UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
GISELLI SCAINI
INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE TOXICIDADE DOS
COMPOSTOS ACUMULADOS NA DEFICIÊNCIA DA DESIDROGENASE DE ACILAS DE CADEIA MÉDIA (MCAD) EM CÉREBRO, FÍGADO E
MÚSCULO DE RATOS DURANTE O SEU DESENVOLVIMENTO NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE HIPERAMONEMIA.
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2010
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GISELLI SCAINI
INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE TOXICIDADE DOS
COMPOSTOS ACUMULADOS NA DEFICIÊNCIA DA DESIDROGENASE DE ACILAS DE CADEIA MÉDIA (MCAD) EM CÉREBRO, FÍGADO E
MÚSCULO DE RATOS DURANTE O SEU DESENVOLVIMENTO NAPRESENÇA OU AUSÊNCIA DE HIPERAMONEMIA.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Emílio Luiz Streck Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia F. Schuck
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2010
Dedico este trabalho aos meus familiares, em especial aos meus pais, Elcio e Adioni, que estão presentes em todos os momentos da minha vida e por serem sempre os maiores incentivadores de todas as minhas escolhas.
AGRADECIMENTOS
Considerando esta dissertação como resultado de uma caminhada que não começou na UNESC, agradecer pode não ser tarefa fácil, nem justa. Para não correr o risco da injustiça, agradeço de antemão a todos que de alguma forma passaram pela minha vida e contribuíram para a construção de quem sou hoje. E agradeço, particularmente, a algumas pessoas pela contribuição direta na construção deste trabalho:
A Deus, que sempre olha por mim e que me concedeu tantas maravilhas. Por seu amor incondicional, sua misericórdia, sua luz e, principalmente, por ter me dado força, coragem e incentivo para que, nos momentos de fraqueza, eu me levantasse e continuasse a minha jornada. Obrigada, Senhor!
Aos meus pais, Adione Cardoso Scaini e Elcio Scaini, pelas noites mal dormidas, pelas angústias e preocupações, por todo amor, carinho e felicidade que me concederam. Obrigada pela vida e por terem feito de mim o que sou hoje. Por terem me dado a melhor educação e incentivo ao aperfeiçoamento constante. Por serem exemplos a ser seguidos e por serem tudo aquilo que um dia eu quero ser para o meu filho. Muito obrigada. Amo vocês!
Aos meus irmãos, Junior e Giovanna, presenças alegres e incentivos constantes, pelo carinho e força que me dão, por estarmos sempre juntos nos momentos mais importantes, por
"contar" com vocês! Agradeço também a minha cunhada e ao meu futuro sobrinho que com certeza vai ser lindo e já é muito amado. Tenho certeza de que a minha alegria os faz alegres também.
Agradecimento muito especial, ao meu orientador, Prof. Dr. Emilio Luiz Streck, obrigada primeiramente pela confiança depositada, pelo exemplo de profissionalismo e comprometimento com o conhecimento científico, pelos ensinamentos, amizade, e, principalmente, por nunca ter medido esforços para que esse trabalho acontecesse. O seu apoio incondicional foi fundamental para que tudo desse certo. A você serei eternamente grata. Minha eterna gratidão pela valiosa orientação que tornou real a concretização de um sonho.
A Profa. Dra. Patrícia Fernanda Schuck, pela paciência, pelos ensinamentos no âmbito profissional e pessoal, pelo incentivo, pela amizade e pela experiência profissional que contribuíram para o meu crescimento. Agradeço imensamente o carinho em todos os momentos.
Aos professores que compõem a banca examinadora dessa dissertação: Agradeço as valiosas contribuições dadas durante a defesa do projeto, sua disponibilidade e abertura à troca de conhecimentos.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, agradeço pelo muito que aprendi nestes dois anos, pelas dúvidas e incertezas que por vocês foram esclarecidas.
À Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), em especial ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, pela formação e pela possibilidade de realizar esse trabalho de pesquisa. Agradeço também a CAPES, pelo auxílio financeiro.
A todos os meus amigos pela amizade, carinho, companheirismo, cumplicidade e, principalmente paciência e tolerância por todos os “nãos” recebidos a muitos dos seus convites feitos a mim nesses dois últimos anos. São tantos os amigos que se encaixam nessas palavras, que eu precisaria de muitas páginas para nomear a todos. Deixo aqui, meu muito obrigada e minha eterna gratidão pelo simples fato de existirem.
As minhas companheiras de laboratório, em especial a Gabi, a Bela e a Gislaine, pelo incentivo, força, amizade, carinho que partilhamos durante nosso caminhar... Muito Obrigada!
Agradecimento muito especial as “minhas” aprimorandas, Nati, Joana (mesmo que longe) e Meline, pela amizade, pela confiança que depositaram em mim, pelas coincidências e reencontros em nossas vidas e também pelo auxílio na etapa final desse trabalho. Muito obrigada!
À toda a família do Laboratório de Fisiopatologia Experimental pela grande amizade, convivência e troca de experiência. Obrigada por tudo.
“Qualquer caminho que você decida tomar, sempre existe alguém para te dizer que você está errado. Existem sempre dificuldades surgindo que te tentam a acreditar que as críticas estão corretas. Mapear um caminho de ação e segui-lo até o fim requer coragem”
Ralph Waldo Emerson
RESUMO
A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD) é o mais frequente defeito da oxidação de ácidos graxos, caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo tecidual predominante dos ácidos graxos de cadeia média, ácido octanóico (AO) e ácido decanóico (AD). Os pacientes afetados apresentam hipoglicemia hipoacetótica, rabdomiólise, hepatomegalia, hiperamonemia, letargia e convulsões, podendo rapidamente evoluir para o coma e morte. Atualmente, os mecanismos fisiopatológicos dos danos teciduais apresentados pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão esclarecidos. Assim, no presente trabalho, investigamos o efeito in vitro dos ácidos octanóico (AO) e decanóico (AD) na ausência ou presença de acetato de amônia (AA) sobre parâmetros do metabolismo energético e de estresse oxidativo em córtex cerebral, fígado e músculo esquelético de ratos jovens.
Verificamos que o AO e AD diminuiu a atividade do complexo I-III, II, III e IV no fígado, e também inibiu a atividade do complexo IV no músculo esquelético. Além disso, o AD causou uma diminuição da atividade do complexo II-III no músculo esquelético.
Verificamos também que o AO e AD aumentaram os níveis de TBA-RS e o conteúdo de carbonilas em ambos os tecidos. Finalmente, AD, mas não AO, diminuiu significativamente os níveis de GSH no músculo esquelético de ratos. Além disso, observamos que o AA inibiu a atividade do complexos II-III no fígado, e a atividade do complexo IV no músculo esquelético, cérebro e fígado. Por outro lado, houve um aumento na atividade do complexo II no fígado.
Quanto à associação entre AA e os ácidos graxos, observamos uma inibição do complexo I-III e II no cérebro, e do complexo II no músculo esquelético quando o AD e o AA estiveram presentes simultaneamente no meio de incubação, sugerindo uma ação sinérgica entre AA e AD. Além disso, as evidências de efeitos aditivos entre AA e os ácidos graxos foram observadas, uma vez que o AA potencializou os efeitos inibitórios do AO e AD sobre a atividade do complexo IV em diferentes estruturas. Observou-se também que o AO, AD e AA, sozinhos ou associados, inibiram a atividade da citrato sintase no cérebro, mas somente a combinação do AD com AA inibiu a atividade da citrato sintase no fígado. Já a atividade da succinato desidrogenase no córtex cerebral foi reduzida pelo AD isolado ou associado com AA.
O presente estudo fornece evidências de que os AO e AD, os principais metabólitos acumulados na MCADD, alteram a bioenergética mitocondrial e causam estresse oxidativo em tecidos periféricos de ratos jovens. Esse estudo também demonstrou um efeito sinérgico/aditivo entre o AO, DA e a amônia, prejudicando a bioenergética mitocondrial no cérebro, fígado e músculo esquelético de ratos.
Palavras-chave: ácido octanóico; ácido decanóico; amônia; mitocôndrias; deficiência de MCAD.
ABSTRACT
Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MCADD) is the most frequent fatty acid oxidation disorder, leading to the accumulation of octanoic (AO), and decanoic (AD) acids. Affected patients present hypoketotic hypoglycemia, rhabdomyolysis, hepatomegaly, hyperammonemia, seizures and lethargy, which may quickly progress to coma and death. At present the pathophysiological mechanisms underlying tissues damage in affected patients are poorly known. Therefore, in the present study we investigated the in vitro effects of OA and DA in the absence or presence ammonium acetate (AA) on energy metabolism and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex, liver and skeletal muscle. It was first verified that OA and DA decreased complex I-III, II-III and IV activities in liver, and also inhibit complex IV activity in skeletal muscle. In addition, DA decreased complex II-III activity in skeletal muscle. We also verified that OA and DA increased TBA-RS levels and carbonyl content in both tissues. Finally, DA, but not OA, significantly decreased GSH levels in rat skeletal muscle.
Moreover, we verified that AA inhibited complex II-III in liver, complex IV activity in the brain, liver and skeletal muscle. On the other hand, AA increased complex II activity in liver. Regarding the associations between AA and the fatty acids, we observed that inhibitions of complex I-III and II in the brain and complex II in skeletal muscle were detected only when DA plus AA were simultaneously present in the incubation medium, suggesting a synergistic action between AA and DA. In addition, evidences for additive effects between AA and the fatty acids were observed, since AA enhanced the effects of OA and DA on complex IV in the different structures. observed that OA, DA and AA, per se or associated, inhibited sitrate synthase activity in the brain, but only the combination of DA plus AA inhibited the same enzyme activity in liver. On the other hand, citrate synthase activity was not affected by these compounds in skeletal muscle. Succinate dehydrogenase activity was decreased by DA, but AA failed to enhance this inhibition.
The present study provides evidence that OA and DA, the major metabolites accumulating in MCADD, disturb mitochondrial bioenergetics and elicit oxidative stress in rat peripheral tissues. This study also demonstrated evidence for a synergistic/additive effect between OA, DA and ammonia impairing bioenergetics parameters in brain, liver and skeletal muscle of rats.
Keywords: octanoic acid; decanoic acid; ammonia; mitochondria; MCAD deficiency
Lista de Figuras
Figura 1. Bloqueio de uma rota metabólica ... 15
Figura 2. Efeitos dos ésteres de CoA sobre a síntese da uréia ... 22
Figura 3. Destinos da glicose ... 28
Figura 4. Ciclo de Krebs ... 29
Figura 5. Cadeia respiratória mitocondrial ... 31
Lista de Abreviaturas
AD – Ácido decanóico AcD – Ácido cis-4-decenóico AO – Ácido octanóico
Acetil-CoA – acetil coenzima A ATP – adenosina trifosfato CK – creatina quinase CO2 – gás carbônico CoQ – coenzima Q
EIM – erros inatos do metabolismo ERO – espécies reativas de oxigênio ERN – espécies reativas de nitrogênio
FAD+ – flavina adenina dinucleotídeo (forma oxidada) FADH2 – flavina adenina dinucleotídeo (forma reduzida) GABA – ácido γ-aminobutírico
GTP – guanosina trifosfato GSH – glutationa reduzida H+ – próton
H2O – água
H2O2 – peróxido de hidrogênio
LCHAD – desidrogenases de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia longa LDL – lipoproteína de baixa densidade (low density lipoprotein)
MCAD – desidrogenase de acil-CoA de cadeia média
NAD+ – nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada) NADH – nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida) NMDA – N-metil-D-aspartato
NO• – óxido nítrico
NOS – óxido nítrico sintase O2 – oxigênio
O2•-
– ânion superóxido OCl- - ânion hipoclorito
1O2 –oxigênio “singlet”
OH• – radical hidroxila ONOO- – peroxinitrito
SDH – succinato desidrogenase SOD – superóxido dismutase Pi – fosfato inorgânico PKC – proteína quinase C
SCAD – desidrogenases de acil-CoA de cadeia curta
SCHAD – desidrogenases de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia curta SDH – succinato desidrogenase
SNC – Sistema nervoso central
VLCAD – desidrogenases de acil-CoA de cadeia muito longa
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO ... 14
1. Erros Inatos do Metabolismo ... 14
1.1. Histórico ... 14
1.2. Defeitos da Oxidação de Ácidos Graxos ... 15
1.3. Deficiência da Desidrogenase de Acil-CoA de cadeia média (MCAD) ... 16
1.3.1. Metabólitos Acumulados nos pacientes com deficiência de MCAD ... 18
1.3.2. Aspectos Moleculares da deficiência de MCAD ... 18
1.3.3. Fisiopatologia da deficiência de MCAD ... 19
2. Hiperamonemia ... 21
2.1. Hiperamonemia na deficiência de MCAD ... 22
2.2. Toxicidade da Amônia ... 23
3. Metabolismo Energético ... 27
3.1. Histórico ... 27
3.2. Destino da Glicose e Ciclo de Krebs ... 27
3.3. Cadeia Respiratória e Fosforilação Oxidativa ... 30
3.4. Creatina Quinase ... 32
4. Radicais Livres ... 34
4.2. Defesa Antioxidante ... 35
4.3. Estresse Oxidativo ... 36
II. OBJETIVOS ... 39
Objetivo Geral ... 39
Objetivos Específicos ... 39
III. RESULTADOS ... 40
IV. DISCUSSÃO ... 83
V. REFERÊNCIAS ... 90
14
PARTE I - INTRODUÇÃO
1. Erros Inatos do Metabolismo
1.1. Histórico
Em 1908, Sir Archibald E. Garrod usou o termo erros inatos do metabolismo (EIM) para designar doenças como a alcaptonúria, em que os indivíduos afetados excretam grandes quantidades de ácido homogentísico na urina. Garrod observou uma maior frequência desta doença em indivíduos de uma mesma família e maior incidência de consanguinidade entre os pais dos pacientes. Baseando-se nas leis de Mendel e no fato de que os pais dos indivíduos afetados não apresentavam a doença, Garrod propôs um modelo de herança autossômica recessiva para este distúrbio. Através da observação de que o ácido homogentísico presente em excesso na urina dos pacientes era um metabólito normal da degradação protéica, ele relacionou este acúmulo a um bloqueio na rota de catabolismo da tirosina. Com o surgimento de novos distúrbios relacionados a alterações genéticas e que envolviam o acúmulo de outras substâncias nos líquidos biológicos dos pacientes, postulou-se que estas doenças resultavam da síntese qualitativa ou quantitativamente anormal de uma proteína, enzimática ou não, pertencente ao metabolismo (Scriver et al., 2001). Presumiu-se, então, que em consequência deste bloqueio metabólico pode ocorrer o acúmulo de precursores da reação catalisada pela enzima envolvida, com a formação de rotas metabólicas alternativas e a deficiência de produtos essenciais ao organismo (Bickel, 1987).
15 Figura 1. Bloqueio de uma rota metabólica (Adaptado de Scriver et al., 2001).
Até o momento foram descritos mais de 500 EIM, a maioria deles envolvendo processos de síntese, degradação, transporte e armazenamento de moléculas no organismo (Scriver et al., 2001). Embora individualmente raras essas doenças em seu conjunto afetam aproximadamente 1 a cada 500/2.000 recém nascidos vivos (Baric et al., 2001).
1.2. Defeitos de Oxidação de Ácidos Graxos
A beta-oxidação mitocondrial de ácidos graxos é uma fonte de energia muito importante para a síntese de ATP, principalmente em períodos de jejum, já que este processo gera acetil-coenzima A (acetil-CoA) e energia na forma de ATP. A rota de oxidação dos ácidos graxos é complexa e inclui muitos passos: captação celular de ácidos graxos, ativação desses mesmos ácidos graxos a ésteres acil-CoA, trans-esterificação a acilcarnitinas, translocação através da membrana mitocondrial, re-esterificação a acil-CoA, e a espiral da beta-oxidação intramitocondrial, que fornece elétrons para flavoproteínas transferidoras de elétrons e acetil-CoA. Cada etapa da espiral de oxidação é catalisada por enzimas específicas para o comprimento da cadeia carbônica do ácido graxo (Smith et al., 2005).
Na década de setenta foram descritos os primeiros erros inatos do metabolismo atribuídos a defeitos na oxidação dos ácidos graxos em pacientes com astenia ou rabdomiólise
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induzida por exercício. Pouco tempo depois foi descrita a deficiência sistêmica de carnitina e, em 1982, a deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD) foi diagnosticada em pacientes que apresentavam descompensação metabólica com sintomas neurológicos durante o jejum (Kolvraa et al., 1982). Atualmente, já estão descritas pelo menos 23 diferentes entidades clínicas dentro deste grupo de doenças, incluindo defeitos no transporte de carnitina na membrana plasmática, nas enzimas carnitina palmitoiltransferase I e II, carnitina/acilcarnitina translocase, nas desidrogenases de acil-CoA de cadeia muito longa (VLCAD), média (MCAD) e curta (SCAD), na 2,4-dienoil-CoA redutase e nas desidrogenases de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia longa (LCHAD) e curta (SCHAD), bem como na proteína trifuncional mitocondrial (Roe & Ding, 2001).
Acredita-se que a prevalência dessas doenças seja subestimada, visto que seu diagnóstico depende da detecção dos metabólitos acumulados por métodos sofisticados e equipamentos de alto custo que poucos laboratórios possuem (Walker, 1994). Além disso, devido à semelhança do quadro clínico, uma parte considerável dos pacientes afetados por defeitos de oxidação de ácidos graxos é diagnosticada erroneamente como síndrome de morte súbita da infância, infecção bacteriana aguda (sepse), síndrome de Reye, fígado gorduroso da gravidez ou síndrome de vômito cíclico (Rinaldo et al., 1998).
Dentre os defeitos de beta-oxidação, a MCADD é o mais frequente destes distúrbios, com uma prevalência similar à da fenilcetonúria, o mais frequente erro inato do metabolismo.
1.3. Deficiência de Desidrogenase de Acil-CoA de Cadeia Média (MCAD)
A MCADD é um defeito hereditário metabólico de herança autossômica recessiva cujos primeiros sinais clínico-laboratoriais geralmente aparecem entre os primeiros dias de vida até os seis anos de idade (Wilcken et al., 2007), podendo, no entanto, ocorrer na fase
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adulta (Ruitenbeek et al., 1995). Os pacientes afetados pela MCADD geralmente são assintomáticos e os sintomas são precipitados por períodos de jejum ou de outras formas de estresse metabólico, usualmente associadas a infecções virais ou bacterianas ou mesmo à vacinação (Derks et al., 2006). Pacientes afetados pela MCADD apresentam uma sintomatologia muito variada, incluindo episódios de vômitos, letargia, apnéia e coma, podendo levar à morte súbita (Grosse et al., 2006). Podem também apresentar atraso no desenvolvimento psicomotor, rabdomiólise, paralisia cerebral, retardo no crescimento, problemas comportamentais e déficit de atenção (Roe & Ding, 2001). Durante as crises mais graves o coma, muitas vezes acompanhado de convulsões, e a hiperamonemia com disfunção hepática são frequentes (Ruitenbeek et al., 1995).
Os principais achados neuropatológicos dos pacientes com MCADD são microcefalia, edema cerebral e anomalias no lobo frontal (Egidio et al., 1989; Maegawa et al., 2008). Em muitos casos ocorre acúmulo microvesicular de lipídeos no fígado, similar ao acúmulo observado em pacientes com síndrome de Reye (Roe & Ding, 2001). Também pode ocorrer rabdomiólise, acúmulo microvesicular de lipídeos entre as miofibrilas e de glicogênio detectados por biópsia muscular (Ruitenbeek et al., 1995).
Se não diagnosticados precocemente, 20 a 25% dos pacientes afetados pela MCADD morrem durante o primeiro episódio de crise metabólica (Grosse et al., 2006), enquanto o risco de sofrer uma crise fatal estende-se por toda a vida (Roe & Ding, 2001).
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1.3.1. Metabólitos Acumulados nos Pacientes com Deficiência de MCAD
O defeito no catabolismo de ácidos graxos de cadeia média ocasiona o acúmulo destes ácidos graxos e seus derivados que, principalmente durante os períodos de crise, encontram-se muito aumentados no sangue e em outros tecidos, bem como na urina dos pacientes. Os principais metabólitos acumulados são os ácidos graxos de cadeia média octanoato, decanoato e cis-4-decenoato. Outro achado comum na doença é a elevação da concentração urinária de hexanoilglicina, fenilpropionilglicina e suberilglicina (Costa et al., 2000).
1.3.2. Aspectos Moleculares da Deficiência de MCAD
A MCADD é uma doença autossômica recessiva, cuja mutação mais comum é uma mutação ponto que resulta na substituição de lisina por ácido glutâmico no aminoácido 329 do precursor da MCAD (K329E). Isso ocorre devido à adição de um nucleotídeo adenina (na posição 985) no lugar de guanina no gene da MCAD (c.985A>G), mutação responsável por aproximadamente 80-90% dos alelos mutantes em caucasianos. Deve-se considerar também que o desenvolvimento dos sintomas deve ser influenciado pelo grau de estresse metabólico e a combinação de fatores, tais como infecção e jejum (Matsubara et al., 1992). Por outro lado, mais recentemente tem-se tentado correlacionar o tipo de mutação envolvida na doença com o acúmulo de metabólitos nos pacientes, sendo que aparentemente a presença da mutação c.985A>G parece estar correlacionada a maiores níveis de acúmulo neonatal de octanoilcarnitina no plasma bem como de acilglicinas na urina. Além disso, as mutações c.985A>G e c.583G>A parecem resultar em maior severidade, enquanto que a mutação c.199T>C está associada a sintomas menos severos da doença (Waddell et al., 2006).
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1.3.3. Fisiopatologia na Deficiência de MCAD
A síntese diminuída de corpos cetônicos durante o jejum é uma característica da MCADD, fazendo com que aumente a importância da glicose sanguínea como fonte de energia celular, ocasionando hipoglicemia nos pacientes. Outra consequência da não- utilização dos ácidos graxos de cadeia média na síntese de corpos cetônicos é o acúmulo de acil-CoA de ácido graxo de cadeia média dentro das mitocôndrias. Eleva-se então a razão acil-CoA:CoA, causando a inibição das enzimas piruvato desidrogenase e α-cetoglutarato desidrogenase, que utilizam coenzima A como substrato. Assim, ocorre diminuição da conversão do piruvato a acetil-CoA e diminuição na velocidade do ciclo de Krebs, visto que a síntese do citrato e a conversão do α-cetoglutarato a sucinil-CoA também estão diminuídas.
Além disso, a sucinil-CoA ligase é inibida pelo ácido octanóico e também por intermediários de acil-CoA. Com a baixa produção de acetil-CoA, há diminuição da síntese de citrato, o citrato por sua vez é precursor de malato, substância necessária para a produção de glicose, via gliconeogênese, e precursor de malonil-CoA, o principal regulador inibitório da carnitina palmitoil transferase I, enzima responsável pela entrada de ácidos graxos de cadeia longa na mitocôndria. Portanto, a diminuição dos níveis de citrato ocasionada pelo acúmulo do octanoato e outros ácidos graxos na MCADD provoca também uma diminuição da gliconeogênese e um aumento da entrada de ácidos graxos de cadeia longa na mitocôndria, o que deve ser um agravante para a hipoglicemia e deve provocar o acúmulo de derivados de acil-CoA graxos nos pacientes (Roe & Ding, 2001). Além disso, com a pouca disponibilidade de substratos energéticos, há uma exacerbação de processos catabólicos, dentre os quais podemos salientar a proteólise. Com a grande degradação de proteínas e utilização de aminoácidos como substratos energéticos, há uma maior liberação de amônia, produto resultante da degradação de aminoácidos (Smith et al., 2005), que apresenta alta toxicidade
20
para os tecidos em geral, em especial para o sistema nervoso central (SNC) (Felipo &
Butterworth, 2002).
Por outro lado, acredita-se que o quadro de letargia, que pode evoluir a coma e morte, seja devido, particularmente, ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia média e seus derivados (Gregersen et al., 2008). Até o presente momento, poucos estudos foram realizados sobre os efeitos tóxicos dos ácidos graxos de cadeia média acumulados na MCADD. Foi demonstrado que o octanoato causa um aumento do consumo de oxigênio (O2) e produção de monóxido de carbono (CO2), sem causar um correspondente aumento na produção de ATP em fígado de ratos (Berry et al., 1983; Scholz et al., 1984). Além deste, outros efeitos têm sido atribuídos ao octanoato, quando testado in vitro, como inibição do controle do volume de astrócitos e da Na+,K+-ATPase em cultura de células gliais (Olson et al., 1989), que poderiam estar relacionados ao edema cerebral observado na deficiência de MCAD e também na síndrome de Reye, ambas caracterizadas por acúmulo de octanoato nos tecidos dos pacientes afetados. Foi também demonstrado que o octanoato e o decanoato são inibidores do transporte de ácidos orgânicos através do plexo coróide em coelhos. Os autores do trabalho sugeriram que tal efeito poderia impedir a depuração do octanoato e compostos relacionados, contribuindo para o acúmulo desses compostos no cérebro e no líquido cerebroespinhal e para a encefalopatia das doenças em que essas substâncias se acumulam (Kim et al., 1983).
Mais recentemente, foi demonstrado que os ácidos octanóico (AO), decanóico (AD) e cis-4decenóico (AcD) inibem in vitro importantes parâmetros do metabolismo energético em cérebro de ratos jovens, incluindo as atividades de complexos da cadeia respiratória, da creatina quinase e Na+,K+-ATPase, bem como a produção de 14CO2 a partir de [U-
14C]glicose, [1-14C]acetato e [U-14C] citrato (de Assis et al., 2003; 2006; Reis de Assis et al., 2004). Também foi demonstrado recentemente que esses mesmos compostos induzem estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens (Schuck et al., 2007; 2009a).
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Enfatize-se que, apesar de se ter investido muito no estudo dos defeitos da oxidação de ácidos graxos com evidentes progressos no diagnóstico da maioria delas, poucas informações estão disponíveis na literatura internacional sobre a etiopatogenia do dano neurológico nos pacientes afetados por essas doenças (Lund et al., 2003). Assim, a expectativa é de que estudos bioquímicos, como o presentemente proposto, sejam levados a efeito para clarificar a associação do defeito genético e dos sintomas dos pacientes nos distúrbios propostos com a finalidade precípua de contribuir mais decisivamente para o tratamento dos portadores dessas doenças.
Neste contexto, apesar dos sintomas dos pacientes afetados pela MCADD piorarem subitamente durante ou após crises metabólicas em que há exacerbação dos processos catabólicos, levando uma parte deles a degeneração aguda ou crônica de estruturas cerebrais durante esses episódios, praticamente nada tem-se investigado sobre a etiopatogenia da disfunção neurológica e dano cerebral que acomete os indivíduos afetados pela MCADD nestas situações de estresse metabólico. É possível que o acúmulo maior dos produtos tóxicos nesses distúrbios durante as crises de descompensação metabólica possa ter um papel importante na fisiopatologia dos danos apresentados pelos pacientes, embora não se possa afastar a possibilidade de que um déficit de energia primário causado por hipoglicemia ou pela impossibilidade de degradar ácidos graxos seja responsável por parte desse dano.
2. Hiperamonemia
A amônia é uma substância proveniente do metabolismo dos compostos nitrogenados, sendo produto e/ou precursor de importantes compostos (Lehninger et al., 2007). Este metabólito possui um papel importante na manutenção da homeostase do nitrogênio nos
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organismos vivos, mas quando em altas concentrações se torna extremamente tóxico, principalmente para o SNC (Cooper & Plum, 1987).
2.1. Hiperamonemia na deficiência da MCAD
A MCADD é clinicamente caracterizada por alterações no SNC, fígado e músculo esquelético e cardíaco, ocorrendo principalmente após situações de estresse metabólico associado a catabolismo exacerbado. Desta forma, a hiperamonemia é um dos achados clínicos encontrados em pacientes com a MCADD (Ruitenbeek et al., 1995). Segundo Fenton
& Rosenberg (1995), ésteres de CoA inibem diretamente a enzima carbamil fosfato sintetase I, enzima responsável pelo primeiro passo do ciclo da uréia. Um bloqueio na síntese da uréia resulta num acúmulo de amônia, justificando a hiperamonemia apresentada por estes pacientes. Além disso, com a grande degradação de proteínas e utilização de aminoácidos como substratos energéticos, há uma maior liberação de amônia, produto resultante da degradação de aminoácidos (Smith et al., 2005).
Figura 2: Efeitos dos ésteres de CoA sobre a síntese da uréia (Adaptado de Fenton & Rosenberg, 1995) .
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A hiperamonemia é causa primária da neurotoxicidade em uma gama de doenças, principalmente aquelas associadas à insuficiência hepática (Stewart & Walser, 1980; Smeltzer
& Bare, 1996), levando a dificuldades motoras, alterações comportamentais, convulsões, coma e morte. Além disso, os pacientes que possuem níveis séricos elevados de amônia podem apresentar diarréia, vômitos e acidose metabólica (Smeltzer & Bare, 1996).
Os mecanismos de neurotoxicidade da amônia ainda não estão bem esclarecidos.
Entretanto, existem evidências de que os distúrbios provocados pela amônia no SNC sejam decorrentes da combinação de alterações bioquímicas, morfológicas, energéticas e físico- químicas, tais como alterações no pH celular e consequente modificações na estrutura celular, principalmente em astrócitos (Dolinska et al., 1996; Drewes & Leino, 1985; Noremberg et al., 1991), alterações no metabolismo de alguns neurotransmissores (Felipo et al., 1994; Zhou et al., 1999), produção de radicais livres (Kosenko et al., 1999) e possível depleção de alguns intermediários do ciclo de Krebs e depleção de ATP (Cooper & Plum, 1987; Lai & Cooper, 1991; Felipo et al., 1994).
2.2. Toxicidade da Amônia
Os efeitos tóxicos provocados pela amônia parecem estar relacionados àqueles envolvidos na neurotoxicidade glutamatérgica, uma vez que concentrações elevadas de amônia induziram um aumento nos níveis extracelulares de glutamato por inibir a sua captação (Felipo et al., 1994; Zhou & Noremberg, 1999), o acúmulo extracelular deste neurotransmissor ativa receptores gtlutamatérgicos do tipo NMDA, levando à abertura dos canais de íons a ele associados, permitindo o influxo neuronal de íons Ca+2 e Na+ (Lai &
Cooper, 1991; McDonald & Schoepp, 1993). Kosenko & colaboradores (2000) demonstraram que a administração de amônia em ratos induziu uma importante alteração na homeostase de
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cálcio nas células do SNC, levando a um rápido aumento no conteúdo de cálcio intramitocondrial, seguido por uma redução na capacidade e na taxa de captação desse íon, além de aumentar o efluxo espontâneo deste íon da mitocôndria para o citosol. O aumento intracelular de cálcio permite a ativação de algumas enzimas dependentes deste íon e de outros mecanismos que desencadeiam injúria neuronal (Brorson et al., 1995; Pavlakovic et al., 1995).
Kosenko & colaboradores (1995) demonstraram que administração de compostos que previnem a toxicidade glutamatérgica do tipo NMDA, como os inibidores da enzima óxido sintetase, atenuaram a toxicidade e as alterações nos metabólitos cerebrais provocadas pela amônia. A nitroarginina, um inibidor da óxido nítrico sintetase (NOS), preveniu parcialmente a morte dos animais, a depleção de ATP, o aumento no conteúdo da glicose, o aumento de lactato e piruvato e o decréscimo no conteúdo de glicogênio. No entanto não preveniu o aumento dos níveis de glutamina e a diminuição de glutamato. Estes dados sugerem o envolvimento da produção de óxido nítrico via ativação de receptores NMDA nos efeitos tóxicos causados pela amônia. Entretanto, estudos demonstram que o mecanismo de toxicidade da amônia não está exclusivamente ligado aos efeitos mediados pelo receptor NMDA, mas que a ativação deste receptor é um passo essencial no processo que levará a depleção de ATP e morte (Marcaida et al., 1992; Kosenko et al., 1994; Felipo et al., 1994).
Um dos achados mais importantes nos estados de hiperamonemia é a depleção de ATP. Recentemente foi proposto que a depleção de ATP é decorrente da ativação da enzima Na+,K+-ATPase, induzida pela amônia (Felipo et al., 1994; Ratnakumari et al., 1995).
Kosenko & colaboradores (1994) demonstraram que a amônia induziu uma ativação da enzima Na+,K+-ATPase, e que o MK-801 preveniu completamente este aumento, indicando que este evento estava relacionado com ativação de receptores NMDA, e que poderia estar envolvido na depleção de ATP. Foi proposto que a amônia pudesse ter influência sobre a
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fosforilação desta ATPase pela proteína quinase C (PKC) ou sobre a desfosforilação desta enzima por uma fosfotase (Felipo et al., 1993).
Além disso, a depleção de ATP pela amônia também foi associada a incorporação dos grupos amônio ao α-cetoglutarato, glutamato e glutamina, em uma sequência de reações que culminaram no consumo de ATP pela glutamina sintetase. Além do consumo de ATP pela glutamina sintetase, o seqüestro do α-cetoglutarato provavelmente resultaria em uma interferência no funcionamento do ciclo de Krebs, já que este é um intermediário desse ciclo, prejudicando assim a formação do ATP (Hertz & Kala, 2007).
Além das teorias já citadas para a depleção de ATP, alguns trabalhos demonstraram que a amônia influência diretamente o funcionamento do ciclo de Krebs, uma vez que este composto inibe algumas enzimas importantes deste ciclo, como a α-cetoglutarato desidrogenase e a isocitrato desidrogenase (Lai & Cooper, 1986; Siegel et al., 1994). Outra hipótese sugeriu que a amônia pudesse causar uma inibição da lançadeira de elétrons malato- aspartato, uma vez que a diminuição no nível de glutamato total pode comprometer o funcionamento desta lançadeira pela diminuição do fluxo de elétrons, e consequente causar uma interferência no metabolismo energético (Fitzpatrick et al., 1983). Segundo Siegel &
colaboradores (1994) ratos com hiperamonemia apresentam as relações de lactato/piruvato e NADH/NAD+ citoplasmáticas aumentadas, indicando assim que pode existir um comprometimento no funcionamento da lançadeira de elétrons, através de uma diminuição na translocação do glutamato-aspartato e pelo decréscimo nas atividades das aspartato aminotransferases, principalmente a mitocondrial.
Por outro lado, estudos demonstraram que a amônia também interfere no metabolismo da glicose. Muntz & Hurwitz (1951) verificaram que a amônia estimula a glicólise em extratos cerebrais. A partir destes resultados os autores sugeriram que a amônia desinibia ou ativava a fosfofrutoquinase, uma das enzimas marca-passo da via glicolítica in vivo e in vitro.
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Uma desinibição ou ativação dessa enzima pode estimular a utilização de glicose, fato esse observado em animais que apresentaram hiperamonemia aguda (Hawkins et al., 1973; James et al., 1974). Outra evidência que indica a interferência da amônia sobre a glicólise é o aumento nos níveis de lactato cerebral e a relação lactato/piruvato de animais hiperamonêmicos (Duffy et al., 1972; Lai et al., 1986).
Além dos mecanismos já descritos para a toxicidade da amônia, acredita-se que este composto cause prejuízo na função mitocondrial através da produção de radicais livres.
Alguns estudos demonstraram que a amônia provocou uma diminuição na atividade das enzimas antioxidantes e um aumento na produção de radicais superóxido no cérebro (Kosenko et al., 1997).
Embora as causas das disfunções neurológicas provocadas pela amônia não sejam totalmente conhecidas, acredita-se que parte das alterações ocorridas nas células do SNC seja decorrente, além das alterações já citadas, do acúmulo de água, já que altos níveis de amônia induzem um grande acúmulo mitocondrial de glutamina no cérebro (Dolinska et al., 1996), um metabólito que promove retenção de água, causando assim um edema celular que aparece principalmente nos astrócitos, embora algumas alterações possam ocorrer nos neurônios (Drewes & Leino, 1985; Noremberg et al., 1991).
Drewes & Leino (1985) demonstraram que a exposição aguda a amônia e ao ácido octanóico causou dano nos corpos celulares dos neurônios em preparações de cérebro de cães.
Neste estudo foi verificado que as mitocôndrias dos neurônios se apresentam alteradas e, apesar do edema, as mitocôndrias dos astrócitos pareciam normais. A partir destas observações, os autores concluíram que além dos astrócitos, os neurônios também podem sofrer alterações nas síndromes hiperamonêmicas.
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3. Metabolismo Energético
3.1. Histórico
Hans Krebs propôs, em 1937, uma série de reações do metabolismo intermediário dos carboidratos. Atualmente, o ciclo proposto por Krebs leva o seu nome. Há aproximadamente meio século, Kennedy e Lehninger descobriram que as mitocôndrias contêm as enzimas do ciclo de Krebs e as enzimas de oxidação dos ácidos graxos, além dos complexos respiratórios.
Alguns anos depois, Palade e Sjonstrand, através de microscopia eletrônica, mostraram que a mitocôndria apresenta duas membranas, uma externa e uma interna, muito dobrada. Em 1961, Peter Mitchell propôs a teoria quimiosmótica, sugerindo que o transporte de elétrons e a síntese de ATP estão acoplados a um gradiente de prótons na membrana mitocondrial interna.
Mitchell sugeriu que bombas de prótons criariam este gradiente de prótons, que seria a força motriz para a síntese de ATP (Berg et al., 2008).
3.2 Destinos da glicose e Ciclo de Krebs
Os seres vivos precisam de energia para realizar várias funções, como, por exemplo, o transporte ativo de íons e moléculas, neurotransmissão, síntese de macromoléculas e outras biomoléculas a partir de precursores simples e para a contração muscular. A energia necessária para realizar essas funções é obtida com a oxidação de substâncias pela respiração celular. O ATP é o principal combustível da célula na maioria dos processos que precisam de energia, sendo a energia liberada pela hidrólise de ATP, que impulsiona uma série de reações (Lehninger et al., 2007)
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A glicose é a principal fonte de energia utilizada pela maioria das células e ocupa uma posição central no metabolismo. Ela é transportada para dentro das células por proteínas transportadoras especificas, e ao entrar na célula, a glicose pode ser metabolizada em diferentes rotas metabólicas. No entanto, a principal via de degradação da glicose é a glicólise. Esta via é composta por uma sequência de 10 reações enzimáticas, cuja função no metabolismo energético é fornecer parte da energia utilizada pelos organismos; este processo ocorre no citoplasma e tem como produto final o piruvato (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008). Uma molécula de glicose gera duas moléculas de piruvato e de ATP. Além disso, a glicose pode participar do ciclo das pentoses, que tem como objetivo formar NADPH, um doador de elétrons de fundamental importância para as biossíntesses redutoras, e ribose-5- fosfato, precursor da biossíntese de nucleotídios. Quando a célula está com elevados níveis de ATP, a glicose pode ser armazenada na forma de glicogênio, que pode ser liberado e utilizado rapidamente se a célula necessitar de energia (Clark et al., 1993; Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
Figura 3. Destinos da glicose (Nelson & Cox, 2000).
Em organismos superiores, o piruvato, formado na glicólise a partir de glicose, pode seguir duas rotas metabólicas distintas. No metabolismo anaeróbico, o piruvato apresenta dois
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caminhos. Primeiro, e mais comum, o piruvato é reduzido a lactato pela lactato desidrogenase, formando ATP e consumindo NADH. Segundo, nos organismos capazes de fazer fermentação alcoólica, o piruvato perde dióxido de carbono produzindo acetoaldeído, que então será reduzido a etanol. No metabolismo aeróbico, o piruvato é transportado para dentro da mitocôndria e sofre ação do complexo enzimático da piruvato desidrogenase formando acetil- CoA, que seguirá para o ciclo Krebs (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
O ciclo de Krebs ocorre na matriz mitocondrial, onde uma molécula de acetil-CoA é completamente oxidada a CO2, através de uma série de reações composta por oito passos, onde cada um é catalisado por enzimas diferentes (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
O ciclo de Krebs começa e termina com oxaloacetato e consiste de uma sequência de reações onde, em cada volta do ciclo, são formadas três moléculas de NADH, uma de FADH2, duas de CO2 e uma de GTP. O NADH e FADH2 produzidos no ciclo de Krebs são carreadores de elétrons que serão posteriormente utilizados na cadeia transportadora de elétrons para a produção de ATP na fosforilação oxidativa (Marks et al., 1996; Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
Figura 4. Ciclo de Krebs (Nelson & Cox, 2000).
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Altos níveis de ATP inibem o ciclo de Krebs por mecanismos complementares em vários locais do ciclo. Um dos pontos de controle é a conversão de piruvato a acetil-CoA pela enzima piruvato desidrogenase, inibida por ATP, acetil-CoA e NADH (Smith et al., 2005;
Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
3.3. Cadeia respiratória e fosforilação oxidativa
A cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, assim como o ciclo de Krebs, ocorrem nas mitocôndrias. A cadeia respiratória é formada por uma série de complexos protéicos, onde ocorre a transferência de elétrons doados por NADH e FADH2. O fluxo de elétrons do NADH e FADH2 até O2 se da através de complexos enzimáticos ancorados na membrana mitocondrial interna, essa transferência de elétrons é impulsionada por um crescente potencial redox entre as coemzimas NADH e FADH2, os complexos enzimáticos e oxigênio, o aceptor final da cadeia respiratória (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
A cadeia respiratória é composta de quatro complexos (I, II, III e IV). O complexo I, conhecido como NADH desidrogenase ou NADH: ubiquinona oxidorredutase, transfere elétrons do NADH para a ubiquinona, formando ubiquinol. Essa reação faz com que dois prótons sejam bombeados para o espaço intermembrana. O complexo II, também denominado de succinato: ubiquinona oxirredutase, é formado pela enzima succinato desidrogenase (SDH) e três subunidades hidrofóbicas. Esse complexo participa do ciclo de Krebs e transfere elétrons do succinato para a ubiquinona e também forma ubiquinol. O complexo III, ou citocromo c oxirredutase, transfere elétrons do ubiquinol para o citocromo c, reação que serve para o bombeamento de mais quatro prótons para o espaço intermembrana. O complexo IV, mais conhecido como citocromo c oxidase, transfere elétrons do citocromo c reduzido para o
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oxigênio, reduzindo-o a H2O. Nessa etapa os últimos dois prótons são bombeados (Wallace, 1999; Murray, 2002; Voet et al., 2008).
O gradiente eletroquímico formado pelo bombeamento de prótons durante a cadeia respiratória mitocondrial é utilizado como força-motriz para o complexo V, ou ATP sintase, formar ATP (fosforilação oxidativa). Dessa forma, a oxidação de substratos energéticos está acoplada ao processo de fosforilação do ADP, ou seja, quando o potencial de membrana é dissipado pelo fluxo de prótons a favor do gradiente eletroquímico, a energia liberada é utilizada pela ATP sintase, que atua como uma bomba de prótons ATP-dependente (Lehninger et al., 2007).
Figura 5. Cadeia respiratória mitocondrial (Nelson & Cox, 2000).
Além da regeneração do ATP, a mitocôndria é a principal fonte de espécies reativas de oxigênio e de defesas antioxidantes nas células (Cadenas & Davies, 2000), gerando ânions
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superóxido no espaço intermembrana pelo vazamento de elétrons que se combinam com oxigênio molecular no complexo III em um processo que é dependente do potencial de membrana, e na matriz, através do complexo I (Han et al., 2001). Além disso, a mitocôndria participa ativamente da homeostase de cálcio (Nicholls & Akerman, 1982). Neste contexto, alterações na função mitocondrial levam a uma rápida queda na produção de energia e morte celular (Ankarcrona et al., 1995). Além disso, a diminuição do metabolismo energético pode levar a apoptose através da liberação de citocromo c (Liu et al., 1996; Heales et al., 1999).
A redução de produção de energia no cérebro pode comprometer a síntese se neurotransmissores (acetilcolina, glutamato, aspartato e GABA) e lipídios nesse tecido e pode, por isso, levar ao dano neuronal (Di Donato, 2000). Acredita-se que a diminuição no metabolismo energético pode estar envolvido na fisiopatologia de diversas doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer, Parkinson, Huntington, isquemia cerebral e esclerose amiotrófica lateral (Brennan et al., 1985; Beal et al., 1992; Heales et al., 1999; Blass, 2001), e também de vários erros inatos do metabolismo (Schuck et al., 2002;
Reis de Assis et al., 2004; Latini et al., 2005; Ferreira et al., 2007; Viegas et al., 2008).
3.4 Creatina quinase
Outra forma de produção de ATP é a partir da enzima creatina quinase (CK). Esta enzima foi descoberta em extratos de músculos por Karl Lohman, em 1934 (Wallimann et al., 1992). A CK é uma enzima que possui um papel central no metabolismo energético, principalmente para tecidos com alta demanda energética, como cérebro, músculo cardíaco e esquelético, onde funciona como um efetivo sistema de tampão para os níveis celulares de ATP, sendo assim é uma enzima crucial para a homeostase energética (Pilla et al., 2003). A reação da CK catalisa a transferência metabolicamente reversível do grupamento N-fosforil da
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fosfocreatina para o ADP, regenerando o ATP (Wyss & Kaddurah-daouk, 2000; Pilla et al., 2003; Berg et al., 2008).
Esta enzima possui cinco isoenzimas, três citoplasmáticas e duas mitocôndrias. As isoenzimas citoplasmáticas são compostas por dois tipos de subunidades, a M de “muscle” e a B de “brain”; os nomes são em função dos lugares de onde foram primeiramente isoladas.
Essas isoenzimas são conhecidas como CK-MM, encontrada no músculo esquelético, CK-BB, encontrada no cérebro e CK-MB, encontrada no músculo cardíaco (Eppemberg et al., 1967;
Wallimann et al., 1992).
A CK consiste de dois domínios, um pequeno domínio de natureza α-helicoidal e um amplo domínio contendo uma lâmina β antiparalela produzida por oito intermitências franqueadas por sete α-hélices, o seu local ativo está localizado entre os dois domínios e é coberto por resíduos que são conservados dentro da família CK. Além disso, as isoenzimas da CK possuem no seu local ativo um grupo sulfidril que é altamente reativo, desta forma este grupo pode ser uma maneira tanto para inibir a ativação da CK como proteger contra o dano irreversível durante períodos de estresse oxidativo, entretanto as isoenzimas da CK foram identificadas como alvos primários da modificação e inativação irreversível pelas espécies reativas de oxigênio (Wyss & Kaddurah-daouk, 2000).
O sistema creatina quinase/creatina /fosfocreatina mostra diferentes funções integradas em células cerebrais, isto é, tamponamento de energia, capacidade metabólica, transferência de energia e controle metabólico. Desta forma este sistema é reconhecido como um regulador metabólico importante entre a saúde e a doença (Pilla et al., 2003). A CK parece estar envolvida em certas condições patológicas relacionadas com déficit de energia cerebral, foi postulado que o prejuízo na função da CK possa ter um papel crítico no processo neurodegenerativo que leva à perda neuronal. Além disso, a baixa atividade desta enzima está
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associada a doenças neurodegenerativas, como por exemplo, isquemia cerebral, transtorno bipolar, doença de Alzheimer e outros estados patológicos (Tomimoto et al., 1993).
4. Radicais Livres
Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de existir de forma independente e que contenha um ou mais elétrons desemparelhados. Por isso, são muito reativos e atacam moléculas, como lipídios, proteínas e DNA. Dentre os radicais livres, podem-se destacar dois grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as de nitrogênio (ERN). As ERO mais importantes são o ânion superóxido (O2•-
), radical hidroxila (OH•), peróxido de hidrogênio (H2O2), ânion hipoclorito (OCl-) e o oxigênio “singlet” (1O2). O óxido nítrico (NO•) e o peroxinitrito (ONOO-) constituem as principais ERN (Halliwell &
Gutteridge, 1999).
Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbico, o oxigênio molecular sofre redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons resultando na formação de água.
Cabe a citocromo oxidase mitocondrial a função de acrescentar quatro elétrons em cada molécula de oxigênio para gerar duas moléculas de água (Bergendri et al., 1999). Porém, devido a uma forte configuração eletrônica, o oxigênio tem uma forte tendência a receber um elétron de cada vez, formando compostos intermediários altamente reativos, como o radical ânion superóxido e o radical hidroxil (Babior, 1997; Güinçin et al., 2004). O radical ânion superóxido é formado pela redução do oxigênio molecular por apenas um elétron mediante aporte de energia (Bowles & Crapo, 2002). Apesar do radical ânion superóxido não poder atacar diretamente o DNA, lipídeos e proteínas (Halliwell & Gutteredge, 1999); ele é altamente reativo, devendo ser removido rapidamente dos tecidos pela reação da dismutação realizada pela enzima superóxido dismutase, em que dois ânions superóxido reagem entre si;
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sendo um oxidado a oxigênio e outro reduzido a peróxido de hidrogênio (Bowles & Crapo, 2002; Forman & Torres, 2002).
As ERO ocorrem tanto em processos fisiológicos quanto em processos patológicos do organismo. Fisiologicamente, essas espécies reativas apresentam diversas funções (Bergendi et al., 1999). Assim, um aumento da liberação local de radicais livres pode ser benéfico, como é o caso da liberação de radicais livres pelos neutrófilos, que podem atuar na defesa do hospedeiro contra uma infecção (Delanty & Dichter, 1998; Halliwell & Gutteridge, 2007).
Participam ainda de processos de sinalização celular e também estão envolvidos na síntese e regulação de algumas proteínas (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Por outro lado, quando formadas em excesso, essas espécies altamente reativas têm o potencial de oxidar moléculas (Maxwell, 1995). Com relação aos efeitos prejudiciais das reações oxidantes ao organismo, os radicais livres podem promover lipoperoxidação, causar a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), reagir com proteínas, levando à sua inativação e consequente alteração de sua função, e reagir com o DNA e RNA, levando a mutações somáticas e a distúrbios de transcrição (Delanty & Dichter, 1998), dentre outros efeitos.
4.1. Defesas antioxidantes
Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias que, em baixas concentrações em relação ao substrato oxidável, retardam ou previnem a oxidação desse substrato. Desse modo, os antioxidantes atuam como protetores da oxidação de biomoléculas por radicais livres e impedem a propagação da reação em cadeia provocada pelos mesmos (Halliwell &
Gutteridge, 1999; Fang et al., 2002).
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As principais defesas enzimáticas antioxidantes são a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX). Além disso, antioxidantes não-enzimáticos, como a glutationa reduzida (GSH), tocoferol (vitamina E) e ácido ascórbico (vitamina C), entre outros, auxiliam no combate às ERO. Os antioxidantes estão amplamente distribuídos nos organismos vivos e constituem um sistema de defesa muito importante em condições aeróbicas (Halliwell & Gutteridge, 1999; Fang et al., 2002).
4.2. Estresse oxidativo
Os radicais livres são formados normalmente no metabolismo celular. As defesas antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a toxicidade dessas espécies e são responsáveis pela manutenção da homeostase entre a produção e a eliminação de radicais livres. No entanto, em determinadas condições patológicas pode haver um desequilíbrio entre a produção de oxidantes e as defesas antioxidantes, favorecendo a ocorrência do estresse oxidativo. Assim, o termo “estresse oxidativo” é usado para se referir à situação na qual a geração de espécies reativas ultrapassa a capacidade das defesas antioxidantes disponíveis, que pode resultar tanto de uma diminuição das defesas antioxidantes quanto de uma produção aumentada de oxidantes, bem como da liberação de metais de transição ou a combinação de quaisquer desses fatores (Bondy & Le Bel, 1993; Cadenas & Davies, 2000; Halliwell, 2006).
O estresse oxidativo pode promover adaptação, dano ou morte celular, onde a adaptação ocorre quando as células podem tolerar um estresse oxidativo moderado, que geralmente resulta em um aumento da síntese de sistemas de defesa antioxidante a fim de restaurar o balanço oxidante/antioxidante. Apesar disso, nem sempre o estresse oxidativo precisa envolver um aumento das defesas antioxidantes. No dano celular, o estresse oxidativo pode danificar alvos moleculares (DNA, proteínas, carboidratos e lipídios) (Halliwell &
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Gutteridge, 2007). A resposta à injúria pode ser reversível: a célula entra em um estado de homeostase alterado temporário ou prolongado, que não leva à morte celular. Já a morte celular pode ocorrer tanto por necrose quanto por apoptose. Na morte celular por necrose, a célula incha e se rompe, liberando seu conteúdo para o meio extracelular. Pode haver a liberação de antioxidantes, como a catalase e a glutationa reduzida, e também de pró- oxidantes, como os íons cobre e ferro e proteínas do grupo heme, agentes esses que podem afetar as células adjacentes, podendo até mesmo induzi-las a um estresse oxidativo. Já na apoptose, o mecanismo de morte celular programada é ativado e não há a liberação do conteúdo celular (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Todos os tecidos humanos são suscetíveis ao dano oxidativo. No entanto, o cérebro parece ser especialmente sensível a este tipo de lesão. Uma razão importante para isso seria o alto consumo de oxigênio apresentado por este tecido. Além disso, as membranas neuronais apresentam grande quantidade de lipídios poliinsaturados, altamente suscetíveis a lipoperoxidação. Ainda, a autooxidação de muitos neurotransmissores, como dopamina e noradrenalina, gera espécies reativas, sendo que esta autooxidação pode ser acelerada pela presença de ferro, amplamente distribuído no cérebro. Por fim, o tecido cerebral apresenta um baixo nível de defesas antioxidantes (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Existem evidências crescentes sugerindo que as espécies reativas desempenham um papel importante na patogênese de muitas doenças, como diabetes, neoplasias, aterosclerose, doenças inflamatórias e doenças neurodegenerativas, em particular a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica (Reznick & Packer, 1993; Przedborski et al., 1996; Bem–Menachem et al., 2000), sem, entretanto, obter até o momento uma explicação completamente satisfatória para explicar o dano cerebral dessas doenças. No entanto, acredita-se que possíveis mecanismos envolvam deficiência no metabolismo energético, estresse oxidativo e
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neurotoxicidade mediada por receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (excitotoxicidade), ou, possivelmente, um somatório desses fatores (Rose & Henneberry, 1994).
Tem também sido recentemente demonstrado que o estresse oxidativo atua em vários erros inatos do metabolismo (Colomé et al., 2000, Wajner et al., 2004). A produção excessiva de radicais livres e a redução das defesas antioxidantes ocorrem em algumas acidemias orgânicas, como nas acidemias glutárica (Kolker et al., 2001; Latini et al., 2005; 2007), propiônica e metilmalônica (Fontella et al., 2000), bem como em aminoacidopatias como na homocistinúria (Streck et al., 2003; Stefanello et al., 2005), tirosinemia tipo I (Bird et al., 1995) e fenilcetonúria (Artuch et al., 2001; Hagens et al., 2002; Artuch et al., 2004; Sirtori et al., 2005; Sitta et al., 2006) e também na doença peroxissomal adrenoleucodistrofia ligada ao X (Vargas et al., 2004; Deon et al., 2006), sugerindo que o estresse oxidativo possa estar envolvido no dano neurológico observado nessas doenças. Embora o mecanismo responsável pelo estresse oxidativo nos erros inatos do metabolismo não seja totalmente compreendido, é possível que o acúmulo de metabólitos tóxicos induza a formação excessiva de radicais livres.
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PARTE II - OBJETIVOS
Objetivo Geral
Investigar os efeitos in vitro dos principais metabólitos que se acumulam na deficiência de MCAD (ácidos octanóico e decanóico) na ausência ou presença de hiperamonemia induzida pelo acetato de amônio (AA) sobre parâmetros de estresse oxidativo e de metabolismo energético em córtex cerebral, fígado e músculo de ratos jovens.
Objetivos Específicos
Investigar o efeito in vitro dos ácidos octanóico e decanóico e do acetato de amônio sobre parâmetros de estresse oxidativo e de metabolismo energético, através da determinação dos seguintes parâmetros em córtex cerebral, fígado e músculo de ratos:
a) Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS);
b) Carbonilação de proteínas;
c) Atividade da creatina quinase;
d) Atividade da succinato desidrogenase;
e) Atividade da citrato sintase;
f) Atividade dos complexos I, II, III e IV da cadeia respiratória;
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PARTE III – RESULTADOS
Artigo 1
Toxicity of octanoate and decanoate in rat peripheral tissues: evidence of bioenergetic dysfunction and oxidative stress induction in liver and skeletal muscle
Giselli Scaini, Kellen R. Simon, Anelise M. Tonin, Estela N. B. Busanello, Alana P. Moura, Gustavo C. Ferreira, Moacir Wajner, Emilio L. Streck, Patrícia F. Schuck
Artigo submetido no periódico Archives of Biochemistry and Biophysics
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Artigo 2
Ammonia potentiates toxicity of octanoate and decanoate in rat tissues
Giselli Scaini, Natália Rochi, Bethânia M. Borges, Bruna W. Freitas, Isabela C. Jeremias, Gustavo C. Ferreira, Emilio L. Streck, Patrícia F. Schuck
Artigo submetido no periódico Cellular Physiology and Biocehmistry
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