IFI HIV-1 Bio-Manguinhos IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV-1 (material fornecido para 100 determinações)

Edição: Fevereiro|09 Arte: BM_BUL_033_00_R

IFI HIV-1

Bio-Manguinhos

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV-1

(material fornecido para 100 determinações)

Edição: Fevereiro|09 Arte: BM_BUL_033_00_R

IFI HIV

-1

Bio-Manguinhos

IMUNOFLUORES

CÊNCIA

INDIRETA

(IFI)

PA

RA

DIA

GNÓSTICO DA

INFECÇÃ

O PELO HIV

-1

(material fornecido para 100 determinações)

IFI HIV 1

Bio-Manguinhos

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV-1

(material fornecido para 100 determinações)

PRINCÍPIO DO TESTE

Este teste consiste na reação de soros ou plasmas humanos com células K37-3, infectadas pelo vírus da imunodefi ciência humana tipo 1 (HIV-1), fi xadas em lâminas de microscopia para fl uorescência. Aproximadamente 25-35% das células possuem antígenos virais capazes de serem detectados em sua superfície. A reação entre o antígeno fixado e o anticorpo presente nas amostras é visualizada após a adição de anti-imunoglobulina humana (Ig), conjugada com isotiocianato de fluoresceína. Para a leitura da reação deve-se utilizar microscópio para fl uorescência.

ESQUEMA DO TESTE

Reação Positiva Reação Negativa CÉLULAS INFECTADAS AMOSTRA POSITIVA CONJUGADO FLUORESCÊNCIA

+ LUZ AZUL E ULTRAVIOLETA

CÉLULAS INFECTADAS AMOSTRA NEGATIVA CONJUGADO AUSÊNCIA DE FLUORESCÊNCIA

+ LUZ AZUL E ULTRAVIOLETA

IFI HIV

1

Bio-Manguinhos

IMUNOFLUOR ESCÊNCIA INDIRET A (IFI) PA RA DIA GNÓSTICO DA INFECÇÃ O PELO HIV -1

(material fornecido para 100 determinações)

PRINCÍPIO DO TESTE

Este teste consiste na reação de soros ou plasmas humanos com células K37-3, infectadas pelo vírus da imunodefi ciência humana tipo 1 (HIV-1), fi xadas em lâminas de microscopia para fl uorescência. Aproximadamente 25-35% das células possuem antígenos virais capazes de serem detectados em s ua s up erf íc ie . A re aç ão e ntr e o an tíg en o fix ad o e o an tic orp o presente nas amostras é visualizada após a adição de anti-imunoglobulina hu ma na ( Ig ), co nju ga da c om is oti oc ia na to d e flu ore sc eín a. Pa ra

a leitura da reação deve-se utilizar microscópio para fl uorescência.

ESQUEMA DO TESTE

Reação P ositiva Reação Negativa CÉLUL AS INFECTA DA S AMOSTR A POSITIVA CONJUGA DO FLUORESCÊNCI A + LUZ AZUL E UL TRA VIOLETA CÉLUL AS INFECTA DA S AMOSTR A NEGA TIVA CONJUGA DO AUSÊNCI A DE FLUORESCÊNCI A + LUZ AZUL E UL TRA VIOLETA 2 2

MATERIAL FORNECIDO

Componentes Apresentação

Lâminas para IFI com Células

K37-3 Infectadas pelo HIV-1 10 lâminas

Controle Positivo 1 fr. de 0,25 mL

Controle Negativo 1 fr. de 0,25 mL Anti-Ig Humana Conjugada

com Fluoresceína 1 fr. de 0,15 mL Glicerina Tamponada

pH 9,0 +0,5 1 fr. de 2 mL

Azul de Evans 0,1% 1 fr. de 0,25 mL Manual de Instrução de Uso

MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO

- Tampão fosfato (PBS) pH 7,2;

- Microplacas e pipetadores de volume regulável ou tubos e pipetas para diluições;

- Recipiente com tampa com gaze umedecida para câmara úmida; - Cubas para lavagem de lâminas (tipo Koplin);

- Luvas descartáveis; - Água destilada;

- Hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária; - Recipiente para descarte de material contaminado; - Lamínulas 24 x 60 mm;

- Vidraria básica em geral (tubos, pipetas, provetas, etc);

- Estufa a 37o_C;

- Microscópio para fl uorescência.

CONSERVAÇÃO E ESTOCAGEM DO MATERIAL

Manter a -20o_{C: Lâminas para IFI, Controle Positivo e Controle Negativo.}

Manter entre 2o _{e 8}o_{C: Anti-Ig Humana, Glicerina Tamponada e Azul de Evans.}

Todos os componentes do teste devem ser guardados nas temperaturas indicadas desde o ato do recebimento do conjunto, permanecendo estáveis pela validade defi nida na caixa principal do kit.

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MATERIAL FORNECIDO

Componentes Apresentação

Lâminas para IFI c om Células

K37-3 Infectadas pelo HIV-1 10 lâminas

Controle Positivo 1 fr. de 0,25 mL

Controle Negativo 1 fr. de 0,25 mL

Anti-Ig Humana Con jugada com Fluoresceína 1 fr. de 0,15 mL Glicerina T amponada pH 9,0 +0,5 1 fr. de 2 mL Azul de Evans 0,1% 1 fr. de 0,25 mL

Manual de Instrução de Uso

MATERIAL NECES

SÁRIO MAS NÃO FORNECIDO

- T am pão fosfato (PBS) pH 7,2;

- Microplacas e pipetadores de volume regulável ou tubos

e pipetas para diluições;

- R ec ip ie nte c om ta mp a c om g aze u me de cid a p ara c âm ara ú mid a;

- Cubas para lavagem de lâminas (tipo Koplin );

- Luvas descartáveis; - Água destilada; - Hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária;

- Recipiente para descarte de material contaminado; - Lamínulas 24 x 60 mm;

- Vidraria básica em geral (tubos, pipetas, provetas, etc); - Estufa a 37

o

C; - Microscópio para fl uorescência .

CONSERV

AÇÃO E ESTOCAGEM DO MATERIAL

Manter a -20

o

C: Lâminas para IFI, Controle P ositivo e Controle Negativo.

Man ter en tre 2 o e 8 o C: An ti-I g H um an a, G lic erin a T am po nad a e A zu l d e E van s. T odos os componentes do teste devem ser guardados nas temperaturas indicadas desde o ato do recebimento do conjunto, permanecendo estáveis

pela validade defi nida na caixa principal do kit.

ENSAIO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA HIV 1 MODELO DE PROTOCOLO

Lote:

Validade:

IFI nº:

Data:

Antígeno:

Lote:

Validade:

Conjugado:

Lote:

Validade:

Diluição:

Lâmina nº:

1.

7.

2.

8.

3.

9.

4.

10.

5.

11.

6.

12.

Lâmina nº:

1.

7.

2.

8.

3.

9.

4.

10.

5.

11.

6.

12.

Técnico Responsável: Observações:

ENSAIO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRET A (IFI) PARA HI V 1 MODELO DE PROTOCOL O

Lote:

Validade:

IFI nº:

Data:

Antígeno:

Lote:

V

alidade:

Conjugado:

Lote:

Validade:

Diluição:

Lâmina nº:

1.

7.

2.

8.

3.

9.

4.

10.

5.

11.

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12.

Lâmina nº:

1.

7.

2.

8.

3.

9.

4.

10.

5.

11.

6.

12.

Técnico Responsável: Observações:

Obs.: A temperatura de transporte, com bobinas de gelo reciclável, permite que o conjunto se mantenha em condições adequadas durante 24 a 36 horas.

CUIDADOS E PRECAUÇÕES

Somente para uso in vitro. Este conjunto diagnóstico contém produtos

biológicos e químicos, podendo representar uma fonte de infecção. Portanto, ao manusear qualquer um dos reagentes desse conjunto, observar as precauções de biossegurança necessárias.

A qualidade dos resultados obtidos com este conjunto diagnóstico depende do cumprimento às boas práticas de laboratório, tais como:

-As amostras, assim como lâminas e outros insumos devem ser estocados e manipulados adequadamente;

-Homogeneizar as amostras e controles antes de usar;

-Utilizar equipamento de proteção individual (EPI), tais como luvas descartáveis, jaleco e protetor facial em todas as etapas do teste;

-Desprezar ponteiras, luvas, pipetas de vidro, frascos, lâminas usadas, etc., em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária;

-Para evitar interferências,nunca tocar com os dedos na parte superior da lâmina onde se encontram as células fi xadas;

-Nunca reaproveitar as lâminas;

-Não usar os reativos após sua data de validade;

-Utilizar frascos e vidrarias rigorosamente limpos, secos e desengordurados, pois resíduos de detergentes e/ou substâncias oxidantes poderão interferir na reação;

-Nunca misturar componentes de lotes diferentes;

-Utilizar lápis grafi te preto para identifi car e / ou numerar lâminas escrevendo unicamente o necessário e qualquer anotação deve ser registrada no protocolo do ensaio. 4 4 17

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 . A s c h e r, M . S . & W i l b e r, J . C . I m m u n o f l u o re s c e n c e f o r

Serodiagnosis of Retrovirus Infection. Arch. Pathol. Lab. Med.

114: 246-248, 1990.

2. Gallo, D.; Hoffman, M. N.; Yeh, E.T.; George, J. G. & Hanson, C. V. Comparison of Indirect Immunofl uorescence and Membrane Fluorescence Assays for the Diferentiation of Antibodies to Human Immunodefi ciency Virus Types 1 and 2. J. Clin. Microbiol. 30: 2275-2278, 1992.

3. Sullivan, M. T.; Mucke, H.; Kadey, S. D.; Fang, C. T. & Williams, A. E. Evaluation od an Indirect Immunofluorescence

A s s a y f o r Confirmation of Human Immunodeficiency Virus

Type 1 Antibody in U.S. Blood Donor Sera. J. Clin. Microbiol., 30: 2509-2510, 1992.

4. Sandstrom, E. G.; Schooley, R . T.; Ho, D. D.; Byington, R.; Sarngadharan, M. G.; MacLaren, M. E.; Essex, E.; Gallo, R. C. & Hirsch, M. S. Detection of Human anti-HTLV-III Antibodies by Indirect Immunofluorescence Using Fixed Cells. Transfusion, 25/41: 308-12, 1986.

ASSISTÊNCIA AOS USUÁRIOS

Orientações técnicas adicionais a respeito deste produto poderão ser obtidas junto a:

Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos

Bio-Manguinhos | Fiocruz

CNPJ: 33.781.055/0001-35

Av. Brasil, 4365 - Manguinhos -CEP: 21040-900 - Rio de Janeiro - RJ

SAC: 0800.210.310 | sac.reativos@bio.fi ocruz.br

Fax: (21) 3882.7176

www.bio.fi ocruz.br

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. As ch er, M . S. & Wil be r, J. C. Im mu no fl uo re sc en ce f or Se ro dia gn os is o f Re tro vir us I nfe cti on . Arc h. Pa th ol. L ab . Me d. 114: 246-248, 1990. 2. G allo , D .; H offm an , M . N .; Y eh , E .T. ; G eo rg e, J . G . & H an so n, C . V. C om pa ris on of I nd ire ct Im mu no fl u ore sce nce an d M em bra ne Flu ore sce nce A ssa ys fo r th e Dif ere nti ati on of An tib od ies to H um an Im mu no defi c ien cy Vi ru s T yp es 1 a nd 2. J. Clin. Microbiol. 30: 2275-2278, 1992. 3. Su lli va n, M. T.; M uc ke , H.; K ad ey , S. D.; F an g, C. T. & Wil lia ms , A. E. E va lu ati on o d an I nd ire ct Im mu no flu ore sc en ce As sa y fo r C on fir ma tio n of Hu ma n Im mu no de fic ie nc y Vir us Ty pe 1 A nti bo dy i n U.S . Blo od D on or Se ra . J. Cli n. Mic ro bio l., 30: 2509-2510, 1992. 4. Sa nd str om , E. G.; S ch oo le y, R. T.; H o, D. D.; B yin gto n, R.; S arn ga dh ara n, M. G.; M ac La re n, M. E.; E ss ex , E.; G all o, R. C. & H irs ch , M . S . De te cti on o f Hu ma n an ti-HT LV -II I An tib od ie s by I nd ire ct Im mu no flu ore sc en ce U sin g Fix ed C ell s . Tra ns fu sio n, 25/41: 308-12, 1986.

ASSISTÊNCIA AOS USUÁRIOS

Ori en ta çõ es t éc nic as a dic io na is a r es pe ito d es te p ro du to p od erã o ser o btid as jun to a:

Instituto de T ecnologia em Imunobiológicos

Bio-Manguinhos | Fiocruz

CNPJ: 33.781.055/0001-35

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SAC: 0800.210.310 | sac.reativos@bio.fi

ocruz.br

Fax: (21) 3882.7176

www.bio.fi

ocruz.br

Ob s.: A t em pe ra tu ra d e t ra ns po rte , c om b ob in as d e g elo r ec ic lá ve l, pe rm ite q ue o c on ju nto s e m an te nh a e m c on diç õe s a de qu ad as d ura nte 24 a 3 6 h ora s.

CUIDADOS E PRECAUÇÕES

So me nte p ara u so in v itr o. E ste c on ju nto d ia gn óst ic o c on té m p ro du to s bio ló gic os e q uím ico s, p od en do re pre sen tar um a fo nte de in fec ção . P ort an to , ao m an use ar qu alq ue r u m d os re ag en te s d ess e c on ju nto , o bse rva r a s

precauções de biossegurança necessárias.

A q ua lid ad e d os res ult ad os ob tid os co m e ste co nju nto d ia gn óst ico de pen de

do cumprimento às boas práticas de laboratório, tais como:

-As amostras, assim como lâminas e outros insumos devem ser estocados e manipulados adequadamente; -Homogeneizar as amostras e controles antes de usar;

-U til iza r e qu ip am en to d e p ro te çã o i nd iv id ua l ( EP I), t ais c om o l uv as

descartáveis, jaleco e protetor facial em todas as etapas do teste;

-D esp re za r p on te ira s, lu va s, pip eta s d e v id ro , f ra sc os, lâ min as usa da s, etc ., em so lu çã o d e h ip oc lo rit o d e s ód io a 2 ,5 % o u á gu a s an itá ria ; -Para evitar interferências,nunca tocar com os dedos na parte superior da

lâmina onde se encontram as células fi xadas; -Nunca reaproveitar as lâminas; -Não usar os reativos após sua data de validade;

-Utilizar frascos e vidrarias rigorosamente limpos, secos e desengordurados, pois resíduos de detergentes e/ou substâncias oxidantes poderão interferir na reação; -Nunca misturar componentes de lotes diferentes;

-U tili za r lá pis gr afi t e p ret o p ara id en tifi ca r e / o u n um era r lâ min as esc rev en do un ic am en te o n ec ess ári o e q ua lq ue r a no ta çã o d eve s er re gis tra da n o protocolo do ensaio.

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PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO pH 7,2 (PBS)

Sais Quantidade

Cloreto de Sódio (NaCl)

PA 0,145M 8,77 g

Fosfato de Sódio Dibásico Anidro (Na₂HPO₄)

PA 0,00772M 1,02 g

Fosfato de Sódio Monobásico Anidro (NaH₂PO₄)

PA 0,00228M 0,34 g

Água destilada q.s.p.

(quantidade sufi ciente para) 1000 mL

ATENÇÃO :Os sais descritos acima, quando não utilizados na forma anidra, deverão ter suas quantidades recalculadas em função das moléculas de água presentes. Verifi car sempre no rótulo dos produtos a composição dos sais e o peso molecular.

Exemplo de correção de peso para preparo de PBS quando se utilizar o fosfato dibásico hidratado com 12 moléculas de água.

Cálculo:

Na₂HPO₄ Anidro - Peso Molecular = 142 pesar 1,02 g

Na

₂

HPO

₄

.12H

₂

O - Peso Molecular = 358 pesar X g

142 - 1,02

X = 1,02 x 358 = 2,57 g

358 - X 142

Neste exemplo, onde o Fosfato Dibásico é hidratado com 12 moléculas de água, deve-se pesar 2,57 g para preparar o PBS.

TITULAÇÃO DO CONJUGADO

O título do conjugado varia em função das condições de trabalho, do microscópio utilizado e do operador.

O laboratório deverá utilizar o controle negativo na diluição 1:8, e o controle positivo para HIV-1, com título conhecido, descrito no rótulo, que será utilizado nas diluição 1:8 e na diluição correspondente a seu título.

ÍNDICES DE SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE

A sensibilidade e especificidade de 100% levaram em consideração os resultados obtidos de 2.000 amostras avaliadas através de ensaios enzimáticos de princípios metodológicos ou composição antigênica diferentes. Destas amostras, 20% ainda foram confi rmadas pela metodologia de Western Blot, que é considerada Gold Standart para diagnostico de HIV, que foram confrontadas com o IFI HIV-1.

REPRODUTIBILIDADE, REPETITIVIDADE E

ESTABILIDADE

Diversos estudos foram realizados em nossos laboratórios, avaliando amostras conhecidas e caracterizadas como padrão, sob os aspectos de reprodutibilidade e repetitividade. As conclusões nos permitem determinar um período de 01 ano de validade para o produto, se acondicionado conforme as recomendações do Manual de Instruções de Uso, mantendo-se as mesmas características e padrões de qualidade.

ÍNDICES DE SENSIBILIDADE E ESPECIFICID

ADE

A se ns ib ili da de e e sp ec ifi cid ad e de 1 00 % le va ra m em c on sid era çã o os re su lta do s o bti do s d e 2 .0 00 a mo str as ava lia da s a tra vé s d e e nsa io s en zim áti co s de p rin cíp io s me to do ló gic os o u co mp os iç ão a nti gê nic a dife re nte s. D est as am ost ra s, 2 0% ai nd a fo ra m c on fi rm ad as pe la m eto do lo gia de Western Blot, que é considerada Gold Standart

para diagnostico de

HIV ,

que foram confrontadas com o IFI-HIV 1.

REPRODUTIBILIDADE, REPETITI

VID

ADE E

ESTABILID

ADE

Div ers os e stu do s f ora m r ea liz ad os e m n os so s l ab ora tó rio s, av ali an do amostras conhecidas e caracterizadas como padrão, sob os aspectos de reprodutibilidade e repetitividade. As conclusões nos permitem determinar um p erí od o d e 0 1 a no d e v ali da de p ara o p ro du to , s e a co nd ic io na do co nfo rm e a s r ec om en da çõ es do M an ua l d e In str uç õe s d e U so , m an te nd o-s e

as mesmas características e padrões de qualidade.

PREPARO DO T

AMPÃO FOSFA

TO p

H 7,2 (PBS)

Sais Quantidade

Cloreto de Sódio (NaCl)

PA 0,145M 8,77 g

Fosfato de Sódio Dibásico Anidro (Na

2 HPO 4 ) PA 0,00772M 1,02 g F os fat o d e S ód io M on ob ási co A nid ro (N aH 2 PO 4 ) PA 0,00228M 0,34 g Água destilada q.s.p. (quantidade sufi ciente para) 1000 mL AT EN ÇÃ O: Os s ais d es cr it os a cim a, qu an do n ão u til iz ad os na forma anidra, deverão ter suas quantidades recalculadas em função da s m olé cu la s d e á gu a p re se nte s. Ve rifi c ar se mp re n o r ótu lo d os

produtos a composição dos sais e o peso molecular.

Exemplo de co rreção de peso para preparo de PB S quando se utilizar o

fosfato dibásico hidratado com 12 moléculas de água.

Cálculo: Na 2 HPO 4 A nidro - Peso Molecular = 142

pesar 1,02 g

Na

2

HPO

4

.12H

2

O - Peso Molecular = 358

pesar X g

142 - 1,02

X = 1,02 x 358

= 2,57 g

358 - X 142

Neste exemplo, onde o F osfato Dibásico é hidratado com 12 moléculas

de água, deve-se pesar 2,57 g para preparar o PBS.

TITULAÇÃO DO CONJUGADO O t ítu lo d o c on ju ga do v ari a e m f un çã o d as co nd iç õe s d e t ra ba lh o, do

microscópio utilizado e do operador .

O la bo ra tó rio d eve rá u tili za r o co ntr ole n eg ati vo n a d ilu iç ão 1 :8 , e o co ntr ole positivo para HIV -1, com título conhecido, descrito no rótulo, que será utilizado nas diluição 1:8 e na diluição correspondente a seu título.

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1. Retirar da refrigeração:

a) duas lâminas, e colocá-las por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem. Evitar atrito com a parte superior das lâminas onde se encontram as células fi xadas;

b) os controles positivo e negativo e os demais reagentes deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização.

2. Fazer um protocolo de trabalho, indicando a posição do controle positivo (CP), do controle negativo (CN), e controle do conjugado (PBS), conforme a seguir:

CP* título: Diluição referente ao título para HIV-1

3. Diluir o controle negativo (CN) 1:8 em PBS. Para realizar esta diluição, utilizar 25 µL de soro e adicionar 175 µL de PBS. Homogeneizar suavemente, evitando a formação de bolhas.

4. Diluir o controle positivo (CP), utilizando o esquema de diluição seriada a seguir:

ATENÇÃO: Homogeneizar o conteúdo de cada tubo antes de transferir o volume de 200 µL para o tubo seguinte.

INDETERMINADO

Qualquer padrão diferente dos descritos anteriormente. Na maioria das vezes, observa-se reação fl uorescente em todas as células. Neste caso, repita a reação e, persistindo o resultado, submeta a amostra a outra metodologia confi rmatória.

CONSIDERAÇÕES

A síndrome da imunodefi ciência humana adquirida (AIDS), é um grave problema em saúde pública. Esta síndrome caracteriza-se pela diminuição das células envolvidas na indução de resposta imune, por infecções oportunistas múltiplas, neoplasias, além do comprometimento neurológico. A AIDS é uma sindrome na qual ocorre simultaneamente ausência de regulação, disfunção e defi ciências imunológicas. Dentre as ações de prevenção e controle desta síndrome, o diagnóstico sorológico vem tornando-se um instrumento indispensável. Ao longo dos anos, observa-se o aumento do número de laboratórios que utilizam a metodologia de IFI como alternativa de confirmação sorológica, reduzindo a necessidade de utilização da metodologia de Western Blot, que é um ensaio de alto custo.

INDETERMINADO

Qu alq ue r p ad rã o d ife re nte d os de sc rit os an te rio rm en te . N a m aio ria d as ve ze s, ob se rva -se re aç ão fl uo re sc en te e m t od as as cé lu la s. Ne ste c aso , re pit a a r ea çã o e , p ers is tin do o r es ult ad o, su bm eta a a mo str a a o utr a me to do lo gia c on fi rm ató ria .

CONSIDERAÇÕES

A s ín dro me d a i mu no de fi c iê nc ia h um an a a dq uir id a ( AID S), é u m g ra ve pro ble ma em sa úd e p úb lic a. E sta sí nd ro me ca ra cte riz a-s e p ela di min uiç ão da s cé lu la s e nvo lvi da s n a in du çã o d e r esp ost a im un e, po r in fe cç õe s o po rtu nis ta s múltiplas, neoplasias, além do comprometimento neurológico. A AIDS é um a s in dro me n a q ua l o co rre s im ult an ea me nte a usê nc ia d e r eg ula çã o, disfunção e defi ciências imunológicas. Dentre as ações de prevenção e co ntr ole d est a s ín dro me , o d ia gn óst ic o s oro ló gic o v em to rn an do -se u m instrumento indispensável. Ao longo dos anos, observa-se o aumento do número de laboratórios que utilizam a metodologia de IFI como alternativa de c on fir ma çã o s oro ló gic a, re du zin do a n ec es sid ad e d e u til iza çã o d a

metodologia de Western Blot, que é um ensaio de alto custo.

1. R etirar da refrigeração: a) du as lâ min as , e c olo cá -la s p or 10 m in uto s a 3 7°C e m e stu fa p ara se ca ge m. Ev ita r atr ito c om a p art e su pe rio r da s lâ min as o nd e se en co ntr am a s c élu la s fi xa da s; b) os controles positivo e negativo e os demais reagentes deverão estar à

temperatura ambiente para sua utilização.

2. F azer um protocolo de trabalho, indicando a posição do controle positivo (CP), do controle negativo (CN), e controle do conjugado (PB S), conforme a seguir:

CP* título: Diluição referente ao título para HIV

-1

3. Diluir o controle negativo (CN) 1:8 em PBS. Para realizar esta diluição, uti liz ar 25 µL d e s oro e ad ic io na r 1 75 µL d e P BS . H om og en eiz ar su ave me nte ,

evitando a formação de bolhas.

4. Diluir o controle positivo (CP), utilizando o esquema de diluição seriada a seguir: ATENÇÃO : Homogeneizar o conteúdo de cada tubo antes de transferir

7 14

7 14

5. Conforme seu protocolo de trabalho (item 2), adicionar 10 µL

das diluições nos poços correspondentes ao controle negativo (diluído 1:8), controle positivo (diluído 1:8), controle positivo (diluição equivalente ao título para HIV-1 descrito no rótulo do frasco), e PBS. ATENÇÃO: O título para HIV-1 do controle positivo (CP) está descrito no rótulo do frasco.

IFI HIV-1 | Bio-Manguinhos

Controle Positivo

Título 1:256 (HIV-1)

VS/MS: ---

Lote: ---- Val: ---- Vol: --- Cons:

---Neste exemplo, utilizaríamos a diluição 1:256.

ATENÇÃO: Evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada das células. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada amostra ou controle a ser utilizado.

200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL TUBO 1 Diluição 1:8 350 µL de PBS + 50 µL de soro TUBO 2 Diluição 1:16 200 µL de PBS + 200 µL da diluição 1:8 TUBO 3 Diluição 1:32 200 µL de PBS + 200 µL da diluição 1:16 TUBO 4 Diluição 1:64 200 µL de PBS + 200 µL da diluição 1:32 TUBO 5 Diluição 1:128 200 µL de PBS + 200 µL da diluição 1:64 TUBO 6 Diluição 1:256 200 µL de PBS + 200 µL da diluição 1:128

REAGENTE

Cerca de 25-35% das células apresentam fl uorescência na membrana e em parte da célula.

Algumas amostras podem apresentar reatividade pouco intensa, porém sempre que observada a fl uorescência no percentual indicado, a amostra será reagente.

NÃO REAGENTE

Ausência de fl uorescência em todas as células

5. C on fo rm e se u pro to co lo d e tra ba lh o (it em 2 ), ad ic io na r 10 µ L da s dil uiç õe s no s po ço s co rre sp on de nte s ao c on tro le n eg ati vo (d ilu íd o 1 :8 ), co ntr ole p osi tiv o ( dilu íd o 1 :8 ), co ntr ole p osi tiv o ( dilu iç ão eq uiv ale nte a o t ítu lo p ara H IV -1 d esc rit o n o r ótu lo d o f ra sc o), e P BS . ATENÇÃO : O título para HIV -1 do controle positivo (CP) está descrito no rótulo do frasco. IFI HIV-1 | Bio-Ma nguinhos

Controle Positivo

Título 1:256 (HIV-1)

VS/MS: ---

Lote: ---- Val: ---- V

ol: --- Cons:

---Neste exemplo, util

izaríamos a diluição 1:256.

AT EN ÇÃ O: Ev ita r q ue a po nta d a p on te ira to qu e o u r as pe a su pe rfí cie d a lâmina, pois este procedimento provocará a retirada das células. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Uti liz ar um a p on te ira p ara c ad a a mo str a o u c on tro le a s er uti liz ad o. 200 µ L 200 µ L 200 µ L 200 µ L 200 µ L TU BO 1 Dilu içã o 1 :8 35 0 µ L d e P BS + 5 0 µ L d e s oro TU BO 2 Dilu içã o 1 :1 6 20 0 µ L d e P BS + 2 00 µ L d a dilu içã o 1 :8 TU BO 3 Dilu içã o 1 :3 2 20 0 µ L d e P BS + 2 00 µ L d a dilu içã o 1 :1 6 TU BO 4 Dilu içã o 1 :6 4 20 0 µ L d e P BS + 2 00 µ L d a dilu içã o 1 :3 2 TU BO 5 Dilu içã o 1 :1 28 20 0 µ L d e P BS + 20 0 µ L d a dilu içã o 1 :6 4 TU BO 6 Dilu içã o 1 :2 56 20 0 µ L d e P BS + 2 00 µ L d a dilu içã o 1 :1 28

REAGENTE

Cerca de 25-35% das células apresentam fl uorescência na membrana e em parte da célula. Alg um as am ost ra s p od em a pre sen ta r r ea tiv id ad e p ou co in ten sa , p oré m sempre que observada a fl uorescência no percentual indicado, a amostra será reagente.

NÃO REAGENTE

Ausência de fl uorescência em todas as células

13

13

8

8

6. Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37°C, em estufa. A câmara úmida deve ser previamente colocada em estufa a 37 °C por 30 minutos, para estabilizar na mesma temperatura de incubação do teste. Checar a umidade e repetir este procedimento em todas as etapas de incubação.

7. Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 5 minutos cada lavagem e, em seguida, lavar rapidamente as lâminas uma vez em água destilada.

8. Colocar as lâminas por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem. 9. Preparar uma solução de PBS-Azul de Evans (PBS-AE), a 0,004%. Colocar em um tubo 100 µL de Azul de Evans 0,1% e 2400 µL de PBS.

10. Diluir o conjugado anti-Ig humana marcada com fl uoresceína, conforme descrito a seguir: TUBO 1 Diluição 1:100 50 µL PBS-AE + 50 µL da diluição 1:50 TUBO 2 Diluição 1:200 150 µL PBS-AE + 50 µL da diluição 1:50 TUBO 3 Diluição 1:300 250 µL PBS-AE + 50 µL da diluição 1:50 TUBO 4 Diluição 1:400 350 µL PBS-AE + 50 µL da diluição 1:50 TUBO 5 Diluição 1:500 450 µL PBS-AE + 50 µL da diluição 1:50 TUBO 6 Diluição 1:600 550 µL PBS-AE + 50 µL da diluição 1:50 10 µL de Conjugado + 490 µL PBS-AE diluição 1:50

LEITURA E INTERPRETAÇÃO:

1- Para a leitura e interpretação das reações utilizar o microscópio de imunofl uorescência e objetiva de 40X.

Focalizar a lâmina na posição do controle positivo e observar a fl uorescência presente em cerca de 25-35% das células, de acordo com o padrão descrito a seguir.

Obs.: em algumas preparações de lâminas, a presença de grumos de células poderão ser observados no centro dos orifícios. Neste caso, para facilitar a interpretação do teste, recomendamos que a leitura seja realizada em campos mais periféricos, onde não são observadas aglomerações de células.

2- Focalizar a lâmina na posição do controle negativo e observar a ausência de fl uorescência nas células, bem como a coloração de fundo (“background”).

3- Proceder a leitura de cada amostra em no mínimo cinco diferentes campos, em um mesmo poço, considerando os padrões descritos a seguir:

6. Inc ubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37°C, em estufa. A câmara úmida deve ser previamente colocada em estufa a 37 °C por 30 m in uto s, p ara e sta bil iza r n a m esm a t em pe ra tu ra d e i nc ub aç ão d o teste. Checar a umidade e repetir este procedimento em todas as etapas de incubação. 7. La va r a s lâ min as 3 ( trê s) ve ze s c om P BS em cu ba d e la va ge m a pro pri ad a, 5 minutos cada lavagem e, em seguida, lavar rapidamente as lâminas uma

vez em água destilada.

8. Coloca r as lâminas por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem.

9. Pre pa ra r u ma so lu çã o d e P BS -A zu l d e E va ns (P BS -A E), a 0,0 04 %. C olo ca r

em um tubo 100 µL de Azul de Evans 0,1% e 2400 µL de PBS.

10 . D ilu ir o c on ju ga do an ti-Ig h um an a m arc ad a c om fl u ore sc eín a, c on fo rm e descrito a seguir: TUBO 1 Dilu içã o 1 :1 00 50 µ L P BS -A E + 5 0 µ L d a dilu içã o 1 :5 0 TUBO 2 Dilu içã o 1 :2 00 15 0 µ L P BS -A E + 5 0 µ L d a dilu içã o 1 :5 0 TUBO 3 Dilu içã o 1 :3 00 25 0 µ L P BS -A E + 5 0 µ L d a dilu içã o 1 :5 0 TUBO 4 Dilu içã o 1 :4 00 35 0 µ L P BS -A E + 5 0 µ L d a dilu içã o 1 :5 0 TUBO 5 Dilu içã o 1 :5 00 45 0 µ L P BS -A E + 50 µ L d a d ilu içã o 1 :5 0 TUBO 6 Dilu içã o 1 :6 00 55 0 µ L P BS -A E + 5 0 µ L d a dilu içã o 1 :5 0 10 µ L de Conjugado + 490 µL PB S-A E diluição 1:50

LEITURA E INTERPRETAÇÃO:

1- Pa ra a le itu ra e in te rp re ta çã o d as re aç õe s u til iza r o m ic ro sc óp io d e im un ofl uo re sc ên cia e o bje tiv a d e 4 0X . Foc aliz ar a lâ min a n a p osi çã o d o c on tro le p osi tiv o e o bse rva r a fl u ore sc ên cia pre se nte e m c erc a d e 2 5-3 5% d as c élu la s, de a co rd o c om o p ad rã o de sc rit o a se gu ir. Ob s.: e m a lg um as p re pa ra çõ es d e l âm in as , a p re se nç a d e g ru mo s d e cé lu la s p od erã o s er ob se rv ad os n o c en tro d os o rif íc io s. Ne ste c as o, pa ra fa cil ita r a in te rp re ta çã o d o t es te , r ec om en da mo s q ue a le itu ra se ja re ali za da e m c am po s m ais p eri fé ric os , o nd e n ão s ão o bs erv ad as ag lo me ra çõ es d e c élu la s. 2- F oc aliz ar a lâ min a n a p osi çã o d o c on tro le ne ga tiv o e ob se rva r a au sê nc ia de fl u ore sc ên cia n as cé lu la s, be m c om o a c olo ra çã o d e f un do (“ ba ck gro un d”) . 3- Pro ced er a le itu ra de ca da am ost ra em no m ín im o c in co di fer en tes ca mp os, em u m m esm o p oç o, co nsi de ra nd o o s p ad rõ es de sc rit os a s eg uir :

9 12

9

12 11- Adicionar 15 µL das diluições do conjugado em cada poço,conforme esquema a seguir:

12- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37°C, em estufa. 13- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 5 minutos cada lavagem e, em seguida, lavar rapidamente as lâminas uma vez em água destilada.

14- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem. 15- - Adicionar 1 gota de glicerina tamponada em cada orifício da lâmina, cobrindo-a com lamínula, evitando a formação de bolhas. Mantê-las sob abrigo da luz e a seco até o momento da leitura.

DEFINIÇÃO DO TÍTULO DO CONJUGADO:

Para a leitura das reações e defi nição da diluição de uso do conjugado, utilizar o microscópio de imunofl uorescência e objetiva com aumento de 40X. O título do conjugado corresponderá à primeira diluição em que se observar fl uorescência intensa no controle positivo diluído (1:8), e fl uorescência fraca no controle positivo na diluição correspondente ao título para HIV-1. Além disso, deve-se observar também ausência de fl uorescência no controle negativo e no PBS (controle de conjugado). Caso não seja possível defi nir o titulo entre as diluições utilizadas inicialmente, deve-se proceder uma nova série de titulações, utilizando-se mais uma lâmina. Esta nova série de titulações deverá ser iniciada a partir da concentração 1:700 até a diluição 1:900.

9- Diluir o conjugado ant-Ig humana - fl uoresceína na proporção adequada obtida com a prévia titulação do conjugado, em PBS-AE conforme esquema abaixo:

Nº Lâminas Título Conjugado PBS+AE PBS+AE+Conjugado

1 à 2 1:100 5 µL 495 µL 500 µL 1 à 5 1:200 5 µL 995 µL 1000 µL 1 à 8 1:300 5 µL 1495 µL 1500 µL 1 à 11 1:400 5 µL 1995 µL 2000 µL 1 à 12 1:500 5 µL 2495 µL 2500 µL 1 à 12 1:600 5 µL 2995 µL 3000 µL 1 à 12 1:700 5 µL 3495 µL 3500 µL 1 à 12 1:800 5 µL 3995 µL 4000 µL 1 à 12 1:900 5 µL 4495 µL 4500 µL

10- Adicionar 15 µL da diluição do conjugado em todos os poços das lâminas.

11- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37°C, em estufa. 12- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 5 minutos cada lavagem e, em seguida, lavar rapidamente as lâminas uma vez em água destilada.

13- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem. 14- - Adicionar 1 gota de glicerina tamponada em cada orifício da lâmina, cobrindo-a com lamínula, evitando a formação de bolhas. Mantê-la sob abrigo da luz e a seco até o momento da leitura.

9- Dilu ir o c on ju ga do an t-I g h um an a fl u ore sce ín a n a p ro po rçã o a deq ua da ob tid a co m a p ré via ti tu la çã o d o c on ju ga do , e m P BS -A E c on fo rm e e sq ue ma a ba ixo : Nº Lâminas Título Conjugado PBS+AE PBS+AE+Conjugado 1 à 2 1:100 5 µL 495 µL 500 µL 1 à 5 1:200 5 µL 995 µL 1000 µL 1 à 8 1:300 5 µL 1495 µL 1500 µL 1 à 11 1:400 5 µL 1995 µL 2000 µL 1 à 12 1:500 5 µL 2495 µL 2500 µL 1 à 12 1:600 5 µL 2995 µL 3000 µL 1 à 12 1:700 5 µL 3495 µL 3500 µL 1 à 12 1:800 5 µL 3995 µL 4000 µL 1 à 12 1:900 5 µL 4495 µL 4500 µL 10 - Ad ic io na r 15 µ L da d ilu iç ão d o co nju ga do e m to do s os p oç os da s l âm in as .

11- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37°C, em estufa.

12- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 5 minutos cada lavagem e, em seguida, lavar rapidamente as lâminas uma vez em água destilada. 13- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem.

14- - Adicionar 1 gota de glicerina tamponada em cada orifício da lâmina, cobrindo-a com lamínula, evitando a formação de bolhas. Mantê-la sob abrigo

da luz e a seco até o momento da leitura.

11- Adicionar 15 µL das diluições do conjugado em cada poço,conforme esquema a seguir: 12 - I ncu bar as lâ min as em câ mar a ú mid a p or 30 m in uto s a 3 7°C , e m e stu fa. 13 - L ava r a s lâ min as 3 ( trê s) ve ze s c om P BS em cu ba de la va ge m a pro pri ad a, 5 minutos cada lavagem e, em seguida, lavar rapidamente as lâminas uma

vez em água destilada. 14- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem.

15- - Adicionar 1 gota de glicerina tamponada em cada orifício da lâmina, cobrindo-a com lamínula, evitando a formação de bolhas. Mantê-las sob

abrigo da luz e a seco até o momento da leitura.

DEFINIÇÃO DO TÍTULO DO CONJUGADO:

Par a a le itu ra da s r ea çõ es e d efi niç ão da di lu iç ão de us o d o c on ju ga do , u tili za r o m ic ro sc óp io d e i mu no fl u ore sc ên cia e o bje tiv a c om a um en to d e 4 0X . O tít ulo d o c on ju ga do c orr esp on de rá à p rim eir a d ilu iç ão e m q ue s e o bse rva r fl u ore scê nci a in ten sa no co ntr ole po siti vo di lu íd o (1 :8 ), e fl u ore scê nci a fr aca no co ntr ole p osi tiv o n a d ilu iç ão co rre sp on de nte ao tít ulo p ara H IV -1 . A lé m d iss o, dev e-s e o bse rva r ta mb ém au sên cia de fl u ore scê nci a n o c on tro le neg ati vo e no PB S ( co ntr ole d e c on ju ga do ). Ca so n ão se ja p oss íve l d efi nir o ti tu lo e ntr e a s dilu içõ es util iza das in ici alm en te, de ve-se pro ced er um a n ova sé rie de tit ula çõ es, util iza nd o-s e m ais um a lâ min a. E sta no va sé rie de tit ula çõ es dev erá se r in ici ad a a p art ir da c on ce ntr aç ão 1 :7 00 a té a d ilu iç ão 1 :9 00 .

11

11

10

10

ATENÇÃO: Evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada das células. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada amostra ou controle a ser aplicado na lâmina.

5- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37°C, em estufa. 6- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 5 minutos cada lavagem e, em seguida, lavar rapidamente as lâminas uma vez em água destilada.

7- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem. 8- Preparar, momentos antes do uso, uma solução PBS – Azul de Evans (PBS-AE), conforme tabela abaixo:

O volume preparado do PBS + Azul de Evans da tabela abaixo é sufi ciente para preparo de uma lâmina. Sendo utilizada tanto na diluição base quanto na diluição do conjugado, no titulo previamente defi nido.

Título PBS AE PBS+AE 1:100 480 µL 20 µL 500 µL 1:200 960 µL 40 µL 1000 µL 1:300 1440 µL 60 µL 1500 µL 1:400 1920 µL 80 µL 2000 µL 1:500 2400 µL 100 µL 2500 µL 1:600 2880 µL 120 µL 3000 µL 1:700 3340 µL 160 µL 3500 µL 1:800 3800 µL 200 µL 4000 µL 1:900 4280 µL 220 µL 4500 µL ATENÇÃO : Evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a super fície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada das células. To ma r cu id ad o pa ra q ue o c on te úd o de d ife re nte s po ço s nã o se misturem. Utilizar uma ponteira para cada amostra ou controle a ser aplicado na lâmina. 5- In cu ba r a s lâ min as em c âm ara ú mid a p or 30 m in uto s a 3 7°C , e m e stu fa . 6- La va r a s lâ min as 3 ( trê s) ve ze s c om P BS em cu ba d e la va ge m a pro pri ad a, 5 minutos cada lavagem e, em seguida, lavar rapidamente as lâminas uma

vez em água destilada. 7- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem.

8- Preparar , momentos antes do uso, uma solução PB S – Azul de Evans (PBS-AE), conforme tabela abaixo:

O volume preparado do PBS + Azul de Evans da tabela abaixo é sufi ciente para preparo de uma lâmina. Sendo utilizada tanto na diluição base quanto

na diluição do conjugado, no titulo previamente defi nido.

Título PBS AE PBS+AE 1:100 480 µL 20 µL 500 µL 1:200 960 µL 40 µL 1000 µL 1:300 1440 µL 60 µL 1500 µL 1:400 1920 µL 80 µL 2000 µL 1:500 2400 µL 100 µL 2500 µL 1:600 2880 µL 120 µL 3000 µL 1:700 3340 µL 160 µL 3500 µL 1:800 3800 µL 200 µL 4000 µL 1:900 4280 µL 220 µL 4500 µL

ATENÇÃO: não esquecer que nos poços correspondentes ao controle positivo, somente 25-35% das células possuem antígenos virais capazes de serem detectados.

PROCEDIMENTO DO TESTE

1- Fazer o protocolo de trabalho (vide modelo em anexo), podendo avaliar até 10 amostras de soro ou plasma por lâmina.

ATENÇÃO: os controles positivo e negativo devem estar presentes em todas as lâminas para comparações no momento da leitura.

2- Retirar da refrigeração as lâminas necessárias para testar as amostras, e colocá-las por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem. Os controles positivo e negativo, e os demais reagentes, deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização.

ATENÇÃO: evitar atrito com a parte superior da lâmina onde se encontram as células fi xadas.

3- Diluir as amostras a serem testadas e os controles positivo e negativo 1:8 em PBS. Para realizar essa diluição utilizar 20 µL de soro ou plasma e adicionar 140 µL de PBS. Homogeneizar suavemente, evitando a formação de bolhas.

4- Adicionar 10 µL das diluições das amostras e controles positivo e negativo em cada poço das lâminas, seguindo o modelo abaixo e seu protocolo de trabalho. A = Amostra ATENÇÃO : não esquecer que nos poços correspondentes ao controle po sit ivo , s om en te 2 5-3 5% d as cé lu la s p os su em an tíg en os vi ra is ca pa ze s de serem detectados.

PROCEDIMENTO DO TESTE

1- F azer o protocolo de trabalho (vide modelo em anexo), podendo avaliar

até 10 amostras de soro ou plasma por lâmina.

ATENÇÃO : os controles positivo e negativo devem estar presentes em

todas as lâminas para comparações no momento da leitura.

2- R etirar da refrigeração as lâminas necessárias para testar as amostras, e colocá-las por 10 minutos a 37°C em estufa para secagem. Os controles positivo e negativo, e os demais reagentes, deverão estar à temperatura

ambiente para sua utilização.

AT EN ÇÃ O: ev ita r atr ito c om a p art e su pe rio r da lâ min a on de s e

encontram as células fi xadas.

3- Diluir as amostras a serem testadas e os controles positivo e negativo 1:8 em PBS. Para realizar essa diluição utilizar 20 µL de soro ou plasma e adicionar 140 µL de PBS. Homogeneizar suavemente, evitando a formação de bolhas. 4- Ad ic io na r 1 0 µ L d as d ilu iç õe s d as a mo str as e c on tro le s p os iti vo e ne ga tiv o e m c ad a p oç o d as lâ min as, s eg uin do o m od elo a ba ixo e s eu pro to co lo d e t ra ba lh o. A = Amostra