T í T U L O DA TESE
ALGUMAS AVALIAÇÕES SOBRE A PATOLOGIA E CON-- TROLE DA E U R I T R E M A T Í A S E BOVINA
A L G U M A S A V A L I A Ç Õ E S S O B R E A P A T O L O G I A E C O N - T R O L E D A E U R I T R E M A T Í A S E B O V I N A
A U T O R
M I L T O N H I S S A S H I Y A M A M U R A
APROVADA EM: 23/05/1989
Dra. SUSANA B. AMATO
Dra. DELIR C. G. da SERRA FREIRE
Dr. LUIZ F. FERREIRA
Dr. CARLOS W. G. LOPES
Aos meus pais SEIICHI e MASAKO, que me orientaram o sentido da vida com
luta e perseverança e sempre servindo com humanidade e humildade.
A G R A D E C I M E N T O S
Ao Prof. Michael Robin Honer pela orientação pe-las palavras sempre amigas e uma lição de vida.
Aos Profs. Carlos Wilsom Gomes Lopes e Laerte Grisi pela co-orientação pelas sugestões que foram dadas d u r a n t e t o d o o e x p e r i m e n t o .
Ao Prof. Ernst Eckehart Muller pela colaboração n o s t r a b a l h o s b a c t e r i o l ó g i c o s .
Ao Prof. João Waine Pinheiro e Prof(a) Nilva Apa-recida Nicolau da Fonseca pela colaboração nos trabalhos de processamento de texto e estatístico.
Ao Prof. Joaquim Carvalho da Silva, a Profª. Ali-ne Artioli Machado Yamamura e ao Prof. Lúcio Alberto F. An-tunes pela revisão de texto.
Aos Profs. Odilon Vidotto, Ademir Benedito da Luz Pereira e José da Silva Guimarães pela compreensão e amiza-d e .
Aos Profs. Francisco Coelho Marquês e Alvaro Bra-ga Filho pelo material cedido do Frigorífico Frigozé de Lon-d r i n a .
Ao Dr. Orency Garcia de Moraes e Dr. Jaime Canet Junior pelos animais cedidos nos experimentos.
vi
Aos técnicos José Aldevino, Antônio Carlos Fer-n a Fer-n d e s e W a l t e r L e i l a p e l a c o l a b o r a ç ã o .
A Fundação Universidade Estadual de Londri-na (FUEL), Universidade Federal Rural do Rio de Janei-ro (UFRRJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a todos que direta ou indireta-mente proporcionaram condições necessárias à realização des-te t r a b a l h o .
B I O G R A F I A
MILTON HISSASHI YAMAMURA, filho de Seiichi Yama-mura e Masako YamaYama-mura, nasceu a 16 de dezembro de 1949 em Bastos, Estado de São Paulo.
Ingressou na Universidade de São Paulo em 1971, onde graduou-se em Medicina Veterinária em 1975.
Em 1976 foi contratado para exercer o cargo de Professor Auxiliar de Ensino na Fundação Universidade Esta-dual de Londrina, nas disciplinas de Parasitologia
ria e Moléstias Parasitárias do curso de Medicina Veteriná-r i a .
Realizou o curso de pós graduação em Parasitolo-gia Veterinária, nível de mestrado na Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro, de 1977 a 1979.
Foi bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvi-mento Científico e Tecnológico (CNPg) e da Coordenação do Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), durante o curso de pós graduação em Parasitologia Veterinária, nível de doutorado, na Universidade Federal Rural do Rio de Janei-to, t e n d o i n g r e s s a d o n o a n o d e 1 9 8 3 .
Durante este período tem desenvolvido estudos em Parasitologia Veterinária, com trabalhos publicados em re-vistas cientifícas, em congressos regionais e nacionais e uma tese de Mestrado, referente a hemoparasitos de Cairina
v i i i
moschata, Parahaemoproteus nettionis, em condições brasilei-r a s .
R E S U M O
Foi estudada a infecção natural de Eurytrema coe-lomaticum (Giard & Billet, 1892), Looss 1907 em pâncreas bo-vino, com o objetivo de avaliar a extensão das lesões que este trematódeo causou no órgão. Estas lesões foram correla-cionadas com a população existente, com os números de ovos encontrados nas fezes de bovinos e com os tamanhos do trema-tódeo.
Macroscópicamente estas lesões foram classifica-das em três tipos, de acordo com a extensão classifica-das lesões pro-duzidos por E. coelomaticum:
Tipo I - ausência de lesões macroscópicas nos ductos e parênquima;
Tipo II - presença de lesões macrooscópicas so-mente nos d u c t o s ;
Tipo III - Presença de lesões macroscópicas nos d u c t o s e p a r ê n q u i m a s .
Os resultados mostraram que o parasito causa al-terações nas células acinares e nos casos mais extremos ha-via a ausência destas células, decorrente a destruição acar-retada pela fibrose.
Esta patologia pode ser corroborada também pela infecção intercorrente de bactérias entéricas e entre estas a Escherichia coli, notadamente a bactéria mais frequente na
e u r i t r e m a t í a s e e m b o v i n o .
Quanto as exigências nutricionais, este tremató-deo requer elementos elaborados pelas células acinares, pois espécime colhido de pâncreas comprometido com uma infiltra-ção gordurosa, onde havia a ausência destas células, ele era reduzido em seu tamanho, sua coloração era róseo pálida e notou-se a ausência de ovos no útero e quando presente estes e r a m i n f é r t e i s .
Quando exemplares de E. coelomaticum foram subme-tidos a estudos experimentais de sobrevivência em meios de cultivos, como Gay ABC, 199 e soro de ovino e neste último meio, o trematódeo sobreviveu por um período superior a 1.000 horas. O soro de ovino também serviu como meio de es-colha para os testes de drogas anti-helmínticos in vitro.
As drogas testadas: nitroxinil, rafoxanide, tri-clabendazole e closantel, tanto nos testes in vitro como in vivo, não foram capazes de determinar a morte deste tremató-deo. O mesmo aconteceu quando foram testadas os anti-helmín-ticos normalmente utilizados no controle de nematóides gas-trointestinais de bovino, como febantel, levamizole e iver-mectin. Nos exames microscópicas, foram notadas alterações, principalmente nas glândulas vitelogênicas, como degeneração dos grânulos, presença de grânulos no útero, com variado grau de degeneração, assim comprometendo a viabilidade dos ovos. Estas modificações foram encontradas em maior proporção nos trematódeos colhidos de animais tratados com levamizole.
SUMMARY
A study was made of the extent of damage caused in the pancreas of cattle by natural infections of Eurytre-ma coeloEurytre-maticum (Giard & Billet, 1892).
It was observed that the lesions were correlated with the average number and length of the tremotodes present
in t h e p a n c r e a s and t h e f e c a l egg c o u n t s .
Macroscopically, these lesions were classified in three types, according to the extent of the lesions produced by E. coelomaticum:
Type I - absence of macroscopic lesions in the ducts and parenchima.
Type lI - presence of macroscopic lesions in the ducts only,
Type III - presence of macroscopic lesions in both ducts and parenchima.
The results have shown that the trematode causes damage to the acini cells. In extreme cases these cells were absent as a consequence of destruction caused by fibrosis, provoked by the presence of the parasite, cronic inflamma-tory reaction and the presence of eggs in the pancreatic duct walls. These factors caused fibrosis by the reduction of the normal flow of pancreatic juice.
x i i
The presence of enteric bacteria, mainly Escheri-chia coli aggravates the pathology.
As far as its nutritional requerements are con-serned, it was found that the trematode requires elements present in acini cells. The trematode was often found in pancreases with fatty infiltration and in these cases the acini cells were absent and the trematodes were smaller and pale, without eggs or only infertile eggs in uterus.
When E. coelomaticum was cultivated in variaus media such as: Gay ABC, 199 and sheep serum, it was observed that in sheep serum the trematode could survive for more than 1,000 h o u r s .
Nitroxinil, rafoxanide, closantel and triclaben-dazole tested in vitro and in vivo did not show antihelmin-tic action against the pancreaantihelmin-tic fluke. The same results were found with febantel, levamizole and ivermectin, the most: effective drugs against cattle nematodes. Microscopic examination showed that the vitellogenic glands of E. coelo-maticum were the most affected by the action of levamisole.
ÍNDICE 1 4 4 11 1 3 1 5 16 17 2 1 23 23 24 26 26 28 29 30 32 34 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Espécie de Eurytrema e secas hospedeiros
Caracterização da espécie Eurytrema coelomaticum Aspectos de patologia causados pelos adultos de Eurytrema coelomaticum
Aspectos de patologia causados pelos agentes bacterianos
Manutenção in vitro
Contrôle terapêutico, teste in vivo Contrôle terapêutico, teste in vitro MATERIAL E MÉTODOS
Identificação morfológica do parasito Técnicas histológicas
Técnicas coprológicas Técnicas bacteriológicas
Cultivo de Eurytrema in vitro
Uso de anti-helmíntico, teste in vivo Uso de anti-helmíntico, teste in vitro
Efeito da vermifugação convencional sobre o Eurytrema
x i v 34 38 5 1 54 54 56 58 58 62 64 67 69 89 identificação e biometria de forma adulta de
Eurytrema
Avaliação anatomopatológica e histológica
Aspectos patológicos causados por agentes m i c r o b i a n o s
Observação in vitro de Eurytrema coelomaticum Cultivo in vitro de forma adulta
Observação sobre ovipostura
Avaliações do controle com o uso de drogas anti-helmínticas
Teste in vivo Teste in vitro
Efeitos das vermifugações usualmente empregados no controle de nematóides gastrointestinais de bovino, no Eurytrema
CONCLUSÕES
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICES
Infecção natural de bovino, por forma adul-tas de E. coelomaticum, indicando pâncreas com lesão macroscópica do tipo I, sem alte-rações nos lobos, da extremidade
esquer-d a ( L ) a esquer-d i r e i t a ( R ) 8 9 I n f e c ç ã o n a t u r a l d e b o v i n o , p o r f o r m a
adultas de E. coelomaticum, indicando pân-creas com lesão macroscópica do tipo II, Figura 1.
X V Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7.
notando alterações nos ductos de calibre menores por toda extensão do tecido pan-creático, da extremidade direita (R) a
es-q u e r d a ( L ) 9 0 Infecção natural de bovino, por forma
adul-tas de E. coelomaticum, indicando pâncreas com lesão macroscópica do tipo III, com al-terações por toda extensão do tecido pan-creático, da extermidade direita (D) a
es-q u e r d a ( E ) 9 1 Corte transversal de pâncreas bovino (P)
na-turalmente infectado por E. coelomaticum (E), com infiltrado gorduroso e presença de
secreção serosa (S) no ducto pancreático 92 Infecção natural de bovino com forma adulta
de E. coelomaticum, indicando pâncreas (P) com lesão macroscópica do tipo II, demons-trando a secreção catarral (S) no ducto
pancreático (D) 93 Infecção natural de bovino por forma adulta
de E. coelomaticum, indicando pâncreas com infiltrado gorduroso (l) e presença de
para-sito (E) de tamanho pequeno e rósea 94 Fotomicrografia de um corte histológico de
pâncreas bovino naturalmente infectado com E. coelomaticum (E), com alteração restrita
xvi
a nível do epitélio do ducto pancreático (D) e sem aIteração de células acinares (A) (X95,
H E ) 9 5 fotomicrografia de um corte histológico de
pâncreas bovino naturalmente infectado com E. coelomaticum, demonstrando a ação da ventosa oral (S) sobre (S) o epitélio do dueto pancreático (E) e presença de conteúdo
no interior da boca (B). (X950, HE) 96 Fotomicrografia de um corte histológico de
pâncreas bovino infectado com E. coelo-maticum, demonstrando reação inflamató-ria (I) na superfície do epitélio (L) e na
região da subserosa (S). (X175, HE) 97 Fotomicrografia de um corte histológico de
pâncreas bovino, naturalmente infectado com E. coelomaticum, demonstrando a reação por
e o s i n ó f i l o s ( E ) . ( X 1 9 0 , H E ) 9 8 Fotomicrografia de um corte histológico de
pâncreas bovino naturalmente infectado com E. coelomaticum, demonstrando tipo celura-res pcelura-resente na reação catarral (R) a nível
d o e p i t é l i o ( E ) . ( X 2 1 4 , H F ) 9 9 Fotomicrografia de um corte histológico de
pâncreas bovino, naturalmente infectado com E. coelomaticum (E), demonstrando apresenca Figura 8.
Figura 9.
Figura 10.
Figura 11.
xvii
de calcificação (C). (X95, HE) 100 Fotomicrografia de um corte histológico de
pâncreas bovino, naturalmente infectado com E. coelomaticum, demonstrando obstrução total e formação de um granuloma parasitá-ria (N) no ducto pancreático (D) e a
fibro-se (F) invadindo o tecido acinar (A) (X95, HE) 101
Fotomicrografia de um corte histológico de pâncreas bovino, naturalmente infectado com E. coelomaticum, demonstrando ausência de reações inflamatórias em torno dos ovos (O), encapsulados no tecido acinar (A) e
en-tre a fibrose (F). (X238, HE) 102 Fotomicrografia de um corte histológico de
pâncreas bovino, naturalmente infectado com E. coelomaticum, demonstrando a reação in-flamatória representada pelas células gi-gante (G) e a tentativa de englobar o ovo (O)
( O ) ( X 7 0 0 , H E ) 1 0 3 Visualisação dos ovos fértil (F) e
infér-teis (I) no útero (T) de E. coelomaticum.
( X 7 1 0 ) 1 0 4 Glândulas vitelínica (N) de E. coelomaticum,
demonstrando a ausência de alteração
( X 1 6 0 ) 1 0 5 Figura. 13. Figura. 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17.
x v i i i
Glândulas vitelínica (N) de E. coelomaticum, demonstrando alterações estruturais e
dege-neratiras das células. (X160) 106 Presença de grande quantidade de ovos
in-férteis (I) no interior do útero (U) de E. coelomaticum, recuperado de pâncreas
bovi-n o . ( X 2 6 0 ) 1 0 7 Figura 20. Presença de glânulos vitelogênico no
inte-rior do útero (T) de E. coelomaticum,
recu-perados de pâncreas bovino. (X285) 108 Presença de glânulos vitelogênico e grande
quantidade de ovos inférteis (I) no interior do útero (U) de E. coelomaticum, recuperados
de pâncreas bovino (X700) 109 Presença de concreções de ovos inférteis (I)
e grânulos vitelogênico liquefeito, no in-terior do útero (U) de E. coelomaticum,
re-cuperados de pâncreas bovino. (X226) 110 Avaliação biométrica (comprimento) dos
para-sitos colhidos de pâncreas bovino, natural-mente infectados e correlacionado com
carga parasitária 111-112 Avaliação biométrica (largura) dos parasitos
obtidos de bovinos, naturalmente infectados
e correlacionado com a carga parasitária 113-114 Figura 18. Figura 19. Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura 24.
x i x
Avaliação quantitativa de ovos de E. coelo-maticum eliminados nas fezes de bovinos,
correlacionados com a carga parasitária 115-116
Porcentagens de ovos férteis de E. coeloma-ticum encontrados nas fezes de bovinos e no
útero do parasito adulto 117-118 Porcentagem de sobrevivência de forma
adul-ta de E. coelomaticum em soro de ovino 119-120
Dados de carga parasitária, biometria dos principais caracteres de E. coelomaticum e análises das lesões provocadas nos pâncreas
de bovino (boi), naturalmente infectados 121-122
Dados de carga parasitária, biometria dos principais caracteres do E. coelomaticum e análises das lesões provocadas nos pâncreas
de bovino (vaca), naturalmente infectados 123-124
Presença de infecção bacteriana na euritre-matíase bovina e em animais sem o E.
coelo-maticum 125-126 Dados sumarizados de características
biomé-tricos de E. coelomaticum encontrados por
outros autores em infecção bovina 127-128 Figura 25. Figura 26. Figura 27. Tabela 1. Tabela 2. Tabela 3. Tabela 4.
1. INTRODUÇÃO
Entre os parasitos comumente encontrados em pân-creas de bovinos, tem sido relacionados os trematódeos dige-néticos do Gênero Eurytrema Looss, 1907, que incluem as espé-cies: E. coelomaticum (Giard & Billet, 1892) Looss, 1907; E. pancreaticum (Janson,1889) Looss, 1907; E. escuderoi Eduardo, Manuel & Tongson, 1976; E. parvum Senoo, 1907; E. dajii Bhale-rao, 1924; E. cladorchis Chin, Li & Wei, 1965; E. medium Ts-chertkova, 1959; E. tonkinense Galhard & Ngu, 1941. Muitas investigações tem sido realizadas com E. coelomaticum e E. pancreaticum, sem dúvida, as espécies que possuem uma maior distribuição geográfica e que também têm gerado contravér-sias quanto a sua posição taxonômica. Alguns autores como LOOSS & CUFFEY (1907), TRAVASSOS (1944), WATANABE (1960), NOSA-KA et alii (1970) e SANOSA-KAMOTO (1981) basearam-se nas caracte-rísticas fenotípicas para determinação da espécie de Eury-trema; outros como MORIYAMA et alii (1980) fizeram isto através das características genotípicas, revelando ainda que as duas espécies podem não coexistir no mesmo hospedeiro animal, fato este que não foi observado por EDUARDO et alii (1976) que encontraram infecção mista de E. coelomaticum e E. escuderoi em bovinos procedentes das Filipinas. Entre-tanto PRYADKO (1962) in MORIYAMA (1980) registrou que E.
coe-2
lomaticum e E. pancreaticum sejam a mesma espécie e CHINONE & ITAGAKI (1976) demostraram a similaridade das espécies no hospedeiro final.
CABRAL (1981) reportou que no Brasil os helmintos são fatores importantes na baixa produtividade dos rebanhos, sendo os nematódeos gastrointestinais aqueles parasitos mais investigados e indaga em relação a euritrematose que parcela de prejuizo é determinado por esta doença, a sua distribui-ção geográfica, tanto do agente causador, como dos seus hos-pedeiros, moluscos e gafanhotos, a sua variação estacional, a sobrevivência das metacercárias, a época e idade de ção de ruminantes com euritrematose, os efeitos das infec-ções na produtividade dos rebanhos, o uso de medicainfec-ções es-tratégicas e o custo benefício dos tratamentos.
De acordo com as nossas observações o Estado do Paraná, essencialmente a região Norte, possui um alto índice de euritrematíase bovina e que, ao passar dos anos, estes índices vêm aumentando gradativamente, Considerando-se a importância dos trematódeos na patologia e epidemiologia das doenças que acometem os bovinos no Brasil, os parasitos do Gênero Eurytrema tem sido mais notados pela frequência, que vai desde a citação inicial de HORTA (1918), seguida das des-crições de lesões patológicas produzidas pelo E. coelomati-cum em pâncreas bovino feita por TORRES & PINTO (1936), RI-BEIRO et alii (1980) e até mais recentes trabalhos de biolo-gia desta espécie por RAGUSA & CAMPOS (1976) e MATTOS
Jr (1987).
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a infecção do E. coelomaticum em pâncreas de bovino, e corre-lacionar a população existente no órgão, com a lesão produ-zida e com os dados de ovipostura do trematódeo. Paralela-mente desenvolveu-se estudos experimentais de sobrevivência do E. coelomaticum fora do habitat natural e para isto uti-lizou-se de meios de culturas como Gay ABC, 199 e o soro de animais, cuja finalidade principal foi para obter informa-ções que foram empregadas no teste de drogas anti-helmínti-cas in vitro. As drogas utilizadas foram as mesmas que foram testadas em bovinos naturalmente infectados com E. coeloma-ticum. Também avaliou-se a interferência das drogas anti-helmínticas, usualmente aplicadas para o controle de nema-tóides gastrointestinais e pulmonares de bovinos, sobre o trematódeo de localização pancreática.
2 . REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2 . 1 . E s p é c i e s de E u r y t r e m a e seus hospedeiros
E u r y t r e m a c o e l o m a t i c u m Bovino
Autor(s) ano
GIARD & BILLET (1892) HORTA (1918)
TRAVASSOOS (1918) FIGUEIREDO (1928) PINTO & ALHEIDA (1935) TORRES & PINTO (1936) CARVALHO (1940) TRAVASSOS (1944) CÔDO (1952)
WATANABE (1960) BRANT & COSTA (1963) NOSAKA et alii (1970) CAMPOS et alii (1974) MOLFI (1976)
EDUARDO et alii (1976) TANG & TANG (1977)
P r o c e d ê n c i a Tonkin B r a s i l Brasil Brasil Brasil B r a s i l B r a s i l B r a s i l B r a s i l Japão B r a s i l Japão B r a s i l B r a s i l Filipinas C h i n a tipo de infecção natural natural natural natural natural natural natural natural natural natural natural n a t u r a l natural natural natural natural
5
SHIEN e t alii (1978) MORIYAMA e t alii (1980)
KONO et alii (1980) Japão SOUZA & RABELO (1981)
YAMAMURA e t alii (1982) MATTOS J r ( 1 9 8 7 ) C h i n a J a p ã o B r a s i l B r a s i l B r a s i l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l C a p r i n o Autor ( s ) , ano PROENÇA (1935) TRAVASSOS (1944) TANG & TANG (1977) SAKANOTO et alii (1980) KONO et alii (1986) MATTOS Jr (1987) p r o c e d ê n c i a B r a s i l Brasil China J a p ã o J a p ã o B r a s i l t i p o d e i n f e c ç ã o na t u r a l n a t u r a l e x p e r i m e n t a l e x p e r i m e n t a l e x p e r i m e n t a l e x p e r i m e n t a l L e b r e
Autor(s), ano procedência SAKAMOTO (1981) Japão
tipo de infecção natural
Camundongo Balb c / nude+mouse
Autor (s), ano p r o c e d ê n c i a SAKAMOTO et alii (1981) Japão
t i p o de i n f e c ç ã o e x p e r i m e n t a l
G a t o
6 C H I N O N E e t a l i i ( 1 9 8 4 ) J a p ã o e x p e r i m e n t a l Ovino Autor (s), ano CARVALHO (1940) TRAVASSOS (1944) TANG & TANG (1977)
p r o c e d ê n c i a B r a s i l B r a s i l C h i n a tipo de infecção natural n a t u r a l n a t u r a l Bubalinos Autor (s), ano YAMAMURA et alii (1982) p r o c e d ê n c i a Brasil tipo de infecção n a t u r a l Eurytrema pancreaticum B o v i n o Autor(s), ano PURVIS (1931) TRAVASSOS (1944) FLORENCE (1939) TANG (1950) MAYAUDON (1954) WATANABE (1960) BASCH (1966) FREIRE (1967) NOSAKA et alii (1970) CAMPOS et alii (1974) EDUARDO et alii (1976) p r o c e d ê n c i a Malasia B r a si l M a d a g a s c a r China VenezueIa J a p ã o M a l a s i a Brasil J a p ã o B r a s i l F i l i p i n a s tipo de infecção n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l
TANG et alii SHIEN et alii MORIYAMA et alii RIBEIRO et alii SANTOS (1986) (1977) (1977) (1980) (1980) C h i n a C h i n a Japão B r a s i l B r a s i l natural natural natural natural natural Lebre Autor (s), ano TANG (1950) procedência C h i n a tipo de infecção n a t u r a l Coelho Autor(s), ano CHINONE & ITAGAKI (1976) SAKAMOTO et alii (1981) procedência Japão J a p ã o tipo de infecção e x p e r i m e n t a l experimental G a t o Autor(s), ano CHINONE et alii (1984) p r o c e d ê n c i a J a p ã o tipo de infecção e x p e r i m e n t a l Bubalino Autor(s), ano TRAVASSOS (1944) TANG (1950) BUSETTI et alii (1983) p r o c e d ê n c i a B r a s i l C h i n a B r a s i l tipo de infeccão n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l O v i n o
Autor (s), ano JANSON (1889) TRAVASSOS (1944) TANG (1950) FREIRE (1967) p r o c e d ê n c i a J a p ã o B r a s i l C h i n a B r a s i l tipo de infecção n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l n a t u r a l
C a p r i n o
Autor (s),
ano TRAVASSOS (1944) TANG (1950) BASCH (1966)CHINONE
& ITAGAKI (1976)p r o c e d ê n c i a Brasil China Malásia J a p ã o tipo de infecção n a t u r a l n a t u r a l e x p e r i m e n t a l e x p e r i m e n t a l
Camelo
Autor (s), ano TRAVASSOS (1944) TANG (1950) p r o c e d ê n c i a B r a s i l C h i n a tipo de infecção n a t u r a l n a t u r a lM a c a c o
Autor(s), ano
TANG (1950)
p r o c e d ê n c i a C h i n a t i p o d e i n f e c ç à o n a t u r a lHumano
Autor(s), ano
T A N G ( 1 9 5 0 )
CHANG & LI (1964)
p r o c e d ê n c i a C h i n a C h i n a tipo de infecção n a t u r a l n a t u r a lASADA et alii (1966) I S H I I ( 1 9 8 3 ) S u í n o Autor(s), ano TRAVASSOS (1944) TANG (1950) Eurytrema dajii B o v i n o Autor(s), ano BHALERAO (1924) HANDOKO (1981) Eurytrema tonkinense B o v i n o Autor(s), ano
GALLIARD & NGU (1941)
Eurytrema satoi S i m e o Autor(s), ano KOBAYASHI (1920) E u r y t r e m a r e b e l e Canino J a p ã o J a p ã o p r o c e d ê n c i a B r a s i 1 C h i n a p r o c e d ê n c i a I n d o n é s i a Indonésia p r o c e d ê n c i a Vietnã procedência J a p ã o n a t u r a l natu r a l tipo de infecção n a t u r a l natural tipo de infecção n a t u r a l n a t u r a l tipo de infecção n a t u r a l tipo de infecção n a tu r a l
A u t o r ( s ) , a n o R A I L L I E T (1924) procedência I n d o c h i n a . tipo de infecção n a t u r a l Eurytrema parvum Bovino Autor(s), ano SENOO (1907) p r o c e d ê n c i a J a p ã o tipo de infecção n a t u r a l Eurytrema ovis O v i n o Autor(s), ano TUBANGUI (1925) p r o c e d ê n c i a F i l i p i n a s tipo de infecção n a t u r a l E u r y t r e m a c l a d o r c h i s Nemobius A u t o r ( s ) , a n o T A N G & T A N G ( 1 9 7 7 ) p r o c e d ê n c i a China tipo de infecção n a t u r a l Eurytrema escuderoi B o v i n o A u t o r ( s ) , a n o EDUARDO et alii (1976) p r o c e d ê n c i a Filipinas tipo de infecção natural C a r a b a o A u t o r ( s ) , a n o E D U A R D O et alii (1976) procedência Filipinas tipo de infecção natural
Eurytrema hydropodes Hydropotes inermis Autor (s), ano
TANG & TANG (1975)
procedência China t i p o de i n f e c ç ã o n a t u r a l Eurytrema medium Ovino Autor (s), ano TSCHERTKOVA (1959) procedência Russia tipo de infecção natural
2.2. Caracterização da espécie Eurytrema coelomaticum
Na classificação sistemática dos trematódeos de localização pancreática, ao longo dos anos surgiram dúvidas e quase todos os trabalhos, inicialmente, descreviam os pa-rasitos pela sua localização habitual nos órgão, pela loca-lização errática, pelo seus hospedeiros, em seguida pelas características fenotípicas, através das descrições morfoló-gicas das estruturas dos órgãos do parasito e por fim pelas análises citológicas dos cromossomos do trematódeo.
LOOSS & CUFFEY (1907) revendo a nomenclatura taxo-nômica dos trematódeos digenéticos descritos por diversos a u t o r e s , s a l i e n t a r a m que a m e d i d a e a p o s i ç ã o r e l a t i v a d a s
ventosas representavam características específicas de E. coelomaticum, ou seja, o diâmetro da ventosa oral tinha a
12
mesma medida do diâmetro da ventosa ventral e a distância entre as duas ventosas era menor em E. coelomaticum, quando comparado com E. pancreaticum; também era menor a formação de grupos de folículos da glândula vitelogênica encontrada em E. coelomaticum. A partir destas considerações, outros autores começaram a caracterizá-los como espécies distintas e acrescentaram outras estruturas, como o útero, que em E. coelomaticum não forma curvas anteriores à ventosa ventral, e as glândulas vitelogênicas que são constituídos de peque-nos folículos arredondados. Tais observações foram realiza-dos por EDUARDO et alii (1976).
TRAVASSOS (1944) na revisão da familia Dicrocoeli-idae, considerou quatro subgêneros: Eurytrema (Eurytrema) Lo-oss, 1907; Eurytrema (Platynosomum) Nicole, 1914; Eurytrema (Lu-bens), Travassos, 1919 e Eurytrema (Skrjabinus) Bhalerao, 1936 e também descreveu e analisou os espécimes de E. coelomaticum e E. pancreaticum, já descritos por diversos autores brasi-leiros e internacionais, bem como os espécimes que recebeu, procedentes, na sua maioria, de diferentes Estados da Fede-ração e uma amostra da Índia. Reconheceu, também, efetiva-mente o E. coelomaticum, como espécie distinta e pela análi-se morfológica coloca outras espécies como sinonímia de uma das duas espécies e ressaltou ainda que a espécie prevalente na América do Sul era E. coelomaticum. Muitos autores a de-nominaram em seus trabalhos como E. pancreaticum, como HOR-TA (1918); FREIRE (1967); CAMPOS et alii (1974); RIBEIRO et
1 3
bem como a morfologia das formas larvais encontradas em hos-alii (1980); BUSETTI et hos-alii (1983); CORREA et hos-alii (1984) e SANTOS (1986) na realidade, deve-se tratar de E. coelomati-cum, levando em consideração a afirmação feita por TRAVAS-SOS (1944). O mesmo deve acontecer em outros países do conti-nente sulamericano, como a Venezuela, onde MAYAUDON (1954) reportou a ocorrência de E. pancreaticum e o autor levantou suspeita de que o animal parasitado fora importado do
Bra-TANG & Bra-TANG (1977) realizaram trabalhos, que di-ferenciaram os aspectos morfológicos dos parasitos adultos,
pedeiros intermediários, ressaltando a segunda geração de esporocisto.
MORIYAMA et alii (1980) estudou paralelamente a características fenotípicas e genotípicas, através das aná-lises cariológicas de cromossos de tecido gonadal de E. coe-lomaticum e E. pancreaticum, designando-os neste estudo de tipo I e tipo II respectivamente e concluiu haver diferenças morfológicas e biométricas dos cromossomos, bem como as po-sições dos centrômeros destas duas espécies.
2 . 2 . A s p e c t o s de P a t o l o g i a
1 4
TORRES & PINTO (1936) descreveram a ação do para-sitismo de formas adultas de E. coelomaticum em pâncreas de bovino naturalmente infectado e caracterizaram as lesões ma-croscópicas e mima-croscópicas, bem como a implicação que os ovos exercem neste mecanismo. Trabalhos como de KONO & FUKU-YOSHI (1966), NOSAKA et alii (1970) também investigaram o me-canismo da ação patológica dos ovos na infecção de Eurytre-ma.
Anterior aos trabalhos de TORRES & PINTO (1936), FIGUEIREDO (1928) e PINTO & ALMEIDA (1935) também descreveram
a ação parasitária de E. coelomaticum em bovinos.
BASCH (1966) estudou a biologia de E. pancreati-cum, também fez observações sobre a patologia e registrou alterações microscópicas e macroscópicas e ainda fez corre-lação entre o tamanho e a coloração dos parasitos e as con-dições dos órgãos parasitados.
CAMPOS et alii (1974) verificaram que havia corre-lação positiva e significativa entre o número de parasitos e o peso de pâncreas parasitado com E. pancreaticum, ou seja, à medida que aumenta o número de parasitos aumenta também o peso do pâncreas.
SAKAMOTO et alii (1981) notaram que não havia di-ferança significativa no tamanho dos parasitos obtidos de infecção experimental de caprino e de camundongo nude hete-rogêno. À medida que aumentou a carga parasitária, também houve um aumento da atrofia dos órgãos e os parasitos
obti-15
dos em infecção experimental nestes animais tiveram tamanho maiores, se comparados com aqueles colhidos de bovinos natu-ralmente infectados. Ressaltaram ainda os autores que a tro-ca regressiva dos tecidos acinares foi vista em pâncreas de camundongos infectados. Por este achado, eles consideram que o parasito teve severa patogenicidade sobre o tecido acinar de pâncreas.
Recentemente MATTOS Jr (1987) observou que as es-pécimes de E. coelomaticum colhidos dos caprinos experimen-talmente infectados era de tamanho menor do que os colhidos dos bovinos naturalmente infectados.
b . Causados p o r a g e n t e s b a c t e r i a n o s
Quando se estuda a patogenicidade de um agente parasitário, a atenção é sempre dirigida ao agente primário, no entanto, a severidade do quadro pode ser acarretada por agentes considerados secundários, notadamente quando o para-sito cria um estado imunodepressor, como mostrou o trabalho desenvolvido por AITKEN et alii (1979) com animais infectados com Fasciola hepatica.
EUZEBY (1954) assinalou que a infecção intercor-rente pode ser realizada pela transferência de agentes bac-terianos, pela migração dos trematódeos, como na fasciolose, entre estes incluem-se agentes anaeróbicos como Clostridium, assim facilitando o aparecimento de hepatite necrótica e
au-16
mentando o potencial patogênico dos esporos de Clostridium novyi, evidenciados pelos trabalhos realizados por MUZQUIZ M O R A C H O et alii (1981) e B A G A D I & SEWELL (1973).
N o e n t a n t o a m a i o r i a d o s t r a b a l h o s c i t a m a o c o r - rência de Escherichia coli, como um dos agentes enterobacte-rianas que aparecem com maior frequência e porcentagem, como p o d e s e r v i s t o n o s t r a b a l h o s d e M U Z Q U I Z M O R A C H O e t alii (1981) e OGUNRINADE & ADEGOKE (1982), que trabalharam com
infecção de Fasciola hepatica.
A necessidade de averiguar a real extensão da pa-tologia da euritrematiase bovina se deve a problema de saúde pública, uma vez que este órgão sofre um processo de indus-trialização na extração de hormônios, entre eles a insulina,
q u e é d e s t i n a d a p a r a o u s o h u m a n o .
2.3. Manutenção "in vitro"
Um dos primeiros passos no estudo da fisiologia d o p a r a s i t o a d u l t o é t e n t a r m a n t e r o p a r a s i t o v i v o f o r a d a
localização habitual do hospedeiro vertebrado e por maior tempo possível e a outra importância prática refere-se á ve-rificação do efeito de drogas de ação anti-helmíntica. Não foram encontradas nas pesquisas bibliográficas consultadas nenhuma tentativa sistemática do cultivo de E. coelomaticum, bem como dados de sobrevivência, condições respiratórias,
17
As tentativas com outros parasitos já foram ob-servadas, como ROSS & BUEDING (1950) que testaram o saro bo-vino fitrado e não filtrado e verificaram que o período de sobrevivência de Schistosoma mansoni não diferira nestes dois meios, indicando que as proteínas e outros componentes não dializáveis da soro tinham pequeno significado na sobre-vivência deste parasito. Também este experimento mostrou que o metabolismo respiratório tem pouca importância na manuten-ção em condições experimentais e esta completa inibimanuten-ção da respiração foi provocada pela incubação do parasito em "cya-nida" 1x10-3M. Quando o parasito tratava-se de Litomosoides carinii, nematódeo filarídeo, não sobreviveu mais que doze horas; mudando as condições respiratória para aeróbica a so-b r e v i d a d e s t e p a r a s i t o foi de s e t e dias.
2.4 Controle terapêutico
a. Teste "in vivo"
O controle químico da euritrematíase em animais doméstico tem sido efetivado, especialmente em bovinos natu-ralmente infectados com Eurytrema. Muitas drogas foram tes-tadas, em função da atividade anti-helmíntica, principalmen-te contra os trematódeos de ruminanprincipalmen-tes e assim ITAGAKI (1961)
in SAKAMOTO et alii (1980) utilizou Niclofolan, Bithionol, Tetracloreto de carbono, Hexaclorofeno, Niclosamida e
com-18
plexos antimoniais; KUKHARENKO (1971) testou drogas como He-xacloroparaxilol, Hexide, Hexacloroetano, Cyazide, Sulfeno, e Clorofos e nenhuma destas drogas foram capazes de agirem contra a infecção de Eurytrema em ruminantes. Os mesmos re-sultados foram obtidos por NOSAKA et alii (1977) quando em-pregaram o Bithionol, Bithionol sulfóxido, Thiabendazole e P i p e r a z i n a .
As drogas que se mostraram efetivas para Eurytre-ma foram obtidas por SAKAMOTO et alii (1980) quando testaram Nitroxinil e Praziquantel, notaram evidências de serem efe-tivos anti-helmínticos para E. coelomaticum, baseandos-se nos dados relativos a decréscimo da quantidade de ovos eli-minados pelas fezes, bem como a degeneração destes, refor-çando, com o encontro de trematódeos degenerados. O encontro de células em regeneração ativa dos tecidos tissulares, ob-servados em exames histopatológicos de pâncreas de animais tratados, reforça ainda mais as atividades destas drogas. Estes mesmos autores sugerem que Praziquantel seja um anti-helmíntico ideal contra trematódeos do gênero Eurytrema e assim observaram que utilizando a droga, havia um acréscimo de ovos anormais de E. coelomaticum.
Os testes anti-helmínticos em animais infectados experimentalmente foram realizados por KONO et alii (1986)
seguindo as indicações de SAKAMOTO et alii (1980) que utili-zaram o Praziquantel em caprinos e que mostrou ser efetivo, observados pelo decréscimo de quantidade de ovos nas fezes e
o encontro de pequenas quantidades de parasitos e no órgão haviam muitos leucócitos e assim demonstraram uma eliminação gradual do parasito e a recuperação do tecido, com a proli-feração do epitélio do ducto pancreático. Neste mesmo expe-rimento os autores testaram Triclabendazole e este não mos-trou nenhuma atividade anti-helmíntica para trematódeo pan-creático.
Na literatura sobre os anti-helmínticos utiliza-dos no controle da F. hepatica, como de ARMOUR & BOGAN (1982) notou se que havia uma seletividade muito grande das drogas testadas que agem sobre este parasito e sendo mais restrito quando se tratou de fase parasitária abaixo de quatro sema-nas após infecção, entre estas drogas incluíam Dianfenetide, esta não foi indicada para bovino, e Triclabendazole não mostrou ser ativo para trematódeo de Iocalização pancreáti-ca.
ARMOUR & BOGAN (1982) registraram excelentes re-sultados tanto para as formas adultas jovens e maturas de F. hepatica em ovinos e bovinos, Na fase parasitária entre qua-tro e oito semana de F. hepatica, além destas drogas acima c i t a d a s , a i n d a i n c l u e m o N i t r o x i n i l c o m o o b s e r v o u L U -CAS (1967).
GAN (1985) foram próximo de 90% de eficiência na eliminação Os resultados obtidos por MOHAMMMED ALI &
BO-deste parasito dos ductos biliares dos animais, utilizando Rafoxanide e Closantel.
E s t e s a n t i - h e l m í n t i c o s t ê m f u n ç ã o d e e l i m i n a r tanto as formas jovens e adultas, mas alguns destes agem de uma outra maneira, interferindo no desenvolvimento.
LUCAS (1967) observou a atividade de Nitroxinil, que era relacionada com a dosagem da medicação e a idade de infecção e que o desenvolvimento e as características biomé-tricas tem sido retardadas em grande proporção
A implicação desta droga no sistema reprodutivo foram observadas por FOREYT & TODD (1976) com a ação inibitó-ria na produção de ovos de FascioIoides magna, em cervos tratados com Nitroxinil, mas sem que ocorresse a morte do parasito. Os ovos não foram evidenciados nos úteros de para-sito, de animais sacrificados 17, 18 e 20 dias após o trata-mento. Os autores alegam que apesar do anti-helmíntico não matar o parasito, este tem o potencial de interromper tempo-rariamente a sua transmissão e ainda não se conhece a alte-ração deste estado de inibição
Trabalhos efetuados, com F. hepatica, em ovinos, utilizando Nitroxinil, STAMMERS (1976) obteve a redução da quantidade de ovos nas fezes, isto foi maior após 28 dias de
infecção. Após 42 dias do tratamento, o grupo tratado apre-sentou uma redução na viabilidade dos ovos, em relação ao grupo controle. As anormalidades dos orgãos reprodutivos, como a dos testículos, foram verificadas com pique na 8º se-mana do tratamento, havendo estreitamento da parte distal do túbulo, com distenção tubular periódica e redução do número
de túbulos brancos, enquanto que as anormalidades no ovário só foram observadas após a 8ª semana, podendo notar-se dis-tenção e atrofia, desenvolvimento incompleto ou ainda a sua ausência. O efeito mais marcante notado no útero foi a redu-ção em número de circunvoluções e do tamanho do órgão e por fim no sistema vitelogênico notaram-se a distenção e, algu-m a s v e z e s , a b i f u r c a ç ã o .
b. Teste "in vitro"
Foram poucos os trabalhos que tentaram observar a atuação de medicamentos anti-helmínticos sobre formas adul-t a s de adul-t r e m a adul-t ó d e o s de l o c a l i z a ç ã o p a n c r e á adul-t i c a .
VYKHRESTYUK et alii (1984) efetuaram testes com drogas derivadas de Salicilanilida (G937 e G1026) e com um derivado de Bisfenol (Oksinid) em E. pancreaticum, cujos re-sultados mostraram que as três drogas testadas atuaram sobre esta forma do trematódeo, matando num intervalo de 24 horas, na dose de 5x19-5M/litro do meio de cultivo. Os autores re-gistraram também alterações que ocorreram a nível de metabo-lismo de carbohidrato.
Com relação à utilização de soro sanguíneo, como meio de manutenção do trematódeo, BERETTA & LOCATELLI (1969)
investigaram com detalhes a interação entre o Nitroxinil e o soro sanguíneo em si ou com algumas proteínas séricas e ob-servaram ser esta droga um potente fasciolicida in vitro,
tanto em contacto direto, mas também quando introduzido por diálise (30 a 80ºA) e em contacto como meio: solução de gli-cose, de polivinil pirrolidona (PVP) e de leite, onde houve a atividade anti-helmíntica e quando em contacto com soro san-guíneo bovina, houve a redução da atividade anti-helmíntica a nível zero, isto por que a difusão desta droga era extrema-mente pequena em soro sanguíneo e na solução de albubina sér i c a e q u e e s t e s o sér o e sér a c a sér a c t e sér i z a d o p o sér f o sér t e l i g a -ção (binding) através da molécula da droga.
SAKAMOTO et alii (1984) desenvolveram testes in vitro, utilizando cercátrias de E. coelomaticum, obtidos de esporocistos de Bradybaena similaris. A manutenção destas cercárias era feita em meios básicos sintéticos, contento 20% de soro fetal bovino, 0,812% de lactoalbumina hidrolisá-vel, 0,625% de extrato seco e 0,5% de glucose e incubados a 28°C e acondicionados em tubos de Falcon, contendo 5 milili-tros do meio. Foram testadas 88 drogas que eram dissolvidas ou suspensas em propileno glicol na concentração de 0,002, 0,02, 0,2, 2,0 ou 20,0 miligramas por mililitro. A s altera-ções morfológicas das cercárias foram observadas por 24 ho-ras, através do uso de microscópio com contraste de fase e
23
3 . MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi realizado nos Laboratórios de Parasitologia e de Microbiologia, do Departamento de Medici-na Veterinária Preventiva, Patologia Animal e Zootecnia, do Centro de Ciências Agrárias, da Fundação Universidade Esta-dual de Londrina; nos Laboratórios da Área de Parasitologia Veterinária do Departamento de Biologia Animal, do Instituto de Biologia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. As colheitas de pâncreas parasitados e não para-sitados, bem como as fezes dos respectivos animais, foram realizadas nas dependências do Matadouro-Frigorífico Frigo-zé, em Londrina, Paraná. Os bovinos constituídos para estes estudos eram na sua maioria de raça zebuina e o período se estendeu, de Janeiro de 1983 a dezembro 1986.
3 . 1 . I n d e n t i f i c a ç ã o m o r f o l ó g i c a do p a r a s i t o
seada nos trabalhos de descrição original realizados por GIARD & BILLET (1892) e de LOOSS & CUFFEY (1907), de KOBAYAS-HI (1920), de TRAVASSOS (1944), de TRAVASSOS, FREITAS & KOHN (1969) e de CHINONE, FUKASE & ITAGAKI (1984).
ba-Os espécimes foram colhidos diretamente dos duc-tos pancreático de bovino, colocados em bandeja de plástico, contendo solução salina fisiológica e mantidos em temperatu-ra de geladeitemperatu-ra (entre 6 a 10 gtemperatu-raus centígtemperatu-rados) por um pe-ríodo de 12 horas. Alguns destes trematódeos foram colocados para compressão entre duas lâminas de vidro e amarrados através de um fio de algodão e mantidos em álcool, formol e ácido acético (AFA), por um período de 2 a 3 dias e em tempe-ratura ambiente. Após a compressão, os espécimes eram manti-dos em solução de AFA até a sua montagem. A coloração empre-gada foi o carmim clorídrico alcoólico, seguindo a técnica descrito por TRAVASSOS (1950).
Os registros morfológicos e micrométricos de Eurytrema foram realizados com o auxílio de microscópio óp-tico, com ocular micrométrico. Foram considerados as seguin-tes estruturas do trematódeo o comprimento e a largura do corpo, os diâmetros das ventosas oral e acetabular a dis-tância, das ventosas e a razão entre as ventosas.
3.2. T é c n i c a s h i s t o l ó g i c a s
Os pâncreas bovino naturalmente parasitados foram obtidos de animais abatidos no matadouro e procederam dos municípios de Maria Helena (3 vacas), Londrina (3 bois), Pero-bal (3 vacas), Paranavaí (3 vacas), Cornélio Procópio (3 va-cas), Umuarama (1 vaca), Altônia (3 vava-cas), Tapejara (4 bois),
Sertanópolis (4 bois), Marumbi (4 vacas), Alto Piquiri (4 bois), Castelo Branco (1 boi), Matelândia (2 bois) municípios sito no Estado do Paraná e Brasilândia (2 bois) de Mato Gros-so do Sul, totalizando 40 amostras de pâncreas, sendo consti-tuídos de 20 vacas, animais fêmeas e com idade superior a 60 meses e de 20 bois, animais que na sua maioria eram machos e com idade entre 36 a 48 meses. Estas amostras foram colhidas no período de janeiro a fevereiro de 1983 e remetidos a La-boratório de Parasitologia Veterinária da FUEL. Para o pro-cedimento de exames macroscópicos foram feitos o exame su-perficial do órgão como o aspecto, coloração e a sua consis-tência, para em seguida realizar o corte transversal do pân-creas para avaliar o estado do ducto e parênquima pancreáti-co.
Para os estudos histológicos, colheu-se fragmen-tos de pâncreas de três regiões distintas, os ducfragmen-tos da ex-tremidade direita, da posição mediana e da exex-tremidade es-querda e, em seguida, foram acondicionados em recipientes de vidro, contendo solução neutra de formalina a 10%: poste-riormente foram desidratados em etanol e a inclusão foi efe-tuada em parafina. A peça emblocada foi seccionada com o au-xílio de micrótomo em fragmentos com espessura de cinco mi-crômetros. A coloração foi obtida, utilizando-se a hematoxi-lina-eosina (HE), de acordo com o método de PUTT (1948).
Os registros das lesões produzidas por Eurytrema foram realizados com o auxílio de microscópio óptico da
mar-26
ca Nikon, utilizando filme Ektachrome-Kodak, 35 milímetros, A S A 6 4 .
3.3. Técnicas coprológicas
Concomitantemente às colheitas de pâncreas para-sitados, foram támbém realizadas as de amostras de fezes dos
respectivos animais, para estudar a correlação da carga pa-rasitária, com a quantidade de ovos eliminados pelas fezes
e as possíveis interferências decorrentes a tipos de lesões nos pâncreas.
Cada amostra constituiu de 10 gramas de fezes e acrescida de dois mililitros de formalina a 10%. Para
diag-nóstico parasitológico quantitativo, foi empregada a técnica descrita por CHINONE & ITAGAKI (1976) que consistia na tami-zação desta amostra de fezes em malhas com abertura de 150,106 e 76 micrómetros e o filtrado submetido a sedimenta-ção em cálice de Hoffman e a contagem total da amostra foi
realizada com o auxílio de um microscópio
esterescópio-Z e i s s , c o m c a p a c i d a d e d e a u m e n t o d e 1 0 0 v e z e s .
3.4. Técnicas bacteriológicas
As amostras de pâncreas bovino parasitados com
Eurytrema foram colhidas e acondicionadas em sacos plásticos limpos, devidamente identificadas, e, em seguida, remetidas
passa do intestino para o pâncreas pelo Canal de Virsung, assim a forma juvenil poderia transportar agentes microbia-nos.
para o Laboratório de Microbiologia da FUEL para realizações dos exames bacteriológicos, visando constatar a presença de enterobactérias, devido & proximidade do órgão com o trato
intestinal. No ciclo evolutivo de Eurytrema, PRYADKO (1962) reportou que a espécie E. pancreaticum na sua forma juvenil
As técnicas bacteriológicas utilizadas para estes
estudos foram baseadas, segundo a descrição de JAWETZ et alii (1984). Para o isolamento de enterobactérias, o material constituiu em raspar a mucosa pancreática por meio de alça
de platina. Em seguida, semeada em ágar sangue e incubados
em estufas a 37 graus centígrados, durante 24 horas. Os mi-croorganismos que cresciam neste meio eram identificados
pe-la técnica de Gran. Se Gran negativo eram replicados em meio
de ágar MacConkey e incubados a 37 graus centígrados, duran-te 24 horas e em condição aeróbica, para em seguida serem
submetido a testes bioquímicos, que consistiam nas passagens
pelo Indol, TSI (triple sugar iron agar lactose, sucrose and glucose), Nitrato (N03), Fenil Alanina, Uréia, Citrato, Ver-melho Metila, Reação de Voges Proskaner, Manitol e Lisina.
Os microorganismos que reagiam como Gran positivos foram submetidos a prova de coagulase rápida, diferenciando a coa-gulase rápida positiva como Staphilococcus aureus, que é um agente patogênico, invasor, hemolítico, fermenta manitol e
poduz pigmento amarelo. A prova de coagulase rápida
negati-va como Staphilococcus epidermitis, que é um agente apatogê-nico, não é invasor, costuma não ser hemolítico, não fermen-ta o manitol e produz pigmento branco.
3.5. Cultivo de Eurytrema "in varro"
Para a manutenção de Eurytrema fora do seu habi-tat natural que é o pâncreas e em condiões experimentais,
foram utilizados o soro de ovino, o meio de Gay ABC e o meio 199, estes dois meios são largamente empregados para o cul-tivo de células de origem animal.
Os espécimes do trematódeos foram colhidos em condições assépticas do ducto pancreático de bovino natural-mente infectado. No total de dez amostras de orgãos parasi-tados, foram selecionados dez parasitos de cada pâncreas e
acondicionados em recepiente de vidro com capacidade de dez mililitros e com tampa de borracha. Em cada recepiente foram
colocados um mililitro do meio e incubados em estufas a 38 graus centígrados.
Para obtenção de soro de ovino, o sangue foi co-lhido da veia jugular do animal e acondicionados em
rece-litros e mantidos na temperatura de geladeira por 24 horas, piente de vidro, contendo vácuo, com capacidade de 600
mili-para o seu desoramento. O soro foi colhido através de uma pipeta e acondicionado em garrafa xarope e mantido a
tempe-2 9
ratura de geladeira até a sua utilização. Este soro não foi submetido a qualquer processo de inativação ou de filtragem. O critério para observar a sobrevida dos
tremató-deos nos meios de cultivo foi através da motilidade do para-sito, não havendo nenhum estímulo externo para verificar tal fenômeno. Caso houvesse dúvidas, recorreu-se ao uso de
mi-croscópio estereoscópio, principalmente após um longo perío-do de manutenção perío-dos parasitos nos meios, quanperío-do se perde muito a motilidade.
Baseando-se nas técnicas utilizadas no cultivo do Eurytrema in vitro, foram observadas a oviposição média diária deste parasito. As leituras só foram consideradas
pa-ra amostpa-ras que possibilitapa-ram duas leitupa-ras consecutivas, com espaço de 24 horas cada uma, consequentemente, neste pe-ríodo, foram realizadas as trocas dos meios e de recepien-tes; e assim os trematódeos teriam que sobreviver no mínimo
p o r 7 2 h o r a s .
3 . 6 . U s o d e a n t i - h e l m í n t i c o s
a. Teste "in vivo"
Foram selecionados 28 bovinos, com idade aproxi-mada de 36 meses, de raça Nelore, de um total de 60 animais, naturalmente infectados com Eurytrema, comprovados pela
30
CHINONE & ITAGAKI (1976). Estes animais procederam de Londri-n a e f o r a m d i v i d i d o s em s e i s g r u p o s :
Nº a n i m a i s T r a t a m e n t o
dias após as inoculações, inicialmente através da observa-ções macroscópicas para observar o estado geral dos parasi-tos encontrados nas necrópsias e posteriormente pela
visua-D o s e V i a 4 Nitroxinil (Dovenix.-Rhodia-Merieux) 20 mg/Kg Inj. 3 Closantel (Seponver-Smith kline) 10 mg/Kg Oral 4 Rafoxanide (Ranide-MSD AGEVET) 3 mg\Kg Inj. 6 Triclabendazole (Fasinex-Ciba Geigy) 10 mg\Kg Oral 5 Controle infectado
6 C o n t r o l e n ã o i n f e c t a d o
As avaliações terapêuticas foram realizadas 30
lização microscópica, através de compressão em duas lâminas de vidro e também pela montagem dos espécimes, fixados em formalina a 10% e corados pelo carmim clorídrico, seguindo a t é c n i c a d e s c r i t o p o r TRAVASSOS (1950).
b. Teste "in vitro"
Os ovinos utilizados neste experimento e que ser-viram como doadores de sangue foram preparados previamente, não recebendo nenhuma medicação anti-helmíntica por um pe-ríodo de 180 dias quando me fez o contrôle de helmintos que causam a gastroenterite verminótica, não houvendo a interfe-rência dos resíduos destes vemífugos. Antes das aplicações
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das drogas selecionadas para este experimento foram reali-zadas colheitas de sangue, que na etapa posterior, serviram para formarem os lotes testemunhos. Neste experimento também
foram empregadas as normas de assepsia para evitar a conta-minação do soro.
Os anti-helmínticos inoculados em ovinos foram as
mesmas utilizados no teste in vivo:
T r a t a m e n t o D o s e V i a Nitroxinil (Dovenix-Rhodia Merieux) 2 0 , 0 m g / K g I n j . Closantel (Sponver-Smith Kline) 10,0 mg/Kg Oral
R a f o x a n i d e ( R a n i d e - M S D A G E V E T ) 7 , 5 m g / K g O r a l TCBZ (Fasinex-Ciba Geigy) 10,0 mg/Kg Oral TCBZ (Triclabendazole)
As amostras de sangue dos ovinos foram obtidos através da punção da veia jugular, quando a concentração plasmática das drogas atingiu o seu pico máximo, baseando-se nos dados a seguir:
Tratamento Autor (Ano) Nitroxinil PARNELL (1970) C1osantel JOHNSON & JOHNSON Rafoxanide MSD AGEVET TCBZ BOGAN et alii (1985) D o s e 20,0 mg/Kg 10,0 mg/Kg 7,5 mg/Kg 10,0 mg/Kg
Este sangue foi colhido em frascos de vidro, con-H s / C o n c e n t r a t a ç ã o
24/55,0 microgr./ml 24/115,8 microgr./ml
24/ 32,5 microgr./ml 24/ 11,0 microgr./ml
tendo vácuo, após o desoramento por 24 horas, os soros dos
ovinos foram distribuídos em frascos de vidro transparente e com capacidade de dez mililitros e receberam cada um, um
mi-3 2
lilitro do soro em teste. Para cada droga selecionada foram empregadas dez amostras e o mesmo número, com o soro que serviu como testemunho.
c. Efeitos da vermifugação convencional sobre Eurytrema
Foram selecionados, através de exame de fezes, utilizando a técnica descrita por CHINONE & ITAGAKI (1976), 40 bovinos de raça mista de Nelore e Charolês, naturalmente infectados com Eurytrema. Estes animais foram divididos em
D o s e V i a 7,50 mg/Kg Oral 0,20 mg/Kg Inj. 3,75 mg/Kg Inj.
Os bovinos foram mantidos nas pastagens, agrupa-dos num mesmo piquete e receberam durante o experimento qua-tro aplicações anti-helmínticas nos dias 24/9/85, 17/12/85, 4/6/86 e 24/9/86. Estas vermifugações foram realizadas em bovinos a partir de doze meses de idade.
Os animais foram sacrificados com 32 a 36 meses e os pâncreas foram colhidos, devidamente identificados e re-metidos ao Laboratório de Parasitologia Veterinária da FUEL. Em parte da amostra dos trematódeos colhida dos ductos pan-creático dos bovinos, verificou-se a porcentagem de ovos
quatro grupos a saber: G r u p o \ T r a t a m e n t o
10 Febantel (Rintal-Bayer) 10 Ivermectin (Ivomec-MSD AGEVET) 10 Levamizole (Ripercol-Cyanamid) 10 Controle
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férteis presentes na porção final do útero do parasito adul-to, o estado das glândulas vitelogênicas, bem como os órgãos reprodutivos. Estes exames foram feitos colocando o parasito comprimidos entre duas lâminas de vidro. Outra parte da amostra colhida foi fixada em AFA por dois a três dias, em temperatura ambiente, comprimidos entre duas lâminas de vi-dro, posteriomente corados em carmim clorídrico, de acordo com a técnica descrita por TRAVASSOS (1950), para exame das estruturas, principalmente do sistema reprodutivo do trema-tódeo.
34
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Identificação e biometria da forma adulta de E u r y t r e m a
trabalho foram o comprimento e a largura do corpo de forma a d u l t a , o d i â m e t r o d a s v e n t o s a s o r a l e a c e t a b u l a r , a r a z ã o entre as ventosas e a distância entre as ventosas. Foram A s e s t r u t u r a s m o r f o l ó g i c a s c o n s i d e r a d a s n e s t e
mensurados 699 espécimes, colhidos de pâncreas bovina natu-ralmente infectados e distinguindos os animais quanto ao se-xo e faixa etária. Os bois foram constituídos de animais na sua maioria de machos, com idade entre 36 a 48 meses e as vacas foram constituídas de animais fêmeas e com idade supe-rior a 60 meses. Os resultados foram sumarizados na tabela 1
e 2.
N a l i t e r a t u r a c o n s u l t a d a c o m o E D U A R D O e t a l i i (1976) e LOOSS & CUFFEY (1907) deixam claro que o método de c o m p r e s s ã o e c o l o r a ç ã o p a r a d i a g n ó t i c o e s p e c í f i c o d o s h e l -mintos do gênero Eurytrema é satisfatório. Baseando-se nes-t e s d a d o s e a nes-t r a v é s d a s a n á l i s e s b i o m é nes-t r i c a s e c o m p a r a n d o com de outros autores (Tabela 4), o espécime do presente tra-batho trata-se de E. coelomaticum.
Os espécimes colhidos de bovinos tinham tamanhos semelhantes, não se observando diferenças significativas en-tre aqueles que se encontravam em bois e em vacas.
3 5
v e r i f i c o u a m e s m a c o i s a q u a n d o h o u v e a v a r i a ç ã o p o p u l a c i o -n a l .
Também não houve diferenças nos tamanhos quando variou-se a carga parasitária, mesmo quando a população de parasito era muito alta, os trematódeos encontradas conse-guiram atingir tamanhos que se aproximaram, se comparados c o m o s d e b a i x a p o p u l a ç ã o , c o m o p o d e s e r v i s t o n a F i g . 23 (comprimento) e Fig. 24 (largura).
As variações observadas nestas mensurações foram afetadas por fatores como o desenvolvimento do parasito no pâncreas bovino, grau e tipo de lesão; estas lesões podem ser decorrentes de causas extrínsecas, como lipomatose, e morfológicamente os parasitos colhidos neste tipo de altera-ção tinham tamanhos reduzidos.
As características biométricas dos ovos encontra-dos nas fezes (Tabela 1, de boi e Tabela 2 de vaca), obtidas de 790 mensurações.
O índice de fertilidade, quando comparados com aquele que foi encontrado nas fezes com o que foi verificado n a p o r ç ã o f i n a l d o ú t e r o ( F i g . 1 6 ) é m o s t r a d o n a F i g . 2 6 . As medidas de comprimento e largura dos ovos não variaram, se encontrados nas fezes de vaca ou de boi e se
Pelo número de ovos encontrados nas fezes (opg) de bovinos pôde-se notar que à medida que aumentou a população do parasito houve um aumento proporcional de ovos.
3 6
contratavam na porção final do útero revelaram existir uma
re-lação direta nas porcentagens de ovos férteis pesquisados nestes dois locais, cujo resultado pode ser visto na Fig. Os estudos de viabilidade realizados tanto em ovos que eram eliminados nas fezes como aqueles que se
en-26. Isto demonstrou que com a técnica empregada para
pesqui-sa quantitativa e qualitativa foi possível detectar tanto ovos férteis como ovos inférteis. Os ovos inférteis foram observados com maior frequência naqueles parasitos de tama-nho reduzido (Fig. 19), mas quando se aumentou o número de
parasitos adultos imaturos nos órgãos, não foi verificado um aumento proporcional deste tipo de alteração.
A técnica empregada no exame total de 10 gramas
de fezes, resultado na ausência de ovos em uma amostra, no total de 40, apesar desta estar parasitada. As exigências
quanto a quantidade foram satisfatórias, sendo que a sensi-bilidade verificada foi na ordem de 97,5%. Esta eficiência também fica condicionada a fatores como observou CHINONE &
ITAGAKI (1976) sendo difícil detectar ovos nas fezes quando o número de E. pancreaticum era pequeno nos hospedeiros
fi-nais. A quantidade de fezes empregada para pesquisa de ovos
ITAGAKI (1976); estes autores realizaram a técnica de sedi-de trematósedi-deos tem sido relativamente gransedi-de, se comparados com a de nematódeos; variando de uma grama, quantidade uti-lizada por DENNIS et alii (1954); UENO & GUTIERRES (1987),
3 7
final.
mentação e ou parcelando em alíquotas para fazer a leitura
Pelas análises entre a eliminação de ovos pelas fezes dos bovinos e tipo de lesões macroscópicas encontradas nos pâncreas bovino, pôde-se observar que na lesão do tipo I, os ovos eram eliminados de forma relativamente homogênea, guardando uma proporção isto é, à medida que cresceu o nú-mero de parasitos, aumentou o núnú-mero de ovos encontrados nas fezes, como mostra a Fig. 25. Já em relação às lesões do
ti-po II e III, os números foram relativamente baixos, demos-trando que os ovos nestas condições sofreram uma maior
in-terferência das lesões presentes na parede dos ductos pan-creático, com possível retenção parcial até total (Fig. 13). A configuração da distribuição de ovos nas lesões
Fig. 25, isto é, as áreas envolventes na correlação entre a do tipo I e II foram semelhantes, como pode ser visto na
carga parasitária e o fluxo de eliminação de ovos nas fezes foram coicidentes e que a quantidade de ovos eliminados nas
f e z e s ( o p g ) , n e s t a s c o n d i ç õ e s f o i c o n s i d e r a d a b a i x a . Pela grande carga parasitária, presente na lesão do tipo III, como consequência, deveria haver um aumento proporcional de opg, mas desenvolveram-se situações que pro-porcionaram maiores obstáculos, como reação inflamatória e o próprio número de parasito presente nos ductos. Muitos ovos sofreram retenção junto ao órgão, outros tiveram uma elimi-nação mais lenta ou mais rápida e assim resultaram nesta
38
g r a n d e v a r i a ç ã o d e o p g n e s t e t i p o d e l e s ã o . A n á l i s e s e s t a t í s t i c a s
Tipo de lesão Coef. Correlação
I 0 , 8 1 8 0 , 6 7 I I 0 , 6 5 2
I I I 0 , 0 4 7 0 , 0 0 2 2 1 Coef. Determinação
0 , 4 2 5
Na coproscopia a nível individual, mesmo decor-rente de uma grande variação de infecção de Eurystrema, o opg não estimou precisamente o número de trematódeos e muito me-nos existiu uma correlação segura do grau de patologia que os parasitos provocaram nos pâncreas bovino e estas observa-ções estão de acordo com MATTOS Jr & VIANNA (1987) ao regis-trarem, que os ovos eliminados nos ductos pancreáticos pelos parasitos adultos sofrem um retardamento ou obstrução pelas reações ou modificações dos tecidos pancreáticos e por isto o número de ovos eliminados com as fezes não está relaciona-do com o número de trematódeos albergarelaciona-dos no órgão.
CALAMEL & GIAUFFRET (1976) trabalharam com Dicro-coelium lanceolatum, parasito de localização hepática, porém da mesma família do gênero Eurytrema. Os resultados coproló-gicos deste trabalho realizado em 55 ovinos foram utilizados como parâmetro para interpretar a intensidade parasitária.
3 9
Nos pâncreas de bovinos naturalmente infectados, foram encontrados as formas adultas de E. coelomaticum nos ductos pancreáticos.
Quando o número de parasitos foi pequeno, eram distribuidos no ducto principal e em órgão onde havia uma maior quantidade de parasitos foi possível constatar muitos
s e a l o j a n d o e m d u c t o s d e m e n o r calibre (Fig. 7 ) .
Nenhuma vez foi verificada a localização deste trematódeo fora destes locais citados. Somente em ovinos foi
constatada a presença deste parasito na vesícula biliar e nos ductos pancreáticos e quando comparados biométricamente não foram observadas diferenças significativa em seus
tama-n h o s .
GIARD & BILLET (1892) reportaram na descrição ori-ginal de E. coelomaticum, dando-lhe o nome específico, a lo-calização do parasito que fora encontrada, na cavidade geral e ainda na pleura e no epíplom de bovino.
TRAVASSOS (1944) na revisão da família
Dicrocoeli-idae, relatou a ocorrência de E. coelomaticum, além do pân-creas de ruminantes, sendo raramente encontrados nos ductos
biliares destes animais e, em vitelo foi encontrado exemplar no Canal de Virsung, mas não fez nenhuma referência ao tama-nho do trematódeo. CHINONE & ITAGAKI (1976) através de infec-ção experimental de E. pancreaticum em coelhos, observaram
grande quantidade de forma juvenil na porção marginal do pâncreas, estes trematódeos mediram 1,1 milímetro de
compri-mento, ficando difícil confirmar o registro realizado por
TRAVASSOS (1944).
Os exames macroscópicos de pâncreas parasitados
que consistiram nas análises da consistência, coloração e a presença do parasito foram feitos através do corte transver-sal e em seguida pela compressão e consequente expulsão de agromerados de trematódeos.
Para uma melhor compreensão, os pâncreas bovinos parasitados naturalmente foram classificados em três tipos, de acordo com a extensão das lesões produzidas por E. coelo-maticum:
Tipo I - ausência de lesões macroscópicas nos ductos e pa-rênquima (Fig. 1).
Tipo II - presença de lesões macroscópicas somente nos duc-tos (Fig. 2) (Fig. 5),
Tipo III - presença de lesões macroscópicas nos ductos e pa-rênquimas (Fig. 3) (Fig. 6).
NOSAKA et alii (1970) mencionaram uma
classifica-ção de acordo com o tipo de infecclassifica-ção causado por Eurytrema, em bovino, baseando-se nas nodulações do processo inflamató-rio: como sendo altamente severo, moderadamente, levemente e
e m ú l t i m o c o m o s e n d o d e m e n o r g r a u d e l e s ã o .
ASHIZAWA et alii (1971) também classificaram, quanto a localização das lesões, de acordo com a região ana-tômica do pâncreas: como severo, se a lesão era presente no ducto principal e ducto colateral, grupo médio, quando a
le-são era restrita a ducto principal e o grupo intermediário, quando a lesão era presente no ducto do lobo direito era maior do que o esquerdo.
L e s ã o d o t i p o I
b o v i n o f o i c a u s a d a p r i m a r i a m e n t e p e l o s p a r a s i t o s e m d e s e n -Invariavelmente a patologia da euritrematíase em
v o l v i m e n t o n o s d u c t o s p a n c r e á t i c o s , p e l a a ç ã o d a s v e n t o s a s sobre a mucosa dos ductos (Fig. 8). Esta ação irritativa es-tabeleceu uma reação secretória de maior intensidade de cé-lulas caliciformes (Fig. 4). Os pâncreas ao exame externo não apresentaram nenhuma lesão apreciável, sua coloração era ró-sea, assemelhando aspecto de um órgão não parasitados, mas s e n d o v i s í v e l n a d i f e r e n ç a d o c a l i b r e d o d u c t o p a n c r e á t i c o , com ligeiro espessamento. Demonstrando assim, que a presença d o p a r a s i t o c o n s t i t u i u u m o b s t á c u l o p a r a o e s c o a m e n t o u n i -forme dos sucos pancreáticos.
A s l e s õ e s m i c r o s c ó p i c a s v i e r a m c o n f i r m a r a a f i r -•
mação acima que foi a presença de fibrose periductal e quan-do a intensidade foi maior, esta alteração se estendeu para o í n t e r s t í c i o e n ã o f o r a m v e r i f i c a d a s c o n s e q u ê n c i a s d i r e t a s em outras estruturas do órgão. As reações celulares por mo-nonucleares e notadamente por eosinofilia foram em pequena intensidade e se localizaram nas áreas de fibrose. Em casos mais avançadas, havia reação inflamatória na região da subs e r o subs a ( F i g . 9 ) e n e subs t a m e subs m a f i g u r a p o d e subs e n o t a r u m a e subs -treita malha de fibrina, representada por células mono e
