BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I. Métodos instrumentais de análise para o estudo de células e tecidos - Microscopia

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Objectivos:

◉

◉◉

◉

Listar e descrever as ferramentas de estudo da célula

◉

◉◉

◉

_{Definir e analisar a metodologia usada na:}

-Microscopia óptica e electrónica; -Microscopia de

fluorescência;

Microscopia de contraste de fase; Microscopia confocal;

-Microscopia Electrónica de Transmissão e de Varrimento.

◉

◉◉

◉

Listar e descrever a preparação do material biológico para a

microscopia óptica e electrónica

Métodos instrumentais de análise para o estudo

de células e tecidos - Microscopia

BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Poder de

resolução

Microscopia depende de:

- técnicas de preparação

das amostras biológicas

- poder de resolução dos

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Algumas descobertas importantes na

história da microscopia

1611 - Kepler sugere maneiras de construir 1 microsc composto

1881 - Retzius, Cajal

e outros desenvolvem técnicas de

coloração e lançaram os fundamentos da anatomia

microscópia

1879 -

Flemming

descreve o comportamento dos

cromossomas na mitose de cél animais.

1683 - Leeuwenhoek

visualiza pela 1ªx uma bactéria

1882 a 1899 – Klebs e Pasteur

utilizando variados corantes

identificam importantes agentes patogénicos.

1886 – Zeiss

constroi uma série de lentes q permite revelar

estruturas nos limites teóricos da luz visível

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Algumas descobertas importantes na

hist

histó

ó

ória da microscopia

ria da microscopia

1932 – Zernicke

inventa o microscópio de contraste de fase

Estes 2 microsc permitem que células vivas não coradas sejam

vistas em detalhe pela 1ª vez

1981 – Allen e Inoué

– aperfeiçoam o microscópio óptico

de contraste com sistema de vídeo avançado

1988 –

Microscópios confocais de varredura comerciais

passam a ser amplamente utilizados

1898 – Golgi

descreve pela 1ªx o aparelho de Golgi depois

da coloração das células com nitrato de prata

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Detalhes revelados pelo microscópio óptico

O

limite máximo de resolução

de 1 microscópio óptico

é determinado

pelo

comprimento de onda da luz

visível, q varia de

0,4

µµµµ

m (violeta)

a

0,7

µµµµ

m

(vermelho).

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Limite de resolução

– é o limite de separação pelo qual

2 objectos podem ser distinguidos.

Limite de resolução

depende de:

- comprimento de onda da luz (

λλλλ

)

- abertura numérica do sistema de lentes (an)

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

A

abertura numérica

– é a capacidade do

sistema de lentes recolher a luz.

-

lentes secas

-

an

não pode ser maior que 1

-

lentes de imersão

– an

pode chegar a 1,4

Qto > a

an

> a resolução e > a luminosidade.

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Preparação do material biológico para a microscopia óptica

-Fixação

A

fixação

imobiliza,

mata

e

preserva e endurece as células.

torna-as permeáveis aos corantes

e

produz uma ligação cruzada entre as suas

macromoléculas, permitindo que estas

permaneçam estabilizadas nas suas posições

naturais

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

-Fixação

Procedimentos antigos usavam ácidos e solventes orgânicos

como o álcool. Diferentes poderes de penetração ∴∴∴∴ usados em combinações.

Actualmente usam-se os aldeídos (formaldeído e glutaraldeído) que formam ligações covalentes com os grupos amino-livres das proteínas produzindo ligações cruzadas.

Qualquer tratamento usado na fixação pode alterar a estrutura da célula ou das suas moléculas ∴∴∴∴ uma alternativa é o congelamento rápido.

Vantagens- proteínas bem preservadas

Desvantagens- estrutura fina da célula é destruída pelos cristais de gelo

O tecido congelado é seccionado com um criostato (micrótomo mantido numa câmara a _↓↓↓↓ T)

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

-Embebição

Mesmo após a fixação os tecidos são macios e frágeis e

precisam de ser embebidos em

ceras

MO

resinas

,

ME

1º na forma líquida

de

seguida na forma sólida

(por

esfriamento ou polimerização).

O material biológico embebido é seccionado com um

micrótomo/ultramicrótomo

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

-Embebição

O

micrótomo

–

é um

aparelho

com

uma

lâmina metálica afiada

As secções:

-

de 1 a 10

µ

m de espessura,

-

colocadas sobre a superfície

plana de uma lâmina de vidro

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

-Coloração

Depois de fixado e seccionado, o material biológico tem que ser corado

para poder ser observado ao microscópio.

Uma vez que que os corantes têm diferentes afinidades e poderes de penetração têm que ser utilizadas em combinações.

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Há uma relativa falta de especificidade dos corantes a nível molecular que tem levado ao desenvolvimento de procedimentos de coloração mais selectivos e racionais, particularmente a métodos que revelem proteínas específicas ou outras macromoléculas na célula.

-Coloração

Assim algumas enzimas podem ser localizadas nas células através da sua actividade catalítica.

Regiões mais sensíveis podem ser avaliadas através de

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Microscopia de Fluorescência

Moléculas fluorescentes absorvem luz a 1 determinado

_λλλλ

e

emite um

_λλλλ

+ longo, visualizado através de 1 filtro contra

um fundo escuro

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Microscopia de Fluorescência

O 1º permite a passagem de _λλλλ q excitem determinados fluorocromos O 2º permite passagem de λλλλ emitidos qdo o corante fluoresce

Os fluorocromos são detectados em microsc de fluorescência q difere dos normais por ter uma luz + potente q passa por 2 conjuntos filtros:

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Microscopia de Fluorescência

Imagem de FISH com fluorescein e rodamina

A fluoresceina emite fluorescência verde qdo excitada com luz azul A rodamina “ “ vermelha “ “ “ “ amarel/verde

As 2 cores são vistas separada/ alternando conjuntos de filtros

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Microscopia de Contraste de Fase

Qdo se fixa 1a cél ela perde alguns componentes ou

são simples/ distorcidos

∴ ∴ ∴

∴ a forma + correcta de examinar as células seria quando estas ainda estivessem vivas, sem as fixar ou congelar.

Qdo a luz atravessa 1a cél viva a fase do λ é alterado de acordo com o índice de refracção da cél. A luz ao passar através do núcleo é retardada e deslocada em relação à luz que atravessam áreas + delgadas.

O microsc de contraste de fase explora os efeitos da interferência qdo estes 2 conjuntos de ondas se recombinam, criando uma imagem da estrutura da célula

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Microscopia de Contraste de Fase

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

A luz q passa através de 1a cél não corada sofre pouca alteração de amplitude e ∴ os detalhes das estruturas não se conseguem ver As partes coradas da cél Reduzem a amplitude e ∴ A imagem colorida da cél é vista

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Microscopia

Microscopia Confucal

Confucal

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Para a microscopia óptica 1 tecido tem q ser cortado em secções q, qto + fina a secção + nítida é a imagem.

Neste processo a informação 3D é perdida. Com o Mic confucal de

varrimento a partir de 1a série de secções tiradas em _≠≠≠≠s profundidades e armazenadas em computador é fácil reconstruir a imagem 3D

o Mic confucal de varrimento é para o microscopista o que o CAT scanner é para o radiologista. Ambos fornecem imagens seccionadas detalhadas do

interior de uma estrutura intacta. Gastrula – Drosophila

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Microscopia Electr Microscopia ElectrMicroscopia Electr

Microscopia Electróóóónica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM) TEM

TEM TEM

TEM –––– ‘‘‘‘TransmissiomTransmissiomTransmissiomTransmissiom ElectronElectronElectronElectron MicroscopeMicroscopeMicroscope’’’’Microscope

Teorica/ tem 1a resolução 10 000x > q o MO e 1 poder de resolução - 1Å

Na prática tem 1a resolução 100x > q o MO e 1 poder de resolução 20Å

Porquê? Devido a problemas na preparação da amostra

Contraste e

Danos causados pela radiação

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Algumas descobertas importantes na

hist

histó

ó

ória da microscopia electr

ria da microscopia electr

ria da microscopia electró

ria da microscopia electr

ó

ónica

ó

nica

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

1897 – J. Thompson anuncia a existência de partículas carregadas –va/ + tarde denominadas “electrões”

1931– Ruska et al constróem o 1º TEM

1935 – Knoll demonstra a viabilidade do mic electrónico de varredura

1939 - Siemens produz o 1º TEM para fins comerciais

1945 – Porter, Claude e Fullam, usam o TEM para examinar célula em cultura depois de fixadas e contrastadas com OsO₄

1948 – Pease e Baker, preparam secções de mat biológico de 0,1 a 0,2 _µµµµm

1952 – Palade, Porter e Sjöstrand desenvolvem métodos de fixação e corte q possibilitam pela 1ªx a visualização de várias estruturas intracelulares

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Algumas descobertas importantes na

hist

histó

ó

ória da microscopia electr

ria da microscopia electr

ria da microscopia electró

ria da microscopia electr

ó

ónica

ó

nica

1953 – Porter e Blum desenvolvem o 1º ultramicrótomo

1956 – Glauert et al propõem a resina epoxi araldite como agente de inclusão.

1961 – Luft introduz a resina Epon

1957 – Robertson descreve a estrutura trilaminar da membrana

celular vista pela 1ªx no TEM

1959 – Singer usa anticorpos acopolados à ferratina para

detectar moléculas da célula

1965 – Cambridge instruments produz o 1º microscópio de varrimento

1968 – De Rosier e Klug descrevem técnicas para a reconstituição

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Preparação do material biológico para a

microscopia electrónica

1º com gluteraldeído que faz com que as moléculas de proteínas façam ligações covalente/ cruzadas com os seus vizinhos

2º com tetróxido de ósmio q se liga e estabiliza as bicamadas lipídicas assim como as proteínas

Fixa

FixaFixa

Fixaççççãoãoãoão

Desidrata Desidrata Desidrata

Desidrataççççãoãoãoão

Como a amostra é exposta ao vácuo mto forte não pode ser analisada viva, com H₂O, ∴∴∴∴ é feita a desidratação numa série crescente de alcoóis

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Preparação do material biológico para a microscopia electrónica

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Embebi Embebi Embebi

Embebiççççãoãoãoão

Feita com uma resina q se polimeriza formando 1 bloco sólido de plástico

Corte Corte Corte Corte

Cortes ultrafinos (na ordem dos 50 a 100nm de espessura) feitos num ultramicrótomo e colocados numa grelha

Contrasta Contrasta Contrasta

Contrastaççççãoãoãoão

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Preparação do material biológico para a microscopia electrónica

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

mitocôndria nucléolo vacúolo ribossomas RE Golgi

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Microscopia Electr

Microscopia Electró

ó

ónica de Varrimento

ó

nica de Varrimento

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Secções finas obtidos por TEM são pedaços bidimensionais de tecidos e não transmitem de imediato a organização 3D dos componentes celulares

Este é conseguido usando o microscópio electrónico de varrimento, q é num aparelho <, + simples e + barato do q um TEM.

Utiliza os electrões q são dispersos ou emitidos da superfície da amostra ∴

somente características da superfície

podem ser examinadas e a resolução

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COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Microscopia Electr

Microscopia Electró

ó

ónica de Varrimento

nica de Varrimento

A amostra é fixada,

desidratada e

coberta com uma camada fina de metal pesado de seguida

varrida por um feixe de electrões.

A quantidade de electrões emitidos é medido para controlar a intensidade de um 2º feixe, q se move em sincronia com o 1º e forma a imagem num écran.

Como a imagem tem brilhos e sombras dá 1a aparência 3D.