a. C u l t i v o "in vitro" de forma a d u l t a
Os meios de cultivo mais comuns empregados no cultivo celular não mostraram serem adequados, porque os pa- rasitos colocados nestes meios morreram em um período infe- rior a 24 horas, devido a mudança acentuada do pH, verifica- do pela mudança de cor do indicador no meio de cultivo.
MICHAELS & PRATA (1968) utilizaram o meio 199, no culti- vo de S. mansoni, porém acrescido de soro em uma proporção d e 9 p a r a 1 .
A manutenção de E. coelomaticum em soro ovino por tempo maior foi possível sempre que o parasito era mantido no mesmo frasco, sem efetuar a troca do soro, inicialmente estabelecida a cada 72 horas. Quando se fez a troca, houve muitos casos de contaminação, apesar dos cuidados de assep- sia. Assim não houve possibilidade do trematódeo manter-se vivo nestas condições, mostrando evidência de que um dos fa- tores importantes para prolongamento de sobrevivência do pa- rasito em soro foi o controle de microorganismo.
E s t e f a t o t a m b é m f o i o b s e r v a d o p o r S T E P H E N - SON (1947) trabalhando com F. hepatica, na sua manunteção in vitro, obteve a sobrevida por 75 horas e um dos elementos era o boráx, que atuou como agente bacteriostático.
ROHBACHER (1957) confirmou também estes achados, obtendo a manuntenção de F. hepatica in vitro por três sema- nas em excelente condições e por até 30 dias quando livre de bactérias.
SAKAMOTO et alii (1984) ressaltaram a dificuldade de obter trematódeos adultos de pâncreas bovino abatidos em matadouros e em condições assépticas propuseram efetuar os estudos in vitro a partir de cercárias colhidas de espocis- tos que eram expelidos pelo caramujo terrestre de forma as- séptica.
Uma das razões pelas quais não se efetuou nenhum tratamento deste soro foi obter conhecimento prévio do em-
prego do soro animal, como substrato em teste in vitro de drogas anti-helmínticas. Outra razão foi o fato de, ROSS & BUEDING (1950) mostrarem que o período de sobrevivência de S.
mansoni em soro bovino foi de 14 a 18 dias e em soro filtra- do de 10 a 12 dias, demonstrando que as proteínas e outros componentes não dializáveis do soro tinham pequeno signifi-
cado na sobrevivência deste parasito, apesar de se tratar de um organismo de metabolismo respiratório facultativo.
O desenvolvimento do trematódeo pancreático, foi
realizado em condições aeróbicas, assim os resultados deste experimento podem ser visto na Fig. 27. A sobrevivência da metade da amostragem ocorreu ao redor de 96 horas, 20% so-
breviveram por 216 horas, 10% por 504 horas, 3% por 1.032 horas e 1% por mais de 1.200 horas.
5 6
Muitos autores consideram o soro como meio de prolongar a vida do parasito.
BERETTA & LOCATELLI (1968) verificaram que F. he-
patica, quando incubada em meio de Tyrode, acrescido de soro bovino na proporção de 1:1 começam a morrer após 36 horas,
enquanto que em meio simples de Tyrode, este tempo se ini-
ciava a partir de 24 horas; metade da amostra morria dentro de 60 horas e em meio acrescido de soro este tempo era de 120 horas. Daí concluem os autores que o soro bovino repre-
senta um fator de sobrevida para F. hepatica, em condições experimentais.
Como as exigências nutricionais de E. coelomati-
cum podem ser semelhantes às de F. hepatica, em decorrência do encontro do trematódeo pancreático em ductos biliares de ovino, corroborando ainda, que os tamanhos destes parasitos
eram semelhantes, isto significa que o E. coelomaticum pode encontrar elementos necessários também em ductos biliares.
b. Observação sobre ovipostura
Dos resultados obtidos de oito amostras com 47 contagens, obteve-se a média diária de ovipostura de E. coe- lomaticum, que foi de 641 ovos, com uma amplitude de 12 a 3.434 ovos por parasito e a amplitude por amostra de 247 a
1.272. Considerando que um bovino de 500 kilogramas produzam em média 41.500 gramas de fezes em média, se exames coproló-
5 7
gicos forem realizados; estes números corresponderiam o opg d e 1 5 ; 0 , 2 ; 8 2 ; 6 e 3 0 r e s p e c t i v a m e n t e , a d m i t i n d o - s e u m a carga parasitária de 1.000 trematódeos. Neste presente tra- balho; foram considerados os resultados das primeira e se- gunda 24 horas, tendo sido encontrado uma média de 473 para a primeira e 673 para a segunda, perfazendo assim uma média geral de 641 ovos. Em decorrência da troca diária do meio e do recepiente e mesmo mantendo as normas de assepsia, não f o i p o s s í v e l c o n s i d e r a r , a n ã o s e r o s r e s u I t a d o s a c i m a m e n - c i o n a d o s .
Estes dados foram diferentes daqueles obtidos por LOCATELLI & PAOLETTI (1969) que foram de 1.800 ovos na pri- m e i r a 2 4 h o r a s e 3 0 0 o v o s n a s e g u n d a , q u a n d o c o n t a r a m o v o s de F. hepat ica , produzidos por formas adultas e mantidos in vitro, e entre a terceira até a sexta 24 horas não foram ob- servadas postura de nenhum ovo; demostrando a dificuldade de adaptação do trematódeo ao meio utilizado e consequente per- da de motilidade gradativa, acarretando uma diminuição da ovipostura. Alguns trematódeos como S. mansoni responderam melhor, quando o soro animal foi de origem portal, seja de animal permissivo ou não permissivo, estimulando a oviposi- ção in vitro, indicando que este tipo de soro possui um po- tencial para aumentar a capacidade reprodutiva, como mostra- r a m o s t r a b a l h o s d e W U & W U ( 1 9 8 6 ) , i n P O P I E L ( 1 9 8 6 ) . Os números da média diária de ovos de E. coeloma- ticum foram considerados baixos e bastante irregulares. Es-
5 8
tes resultados também foram verificados quando se estudou o o p g d e b o v i n o i n f e c t a d o n a t u r a l m e n t e .
No Japão
,
SAKAMOTO et alii (1980) e CHINONE & ITA- GAKI (1976) encontraram resultados também semelhantes com as infecções de E. coelomaticum e E. pancreaticum respectiva- mente; ressaltam os autores da dificuldade de detectar ovosn a s f e z e s d e a n i m a i s c o m p e q u e n o n ú m e r o d e p a r a s i t o s .
Outros trematódeos, como S. mansoni, também pro-
dia, com variação de 157 a 380, como mostraram MOORE & SANDGROUND (1956) isto pode ser justificado neste parasito p o r a p r e s e n t a r u m o v o n o o o t i p o .
duzem pequena quantidade de ovos, em torno de 253 ovos por
4.4. Avaliações do controle, com o uso de drogas anti-hel- m í n t i c a s
a. T e s t e "in vivo"
Os resultados indicaram que as medicações não fo- ram capazes de eliminar os parasitos dos pâncreas. Os para- sitos encontrados nos animais tratados e não tratados, nos
exames macroscópicos não se observou qualquer alteração, co- m o d e g e n e r a ç ã o o u m u d a n ç a d e c o l o r a ç ã o .
Nos exames microscópicos também não se registrou
qualquer alteração das estruturas dos trematódeos e esta
nos órgãos reprodutivos.
Os exames histológicos do pâncreas mostraram que não ocorreram modificações celulares, indicando que possi- velmente o órgão não recebeu quantidade de droga capaz de sensibilizar as células do epitélio pancreático e as células ligadas ao sistema imune que indicasse a expulsäo dos para- sitos.
A literatura consultada registra que existem dois produtos químicos que comprovadamente atuaram no controle da euritrematíase dos animais domésticos.
SAKAMOTO et alii (1980) obtiveram uma eliminação considerada pelos menos satisfatória do E. coelomaticum em
bovinos naturalmente infectados no Japão, quando administra- ram uma dosagem grande de nitroxinil, 30 miligrama por kilo- grama de peso vivo, com três aplicações, com intervalo de 30 dias. Esta dose aplicada corresponde próximo a dose máxima
t o l e r a d a p e l o b o v i n o d e a c o r d o c o m o t r a b a l h o d e L U C A S (1967), que foi de 40 miligrama por kilograma de peso vivo.
SAKAMOTO et alii (1980) mostraram que o nitroxinil não atuou contra E. coelomaticum quando administrado em doses recomendadas pelo fabricante no controle de fasciolose, como 10 miligrama por kilograma de peso vivo e em dose única. As avaliações da eficiência das drogas, foram verificadas pela contagem de ovos e pela necrópsia para observar a presença do parasita no pâncreas. No tratamento anti-helmíntico, com o emprego de praziquantel, na dose de 10 miligrama por kilo-
férteis foram encontrados mesmo na primeira 24 horas e per- s i s t i u a o f i n a l d o n o n o d i a e e s t e í n d i c e d e i n f e r t i l i d a d e f o i d e 8 6 , 7 % n o p r i m e i r o d i a , 8 7 . 9 % n o s e g u n d o , 8 2 , 5 % n o terceiro e no quarto 93,5%.
grama de peso vivo, com três aplicações em intervalo de dois dias quando do exame dos ovos, a contagem chegou a zero no nono dia após a aplicação e uma alta porcentagem de ovos in-
STAMMERS (1976) obteve a redução de opg, sendo maior após 28º dia de infecção por F. hepatica, em ovinos, e a viabilidade dos ovos sofreram redução após 42º dia do tra- tamento, porque as anormalidade nos órgãos reprodutivos ocorreram a partir da 6º semana e acentuou na 8º semana.
CLEGG (1957) in SMYTH & CLEGG (1959) quando colheu espécimes de F. hepatica de coelhos e manteve in vitro con- seguiu a sobrevivência por 17 dias e observou que a formação dos ovos tornou-se rapidamente anormal e grande número de célula vitelogênica era encontrada no útero dentro de seis horas. O autor afirmou ainda que durante o transporte do ma- tadouro para o laboratório, mesmo mantidos em boas condi- ções, no processo de formação de ovos, tiveram alta taxas de
formas anormais.
No presente trabalho, com E. coelomaticum, na ob- servação sobre a ovipostura e contagens, não foram constata- dos tais fenômenos, mesmo efetivando mudança de meios.
Existem grandes dificuldades na determinação de eficiência das drogas anti-helmínticas em animais com infec-
61
ção natural com Eurytrema, decorrente da variação de amos- tra, da diferença de tempo de infecção dos animais, da pre- sença de diferentes números de parasitos no pâncreas, bem como de alterações provocados por fatores que não dependeram dos parasitos.
Estes problemas persistem mesmo quando se tratar de situação controlada, como infecção experimental realizado por KONO et alii (1986) que inocularam 2.500 a 4.000 metacer- cárias de E. coelomaticum, obtidos de Conocephalus maculatus e estes caprinos foram submetidos a tratamentos anti-helmín- ticas com praziquantel e triclabendazole, o praziquantel foi aplicado na dose de 20 miligrama por kilograma de peso vivo por dois dias e o triclabendazole em 10 miligrama por kilo- grama de peso vivo.
As avaliações também foram baseadas na quantidade de ovos eliminados nas fezes e pela necrópsia, para verifi- car a presença dos parasitos no órgão. As anomalias encon- tradas foram em relação aos ovos e nenhuma vez fizeram refe- rências às alterações em parasitos adultos, sendo mencionada a quantidade dos parasitos encontrados em animais tratados c o m p r a z i q u a n t e l .
E os exames histológicos de pâncreas de animais tratados com praziquantel serviram para atestar a eliminação de parasitos, pela numerosa migração de leucócitos a nível do epitélio dos ductos pancreáticos.
Os autores relataram que o triclabendazole não teve nenhuma atividade anti-helmíntica contra este tremató- deo pancreático.
Muitas drogas foram testadas como: niclofolan, bithionol, tetracloreto de carbono, hexacloroparaxileno, he- xacloroetano, clorophós, hexaclorofeno, niclosamida, comple- xo antimoniais, bithionol sufóxido, thiabendazole, pipera- zina, triclabendazole; anti-helmínticos sabidamente que pos- suem ação efetiva contra F. hepatica e em outros trematódeos e nematódeos, mas nenhum destes mostraram atividade contra a
infecção de Eurytrema em animais domésticos.
Algumas destas drogas como bisphenol, salicilani- lidas, nitroxinil e praziquantel, nos testes in vitro se mostraram capazes de matar o trematódeos pancreático em me- nos de 24 horas, demostrando assim que estas drogas não ti- veram ação efetiva nos testes in vivo; assim o pâncreas con- titui em um órgão de barreira, para que as drogas antipara- sitárias não alcançem os ductos pancreáticos e se o fazem, deve acontecer em pequena quantidade.
b. T e s t e "in v i t r o "
Os ovinos que receberam nitroxinil, closantel, rafoxanide e triclabendazole serviram como doadores de san- gue e o soro destes animais foi empregado como meio de cul- tivo.
6 3
Para a quantidade destes anti-helmínticos na sua concentração máxima ao nível plasmático foram considerados
os dados obtidos por outros pesquisadores e de indústria
fabricantes do medicamento. Para obter os níveis plasmáticos próximos a estas concentrações, foi inoculada a quantidade de medicamento em ovinos de acordo com as dosagens que foram estabelecidas pelos pesquisadores e de Indústrias fabrican- tes.
Os resultados demostraram que nenhuma das drogas
testadas por este sistema lograram sucesso para matar o tre- matódeo. Estas observações foram extendidas por um período de 12 horas e em cada hora eram examinados macroscópicamente
para avaliar a motilidade e nenhuma das vezes foram consta- tada a diminuição ou a morte do parasito.
Este resultado pode ser decorrente de que o para- sito, mesmo ingerindo o soro para sua manuntenção não é afe- tado porque estas drogas normalmente estão acoplados a algu- mas frações de uma proteína plasmática, formando assim um "binding", muitas delas com a albumina. Para que haja a ati- vidade anti-helmíntica, o parasito precisaria quebrar esta ligação da albumina com a droga e no presente trabalho, com
o trematódeo pancreático não deve ter acontecido tal fato. Estas observacões podem ser reforçadas pelos da- dos obtidos por LUCAS (1967) que utilizou o nitroxinil em
conjugação com o soro bovino, relatando que neste meio a mortalidade de F. hepatica era menor, justamente porque ha-
6 4
via esta formação de "binding" e assim prorrogou a vida do trematódeo e se este meio não era o soro, havia o aumento de
mortalidade.
SAKAMOTO et alii (1984) desenvolveram teste in vi- tro, utilizado cercárias de E. coelomaticum, obtidos de es- porocistos expelidos pelo caramujo. E a manutenção destas cercárias era feita em meios básicos sintéticos. Foram tes- tadas 88 drogas que eram dissolvidos ou suspenso em propile-
no glicol. As alterações morfológicas das cercárias foram observadas por um período de 24 horas e estas consistiram de degeneração morfológicas, das células flama, a inativação de enzimas e a motilidade. As sobrevidas das cercárias foram
menores entre as drogas como praziquantel, derivados de qui- nolina-cobre8 quinolina, 3, 5, 5,' tribromo salicyl-0-toluidina, 3,5-dibromo-3'-trifluorometil salicilanilida e 2,5-diclo-
ro-4'-nitrosalicilanilida-derivado de salicilanilida, um de- rivado de benzimidazole-mebendazole e derivado de fenol-ni-
t r o x i n i l .
c. Efeitos das vermifugações usualmente empregado no
trema
controle de nematóides gastrointestinais de bovinos no Eury-
T r a t a m e n t o
C o n t r o l e
Febantel
Os resultados obtidos nos grupos foram: C a r g a p a r a s i t á r i a 432 3 1 9 % fertilidade ovo 82,7 7 9 , 2
6 5
A v e r m e c t i n a L e v a m i z o l e
Os grupos de animais tratados foram aqueles que apresentaram os parasitos com porcentagem de fertilidade do
3 7 2 7 8 , 8 4 2 8 7 0 , 2
ovo em taxas menores do que a do grupo controle, isto mos- trou que as drogas possuem uma atividade residual pequena e
com o decorrer do tempo interferem principalmente nos órgãos reprodutivos e dos grupos tratados.
O levamizole foi o grupo que apresentou uma menor
porcentagens de ovos e também foi aquele que teve maior nú- mero de anomalias como pequena quantidade de massa vitelo- gênica, ausência de ovos nos úteros, massa granular vitelo-
gênica localizada no útero Fig.20, massa vitologênica ene- grecida nos úteros Fig. 22, e distribuição anormal de glân-
dula vitelogênica Fig. 18. Quando comparado com glândulas v i t e l í n i c a s d e p a r a s i t o c o l h i d o s d e a n i m a i s t e s t e m u - nho (Fig. 17), pode-se notar uma grande quantidade de grânulos degenerados.
Estes resultados estão de acordo, com os dados apresentados por STAMMERS (1975) que testou o efeito de rafo- xanide e nitroxinil sôbre F. hepatica em coelhos e observou
uma alta incidência de anormalidade principalmente no siste- ma reprodutivo do trematódeo.
Estes efeitos subletais podem ser explicado com o
que disse DAWES & HUGHES (1964). Os trematódeos submetidos a ação de drogas tenderá a sacrificar os órgãos não vitais e
6 6
c o n s e r v a r o s ó r g ã o s vitais."
As drogas utilizadas no controle de nematódeos são possíveis de permanecer no plasma e em outros órgãos de
animais por um longo período, mas em nenhum trabalho ficou constatada a sua análise quantitativa e residual no pâncreas. Acredita-se, porém, que a sua quantidade seja bastante pe-
quena e assim os trematódeos podem ficar potencialmente su- jeitos e apresentam estas alterações, sem que ocorra a morte do parasito.
67
5. CONCLUSÕES
Assim, tendo por base os resultados obtidos na p r e s e n t e i n v e s t i g a ç ã o p o d e - s e c o n c l u i r que:
1 - Os espécimes adultos de E. coelomaticum co- lhidos de pâncreas bovino nas análises biométricas não dife-
riram entre aqueles que se encontravam em bois e vacas e o
gão;
mesmo aconteceu quando variou a população de parasito no ór-
2 - A quantidade de ovos encontrada nas fezes não estimou precisamente o número de trematódeos e não existiu uma correlação segura do grau de patologia que o E. coeloma- ticum provocou no pâncreas de bovino;
3 - A patologia do E. coelomaticum em pâncreas bovino está relacionado diretamente com o número de tremató- deo encontrado no órgão e, entre as patologias, a fibrose tem sido uma causa constante e de maior consequência na eu- ritrematíase bovina;
4 - A patologia da euritrematíase bovina foi cor- roborada pela presença de bactérias e entre estas a mais
6 8
prevalente foi E. coli;
5 - O soro ovino constituiu em um meio de sobre-
vida de E. coelomaticum, tendo sido possível a sobrevivência por até 50 dias;
6 - A ovipostura média diária in vitro, utilizan- do soro ovino foi de 641 ovos;
7 - As drogas anti-helmínticas: nitroxinil, clo- santel, rafoxanide, triclabendazole não causaram a morte de E. coelomaticum, seja no teste in vivo e no testes in vitro. E ainda febantel, ivermectim e levamizole em teste in vivo em bovino também não mostraram capacidade para matar o tre- matódeos pancreático.
6 9