1 INTRODUÇÃO
A leishmaniose tegumentar é uma doença inflamatória crônica causada por espécies dermotrópicas pertencentes aos subgêneros Viannia e Leishmania, sendo a Leishmania (V.) braziliensis o principal agente etiológico no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007). Infecções provocadas por esses parasitos apresentam manifestações clínicas diversas, que variam desde pequenas lesões ulcerosas de pele (leishmaniose cutânea) até lesões destrutivas de mucosas dos tratos digestivo e respiratório - leishmaniose mucosa.
A leishmaniose cutânea, forma clínica mais comum, consiste inicialmente de pápula ou nódulo caracterizado por infiltrado dérmico rico em macrófagos, linfócitos e plasmócitos. O nódulo evolui, ocorrendo ulceração da pápula. A lesão na maioria das vezes se mantém ulcerada com formato oval ou arredondada, com bordas bem definidas (NEVES et al., 2005).
No Brasil em tribos indígenas, o primeiro caso descrito de leishmaniose tegumentar foi nas décadas de 50/60 no Mato Grosso (FORRATINI; DOS SANTOS, 1956; DE CARNERI et al., 1963). Na reserva indígena Xakriabá (Norte de Minas Gerais), têm sido registrados casos autóctones de leishmaniose tegumentar desde 2001, sendo que em 2006 foram diagnosticados 48 casos entre os habitantes da reserva (MINISTÉRIO DA SAÚDE; FUNASA, 2007).
Vários fatores têm sido associados a um maior risco de se adquirir a doença, tais como, presença de membro da família com antecedente de leishmaniose tegumentar (AMPUERO; URDANETA; MACÊDO, 2005), aglomeração intradomiciliar (YADON et al., 2003), presença de animais domésticos (ALEXANDER et al., 2002), especialmente o cão (FALQUETO et al., 2003), e fatores associados ao indivíduo. Em relação a fatores individuais preditores, estudos da resposta imune na leishmaniose tegumentar mostram que a resolução da infecção humana é dependente da resposta celular inata e adaptativa (PIRMEZ et al., 1993; DA-CRUZ et al., 1994. CARVALHO et al., 1995. COUTINHO et al. 1996), o que justifica a necessidade de se entender melhor a resposta imunológica ao agente causador da doença, visto que esta questão ainda não está bem esclarecida.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Estudar aspectos imunológicos envolvidos no estabelecimento/manutenção da leishmaniose cutânea na comunidade indígena Xakriabá - Minas Gerais.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar a capacidade de fagócitos do sangue periférico em internalizar formas promastigotas vivas de L. braziliensis;
Caracterizar o perfil fenotípico (marcadores de ativação, adesão celular, co-estimulação, receptores Fc e receptor de complemento) de fagócitos do sangue periférico da população avaliada após interação dessas células com promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis.
3 REFERÊNCIAL TEÓRICO
3.1 Leishmaniose tegumentar
A leishmaniose tegumentar é uma doença inflamatória crônica causada por protozoários da ordem Kinetoplastida, pertencentes à família Trypanosomatidae e ao gênero Leishmania (ROSS, 1903). É primariamente uma zoonose que se encontra em expansão geográfica, e atualmente sua ocorrência não mais se restringe as pessoas que entram em contato com matas e animais silvestres, ocorrendo também em áreas rurais desmatadas e regiões peri-urbanas. Dessa forma, o aumento dos fatores de risco relacionados às mudanças ambientais por causas naturais e especialmente pela ação do homem está tornando a leishmaniose tegumentar um importante problema de saúde pública no Brasil (NEVES et al., 2005).
No Brasil, segundo estimativas do Ministério da Saúde, no período de 1985 a 2005, verificou-se uma média anual de 28.568 casos autóctones de leishmaniose tegumentar registrados e coeficiente de detecção médio de 18,5 casos/100.000 habitantes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007). Em Minas Gerais, desde a metade do século passado quando a doença foi descrita, têm sido registrados surtos de leishmaniose tegumentar relacionados, quase exclusivamente, à atividades de desmatamento (MARTINS et al., 1956. DIAS et al., 1977. GONTIJO et al., 2002). Entretanto, a partir da última década, têm sido descritos casos em áreas peri-urbanas de cidades de médio e grande porte (PASSOS et al., 1993. CARVALHO et al., 2005. SILVA et al., 2006) além das áreas de colonização antiga (GONTIJO et al. 1995).
Em tribos indígenas, os primeiros relatos sobre a ocorrência de leishmaniose cutânea datam das décadas de cinquenta/sessenta e referem-se a estudos em tribos do estado do Mato Grosso (FORRATINI; DOS SANTOS, 1956. DE CARNERI et al., 1963). Na reserva indígena Xakriabá (Norte de Minas Gerais), têm sido registrados casos autóctones de leishmaniose tegumentar desde 2001, sendo que em 2006 foram diagnosticados 48 casos entre os habitantes da reserva (MINISTÉRIO DA SAÚDE/FUNASA, 2007).
O protozoário responsável pela doença é digenético e tem seu ciclo biológico realizado em dois hospedeiros, sendo um vertebrado e um invertebrado. Com relação aos hospedeiros vertebrados, existem grande variedade de mamíferos, como por exemplo os roedores, edentados, marsupiais, canídeos e primatas, o que inclui o homem como possível hospedeiro. (NEVES et al., 2005). O homem é considerado hospedeiro acidental, sendo dispensável no ciclo do parasito (FOCACCIA et al., 2010). Os hospedeiros invertebrados são representados
por dípteros da família Phlebotomidae, do gênero Lutzomya, que estão amplamente distribuídos na natureza em reservatórios silvestres e/ou domésticos (FIG. 1). São conhecidos por flebotomíneos e são insetos de hábitos preferencialmente noturnos, portanto o maior risco de infecção surge a partir do entardecer. Entretanto, algumas espécies podem realizar repasto sanguíneo durante o dia, principalmente no interior das florestas (FOCACCIA et al., 2010).
FIGURA 1- Inseto transmissor da Leishmaniose Tegumentar, Lutzomya sp.
Fonte: www.fiocruz.br/ccs/especiais/paleo/leishmaniose_fer.jpg
No Brasil, as principais espécies que causam leishmaniose tegumentar são L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L (L.) amazonensis, sendo que a L. (V.) braziliensis provoca no homem lesões conhecidas como úlcera de Baurú, ferida brava, ferida seca e bouba. Geralmente, as lesões primárias são únicas ou em pequeno número, porém em grandes dimensões, com úlceras em forma de cratera. Esta espécie é responsável pela forma cutânea mais destrutiva dentre as demais conhecidas (NEVES et al., 2005).
Além dessas, outras espécies dermotrópicas de Leishmania foram recentemente descritas: L. (V.) lainsoni, L (V.) naiffi, com poucos casos no Pará e L. (V.) shawi, encontradas, nos estados do Pará e Amazonas. (GONTIJO; CARVALHO 2003).
Estes parasitos apresentam três formas distintas no que se diz respeito a morfologia. São elas as formas amastigota, promastigota e paramastigota. A forma amastigota (FIG. 2) apresenta-se ovóide ou esférica. Quando coradas é possível distinguir a membrana citoplasmática e o citoplasma, podendo assim identificar vacúolos, um único núcleo que fica disposto em geral em um dos lados da célula, além do cinetoplasto, que se situa na maioria das vezes próximo do núcleo. O tamanho é variável de acordo com a espécie. A forma promastigota (FIG. 3) é alongada e possui flagelo livre. É possível identificar no citoplasma pequenos vacúolos. O núcleo se assemelha ao existente na forma amastigota, podendo variar a sua posição. O tamanho varia mesmo dentro da mesma espécie, tanto no tubo digestivo do
inseto quanto em cultura. A forma paramastigota é oval ou arredondada, tendo o cinetoplasto margeando o núcleoe e possuindo pequeno flagelo livre. O tamanho também é variável. Cada forma é específica de determinada fase do ciclo biológico do parasito, tanto no hospedeiro invertebrado e no vertebrado. Em todas as formas, o tipo de reprodução ocorrido é a divisão binária (NEVES et al., 2005).
FIGURA 2- Formas amastigotas de Leishmania sp. dentro do macrófago.
Fonte: www4.ensp.fiocruz.br/Leishmaniose
FIGURA 3- Formas promastigotas de Leishmania sp.
Fonte: blogspot.com/_mZKMG0_h5zI/leishmaniag.jpg
Ao longo dos anos, as pesquisas mostraram que a leishmaniose tegumentar estava associada principalmente aos trabalhadores do sexo masculino envolvidos com atividades agrícolas e extrativistas (MARTINS et al., 1956). Porém, desde o início da década passada, tem sido registrado um aumento considerável no número de casos, estendidos agora às diferentes faixas etárias e às mulheres (GONTIJO et al., 2002), denotando a possibilidade de transmissão peri e intradomiciliar. Nesse novo contexto epidemiológico, vários fatores têm sido associados a um maior risco de se adquirir a doença, tais como, presença de membro da família com antecedente de leishmaniose cutânea (AMPUERO; URDANETA; MACÊDO,
2005), aglomeração intradomiciliar (YADON et al., 2003), presença de animais domésticos (ALEXANDER et al., 2002), especialmente o cão (FALQUETO et al., 2003), e fatores associados ao indivíduo.
Em relação a fatores individuais preditores, estudos da resposta imune na leishmaniose tegumentar mostram que a resolução da infecção humana é dependente da resposta celular inata e adaptativa (PIRMEZ et al., 1993. DA-CRUZ et al., 1994. CARVALHO et al., 1995. COUTINHO et al., 1996). Alguns estudos têm se concentrado na determinação de aspectos importantes da resposta imune na leishmaniose tegumentar, dentre eles: mecanismos imunológicos associados à resistência natural e à presença de lesão ativa.
3.2 Ciclo biológico
A infecção no vetor (FIG. 4) se inicia quando a fêmea pertencente ao gênero Lutzomya sp. faz repasto sanguíneo em um vertebrado já infectado, ingerindo juntamente com sangue, macrófagos parasitados por formas amastigotas (NEVES et al., 2005).
FIGURA 4- Ciclo da Leishmania sp. nos hospedeiros vertebrados e invertebrados.
No trajeto pelo trato digestivo anterior, ou no estômago, ocorre o rompimento dos macrófagos, liberando assim as formas amastigotas. Estas formas sofrem divisão binária e se transformam rapidamente em formas promastigotas, que continuam a se multiplicar. Este processo de divisão ocorre ainda no sangue ingerido, visto que o mesmo se encontra envolto por uma membrana peritrófica secretada pelas células do estômago do inseto. O rompimento desta membrana ocorre após a digestão do sangue, entre o terceiro e quarto dia, liberando assim formas promastigotas (NEVES et al., 2005).
Os parasitos se dirigem para o intestino, local onde ocorre a colonização dos mesmos (regiões do piloro e íleo). É neste local que as formas promastigotas se transformam em formas paramastigotas, que permanecem aderidas pelo flagelo ao epitélio intestinal através de hemidesmossomas, onde continuam o processo de reprodução. Estas formas paramastigotas se transformam novamente em formas promastigotas, que migram através do estômago em direção à faringe do inseto (NEVES et al., 2005).
As promastigotas que migram para o anterior do tubo digestivo do vetor atingem um estágio infectivo, transformando-se em formas metacíclicas infectantes. A principal mudança bioquímica observada é a variação do tamanho das porções glicídicas da molécula de lipofosfoglicano (LPG) que se localizam na superfície da membrana das promastigotas (NEVES et al., 2005).
Durante processo de repasto sanguíneo do flebotomíneo ocorre a transmissão do parasito (FIG. 4). Quando o inseto ingere o sangue, as formas promastigotas metacíclicas, que estão na faringe do inseto, são introduzidas no local da picada. No intervalo de quatro a oito horas, estas formas flageladas são interiorizadas pelos macrófagos teciduais (NEVES et al., 2005).
Na saliva do inseto existem neuropeptídeos vasodilatadores que tem como função facilitar a alimentação do inseto, entretanto imunossuprime a resposta do hospedeiro vertebrado, exercendo assim importante papel no sucesso da infectividade das promastigotas metacíclicas (NEVES et al., 2005).
Após internalização, as formas promastigotas metacíclicas transformam-se, rapidamente, em formas amastigotas. Essas formas se adaptam ao novo meio fisiológico – vacúolo fagocitário dos macrófagos – resistindo à ação destruidora de enzimas digestivas – lisossomas – multiplicando-se até ocupar todo o citoplasma e rompê-lo, liberando amastigotas no meio extracelular, sendo as mesmas novamente fagocitadas, dando início a resposta inflamatória (NEVES et al., 2005).
O curso das infecções em animais – o que inclui o homem – é altamente variável, dependendo da espécie de Leishmania sp., características genéticas e da resposta imunológica do hospedeiro, o que origina diferentes quadros clínicos. De acordo com Castellano et al. (2009), o desenvolvimento das diferentes formas clínicas está associada tanto com o status imunológico do hospedeiro quanto com a espécie do parasito.
3.3 Formas clínicas
A leishmaniose tegumentar pode manifestar de diversas formas clínicas que são classificadas de acordo com os sinais clínicos, aspectos patológicos e também imunológicos (NEVES et al., 2005).
A forma cutânea é caracterizada por lesões indolores, ulceradas, podendo ser únicas – mais comum – ou múltiplas (FIG. 5). Já a forma cutaneomucosa acomete as regiões nasofaríngeas e são lesões agressivas (FIG. 6) (NEVES et al., 2005. GOTO; LINDOSO, 2010). Estas formas são geralmente acompanhadas de forte resposta imune celular e escasso número de parasitos na lesão (CONVIT et al., 1993).
FIGURA 5- Lesão cutânea característica de Leishmaniose Cutânea.
Fonte: www4.ensp.fiocruz.br/Leishmaniose
FIGURA 6- Lesão na região nasofaríngea característica de Leishmaniose Cutâneomucosa. Fonte: www.abcdasaude.com.br
A forma disseminada apresenta muitas úlceras que são disseminadas por vias linfática ou hematogênica. A forma que apresenta lesões nodulares não ulceradas é classificada como forma difusa e denominada como Leishmaniose Cutânea Disseminada (FIG. 7) (NEVES et al., 2005. GOTO; LINDOSO, 2010).
FIGURA 7- Lesões de Leishmaniose Cutâneo Difusa. Fonte: www4.ensp.fiocruz.br/Leishmaniose
3.3.1 Leishmaniose cutânea
De acordo com Focaccia et al. (2010), 85% dos pacientes com leishmaniose cutânea possuem lesão na forma ulcerada. Podem resultar em úlceras típicas de leishmaniose ou podem evoluir para formas vegetantes verrucosas, framboesiformes (NEVES et al., 2005), papulares, nodulares, tuberosas ou em placas infiltradas (FOCACCIA et al., 2010).
A carga parasitária na fase inicial da infecção é grande nas bordas, com tendência a diminuir ao longo do processo infeccioso (NEVES et al., 2005).
Na grande maioria dos casos os pacientes não se queixam de forte dor. Alguns relatam sentir ardência e pontadas, o que pode levar a confusão de diagnóstico, pois estes sintomas são característicos de miíase por Dermatobia hominis. A coloração avermelhada da pele é explicada devido o infiltrado celular nas bordas da úlcera. Esta coloração pode estender a cerca de 2 cm da borda. Também não é comum observar sinais como edema e calor, o que difere a lesão de leishmaniose de uma lesão causada por infecção bacteriana. Entretanto é comum haver infecção oportunista por bactérias e células leveduriformes, o que confere a
lesão aspecto purulento. A infecção oportunista pode levar a dor no local da lesão (FOCACCIA et al., 2010).
A lesão inicia-se aproximadamente 2 a 8 semanas após a picada do inseto e ocorre no exato local da picada, começando com pápula ou nódulo. A partir da lesão inicial, ocorre ulceração, que evolui nos 3 ou 4 meses iniciais (FOCACCIA et al., 2010).
O tamanho da lesão é variável. E a partir do momento que prevalece a resposta imune do hospedeiro, a doença segue o curso de cura espontânea, que pode acontecer no período de seis meses a três anos (FOCACCIA et al., 2010).
A infecção em pacientes imunocompetentes ocorre com escassez de parasitos e macrófagos, observa-se também formação de granulomas epitelioides bem organizados (FOCACCIA et al., 2010).
3.4 Resposta imunológica
A principal defesa do organismo contra protozoários intracelulares, incluindo a Leishmania sp é a resposta imune celular (FOCACCIA et al.,2010). Nesse contexto, Rocha et al. (1999) demonstraram que o desenvolvimento da resposta imune é precoce, podendo preceder o inicio da lesão ou mesmo controlar a infecção impedindo o aparecimento das lesões cutâneas.
Follador et al. (2002) avaliaram a resposta imune celular associada com resistência natural à Leishmaniose em indivíduos que apresentavam Intradermorreação de Montenegro (IDRM) positiva, mas sem história prévia da doença e sem lesão aparente, observando que pacientes considerados resistentes apresentavam níveis de IFN-γ e TNF-α mais baixos e níveis de IL-5 mais elevados quando comparados com pacientes que apresentavam a lesão ativa. Os autores sugerem que esse perfil de citocinas poderia modular a resposta imunológica, diminuindo a reação inflamatória e, consequentemente, o surgimento da lesão. Mais recentemente, Masini et al. (2007) demonstraram perfil de citocinas do Tipo 0, com níveis de produção basal em indivíduos considerados resistentes. Contudo, esses indivíduos também apresentaram menor freqüência de linfócitos T IL-4+, elevada razão entre linfócitos IFN-γ+/IL10+ e altos níveis plasmáticos de nitrito e nitrato, sugerindo que a despeito dos níveis basais de citocinas, a maior proporção de citocinas do Tipo 1 em relação às do Tipo 2 contribuiriam para prevenir o crescimento dos parasitos e o desenvolvimento de lesões. Focaccia et al. (2010) sugere que a resistência à infecção está relacionada com a ativação de
linfócitos T CD4+, que produzem IFN-γ, que tem como função ativar macrófagos para destruírem os parasitos. De maneira inversa, a ativação da resposta Th2 facilita a sobrevivência do parasito e também promove agravamento dos sinais clínicos. Isto ocorre devido ações supressivas dos macrófagos pela IL-4.
Os indivíduos portadores de leishmaniose com lesões cutâneas ativas, apresentam diferentes padrões de distribuição de linfócitos T: CD4+ > CD8+ (BARRAL et al., 1987. PIRMEZ et al., 1990), CD4+ = CD8+ (LIMA et al., 1994) e CD4+ < CD8+ (VIEIRA et al., 2002. AMATO et al., 2003), ativação preferencial de células CD4+ e aumento da proporção de células CD8+ durante o processo de cura, sugerindo uma heterogeneidade dos subtipos de células T nas lesões por Leishmania sp. A presença de linfócitos T também tem sido associada com a fase inicial da formação do granuloma. Acredita-se que estas células participem do reconhecimento antigênico e/ou da produção de citocinas no microambiente da lesão (DA-CRUZ et al., 2005). Já o influxo de linfócitos B tem sido associado à deposição de imunocomplexos que podem estar envolvidos na patogênese das lesões (RIDLEY; RIDLEY 1984). Quanto ao perfil de citocinas, Rocha et al. (1999) demonstraram que há aumento da produção de IL-10, durante a fase inicial da infecção, sugerindo que essa citocina esteja associada à modulação da resposta do Tipo 1, facilitando a proliferação do parasito. Coutinho et al. (1998) observaram diminuição significativa de IL-4 no sobrenadante de cultura celular de pacientes tratados, quando comparado ao sobrenadante dos mesmos pacientes durante a fase ativa da infecção, sugerindo que IL-4 também contribua com a progressão da doença. A capacidade do sistema imune celular em responder aos antígenos de Leishmania sp. é evidenciada pela resposta positiva à IDRM e pela resposta positiva nos testes de proliferação de linfócitos, em ensaios utilizando células do sangue periférico (GRIMALDI, 1982. SILVEIRA et al., 2004). Acredita-se que na leishmaniose cutânea, a ausência de resposta Tipo 1 exacerbada, como aquela observada na forma mucosa, se deve à presença de mecanismos moduladores.
Tem sido demonstrada, em lesões de pacientes portadores de leishmaniose cutânea, a presença de células T reguladoras, caracterizadas fenotipicamente como CD4+CD25+Foxp3+, produtoras de grandes quantidades de IL-10 e TGF-β. Os autores observaram que em cultura, essas células são capazes de inibir a proliferação de células T do sangue periférico, sugerindo sua ação imunorreguladora (CAMPANELLI et al., 2006). Altos níveis de IFN-γ foram encontrados sendo associado com cura espontânea (CARVALHO et al., 1995). Produção simultânea de IFN-γ, TNF-α e IL-10 estimuladas pelo antígeno em células mononucleares de
pacientes com lesões ativas (TRUJILLO et al., 2002), além disso, RNAs mensageiros de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 e IFN-γ foram demonstrados em amostras de biópsia de lesões ativas (BOURREAU et al., 2001. PIRMEZ et al., 1993).
Com relação ao marcador de ativação de superfície celular HLA-DR, Masini et al. (2007) mostrou que ocorre aumento significativo no percentual de linfócitos T CD4+ HLA-DR+ e também T CD8+HLA-DR+, em pacientes portadores de leishmaniose cutânea, quando comparado a pacientes saudáveis.
4 POPULAÇÃO, MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Descrição da área estudada
Os indivíduos avaliados nesse estudo residem na comunidade indígena Xakriabá, demarcada pela Fundação Nacional do Índio em 1979 e localizada no município de São João das Missões, na região norte do Estado de Minas Gerais.
O município de São João das Missões possui uma população de 12.489 habitantes, predominantemente rural (79.58%). A comunidade indígena ocupa uma área de 530,74 Km2, que corresponde a 78,07% da superfície total do município. É constituída por 52 aldeias, formando 5 pólos base com população total estimada de 6.500 habitantes (INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2006; FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 2006).
A reserva indígena foi selecionada para o estudo devido ao grande número de casos de leishmaniose tegumentar registrados nos últimos anos. No período de 2001 a 2006 foram registrados 26, 22, 24, 13, 28 e 48 casos por ano, respectivamente.
Além disso, é importante mencionar o grande interesse dos líderes indígenas no estudo, manifestado em reuniões realizadas pela equipe do projeto com a participação de representantes da Fundação Nacional de Saúde e das instituições municipais.
4.2 Caracterização da população avaliada
Para realização do trabalho foi usada “amostra de conveniência” que se define pela disponibilidade de amostras e de exeqüibilidade do estudo. Nesse contexto, foram incluídos vinte e dois indivíduos no trabalho. Inicialmente foi realizada Intradermorreação de Montenegro (IDRM) em todos participantes do estudo no local de domicílio. Posteriormente, eles foram convocados a comparecer ao Posto de Saúde mais próximo, 48 horas após a realização da IDRM, para leitura do teste, coleta de sangue periférico para testes imunológicos e realização de exame clínico e, se necessário, aspirado/biópsia da lesão pelo médico responsável. Dessa forma, foram considerados casos clínicos, pacientes com lesão característica associada à confirmação parasitológica (exame direto ou cultivo de aspirado/biópsia da lesão ou reação em cadeia da polimerase - PCR) e imunológica (IDRM); pacientes assintomáticos, aqueles com IDRM positiva na ausência de lesões ou cicatrizes;
indivíduos negativos aqueles que não apresentaram sinais sugestivos de leishmaniose cutânea e nenhum exame positivo (IDRM, sorologia e PCR) para doença (FIG. 8)
Em seguida, os resultados foram encaminhados para o setor médico responsável, onde os casos detectados receberam tratamento e acompanhamento adequados.
FIGURA 8- Desenho esquemático, ilustrando procedimentos realizados para classificação dos indivíduos avaliados nesse estudo. Após realização dos exames diagnósticos, os indivíduos foram incluídos em três
diferentes grupos: caso clínico, assintomático e controle. Fonte: Dados da pesquisa.
4.2.1 Critérios de inclusão
Após realização dos exames diagnósticos, os indivíduos foram selecionados de acordo com os seguintes critérios:
Idade compreendida entre 10 a 65 anos;
Conclusão dos exames propostos;
Assinatura de consentimento livre e esclarecido pelo voluntário ou responsável.
4.2.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos desse estudo todos indivíduos que não preencheram os critérios de inclusão definidos acima ou que apresentaram:
Qualquer doença sistêmica significativa crônica ou aguda que pudesse interferir nos resultados dos métodos propostos;
Diagnóstico conhecido de infecção por HIV ou outras imunodeficiências ou uso de imunossupressores;
Uso de medicação tópica sobre a lesão cutânea, uso prévio de leishmanicidas;
Alcoolismo, definido como consumo médio semanal acima de 420 g de etanol (média diária acima de 60 g de etanol);
Gravidez, definida por critérios laboratoriais;
Anemia significativa, definida como hemoglobina menor que 10 g/dL.
4.3 Procedimentos éticos
A participação no estudo foi condicionada à assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido pelos participantes ou seus responsáveis legais, no caso de crianças e menores de 18 anos. Além disso, o trabalho foi realizado em concordância com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde do Ministério da Saúde, que regulamenta pesquisa em seres humanos, mediante aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação Oswaldo Cruz (Parecer no 021/2007) e licença fornecida pela Fundação Nacional de saúde/Ministério da Saúde (no355/2008) e Fundação Nacional do Índio (no 2098/08).
Cabe ressaltar, que todos casos detectados na comunidade indígena no decorrer do estudo, receberam assistência adequada, com diagnóstico e tratamento, independente de terem sido alocados para os propósitos da presente investigação. Entretanto, os resultados desses exames eventuais foram analisados separadamente.
4.4 Obtenção das formas promastigotas e marcação com isotiocianato de fluorosceína (FITC)
As formas promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis (MHOM/BR/1986/MSS), foram obtidas a partir de cultivos em erlenmayers contendo 30 mL de meio líquido complexo LIT suplementado com 20% de soro fetal bovino (SFB), por sete dias (fase estacionária de crescimento), em estufa B.O.D a temperatura de 26°C. Os parasitos foram transferidos para tubos cônicos de polipropileno de 50 mL (Falcon, Becton Dickinson - BD, E.U.A.), e a suspensão foi submetida a centrifugação diferencial a 10 x g (Centrífuga Beckman, Modelo J-6B, E.U.A.), durante 10 minutos a temperatura ambiente, para remoção de contaminantes
como eritrócitos e grumos de parasitos no sedimento. Os parasitos foram recuperados após um período de repouso de 30 minutos em estufa B.O.D a temperatura de 26°C. Posteriormente, o sobrenadante foi transferido para outro tubo cônico de polipropileno de 50 mL e o sedimento foi desprezado. Em seguida, adicionou-se 20 mL de tampão fosfato salino PBS 0,015M, pH 7,4 - PBS 1X (SIGMA, E.U.A.) suplementado com 10% de SFB, homogeneizando com movimentos circulares e centrifugou-se a suspensão celular a 357 x g, durante 07 minutos a 18oC. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi ressuspendido cuidadosamente. Adicionou-se 1 mL de PBS 1X suplementado com 10% de SFB, os parasitos foram contados e a suspensão ajustada para 1x108 promastigotas/mL.
Para marcação das leishmanias, inicialmente quantidades equivalentes de parasitos vivos e da preparação do fluorocromo FITC 200 µg/mL (Fluorescein Isothiocyanate, Isômero I - C21H11NO5S), foram incubados por 30 minutos em estufa B.O.D a temperatura de 26°C.
Este fluorocromo se liga na membrana do parasito. Após incubação dos parasitos com FITC, esses foram lavados por centrifugação a 357 x g, durante 10 minutos a 18°C com PBS 0,015M, pH 7,4 - PBS 1X. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e a suspensão foi ressuspendida com PBS 1X para um volume adequado de parasitos, ou seja, levando em consideração o número de amostras a serem testadas e a relação estabelecida (0,5 parasito/célula). Separou-se uma alíquota para avaliação no citômetro de fluxo a fim de avaliar a intensidade de fluorescência apresentada pelos parasitos marcados com a preparação de FITC. A maioria dos parasitos apresentavam intensidade média de fluorescência (MFI) entre 102 e 103.
4.5 Ensaios de fagocitose e avaliação do perfil de expressão de marcadores de superfície celular
Inicialmente, foram coletadas amostras de sangue periférico em tubos contendo anticoagulante EDTA (4mL) e heparina sódica (30mL) (Vacutainer, Becton Dickinson - BD, E.U.A.). Em seguida, realizou-se hemograma e a partir do valor da global de leucócitos, calculou-se os ajustes necessários para obtenção de uma preparação celular com 1 x 107 leucócitos/mL, conforme equação descrita abaixo (QUADRO 1):
QUADRO 1- Exemplo de cálculo para o ajuste de leucócitos. 10.000.000 – 1.000mL X – 1mL X = 10.000 leuc./mL (C1x V1= C2x V2) 7.500 leuc./mL x 30mL = 10.000 leuc./mL x X X = 22,5mL
Exemplo de cálculo: Considerar global de leucócitos de 7.500 leuc./µL Para obter concentração celular de 1 x 107leuc./mL fazer o seguinte cálculo:
Retirar 7,5 mL de plasma
Fonte: Dados da pesquisa.
Posteriormente, o sangue periférico coletado em heparina sódica foi transferido para um tubo cônico de polipropileno de 50mL (Falcon, Becton Dickinson - BD, E.U.A.) e centrifugado a 664 g a temperatura de 18oC por 10 minutos. Após centrifugação, o plasma obtido foi descartado. Adicionou-se PBS 1X suplementado com 10% de SFB (mesmo volume de plasma retirado), homogeneizou-se e a suspensão celular foi lavada por centrifugação a 664 g a temperatura de 18oC por 10 minutos (esse procedimento foi repetido por mais uma vez). Em seguida, realizou-se ajuste da concentração celular para 1 x 107 leucócitos/mL.
Após ajuste, leucócitos do sangue periférico foram incubados com parasitos vivos, marcados com FITC, numa relação de 0,5 parasito/célula por uma hora sob agitação, em tubos de cultura de 14mL (Falcon, Becton Dickinson - BD, E.U.A.), estufa a 37ºC, 5% de CO2.
Além disso, foram realizadas também culturas nas mesmas condições descritas acima, entretanto, na ausência de parasitos, que foram utilizadas como culturas controle. Após esse período de incubação, adicionou-se 20µ L de Brefeldina A - BFA (Sigma, E.U.A.) em todos os tubos (concentração final de 10 µg/mL), que foram mantidos por mais quatro horas em estufa nas condições mencionadas anteriormente. Posteriormente, adicionou-se 220µ L de EDTA (Sigma, E.U.A.) 20mM, concentração final de 2 mM, e as amostras foram incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
4.5.1 Avaliação do perfil de expressão de marcadores de superfície celular em monócitos do sangue periférico
Amostras de 200µ L foram transferidas para tubos de poliestireno de 5mL (Falcon, Becton Dickinson - BD, E.U.A.), contendo 2µL de anticorpos monoclonais (QUADRO 2) para identificação da população de monócitos CD14-PerCP), receptores Toll (anti-TLR2-PE, anti-TLR4-PE), receptores Fc (anti-CD32-PE, anti-CD64-PE), receptor do complemento (anti-CD35-PE), moléculas de ativação (anti-MHC-1-PE, anti-HLA-DR-PE, anti-CD23-PE) e moléculas de co-estimulação (anti-CD80-PE, anti-CD86-PE). Em seguida, as amostras foram incubadas por 30 minutos, a temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
Posteriormente foram submetidas à etapa de lise dos eritrócitos, utilizando-se 3mL de solução de lise comercial (Facs Lysing Solution - FLS, Becton Dickson - BD, E.U.A), diluída dez vezes em água destilada, e incubadas por 10 minutos, a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. As amostras foram centrifugadas a 357 x g a temperatura de 18oC por 7 minutos. Em seguida, os sobrenadantes foram desprezados, as suspensões celulares ressuspendidas em vortéx e adicionou-se 3mL de PBS 0,015M, pH 7,4, contendo 0,5% de albumina bovina sérica e 0,1% de ázida sódica (Sigma, E.U.A.) - PBS-W. As células foram lavadas por centrifugação a 357 x g a temperatura de 18oC por 7 minutos. Posteriormente, os tubos foram vertidos, as suspensões celulares ressuspendidas em vortéx e adicionou-se 150µL de solução fixadora - MFF (10 g/l de paraformaldeído, 1% de cacodilato de sódio, 6,67 g/l de cloreto de sódio, pH 7,2) em cada tubo. Após período de 15 minutos a 4ºC, um total de 3.000 monócitos foram adquiridos e a análise dos parâmetros morfométricos e imunofenotípicos foi determinada com o auxílio de um citômetro de fluxo FACScan (Becton Dickson - BD, E.U.A.).
QUADRO 2- Relação dos marcadores utilizados na imunofenotipagem.
Marcador Fluorocromo Funções
Anti-CD14 PerCP
Receptor para complexo de lipopolissacarídeo e proteína ligadora de lipopolissacarídeo (LBP) expresso em células mielomonocíticas. Anti-TLR2 PE Molécula de expressão celular com função
relacionada ao reconhecimento de alguns microrganismos e substâncias endógenas. Anti-TLR4 PE Molécula de expressão celular com a função de induzir a ativação de resposta
imunológica adaptativa.
Anti-CD32 PE Receptor Fc para IgG de
baixa afinidade.
Anti-CD64 PE Receptor Fc para IgG1 e
Anti-CD35 PE
Receptor para complemento CR1, que tem como função
regular negativamente a cascata do complemento.
Anti-MHC-I PE
Molécula expressa na superfície celular que tem como função a apresentação
de antígenos protéicos.
Anti-HLA-DR PE
Molécula de MHC de classe II expressa na superfície de
células humanas, que tem como função a apresentação
de antígenos extracelulares derivados do lisossoma.
Anti-CD23 PE
Molécula de ativação celular, receptor de baixa afinidade
de IgE (FcεRII).
Anti-CD80 PE Co-regulação de ativação de linfócitos T.
Anti-CD86 PE
Co-regulação de ativação de linfócitos T.
Fonte: CD Reference Chart. 8th HLDA International Workshop, 2004.
4.6 Análise da capacidade fagocítica e do fenótipo de monócitos do sangue periférico
Para identificação da população celular de interesse e determinação da capacidade fagocítica e do valor percentual de receptores Toll (anti-TLR2-PE, anti-TLR4-PE), receptores Fc (anti-CD32-PE, anti-CD64-PE), receptor do complemento (anti-CD35-PE), moléculas de ativação (anti-MHC-1-PE, anti-HLA-DR-PE, anti-CD23-PE) e moléculas de co-estimulação (anti-CD80-PE, anti-CD86-PE) utilizou-se o software FlowJo (Flow Cytometry Analysis Software, versão 7.6.1.).
4.7 Análise estatística dos dados
Para a análise estatística dos dados foi utilizado o software GraphPad Prism (San Diego, E.UA., versão 5.00) para comparação entre os grupos. Para a análise comparativa entre dois grupos foi empregado o teste T de student para dados paramétricos e o teste de Mann
Whitney para dados não paramétricos. Para a análise comparativa entre três grupos foi empregado o teste de Análises de Variâncias (ANOVA), seguido pelo pós-teste de Tukey, para dados paramétricos e o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo pós-teste de Dunns para dados não paramétricos. As diferenças estatisticamente significativas foram consideradas quando o valor de p foi menor que 0,05.
5 RESULTADOS
5.1 Avaliação da capacidade fagocítica de monócitos do sangue periférico de pacientes portadores de leishmaniose cutânea
Inicialmente o objetivo era avaliar a capacidade fagocítica de monócitos. Para isso, avaliou-se o percentual de células CD14+ e FL-1+, visto que o parasito foi previamente marcado com FITC, que é um fluorocromo que emite fluorescência 1 (FL-1), e o marcador CD14 é constitutivo de monócitos. O anticorpo utilizado para a seleção da população de monócitos foi o CD14-TC, que emite a fluorescência 3 (FL-3). Dessa forma, células que emitem FL-3 e FL-1 internalizaram os parasitos.
Nossos dados (FIG. 9) demonstraram que na presença de formas promastigotas de L. braziliensis, houve menor capacidade fagocítica por monócitos do sangue periférico de pacientes do grupo clínico (LT) quando comparado aos grupos assintomático (AS) e controle (CT).
FIGURA 9- Capacidade fagocítica de monócitos do sangue periférico de indivíduos dos grupos controle (CT), assintomático (AS) e caso clínico (LT). Os resultados estão apresentados como porcentagem de células CD14+LEISH+ em formato de gráficos de boxes que destacam os valores: mínimo, 25%, 50%-mediana, 75% e máximo. As diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) entre os grupos Controle (CT), Assintomático (AS) e Caso clínico (LT) estão representadas pelas letras a, b e c, respectivamente. Já as diferenças estatisticamente significativas entre as culturas na ausência (CC) ou presença (Leish) de promastigotas vivas de L. braziliensis estão representadas por asterisco (*). Utilizando ANOVA.
5.2 Avaliação de receptores Fc (CD32 e CD64) e receptor de complemento (CD35) em monócitos do sangue periférico de pacientes portadores de leishmaniose cutânea
A análise (FIG. 10) do perfil de receptores Fc (CD32 e CD64) mostrou redução estatisticamente significativa da intensidade de expressão de CD32 em monócitos em indivíduos AS quando comparados aos pacientes do grupo CT. Além disso, observou-se, na cultura não estimulada, diminuição estatisticamente significativa da intensidade de expressão do marcador CD64 nos grupos AS e LT quando comparados ao grupo CT. Verificou-se também redução estatisticamente significativa da intensidade da expressão desse marcador no grupo CT da cultura estimulada quando comparado ao grupo CT da cultura não estimulada. Por outro lado, na cultura estimulada, observou-se aumento estatisticamente significativo intensidade de expressão desse receptor no grupo LT quando comparado ao grupo CT. Em relação ao marcador para receptor de complemento (CD35), observou-se, na cultura não estimulada, diminuição estatisticamente significativa da intensidade de expressão nos grupos AS e LT quando comparados ao grupo CT. Além disso, verificou-se redução estatisticamente significativa da expressão desse marcador no grupo CT da cultura estimulada quando comparado ao mesmo grupo da cultura não estimulada.
CT AS LT CT AS LT 200 450 700 a a CC Leish CT AS LT CT AS LT 100 350 600 a a CC Leish CT AS LT CT AS LT 100 300 500 a a a CC Leish M F I C D 3 2 M F I C D 3 5 M F I C D 6 4 * *
FIGURA 10- Avaliação do perfil de receptoresFc (CD32 e CD64) e receptor de complemento (CD35) em monócitos do sangue periférico de indivíduos dos grupos controle (CT), assintomático (AS) e caso clínico (LT). Os resultados estão apresentados como intensidade média de fluorescência (MFI) dos marcadores de superfície em células CD14+ em formato de gráficos de boxes que destacam os valores: mínimo, 25%, 50%-mediana, 75% e máximo. As diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) entre os grupos Controle (CT), Assintomático (AS) e Caso clínico (LT) estão representadas pelas letras a, b e c, respectivamente. Já as diferenças estatisticamente significativas entre as culturas na ausência (CC) ou presença (Leish) de promastigotas vivas de L. braziliensis estão representadas por asterisco (*). Utilizando ANOVA.
FONTE: Dados da pesquisa.
5.3 Avaliação de moléculas de ativação (CD23, HLA-DR E MHC-1) em monócitos do sangue periférico de pacientes portadores de leishmaniose cutânea
A análise (FIG. 11) de moléculas de ativação (CD23, HLA-DR e MHC-I) mostrou, na cultura estimulada, aumento estatisticamente significativo de CD23 no grupo LT com relação ao grupo CT. Houve também aumento estatisticamente significativo da expressão desse marcador no grupo LT da cultura estimulada quando comparado ao mesmo grupo da cultura não estimulada. Além disso, observou-se na cultura estimulada aumento estatisticamente significativo da expressão do marcador HLA-DR no grupo LT quando comparado ao grupo AS. Em relação ao marcador MHC-I na cultura estimulada, houve redução estatisticamente significativa da expressão desse marcador quando comparado ao grupo CT.
CT AS LT CT AS LT 0 15 30 a,* CC Leish CT AS LT CT AS LT 150 450 750 b CC Leish CT AS LT CT AS LT 200 400 600 a CC Leish % C é lu la s C D 2 3 + M F I H L A -D R M F I M H C -1
FIGURA 11- Avaliação do perfil de moléculas de ativação (CD23, HLA-DR e MHC-I) em monócitos do sangue periférico de indivíduos dos grupos controle (CT), assintomático (AS) e caso clínico (LT). Os resultados estão apresentados como percentual e intensidade média de fluorescência dos marcadores de superfície em células CD14+ em formato de gráficos de boxes que destacam os valores: mínimo, 25%, 50%-mediana, 75% e máximo. As diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) entre os grupos Controle (CT), Assintomático (AS) e Caso clínico (LT) estão representadas pelas letras a, b e c, respectivamente. Já as diferenças estatisticamente significativas entre as culturas na ausência (CC) ou presença (Leish) de promastigotas vivas de L. braziliensis estão representadas por asterisco (*). Utilizando ANOVA.
FONTE: Dados da pesquisa.
5.4 Avaliação de moléculas de co-estimulação (CD80 e CD86) em monócitos do sangue periférico de pacientes portadores de leishmaniose cutânea
A análise (FIG. 12) de moléculas de ativação (CD80 e CD86) mostrou aumento estatisticamente significativo da expressão de CD80 no grupo LT da cultura estimulada quando comparado ao mesmo grupo da cultura não estimulada. Em relação a CD86, observou-se, na cultura não estimulada, redução estatisticamente significativa da intensidade de expressão dessa molécula no grupo AS quando comparado ao grupo CT. Além disso, verificou-se redução estatisticamente significativa da intensidade de expressão desse marcador no grupo CT da cultura estimulada, quando comparado ao mesmo grupo da cultura não estimulada.
CT AS LT CT AS LT 0 15 30 * CC Leish CT AS LT CT AS LT 100 400 700 a CC Leish M F I C D 8 6 % C é lu la s C D 8 0 +
FIGURA 12- Avaliação do perfil de moléculas de co-estimulação (CD80 e CD86) em monócitos do sangue periférico de indivíduos dos grupos controle (CT), assintomático (AS) e caso clínico (LT). Os resultados estão apresentados em percentual e intensidade média de fluorescência (MFI) dos marcadores de superfície em células CD14+ em formato de gráficos de boxes que destacam os valores: mínimo, 25%, 50%-mediana, 75% e máximo. As diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) entre os grupos Controle (CT), Assintomático (AS) e Caso clínico (LT) estão representadas pelas letras a, b e c, respectivamente. Já as diferenças estatisticamente significativas entre as culturas na ausência (CC) ou presença (Leish) de promastigotas vivas de L. braziliensis estão representadas por asterisco (*). Utilizando ANOVA.
FONTE: Dados da pesquisa.
5.5 Avaliação de receptores Toll (TLR-2 e TLR-4) em monócitos do sangue periférico de pacientes portadores de leishmaniose cutânea
A avaliação (FIG. 13) de receptores Toll (TLR2 e TLR4) mostrou, na cultura não estimulada, redução estatisticamente significativa da expressão de TLR-2 nos grupos AS e LT quando comparados ao grupo CT. Além disso, observou-se também redução estatisticamente significativa da expressão desse marcador no grupo CT da cultura estimulada quando comparado ao mesmo grupo da cultura não estimulada. Em relação ao TLR-4, observou-se, na cultura não estimulada, redução estatisticamente significativa da expressão desse marcador no grupo LT quando comparado ao grupo CT. Por outro lado, verificou-se aumento estatisticamente significativo da expressão desse marcador no grupo LT da cultura estimulada quando comparado ao mesmo grupo da cultura não estimulada.
CT AS LT CT AS LT 0 15 30 a * CC Leish CT AS LT CT AS LT 0 15 30 a a CC Leish % C é lu la s T L R -2 + % C é lu la s T L R -4 + *
FIGURA 13- Avaliação do perfil de receptores do tipo Toll (TLR2 e TLR4) em monócitos do sangue periférico de indivíduos dos grupos controle (CT), assintomático (AS) e caso clínico (LT). Os resultados estão apresentados como percentual dos marcadores de superfície em células CD14+ em formato de gráficos de boxes que destacam os valores: mínimo, 25%, 50%-mediana, 75% e máximo. As diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) entre os grupos Controle (CT), Assintomático (AS) e Caso clínico (LT) estão representadas pelas letras a, b e c, respectivamente. Já as diferenças estatisticamente significativas entre as culturas na ausência (CC) ou presença (Leish) de promastigotas vivas de L. braziliensis estão representadas por asterisco (*). Utilizando ANOVA.
FONTE: Dados da pesquisa.
5.6 Esquema geral dos resultados obtidos
Em síntese nossos resultados (FIG. 14) mostraram que o grupo assintomático na ausência do parasito, apresenta menor expressão de CD35, CD64, TLR-2, MHC-1, CD32 e CD86. Já na presença do parasito, observamos apenas a redução de CD32.
Em relação ao grupo clínico, na ausência do parasito, observamos, assim como no grupo assintomático, redução de CD35, CD64 e TLR-2. Além disso, de forma diferente do grupo assintomático, observamos também redução de TLR-4. Já na cultura estimulada (presença do parasito), observamos redução da fagocitose e aumento da expressão de CD23, HLA-DR, CD64, CD80 e TLR-2.
LEISH -ASSINTOMÁTICO LEISH + CD86 CD32 MHC-1 CD35 CD32 CD64 TLR-2 CASO CLÍNICO LEISH + CD23 FAGOCITOSE LEISH -TLR-4 HLA-DR CD64 CD80 TLR-2 CD35 CD64 TLR-2
FIGURA 14- Síntese dos resultados obtidos com relação à capacidade fagocítica e imunofenotipagem. Culturas na ausência de promastigotas vivas de L. braziliensis estão representadas por LEISH-. Já as culturas na presença de promastigotas vivas de L. braziliensis estão representadas por LEISH+. Resultados comuns entre os grupos assintomático e caso clínico estão destacados em vermelho.
6 DISCUSSÃO
O estabelecimento e manutenção da leishmaniose cutânea são altamente dependentes da resposta imunológica (PIRMEZ et al., 1993. DA-CRUZ et al., 1994. CARVALHO et al., 1995. COUTINHO et al. 1996). Dessa forma é de crucial importância o entendimento e dinâmica da resposta imunológica. Com esse propósito, muitos grupos de pesquisa têm avaliado a produção de citocinas plasmáticas para melhor compreensão dessa resposta imunológica (CARVALHO et al., 1995. COUTINHO et al., 1998. ROCHA et al., 1999. FOLLADOR et al., 2002. TRUJILLO et al., 2002. MASINI et al., 2007. FOCACCIA et al., 2010).
O estudo da reatividade de células do sangue periférico tem demonstrado que pacientes portadores de leishmaniose cutânea com lesão ativa apresentam resposta celular com proliferação de células T CD4+ (Da-CRUZ et al., 1994. COUTINHO et al., 1998. DA-CRUZ et al., 2005), e que seus linfócitos, respondem in vitro a antígenos solúveis de Leishmania, produzindo níveis elevados de IFN-γ e baixos de IL-4 (CARVALHO et al., 1995. COUTINHO et al., 1996). O IFN-γ pode ser produzido por diferentes populações celulares, listados em ordem de contribuição: linfócitos T CD4+, linfócitos CD4-CD8- e linfócitos T CD8+ (BOTTREL et al., 2001).
Por outro lado, Masini et al (2007), demonstraram que pacientes assintomáticos (resistentes ao processo infeccioso) apresentam diminuição da expressão das citocinas IL-4 e IL-10 nos linfócitos T e subpopulações T CD4+ e T CD8+ e níveis basais de IFN-γ e TNF-α. Esse microambiente, desfavorável ao crescimento das leishmanias, poderia promover ativação de macrófagos e estimular a produção de NO, com conseqüente destruição das leishmanias intracelulares. Além disso, os autores observaram aumento significativo na razão IFN-γ +/IL-10+ e TNF-α+/IL-10+ nos linfócitos T dos pacientes assintomáticos, quando comparados a indivíduos não infectados. Dessa forma, esses indivíduos seriam capazes de eliminar leishmanias, sem precisar aumentar a produção das citocinas do tipo 1, ou seja, sem precisar montar uma resposta inflamatória, e conseqüentemente sem desenvolver lesão.
Observou-se que apesar de muitos estudos relacionados à resposta imunológica da leishmaniose cutânea, não haviam estudos relacionados à imunofenotipagem de monócitos do sangue periférico, bem como a avaliação da capacidade fagocítica destas células, que é um evento fundamental no inicio e estabelecimento da infecção. Estas questões despertaram o
interesse do nosso grupo de pesquisa em determinar a capacidade fagocítica e expressão de moléculas de superfície celular de monócitos do sangue periférico.
Com os resultados obtidos, pode-se demonstrar a menor capacidade fagocítica do grupo clínico, quando comparado aos grupos assintomático e controle.
Observou-se também que o aumento das expressões de CD23, HLA-DR, CD64, CD80 e TLR-2 exclusivamente no grupo clínico, sugerem perfil de resposta imunológico ativado. Como observamos no grupo clínico perfil de resposta imunológico ativado, sugerindo resposta tipo 1, espera-se que estes pacientes expressem elevadas concentrações de IFN-γ e consequentemente elevada capacidade fagocítica, pelo fato desta citocina ativar macrófagos para a destruição do parasito. Entretanto, ao se encontrar capacidade fagocítica reduzida neste grupo, acredita-se que o fato do grupo clínico possuir o parasito na corrente sanguínea, devido o processo infeccioso, e que este é intracelular obrigatório, o sistema imune deste grupo pode estar controlando a fagocitose com o objetivo de eliminar o parasito e consequentemente evoluir para a cura.
Encontrou-se também alterações comuns no grupo assintomático que foram as menores expressões de CD32, MHC-1 e CD86, sugerindo perfil de resposta imunológica balanceado, com provável produção de citocinas como IFN-γ, TNF-α, IL-10 e TGF-β, o que proporcionaria ao grupo assintomático a eliminação do parasito, devido a produção basal de citocinas tipo 1 (IFN-γ e TNF-α). Além disso, a presença de IL-10, que é citocina moduladora, e TGF-β, que é citocina tipo 2 com caráter regulatório, controlariam a resposta imune, não permitindo a exacerbação da resposta tipo 1. Este balanço permite assim a eliminação do parasito e não desenvolvimento da lesão característica de leishmaniose cutânea. Estes resultados mostram que o desenvolvimento da lesão é dependente da imunidade celular, e que a ativação da resposta imunológica é diretamente relacionado ao desenvolvimento para lesão ativa.
A redução dos marcadores TLR-2, CD35, CD64 e CD86 no grupo controle na presença do estímulo, indica provável envolvimento no sítio de ligação do parasito no momento da fagocitose, podendo estes marcadores estar no fagossomo intracelular.
7 CONCLUSÃO
A partir do estudo realizado, pode-se concluir que os grupos clínico e assintomático possuem perfil de resposta imune e capacidade fagocítica diferenciada.
A avaliação da resposta imune em indivíduos clínicos e assintomáticos já foi realizada por outros grupos de pesquisa, entretanto apenas pelo perfil de citocinas plasmáticas. Os resultados encontrados neste estudo, a princípio, corroboram com os dados encontrados em estudos anteriores. Para se ter a real comprovação deste fato e um melhor entendimento da resposta imune com relação à leishmaniose cutânea é necessário realizar outras estratégias experimentais, que são perspectivas do trabalho, são elas: avaliar o perfil de citocinas expressas por monócitos de pacientes destes grupos; avaliar de citocinas intracitoplasmáticas de linfócitos TCD4+ e TCD8+ do sangue periférico na ausência e presença de promastigotas vivas de L. braziliensis; avaliar a expressão de citocinas e quimiocinas no local da lesão.
Por fim, conclui-se que este trabalho foi o primeiro passo para muitos outros estudos, visto que não se tem na literatura um trabalho completo com relação à expressão de receptores celulares em monócitos do sangue periférico de pacientes portadores de leishmaniose cutânea e pacientes atualmente resistentes ao processo infeccioso.
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