo (CRBioSP). Mestre e Doutora em Genética pela Universidade Estadual Paulista (Unesp). Livre docente em Genética Humana e Médica pela Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (Famerp). Professora Adjunta das disciplinas Genética, Biologia Molecular e Genética Médica do Departamento de Biologia Molecular da Famerp. Pesquisadora e Orientadora do Programa de Pósgraduação em Ciências da Saúde da Famerp. Responsável pelo Serviço de Aconselhamento Genético do Hospital de Base da Fundação Faculdade Regional de Medicina (Funfarme/Famerp).
Érika Cristina Pavarino
Professora Universitária. Geneticista. Especialista em Genética e em Biologia Molecular pelo CRBioSP. Doutora em Ciências Biológicas pela Unesp. Livredocente e Professora Adjunta do Departamento de Biologia Molecular da Famerp. Professora das disciplinas Genética, Genética e Médica e Biologia Molecular do Departamento de Biologia Molecular da Famerp, Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular (UPGEM).
Fernanda Abani Mafra
Biomédica. Especialista em Genética Humana pela Universidade Metodista de São Paulo. Mestre e Doutoranda em Ciências da Saúde pela FMABC.
Fernando Luiz Affonso Fonseca
Farmacêuticobioquímico. Mestre e Doutor em Hematologia e Clínica Médica pela FMUSP. Professor Adjunto da Unifesp (campus Diadema). Professorassistente da FMABC. Coordenador do Laboratório de Análises Clínicas da FMABC.Jane Zveiter de Moraes
Especialista em Imunologia pela Unifesp. Mestre e Doutora em Ciências da Vida pela Unifesp. Professora Associada da disciplina Físicoquímica do Departamento de Biofísica da Unifesp.[email protected]
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Leiliane Rodrigues Marcatto
Farmacêutica. Mestranda da FMUSP.Mariana Ferreira Leal
Professora Afiliada e Pesquisadora do Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Unifesp. Mestre e Doutora em Ciências pelo Programa de Pósgraduação em Morfologia/Genética da Unifesp.
Nívea D. Tedeschi Conforti (in memoriam)
Mestre e Doutora em Genética pela Unesp. Pósdoutora pela Universidade do Texas (EUA), ramo médico de Galveston. Professora Aposentada da Unesp (campus São José do Rio Preto). Coordenadora da Divisão de Farmacogenética do Centro de Genomas de São Paulo.Patrícia Matos Biselli Chicote
Geneticista. Doutora em Ciências da Saúde pela Famerp. Pósdoutoranda do Programa de Pósgraduação da Famerp. Pesquisadora da UPGEMFamerp.Patricia Xander
Professora. Doutora em Ciências pela Unifesp. Professora Adjunta II da disciplina Imunologia Básica e Diagnóstico Laboratorial das Doenças Infecciosas e Parasitárias do Departamento de Ciências Biológicas da Unifesp (campus Diadema).
Paula Fernanda da Silva Fonseca
Biomédica. Especialista em Vigilância Sanitária pela Universidade Guarulhos. Mestranda em Ciências Médicas pela FMUSP.
Paulo Caleb Júnior de Lima Santos
Professor do Programa de Pósgraduação em Ciências Médicas da FMUSP. Pósdoutor pelo Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do Instituto do Coração (InCor) do Hospital das Clínicas da FMUSP (HCFMUSP). Doutor pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP. FarmacêuticoBioquímico pela Universidade Federal de Alfenas (Unifal).
Priscila Keiko Matsumoto Martin
Biomédica. Mestre em Biologia Molecular pela Unifesp. Doutoranda da disciplina Biologia Molecular do Departamento de Bioquímica da Unifesp.Renata Pellegrino
Biomédica. Mestre em Morfologia (Genética) e Doutora em Psicobiologia pela Unifesp. Pósdoutora em Genômica pelo The Children’s Hospital of Philadelphia. Senior Research Associate do Center for Applied Genomics, The Children’s Hospital of Philadelphia.Sang Won Han
Professor Associado. Especialista em Terapia Gênica e Celular pela Unifesp. Mestre e Doutor em Bioquímica pela USP. Professor da disciplina Físicoquímica do Departamento de Biofísica da Unifesp.
Wagner Luiz Batista
Professor. Doutor em Ciências pela Unifesp. Professor Adjunto III das disciplinas Microbiologia Básica e Diagnóstico Laboratorial das Doenças Infecciosas e Parasitárias do Departamento de Ciências Biológicas da Unifesp.
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Dedicatória
Dedicamos este livro a pessoas especiais,
que nos iluminam, inspiram e incentivam:
Marco e André, Álvaro e Fernando.
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Agradecimentos
Aos colaboradores, por aceitarem fazer parte desta jornada conosco e nos ajudarem a concretizála. Obrigada por toda confiança, parceria e paciência e por colocarem seus conhecimentos à disposição. Ao Grupo GEN, pela oportunidade, pelo profissionalismo e pela dedicação com que nos acolheu. Aos Drs. Luciane Maria Ribeiro Neto e Alexsandro Macedo Silva, pelo convite para coordenar esta obra. Aos familiares da Dra. Nívea, por nos permitirem incluir seu último trabalho neste livro e, assim, homenagear a grande mestre e amiga que foi. À grande parceria desta e de outras jornadas. Monica V. N. Lipay Bianca Bianco 6
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Apresentação da Série
A série “Análises Clínicas e Toxicológicas” é uma coletânea de livros na área de análises clínicas e toxicológicas que aborda os métodos empregados para o diagnóstico laboratorial de doenças e a interpretação dos resultados para garantir a qualidade analítica e a adequada orientação ao paciente. Esta obra foi idealizada para ser usada por estudantes e profissionais da área de saúde como fonte de consulta. Sua leitura permitirá aprender, revisar ou aprimorar os conhecimentos sobre as questões analíticas, bem como a interpretação de seus resultados na área de análises clínicas e toxicológicas.
Esta série visa a facilitar o acesso às informações de forma prática e rápida, para a execução de métodos analíticos, a interpretação de resultados e a resolução de problemas. Os autores são profissionais e docentes atuantes em suas respectivas áreas, que contribuem para a qualidade, a clareza e a praticidade do conteúdo apresentado. Os principais temas abordados nesta série são: hematologia, bioquímica, imunologia, hormônios, citologia, parasitologia, biologia molecular, microbiologia e micologia e toxicologia ocupacional.
O objetivo de apresentar esses conteúdos em formato de série está fundamentado na importância das análises clínicas e toxicológicas na área da Saúde Pública. Por meio da escolha de métodos adequados e da correta interpretação de resultados, é possível diagnosticar e tratar doenças de forma mais rápida e eficiente ou prevenir doenças, minimizando custos para o sistema de saúde e melhorando a qualidade de vida do paciente.
O estudante e o profissional que desejam atuar em análises clínicas e toxicológicas precisam ter o referencial teórico para desenvolver as competências que a área requer. Neste sentido, a série “Análises Clínicas e Toxicológicas” busca cumprir o seu papel de fonte de consulta na área, sendo sistematicamente revisada e atualizada. Portanto, os livros desta série pretendem ser referência de métodos analíticos, diagnóstico laboratorial, investigação clínica e terapêutica, contribuindo para a qualidade dos resultados analíticos e a promoção da saúde pública. Desejase que os leitores aproveitem as obras publicadas de forma crítica, para que possam avaliar e aplicar soluções de intervenção na prática das análises clínicas e toxicológicas. Alexsandro Macedo Silva Luciane Maria Ribeiro Neto
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Apresentação
Editar este livro envolveu reflexão e perseverança sobre a ideia de uma obra que reunisse diferentes aspectos das abordagens da Biologia Molecular e suas aplicações, cada vez mais diversificadas. Em nossa visão apaixonada da Genética, os temas selecionados precisavam partir de uma obra em comum, que tornasse essa diversidade acessível e agradável ao público surgido de sua crescente extensão. Ao compor este livro, procuramos selecionar temas de importância na aplicação das técnicas de Biologia Molecular ao estudo das doenças e características humanas. Ao finalizá lo, percebemos que atingimos mais do que isso, destacando desde aspectos básicos da rotina laboratorial, de coleta e processamento de amostras, até as metodologias mais utilizadas, além de diversas perspectivas e do estado da arte de técnicas sofisticadas, fruto das conquistas pioneiras do Projeto Genoma Humano e de toda a revolução que ele provocou na ciência.
Nesse longo processo, desde a ideia até a concepção final, esta obra revelou um time de pessoas especiais, que discorreram sobre temas de suas especialidades de modo dedicado e completo, envolvendo velhas e novas amizades e parcerias. E, desse modo, como um rio fica mais completo se houver pontes, nos permitimos navegar pelos caminhos da Biologia Molecular e explorar variados aspectos cruzando esse conhecimento por diferentes lados (ou margens!).
Agradecemos a todos os colegas que colaboraram para essa conquista, pela dedicação, paciência e parceria. E esperamos que, aos nossos leitores, essa viagem pela Biologia Molecular atenda às expectativas e seja tão fascinante quanto é para cada um dos que construíram essa obra.
Monica V. N. Lipay Bianca Bianco
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Prefácio
Biologia Molecular pode ser considerado um guia para consulta tanto no ambiente dos laboratórios quanto para
profissionais de áreas correlatas e estudantes de graduação e pósgraduação interessados no estudo das características e das doenças humanas.
Nos primeiros quatro capítulos são discutidos os aspectos básicos da biologia molecular, que envolvem o trabalho de laboratório: organização, preparo de reagentes, coleta e amostragem de material biológico, conceitos de segurança e controle de qualidade. Em seguida, são apresentadas as principais técnicas utilizadas na atualidade, com suas variações mais frequentes. O livro ainda inclui algumas das mais importantes aplicações das técnicas empregadas nesse estudo, discutidas por profissionais com significativa expertise na área.
Monica V. N. Lipay Bianca Bianco
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Sumário
Bases Teóricas para Investigação Laboratorial Amostragem de Material Biológico Principais Técnicas Utilizadas em Coletas e Extrações de Ácidos Nucleicos Controle de Qualidade no Laboratório de Biologia Molecular Reação em Cadeia da Polimerase Desvendando a Técnica de MLPA Análise de Proteômica Quantitativa Microarrays | Microarranjos de DNA Aplicações da PCR e suas Variações na Microbiologia Clínica Aplicações da PCR na Parasitologia Aplicações da Biologia Molecular em Farmacogenômica Aplicações da PCR em Hematologia Aplicações da Biologia Molecular em Genética de Populações Técnicas de FISH e CGH nas Análises Clínicas e Toxicológicas Citogenômica Aplicada à Medicina Terapia Celular[email protected]
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Introdução
Desde a primeira metade do século 19, alguns países europeus e também os EUA começaram a adotar descobertas no campo das ciências e técnicas biomédicas. No decorrer desses 100 anos, o triunfo da clínica, a medicina préindustrial, o desenvolvimento da medicina laboratorial e experimental e a descoberta do compartimento das células culminaram com o uso da investigação laboratorial e, mais especificamente, dos métodos moleculares para essas investigações. O triunfo da clínica teve seu início no século 18, quando o médico passou a utilizar o ambiente hospitalar para estudos das doenças (casos clínicos). Esse ambiente ainda é usado como cenário de prática para sua própria formação acadêmica e científica. Contudo, na era préindustrial, o diagnóstico era realizado pelo “olhar” clínico singular, ao que se chamava “arte do diagnóstico por excelência”. Nessa época, houve uma passagem lenta da medicinaarte para medicinaciência (baseada na observação, sistemática, controlada e voltada para o doente). Além disso, nesse período, iniciouse o desenvolvimento da fisiologia, da química e da biologia, de modo que a formação dos médicos se fundamentou na anatomia e na patologia. Assim, com a introdução da patologia, a arte do diagnóstico consistia, de certa maneira, em antecipar o que a anatomia patológica descobriria depois da morte.
O desenvolvimento da medicina laboratorial e experimental provocou uma mudança na medicina como um todo, que passou a sofrer uma transformação e, já no século 20, viu a aplicação do conhecimento baseado na bacteriologia e nos estudos laboratoriais. Essa transformação foi marcada pelo aumento de contingente de pessoal médico e paramédico dentro dos hospitais e pela interação entre as ciências biológicas e não biológicas, como a física e a química, que foram desenvolvidas por Pasteur, Koch e Bernard.
Claude Bernard, fisiologista, pode ser considerado um dos fundadores da medicina laboratorial. Sua descoberta da produção hepática do glicogênio foi o início do uso do laboratório para fundamentar as bases da determinação de analitos inerentes ao funcionamento de órgãos ou sistemas. Já Louis Pasteur pode ser considerado o criador da bacteriologia patológica, pois conseguiu demonstrar a teoria do germe, a partir da qual descobriu os microrganismos como causadores de doenças, colocando fim na teoria da geração espontânea. Além disso, foi capaz de unir esses conhecimentos laboratoriais para identificação dos estreptococos à observação clínica e, assim, desenvolveu a vacina contra a raiva. Robert Koch, por sua vez, identificou o bacilo da tuberculose e, em viagem ao Egito e à Índia, isolou o vibrião da cólera e definiu a sequência da investigação bacteriológica, definindo métodos de análises pautados em epidemiologia.
O fim dessa transformação, tanto na Europa quanto nos EUA, foi marcado pelo enfeudamento do hospital com o laboratório, quando o primeiro passou a fornecer casos ao segundo, o qual passou a compartilhar os frutos das ciências com o hospital.
O desenvolvimento das metodologias laboratoriais moleculares só foi possível por causa do descobrimento do compartimento nuclear (núcleo), a partir do qual houve o desenvolvimento da citologia clínica, da teoria da seleção natural e das leis da hereditariedade e a descoberta da molécula do DNA, do cromossomo e do código genético. Com essa
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riqueza de informações, foi possível introduzir os métodos moleculares para investigação de doenças.
Medicina diagnóstica e medicina laboratorial
“Medicina diagnóstica” é o termo usado atualmente para se referir a um conglomerado de especialidades direcionadas à realização de exames complementares no auxílio ao diagnóstico, com impacto nos diferentes estágios da cadeia da saúde: prevenção, diagnóstico, prognóstico e acompanhamento terapêutico. Fazem parte desse mercado os laboratórios de patologia clínica e medicina laboratorial, de anatomia patológica, as clínicas de radiologia e imagem e outras especialidades, conjuntamente denominadas centros de diagnósticos, que fornecem todas as informações sobre o paciente.
Cada vez mais, percebemse tendências à integração desses serviços na medicina diagnóstica. Essa integração traz benefícios para as diferentes partes relacionadas, como: os pacientes, que passam a contar com centros de alta resolubilidade; a comunidade médica, oferecendo laudos e suporte por meio de diagnósticos integrados; e o próprio mercado, que se torna ainda mais competitivo e passa a ter empresas sólidas com alto poder de investimento, favorecendo o crescimento e a profissionalização dos que trabalham com saúde, além de incentivar o uso de novos meios de gestão nas empresas de saúde.
A medicina laboratorial referese à prática da seleção, provisão e interpretação do exame diagnóstico que usa principalmente amostras de pacientes. Os exames na medicina laboratorial podem ser direcionados para confirmar uma suspeita clínica, excluir um diagnóstico, auxiliar na seleção, na otimização e no monitoramento do tratamento, fornecer um prognóstico ou fazer a triagem para a doença na ausência de sinais ou sintomas clínicos. O exame também é usado para estabelecer e monitorar a gravidade de um distúrbio fisiológico.
Essa medicina inclui desde a bioquímica clínica até os diagnósticos moleculares e as disciplinas tradicionais, como toxicologia, endocrinologia, genética molecular, microbiologia, hematologia, hemostasia, medicina transfusional e imunologia, além da citologia e da anatomia patológica. O manejo e a interpretação das informações (incluindo informática laboratorial) são aspectos essenciais do serviço de medicina laboratorial, assim como as atividades relacionadas com manutenção da qualidade (controle de qualidade, testes de proficiência, auditoria, aferição) e gestão clínica (administração das organizações de saúde).
Medicina baseada em evidências
Atualmente, houve a introdução na medicina laboratorial dos campos da epidemiologia clínica e da medicina baseada em evidências (MBE). Os epidemiologistas clínicos desenvolvem projetos de estudo para quantificar a acurácia do diagnóstico dos exames desenvolvidos em medicina laboratorial e métodos de estudo para avaliar o efeito e o valor do exame laboratorial na assistência à saúde. Dessa maneira, priorizam o uso da melhor evidência disponível a partir dos estudos bem projetados no cuidado dos pacientes individualmente. Além disso, essa prática reformula problemas no cuidado clínico dos pacientes em perguntas estruturadas, procura evidências clínicas disponíveis, avalia a qualidade dos estudos clínicos e as implicações clínicas dos resultados e fornece ferramentas para ajudar os médicos a usarem de maneira ideal aqueles resultados no cuidado dos pacientes individualmente. Podese definir a MBE como o uso consciencioso, criterioso e explícito da melhor evidência na tomada de decisões sobre o cuidado individual dos pacientes. A palavra “criterioso” significa o uso de habilidades de médicos experientes em colocar as evidências em um contexto e em reconhecer a individualidade e as preferências dos pacientes. Um dos objetivos da MBE é incorporar as melhores evidências da pesquisa clínica às decisões clínicas – a palavra “melhores” significa a necessidade de avaliação crítica; as palavras “tomar decisões” indicam por que os princípios da MBE podem e devem ser aplicados na medicina laboratorial, uma vez que esta é uma das ferramentas essenciais usadas na tomada de decisões na prática médica.
As justificativas para uma abordagem baseada em evidências para a medicina estão fundamentadas na constante exigência de informações, na adição frequente de novas informações, na qualidade precária do acesso a boas informações, no declínio do conhecimento atualizado e/ou da experiência com o passar dos anos de uma prática médica individual, no tempo limitado disponível para consultar a literatura e na variabilidade dos valores e preferências individuais dos pacientes. A estas, podemse adicionar, especificamente em relação à medicina laboratorial: Número limitado e qualidade precária dos estudos que ligam os resultados dos exames aos benefícios aos pacientes Avaliação ruim do valor dos exames diagnósticos Demanda sempre crescente de exames Abordagem incoerente à alocação de recursos na medicina laboratorial (limites de orçamentos).
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A prática da MBE requer: conhecimento do processo e conversão de um objetivo clínico em pergunta que possa ser respondida; facilidade para originar e avaliar criticamente as informações para gerar conhecimentos, um recurso do conhecimento criticamente avaliado; capacidade para usar o recurso do conhecimento, isto é, um meio de acessálo e distribuílo; uma estrutura de responsabilidade clínica e econômica de prestação de contas; e uma estrutura de administração da qualidade.
A Tabela 1.1 elenca outros fatores que não devem mais ser usados na prática médica e laboratorial.
Medicina laboratorial baseada em evidências
Os serviços de medicina laboratorial são ferramentas importantes na disposição dos médicos para responder a perguntas diagnósticas e ajudar a tomar decisões.
As ferramentas fornecidas pela medicina laboratorial são chamadas de exames diagnósticos, os quais são usados muito mais amplamente do que apenas para fazer um diagnóstico. Como mencionado anteriormente, exames também podem ser realizados para fazer um prognóstico, excluir um diagnóstico, monitorar um tratamento ou processo de doença e fazer triagem para esta.
Tabela 1.1 Outros fatores além da MBE que podem influenciar as decisões clínicas.
Prática médica Características
Medicina baseada em eminência Colegas mais experientes que acreditam que a experiência supera as evidências Medicina baseada em veemência Substituição das evidências pelo volume e pela estridência
Medicina baseada em eloquência Elegância sartória e eloquência verbal Medicina baseada em providência A decisão é deixada nas mãos do líder religioso
Medicina baseada em di〼‾dência O médico di〼‾dente não faz nada por causa de um sentimento de desespero Medicina baseada em nervosismo O medo de um processo é um estímulo para o excesso de investigação e de
tratamento Medicina baseada em con〼‾ança Bravata Modificado de Isaacs e Fitzgerald, 1999.1
A medicina laboratorial baseada em evidências é simplesmente a aplicação de princípios e técnicas da MBE na medicina laboratorial. O médico que pede uma investigação espera que o resultado do exame o ajude a responder a uma pergunta e auxilie na sua decisão. Assim, o processo de tomada de decisão envolve um dos quatro cenários exemplificados pelas seguintes perguntas: Qual é o diagnóstico? Outro diagnóstico pode ser descartado? Qual é o prognóstico desse paciente? Qual é a condição desse paciente? Dentro de uma lógica clínica e laboratorial, a solicitação dos exames serve de base para unir as suspeitas do médico quando realizada a história clínica. Na primeira pergunta, procurase um diagnóstico. As conclusões levam a uma decisão e a alguma forma de ação, o que frequentemente envolve uma intervenção projetada para melhorar os desfechos. Assim, quando se solicita a dosagem de paracetamol e notase elevação desse fármaco, por exemplo, a administração de N acetilcisteína reduzirá o risco de um desfecho fatal. Nesse caso clínico, a mensuração do paracetamol é chamada de “exame para inclusão”.
Na segunda pergunta, o resultado do exame exclui um diagnóstico – este é chamado de “exame para exclusão”. Quando um paciente se queixa de dor torácica e há suspeita de infarto agudo do miocárdio, o achado de que a troponina I
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é indetectável no plasma pode ser usado para descartar a necrose miocárdica aguda.
Já na terceira situação, a pergunta é usada para o prognóstico, que pode ser considerado a avaliação de risco, e complementa a aplicação do diagnóstico. Exemplo dessa situação é quando se mensura a concentração de RNA do vírus da imunodeficiência humana (HIV) no plasma. Após o diagnóstico inicial de infecção pelo HIV, a medida da concentração pode ser usada para prever o intervalo antes do colapso imune se o distúrbio não for tratado.
A quarta pergunta está relacionada com o tratamento do paciente. O resultado do exame de um paciente com uma doença crônica pode ser usado para selecionar o tipo de intervenção e avaliar sua efetividade. Exemplo disso ocorre nos pacientes diabéticos, em que as mensurações de hemoglobina glicada (HbA1c) são usadas para avaliar o controle glicêmico e, assim, a efetividade da terapia. Se a HbA1c estiver alta, devese considerar a mudança do tratamento; se não estiver alterada, mostrandose dentro dos valores desejáveis, o tratamento vigente deve ser mantido.
Em cada um dos exemplos supracitados, há três componentes presentes: uma pergunta, uma decisão e uma ação. Identificálos é crucial para o planejamento de estudos de utilidade ou desfecho do exame. O reconhecimento dessa tríade levou à definição de um pedido de exame adequado, aquele que possui uma pergunta clínica para a qual o resultado fornecerá uma resposta, possibilitando ao médico tomar uma decisão e iniciar a ação que levará a um benefício de saúde para o paciente. O critério principal para a utilidade de um exame é que o resultado possa levar a uma mudança na probabilidade da presença do distúrbioalvo. A mudança na probabilidade em si não é fator decisivo. O médico tem de usar essa informação, aliada a outros achados e ao julgamento clínico, para tomar decisões ou fazer recomendações sobre o cuidado. Na maioria dos casos, o exame deve ser seguido de uma intervenção apropriada para produzir um desfecho desejado. Um resultado de exame sozinho pode tranquilizar ou permitir compreender a origem de uma queixa, mas, ainda assim, podem ser exigidas explicações e tranquilização por parte do médico. Por causa da dificuldade de se documentar que determinado exame melhora os desfechos do paciente, grande parte das pesquisas aborda apenas as características analíticas e o desempenho diagnóstico dos exames, e não seus efeitos na vida dos pacientes. A pesquisa restrita prejudica a compreensão e a contribuição dada pelo resultado do exame. Um exemplo disso pode ser um estudo randomizado de um protocolo rápido de avaliação de dor torácica, que mostra que os resultados normais para marcadores cardíacos descartam o infarto do miocárdio, mas não abordam o fato de o exame levar a menos admissões na unidade de cuidados coronarianos, com redução da mortalidade e morbidade.
Uso clínico do exame laboratorial
A prática clínica geralmente se depara com perguntas e incertezas, resultantes da primeira análise de informações oriundas do paciente. Os testes diagnósticos, laboratoriais ou não, são uma ferramenta valiosa que o clínico utiliza para, aliado ao seu juízo crítico e conhecimento prévio, estabelecer a etiologia das queixas ou anormalidades dos pacientes. Para a prática da medicina sob o novo paradigma da MBE, tanto o médico quanto o analista clínico devem estar familiarizados com as questões que dizem respeito à precisão, à exatidão e à acurácia de determinado teste, baseado nesses conceitos básicos e nos quais estará centrada a discussão da aplicabilidade e da validade do resultado para o paciente em questão.
A seguir, são descritos alguns conceitos básicos e extremamente importantes para a avaliação correta de um teste diagnóstico, laboratorial ou não.
Acurácia do teste
A relação entre o resultado de uma prova diagnóstica, seja laboratorial ou não, e a ocorrência da enfermidade que ela busca diagnosticar é normalmente visualizada em uma tabela 2×2, como mostra a Tabela 1.2. Notase que apenas em duas dessas combinações o teste está correto. Isso ocorre porque, na verdade, não existem provas perfeitas, capazes de acertar todos os diagnósticos. A acurácia é a proporção de testes verdadeiramente positivos e verdadeiramente negativos em relação à totalidade dos resultados (a+d/a+b+c+d). A capacidade do teste, entretanto, é mais frequentemente medida por meio de sua sensibilidade e especificidade, igualmente derivadas dessa tabela.
Tabela 1.2 Tabela 2×2, para cálculo de acurácia, sensibilidade e especificidade de um teste diagnóstico.
Enfermidade
Teste Presente Ausente
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Positivo Verdadeiro-positivos (a) Falso-positivos (b) Negativo Falso-negativos (c) Verdadeiro-negativos (d)
O indicador utilizado para determinar a presença ou não da doença é o que se chama de “padrãoouro”, normalmente difícil de ser encontrado. Na maioria das vezes, a certeza sobre a existência da doença só se dá com o uso de metodologias invasivas, como cirurgias e biopsias, ou já inúteis para aquele caso em particular, como as necropsias.
Sensibilidade
É definida como a proporção de indivíduos doentes que têm o teste positivo. A casela “a” da tabela 2×2 serve de base para o cálculo da sensibilidade, ou seja, S = a/a+c. Um teste muito sensível dificilmente deixa de identificar as pessoas doentes. Sua aplicação clínica ideal, portanto, seria para excluir doentes. Convém ressaltar a diferença entre a sensibilidade aqui definida e a sensibilidade analítica, quantidade mínima do analito capaz de ser diferenciada de zero pelo método em particular.Especificidade
Definida como a proporção de indivíduos sadios que apresentam teste negativo, é relacionada com a casela “d” da tabela 2×2, ou seja: E = d/b+d. Um teste muito específico exclui a grande maioria das pessoas sadias testadas. Sua aplicação clínica recomendável seria para confirmar uma doença.Valores preditivos
Assim como a sensibilidade e a especificidade estão diretamente relacionadas com o desempenho ou a acurácia de um teste, os valores preditivos estão relacionados com a estimativa da presença ou não da doença, com base no resultado positivo ou negativo do teste. Calculadas nas linhas horizontais da tabela 2×2, as fórmulas são as seguintes: VPP (valor preditivo positivo): a/a + b × 100 (percentual) VPN (valor preditivo negativo): d/d + c × 100 Os resultados de VPP devem ser interpretados levando em conta as prevalências das doenças nas populações testadas. Assim, um teste para diagnóstico do HIV que tenha VPP de 20% pode parecer ineficaz, mas tornase útil quando se sabe que a prevalência da doença na população geral é menor do que 1%.Likelihood ratio ou razão de probabilidades (razão de
verossimilhança)
A mais valiosa ferramenta para a prática clínica e laboratorial na análise de um teste diagnóstico é, sem dúvida, o
likelihood ratio (LR). Definido como a possibilidade de um resultado de um teste em particular para uma pessoa com a doença de interesse, é dividido pela probabilidade daquele resultado de teste para uma pessoa sem a doença de interesse. Matematicamente, obtêmse os LR usandose a seguinte fórmula: LR+: Sensibilidade/1Especificidade LR–: 1Sensibilidade/Especificidade Neste caso, os valores de S e E são expressos em proporções, e não em porcentagens. Quanto maior o valor LR+ de um teste, maior a sua capacidade de diagnosticar a doença, enquanto um valor de LR– baixo revela uma baixa suspeita da doença em pacientes com teste negativo. Como sempre se parte da probabilidade inicial da doença (conhecida como probabilidade préteste), o valor de 1 é neutro, ou seja, um teste com LR+ de 1 não acrescenta nada ao diagnóstico, mesmo sendo positivo. Conhecendose ou estimandose uma probabilidade préteste e o LR do teste aplicado, podese, com tranquilidade, definir quantas vezes aumentou ou diminuiu a chance do paciente que tem um teste positivo ou negativo. A probabilidade préteste depende da combinação de valores epidemiológicos (prevalência), mas principalmente de uma avaliação clínica criteriosa e quantitativa. A Tabela 1.3 mostra o comparativo entre duas metodologias aplicadas à
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determinação da HbA1c. A metodologia X (nova metodologia) está sendo comparada a partir da metodologia Y (metodologia de referência e consagrada) cujo ponto de corte é a concentração acima de 6,5%.
Avaliandose a tabela, notase, no ponto de corte de 6,5% determinado pelo método Y (consagrado pela literatura), o valor de 82% dos indivíduos classificados corretamente como alterados para o parâmetro HbA1c. Nessa faixa de avaliação, a sensibilidade é de 74,1% e a especificidade é de 87,3%. A chance do paciente é de 5,85 vezes de não responder ao tratamento, já que o LR+ foi de 5,85.
Adicionase à avaliação citada anteriormente o ponto de corte ou valor de referência. Não há dúvidas de que um ponto crucial na correta interpretação de um teste laboratorial é o seu “ponto de corte”, ou seja, o limiar a partir do qual ele se torna “positivo” ou discriminador da doença. Os profissionais devem estar cientes de que, dependendo da maneira em que esse ponto for definido, muda o enfoque com que o teste passa a ser visto.
O modo clássico com que os laboratórios de análises clínicas definem seus valores de referência segue os recomendados pelo fabricante do kit que está sendo usado. Esse procedimento pode levar a interpretações errôneas e aquele que deseja fazer o melhor uso dos testes diagnósticos deve ter extrema cautela com esse hábito. Uma análise mais criteriosa por parte do responsável pelo laboratório deveria ser feita antes de se adotar um ponto de corte preestabelecido. Sugeremse os seguintes pontos para essa determinação: Tabela 1.3 Capacidade do método X de classificar indivíduos segundo valores de hemoglobina glicada comparado ao método Y. Ponto de corte – Método X
(%) Sensibilidade (%) Especi␀⠀cidade (%) Classi␀⠀cados corretamente(%)
Razão de verossimilhança Positivo Negativo ≥ 4 100,0 0,0 40,6 1,04 < 0,001 ≥ 5 100,0 40,5 64,7 1,68 < 0,001 ≥ 5,7 92,6 74,7 82,0 3,66 0,10 ≥ 5,8 90,7 78,5 83,5 4,22 0,12 ≥ 5,9 87,0 79,8 82,7 4,30 0,16 ≥ 6 83,3 83,5 83,5 5,06 0,20 ≥ 6,1 83,3 86,1 85,0 5,98 0,19 ≥ 6,2 79,6 86,1 83,5 5,72 0,24 ≥ 6,3 75,9 87,3 82,7 6,00 0,28 ≥ 6,5 74,1 87,3 82,0 5,85 0,30 ≥ 6,6 72,2 89,9 82,7 7,13 0,31 ≥ 6,7 66,7 89,9 80,5 6,58 0,37 ≥ 6,8 64,8 89,9 79,7 6,40 0,39 ≥ 6,9 63,0 91,1 79,7 7,11 0,41 ≥ 7 63,0 92,4 80,5 8,29 0,40 ≥ 8 44,4 97,5 75,9 17,56 0,57
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• • • • • • • • • 1. ≥ 8,9 33,3 98,7 72,2 26,3 0,68 Obs.: ponto de corte para método Y > 6,5%. As populações de “sadios” e “doentes” com os quais o fabricante determinou seu valor de referência correspondem à realidade prática do laboratório? Há quanto tempo esse valor está estabelecido pelo fabricante? Existem consensos na literatura especializada corroborando os valores propostos? Há na literatura algum registro recente de trabalhos que referendam ou reveem os valores estabelecidos no caso em particular? A observação desses itens poderá permitir uma informação com maior grau de confiabilidade por parte do laboratório. Outro fator relevante que se deve recordar é que a mudança do ponto de corte afeta os valores de sensibilidade e especificidade de um teste e, consequentemente, todos os cálculos deles derivados influenciam decisivamente na maneira como o teste pode ser usado. O exemplo da Tabela 1.3 mostra essa relação quando outros pontos de corte são usados a partir da metodologia X. Notase que os valores de sensibilidade e especificidade se alteram de acordo com os novos pontos de corte estabelecidos.
Necessidades de informações na medicina baseada em
evidências
Os estudos no campo da medicina laboratorial baseada em evidências têm cinco objetivos principais: Caracterização da acurácia diagnóstica dos exames pelo estudo dos grupos de pacientes Determinação do valor do exame (desfecho) para os indivíduos testados Revisão sistemática dos estudos de acurácia diagnóstica ou desfechos dos exames para responder a uma pergunta clínica específica Avaliação econômica dos exames para determinar quais exames poderão ser usados Auditoria do desempenho no decorrer dos exames para responder a questões sobre seu uso. A prática da MBE parece ter lugar cativo no futuro dos serviços de saúde, graças a alguns benefícios palpáveis que pode oferecer tanto a pacientes quanto a instituições. Os profissionais de laboratório não podem e não devem ficar alheios a esse processo. A MBE na prática clínica iniciase com o estabelecimento de questões e a tentativa de respondêlas com o máximo de evidências possíveis. Nas questões relativas a diagnóstico, terapêutica e prognóstico, é inegável a relevância do laboratório clínico. Assim, o uso correto dos exames laboratoriais é a base para a aplicação e o êxito dessa nova prática médica laboratorial.Considerações finais
Os princípios da medicina laboratorial baseada em evidências podem servir de base para o modo como a medicina laboratorial é praticada, desde a descoberta de um novo exame diagnóstico até sua aplicação no cuidado de rotina do paciente. Os princípios fornecem a lógica pela qual todos os elementos da prática são fundamentados. As ferramentas da medicina laboratorial baseada em evidências, se seguidas da maneira exposta neste capítulo, fornecem os meios para a prestação da mais alta qualidade de serviço ao atender às necessidades dos pacientes e profissionais de saúde que o servem. A aplicação da prática baseada em evidências é muito mais complexa para a medicina laboratorial do que para as intervenções terapêuticas, porém é crucial para o sucesso.
Referência bibliográfica
Isaacs D, Fitzgerald D. Seven alternatives to evidencebased medicine. BMJ. 1999;3:98103.Bibliografia
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Introdução
O conhecimento e a apreciação das ferramentas em biologia molecular, que estão em constante desenvolvimento, devem ser incorporados em projetos de estudo e procedimentos laboratoriais. Sob esse aspecto, algumas considerações devem ser feitas para a preparação, a conservação e o armazenamento de amostras biológicas para esses estudos epidemiológicos e de monitoramento. Apesar da importância da coleta de amostras e da construção de bancos de dados biológicos, pouco tem sido publicado sobre a seleção e a validação dos procedimentos e como eles podem afetar o resultado desses estudos. O objetivo deste capítulo, portanto, é discutir os procedimentos, os desafios e as armadilhas em coleta, processamento e armazenamento de amostras biológicas.Coleta da amostra
Para uma coleta de amostra confiável e consistente, é essencial estabelecer uma comunicação eficaz entre médicos ou pesquisadores, funcionários e pacientes do estudo. Procedimentos especiais de coleta podem ser necessários caso envolvam espécimes de uma população especial, como crianças, nas quais a coleta de sangue muitas vezes requer uma pessoa habilitada e experiente nessa atividade.
Os responsáveis pelo procedimento devem entregar instruções ao pessoal envolvido (funcionários e pacientes), incluindo o período recomendado para coleta, a necessidade ou não de jejum ou abstinência, os volumes necessários, os recipientes específicos a serem utilizados e até mesmo o tamanho da agulha para a punção venosa. Instruções detalhadas são reforçadas por protocolos operacionais de comunicação escrita e frequente. Caso o local do processamento laboratorial seja diferente do local de coleta da amostra, é importante assegurar que o processamento receba os espécimes adequadamente, de modo a evitar perda ou dano de transporte, armazenamento prolongado ou tentativas de entrega sem sucesso.
Instruções claras devem ser fornecidas aos pacientes quando há necessidade de autocoleta e na coleta seriada. Essas instruções podem ser fornecidas por via oral e/ou escrita e devem relatar a necessidade ou não de jejum, interação com medicamentos ou alimentos, higiene, conservação da amostra coletada, armazenamento e transporte de amostras ao laboratório. Por exemplo, pode ser importante colocar a amostra de urina imediatamente no refrigerador ou em gelo até que seja transferida para o laboratório, para que não afete o nível de metabólitos e/ou a integridade das células uroteliais. Também pode ser necessário comunicar ao participante a importância de seguir com precisão os protocolos de coleta de amostras.
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Métodos não invasivos de coleta
A coleta invasiva, às vezes, é necessária para análises específicas. A coleta de sangue é o método mais frequentemente utilizado para obter amostras biológicas, uma vez que certamente é menos invasiva do que biopsias, por exemplo. No entanto, mesmo métodos menos invasivos, como a coleta de células descamadas da boca ou urina (células uroteliais), podem ser adequados para determinados fins (genotipagem, citogenética, detecção de mutações ou lesões) e para minimizar a utilização de amostras de sangue valiosas ou mesmo reduzir o volume de sangue necessário a ser obtido de cada paciente. Além disso, o uso desses métodos pode aumentar a adesão ao exame, uma vez que muitos participantes podem estar mais dispostos a fornecer uma amostra obtida pelo uso de um swab bucal ou mesmo de urina.
A coleta de células descamadas é logisticamente menos difícil e não requer pessoal altamente treinado, como na coleta de sangue. Assim, amostras alternativas podem ser mais viáveis em determinadas situações.
Questões relacionadas com o timing da amostra
Os níveis de biomarcadores podem ter uma variação metabólica tempodependente. Por exemplo, há uma diferença hormonal e de vários níveis de metabólitos detectados na primeira urina da manhã em comparação com as demais do dia. Em algumas investigações, são necessárias várias coletas em diferentes momentos, a fim de se obter a evolução no tempo da verdadeira relação entre a exposição e o desenvolvimento de anomalias e possibilitar o estabelecimento de associações causais. O efeito da préclínica, nos níveis de biomarcadores, tem sido uma questão amplamente debatida, especialmente para biomarcadores medidos durante o curto período antes do início da doença. Se o momento da coleta está dentro do período do início da doença, mas antes de esta ter sido manifestada clinicamente, há uma possibilidade de alguns dos parâmetros biológicos medidos serem resultado da doença em si, e não do valor preditivo para tal. Amostras coletadas um longo tempo antes do aparecimento da doença podem ser mais informativas e mais bem associadas à causa da doença.
Estabilidade das amostras
Fatores que afetam a estabilidade de amostras biológicas incluem anticoagulantes, agentes de estabilização, temperatura, tempo antes do processamento inicial, condições de esterilidade, fatores endógenos (enzimas que degradam as propriedades, morte celular) etc.
Anticoagulantes
Na obtenção de amostras de sangue para análise, destacase a importância da seleção adequada do fator anticoagulante. Enquanto certos anticoagulantes são melhores ou mesmo necessários para fins analíticos, outros podem ser absolutamente contraindicados. Por exemplo, o citrato de sódio pode proporcionar uma melhor qualidade de RNA e DNA em relação a outros anticoagulantes e produz maior rendimento de linfócitos para a cultura, ao passo que a heparina afeta a proliferação de células T e ligase a muitas proteínas. Além disso, o ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA) é bom para ensaios baseados em DNA, influencia a concentração de Mg2+ e gera problemas para a análise citogenética (aumenta a permuta de cromátides irmãs, diminui o índice mitótico etc.). A coleta de sangue total, em qualquer tipo de tubo contendo anticoagulante, pode induzir a produção de citocinas in vitro e, provavelmente, resultar em concentrações artificialmente elevadas.Agentes de estabilização
Muitos componentes do sangue, potenciais biomarcadores, são instáveis e devem ser conservados utilizandose agentes estabilizadores. O EDTA e o ácido ascórbico, por exemplo, são agentes de estabilização de folato no sangue e devem ser adicionados o mais rapidamente possível após a coleta, a fim de garantir a qualidade da análise. O ácido metafosfórico ou a glutationa reduzida são utilizados para preservar o ácido ascórbico. Há também considerações especiais para a determinação dos compostos voláteis, como biomarcadores, ou o efeito de hemólise sobre os níveis de eletrólitos. Esses fatores de estabilidade devem ser explorados e validados em um estudopiloto antes que ocorra uma coleta em larga escala.Tempo decorrido antes do processamento inicial
O tempo permitido entre a coleta e o processamento de amostras biológicas depende dos componentes de interesse e de sua estabilidade. Se a alta viabilidade de células é desejada, o processamento de sangue, esfregaços bucais ou amostras de urina precisariam ter prazo de 24 a 48 h.
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Da mesma maneira, para muitos biomarcadores, o tempo entre a coleta e o processamento afeta a estabilidade, apesar da presença de agentes estabilizadores. Essas considerações determinam a periodicidade e o processamento das amostras coletadas. Por exemplo, se a distância física entre as instalações de coleta e do processamento puder acarretar atrasos de transporte, a análise de biomarcadores instáveis deve ser excluída. Como alternativa, para garantir a sua integridade, pelo menos o mínimo de passos iniciais tem de ser conduzido antes da transferência da amostra.
Temperatura
A temperatura pode afetar a estabilidade da amostra basicamente em duas fases: durante o tempo entre a coleta e o processamento da amostra (se as amostras não são processadas imediatamente) e durante o armazenamento a curto e longo prazos. Geralmente, o DNA isolado é armazenado a 4°C durante várias semanas, a –20°C durante vários meses e a –80°C durante vários anos; RNA isolado deve ser armazenado a –80°C. Células vivas são estáveis à temperatura ambiente por até 48 h, mas devem ser cultivadas ou criopreservadas em nitrogênio líquido a –132°C, a fim de permanecerem viáveis. Soro e plasma contêm um grande número de moléculas solúveis e a maioria requer temperatura muito baixa para se manter intacta (–80°C). O controle da temperatura durante o tempo entre a coleta e o processamento de amostras até o armazenamento final é essencial, especialmente quando envolve várias horas. A temperatura adequada depende do biomarcador de interesse. Se um biomarcador bioquímico muito lábil é o foco principal do estudo (p. ex., citocinas) e as amostras não serão analisadas imediatamente, estas necessitam ser congeladas a –80°C e ciclos repetidos de congelamento e descongelamento devem ser evitados. Congelar a amostra coletada sem processamento é incompatível com a manutenção de células viáveis, visto que estas se romperão se congeladas sem dimetilsulfóxido (DMSO). Portanto, o investigador tem de escolher entre a separação imediata dos componentes da amostra, de modo que cada um possa ser preservado em conformidade, e a seleção de um componente da amostra para preservação imediata (p. ex., citocinas), sacrificando os demais que necessitam de diferentes condições (p. ex., células vivas). Contudo, para manter a viabilidade das células durante várias horas ou dias, devese manter a amostra à temperatura ambiente (até 48 h).
Baixas temperaturas (4°C) geralmente são uma boa opção entre os dois extremos de congelamento ou à temperatura ambiente – as células podem permanecer viáveis (viabilidade reduzida em comparação com a temperatura ambiente) e protegidas também, pelo menos em certa medida, contra a degradação enzimática das sensíveis proteínas biomarcadoras.
Esterilidade
O requisito para as condições assépticas durante o processo de coleta é essencial, especialmente se a intenção for isolar RNA ou realizar cultura de células da amostra. Bactérias ou contaminação fúngica podem ser prejudiciais para a qualidade dos biomarcadores, introduzir novos produtos e metabólitos e tornar a amostra não confiável.Degradação
A degradação enzimática pode afetar muitos biomarcadores bioquímicos. As proteínas são sensíveis à degradação por proteases, em particular se a integridade celular foi comprometida. A integridade proteica é protegida por adição de inibidores de protease disponíveis comercialmente, utilizados logo após a coleta. É importante mencionar que os inibidores da protease são tóxicos para células vivas e, portanto, não devem ser adicionados ao sangue total quando se deseja viabilidade celular. Além disso, todas as etapas durante o processamento de proteína devem ocorrer no gelo.
O RNA também é particularmente sensível à degradação por nucleases abundantes e ubíquas. A manutenção da integridade do RNA é possível por manuseio em ambiente livre de ribonucleases (RNAses), por adição de inibidores disponíveis comercialmente.
Em contraste, o DNA é o componente mais estável em amostras biológicas, incluindo sangue, células esfoliadas e outros tecidos. Existem relatórios mostrando que, a partir de amostras de células esfoliadas, o DNA permaneceu estável por até 1 semana em temperatura ambiente. Na verdade, exposição a 37°C por 1 semana também não afeta o rendimento do DNA. A estabilidade do DNA permite que ele seja recuperado e analisado a partir de fluidos corporais secos, sangue coagulado, manchas de sangue seco, de lâminas ou mesmo roupas, como é frequente nos casos de investigações forenses.
Recipientes/equipamentos
A escolha do tamanho e das características dos tubos, garrafas ou outros recipientes para coleta e transporte de amostras depende do volume, dos meios de transferência para o laboratório, do custo, da eficiência do armazenamento e dos tipos de análises pretendidas. Pequenas amostras de sangue podem ser colhidas por picada no dedo em cartões disponíveis, comercialmente prétratados para evitar a degradação e a contaminação da amostra. Células epiteliais são normalmente
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coletadas com uma pequena escova citológica (swab) ou espátula, que é, então, enxaguada em tubos de centrífuga cônicos contendo tampão de estabilização. O uso de sistema para coleta de lavados bucais ou saliva recentemente ganhou popularidade. A coleta de células bucais também pode ser feita em placas prétratadas. Veículos secos e compactos para coleta de células bucais podem ser particularmente úteis se o tratamento não for possível no local de coleta e requerer transporte para processamento. No entanto, os veículos secos para coleta de amostras biológicas limitam sua utilidade para um número menor de aplicações, como o isolamento de DNA, a detecção de compostos inorgânicos (p. ex., Hg e As) etc.
Além disso, o recipiente primário utilizado para a coleta de amostras e os recipientes subsequentes do processo podem afetar a qualidade da amostra. Recipientes certificados livres de RNAses devem ser utilizados para todos os passos de manuseio de amostras de RNA. De utilização única, tubos estéreis de laboratório são adequados para essa finalidade, desde que todo o manuseio associado não introduza fontes de contaminação (p. ex., o uso de luvas e de uma área de trabalho livre de RNAses). Frascos estéreis de uso único também devem ser utilizados em caso de manipulação e isolamento de células em cultura e/ou de criopreservação.
Segurança
Várias questões de segurança surgem a respeito do manuseio de materiais biológicos humanos, devendo ser tomadas precauções em todas as fases do trabalho. Tecidos humanos são potencialmente infecciosos e testes detalhados para perfis de organismos patogênicos não são realizados, a menos que sejam parte do estudo, como HIV, hepatite ou outros agentes transmissíveis ou parasitários. Os funcionários devem ser treinados para lidar com materiais humanos, tomando as precauções de segurança necessárias para sua própria proteção e de outros envolvidos em todo o processo (p. ex., pessoal de transporte).
Há uma preocupação de segurança particularmente elevada sobre grupos de amostras provenientes de países com alta incidência de doenças infecciosas, como hepatite, na China; tuberculose, em países do Leste Europeu; o HIV, na África etc. A conduta geral preconiza que, a menos que os sujeitos do estudo sejam selecionados e diagnosticados como negativos, o risco é desconhecido e, portanto, os cuidados devem ser tomados como se as amostras fossem infectadas. Objetos afiados, como agulhas, representam um risco particularmente elevado para a contaminação do pessoal.
Recomendamse disponibilidade de manuais e treinamento de práticas de segurança e saúde ocupacional.
Transporte
A consciência dos riscos potenciais durante o transporte de materiais biológicos tem aumentado não só entre os cientistas, mas também entre o público. Materiais biológicos apresentam potencial e muito alto risco de transmissão de doenças infecciosas. Portanto, o responsável pelo laboratório deve fornecer treinamento para seus funcionários a fim de assegurar a conformidade com os regulamentos, que não permitem qualquer margem para erro. Além disso, produtos embalados ou rotulados inadequadamente serão recusados para o transporte pelas companhias aéreas e terrestres ou retidos na alfândega. Todas as operações do processo de transporte devem ser padronizadas por meio de Procedimento Operacional Padrão (POP), que deve incluir, entre outras etapas, condições de acondicionamento e transferência do material, armazenamento temporário, limpeza e manutenção dos equipamentos e veículos.
Documentação
A documentação apropriada inclui detalhes como data de coleta, número da amostra, tipos e volumes, informações de entrega (FedEx e recibo eletrônico) e cadeia de formas de custódia. Informações pessoais sobre os participantes devem ser codificadas, em conformidade com as normas de proteção da privacidade.
Os formulários de papel podem ser substituídos por sistemas informatizados mais versáteis de bases de dados eletrônicos. Códigos de barras são cada vez mais utilizados para catalogar eficazmente amostras e permitir a verificação eletrônica e de processamento. Além disso, todos os protocolos de coleta e processamento, bem como os registros eletrônicos, devem ser armazenados em locais seguros e conservados por período a ser determinado.
Adesão estrita aos protocolos
Quanto maior o estudo, maior é o desafio para a consistência na manipulação de todos os espécimes biológicos. É inevitável que alguns indivíduos e, possivelmente, vários laboratórios manipulem as amostras, seja na coleta ou nos estágios de processamento. O desafio, nesse caso, além de produzir protocolos claros e explícitos, utilizar POP e treinar todas as pessoas sobre os passos a serem seguidos, é garantir que todos adiram estritamente aos POP. Para tanto, os fluxogramas ajudam a equipe técnica a evitar confusões e malentendidos.
