UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
MACELIA PINHEIRO FERREIRA
EFEITOS DO CHÁ VERDE (Camelliasinensis) E DA EPIGALOCATEQUINA-3-GALATO SOBRE A HEMOSTASIA E O DESENVOLVIMENTO TUMORAL DO MELANOMA EM CÉLULAS B16-F10
Natal-RN 2021
MACELIA PINHEIRO FERREIRA
EFEITOS DO CHÁ VERDE (Camelliasinensis) E DA EPIGALOCATEQUINA-3-GALATO SOBRE A HEMOSTASIA E O DESENVOLVIMENTO TUMORAL DO MELANOMA EM CÉLULAS B16-F10
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Farmácia.
Orientador: Profa. Dra. Emérita Maria das Graças de Almeida
Coorientador: Prof. MSc. Saulo Victor e Silva
Natal-RN 2021
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Ferreira, Macelia Pinheiro.
Efeitos do chá verde (Camellia sinensis) e da
epigalocatequina-3-galato sobre a hemostasia e o desenvolvimento tumoral do melanoma em células B16-F10 / Macelia Pinheiro
Ferreira. - 2021.
50f.: il.
Trabalho de Conclusão de Curso - TCC (Graduação em Farmácia) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde, Departamento de Farmácia. Natal, RN, 2021.
Orientadora: Profa. Dra. Emérita Maria das Graças de Almeida.
Coorientador: Prof. MSc. Saulo Victor e Silva.
1. Câncer - TCC. 2. Chá verde (Camellia sinensis) - TCC. 3.
EGCG - TCC. 4. Melanoma - TCC. I. Almeida, Emérita Maria das Graças de. II. Silva, Saulo Victor e. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616-006.6
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
MACELIA PINHEIRO FERREIRA
EFEITOS DO CHÁ VERDE (Camelliasinensis) E DA EPIGALOCATEQUINA-3-GALATO SOBRE A HEMOSTASIA E O DESENVOLVIMENTO TUMORAL DO MELANOMA EM CÉLULAS B16-F10
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Farmácia.
Orientador: Profa. Dra. Emérita Maria das Graças de Almeida
Coorientador: Prof. MSc. Saulo Victor e Silva
Natal, ___de___de_____.
Presidente: Profa. Dra. Emérita Maria das Graças Almeida
Professora associada IV DACT/UFRN.
Membro: Prof. MSc. Jefferson Romáryo Duarte da Luz
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde/UFRN.
Membro: Prof. Dr. Márcio Ferrari
Professor associado ao Departamento de Farmácia/UFRN.
Com muito amor e gratidão aos meus queridos pais, minha irmã, meu cunhado e minhas avós. Amo vocês!
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pelo infinito amor e misericórdia concedendo-me saúde em todos os momentos;
ANossa Senhora, por todo intercessão, proteção e amor;
Aos meus amados pais Maria Pinheiro de Macedo Ferreira e Severino Ramos Macelio Ferreira por todo amor, compreensão e dedicação durante todo esse tempo;
A minha querida irmã Marília Pinheiro Ferreira de Morais e ao meu querido cunhado,Izaias Costa de Morais por todo cuidado, incentivo e parceria;
Aos meus queridos amigos: Amanda Hellen dos Santos Maciel;Aline Cavalcante dos Santos; Rubiamara Mauricio de Sousa por todo apoio, ajuda, palavras de incentivos;
A Professora Dra. Lourena Mafra Veríssimo pelos ensinamentos e por toda confiança;
A minha professora orientadora Dra. Maria das Graças Almeida por toda orientação, ajuda e incentivo concedido a mim;
Aos meus companheiros do LABMULT, por toda a experiência que me foi passada, pela amizade e pela ajuda de vocês, tudo isso foi fundamental;
Aos meus queridos “chefinhos” meus sinceros agradecimentos, Jefferson Romáryo Duarte da Luz por todo apoio, disponibilidade, incentivo e dedicação;Saulo Vitor e Silva pelo apoio e por acreditar sempre em mim. Sem dúvidas que nada teria dado certo sem a ajuda deles;
A minha turma preferida de 2017.2, o meu muito obrigada por tudo. Já sinto falta de todos os nossos momentos. Em especial, meu agradecimento a Karen Kaline, Kauani Georg e Julmi Tanaka pela ajuda, companheirismo e amizade nos momentos de tristeza, alegria e nervosismo, dentro ou fora da faculdade durante todos esses anos;
A todos os professores da Faculdade de Farmácia, por todo ensinamento, paciência e exemplo, ao decorrer dessa graduação.
"Seja forte e corajoso. Não te atemorizes, não tenhas medo, porque o Senhor está contigo em qualquer parte para onde fores.”
(I Crônicas 28:20)
RESUMO
O câncer é uma doença multifatorial que surge a partir do crescimento desordenado de células atípicas, resultando em invasões teciduais que levam à formação de tumores. Entre os mais diversos tipos de cânceres existentes, o câncer de pele do tipo melanoma é um dos mais perigosos. Com base nisso, diversos tratamentos são estudados em todo o mundo, com o intuito de melhorar a eficácia e a qualidade de vida dos pacientes oncológicos. Buscando a diminuição dos efeitos adversos resultantes dos tratamentos convencionais diversos estudos investigam o efeito de plantas sobre a progressão tumoral e sobre o estado de hipercoagulabilidade que está associado ao câncer. Dentre as plantas medicinais mais estudadas atualmente está a Camellia sinensis, que a partir dela é extraído o chá verde e a epigalocatequina-3galato (EGCG), composto majoritário do chá verde. Com base no exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do chá verde e da EGCG sobre a hemostasia e o desenvolvimento tumoral do melanoma, podendo estar contribuindo de maneira adjuvante no tratamento oncológico tradicional. O presente estudo avaliou as propriedades antitumorais, antiangiogênicas e efeitos na hemostasia primária e secundária do chá verde e da EGCG objetivando o desenvolvimento de novas alternativas de tratamentos adjuvantes na oncologia e em alterações na hemostasia. Durante os diversos experimentos realizados, as concentrações testadas do chá verde e da EGCG foram para cada um 25μg/mL, 50μg/mL e 100μg/mL. Foi observado no teste de agregação plaquetária um potente efeito do chá verde diminuindo em até 50% e da EGCG reduzindo em cerca de 80%
quando comparado ao controle negativo. A avaliação dos efeitos do chá verde e EGCG sobre a morte celular através do teste de apoptose por incubação com DAPI revelou redução em torno de 25% e 50% do chá verde e EGCG, respectivamente.
Durante o experimento de angiogênese realizado com células endoteliais, observou-se redução na formação de novos vasos sanguíneos em cerca de 25% na presença do chá verde e cerca de 99% na presença da EGCG nas concentrações de 100μg/mL; No estudo do possível efeito do chá verde e EGCG sobre redução da secreção de VEGF e IL-8 a produção de VEGF e IL-8 foram inibidas na presença do chá verde em 55% e 20% respectivamente; e na presença da EGCG houve redução de 75% de inibição de VEGF e cerca de 80% na inibição de secreção de IL-8; em ambos os casos na concentração de 100μg/mL. Portanto, fica evidenciado através dos resultados os efeitos do chá verde e EGCG sobre hemostasia primária e desenvolvimento tumoral, sendo necessário mais estudos para esclarecer a ação dessas substâncias.
Palavras-chave: Câncer. Chá verde (Camelliasinensis).EGCG. Melanoma.
ABSTRACT
Cancer is a multifactorial disease that comes up from disorderly growth of atypical cells resulting in tissue invasions that lead to tumor formation. Among the of the most diverse types of existing cancers, melanoma-type skin cancer is one of the most dangerous, especially in countries with a tropical climate, duo to the high incidence of sunlight. Based on this, several treatments are studied around the world, with the aim of improving the effectiveness and quality of life of patients who suffer from the side effects of conventional cancer treatments. Seeking to reduce the adverse effects resulting from usual antineoplastic molecules, several studies have investigated the effect of plants on tumor progession and on the hypercoagulable state that is associated with cancer. Among the most studied medicinal plants currently is Camellia sinensis, from which green tea is extracted and EGCG (Major compound of green tea). Based on the above, the aim of this study was to evaluate the effect of the green tea and EGCG on hemostasis and melanoma tumor development, which may be contributing as an adjuvant in traditional cancer treatment. The present study evaluated the antitumor, antiangiogenic and anticoagulant properties of green teat and EGCG. During the various experiments carried out, the tested concentrations of green tea and EGCG were 25μg/mL, 50μg/mL e 100μg/mL. It was observed in the platelet aggregation test a potent effect of green tea decreasing by up to 50% and EGCG decreasing by about 85% when compared to the negative control. The evaluation of the effects of green tea and EGCG on cell death through the apoptosis test by incubation with DAPI revealed a reduction of around 25% and 50% of green tea and EGCG, respectively. During the angiogenesis experiment performed with endothelial cells, there was a reduction in the formation of new blood vessels of about 25% in the presence of green tea and about 99% in the presence of EGCG at concentrations of 100μg/mL; In the study of the possible effect of green tea and MCGT on the reduction of VEGF and IL-8 secretion, VEGF and IL-8 production were inhibited in the presence of green tea by 55% and 20%
respectively; and in the presence of EGCG there was a 75% reduction in VEGF inhibition and about 80% in the inhibition of IL-8 secretion; in both cases at a concentration of 100μg/mL. Therefore, the effects of green tea and EGCG on primary hemostasis and tumor development are evidenced through the results, and further studies are needed to clarify the action of these substances.
Key-words: Cancer. Green tea (Camelliasinensis). EGCG. Melanona.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...12
2 OBJETIVOS ...15
2.1. Objetivo geral ...15
2.2. Objetivos específicos...15
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...16
3.1.Câncer e sua prevalência mundial...16
3.2. Câncer de pele do tipo melanoma...17
3.3. Trombose desenvolvida durante o Câncer...18
3.4. Plantas com propriedade medicinais durante o tratamento oncológico...19
3.5. Camellia sinensis e seu composto majoritário EGCG...20
4. METODOLOGIA………..21
4.1. Aquisição das amostras de chá verde e EGCG...21
4.2. Ensaio de Agregação Plaquetária...21
4.3.1.Testes anticoagulantes ...22
4.3.2.Tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT)...22
4.3.3.Tempo de protrombina (PT)...22
4.4. Cultura de células………..……23
4.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT e ALAMAR BLUE)...23
4.6. Apoptose por citometria de fluxo (anexina-V/iodeto de propídio)...24
4.7. Apoptose incubação por DAPI……….……..24
4.8. Produção de melanina……….………....25
4.9. Formação do tubo de células endoteliais de matrigel……….…...25
4.10. Inibição da secreção de VEGF e IL-8……….……....26
4.11. Análise estatística……….………..26
5. RESULTADO E DISCUSSÕES………....28
5.1. Hemostasia primária (agregação plaquetária)...28
5.2. Hemostasia secundária (coagulação)...28
5.3. Viabilidade celular (Teste MTT e Alamar Blue)...30
5.4. Apoptose por citometria de fluxo (células de melanoma)...32
5.5. Apoptose por incubação com DAPI (células de melanoma)...33
5.6. Produção de melanina (células de melanoma)...35
5.7. Angiogênese (células endoteliais)...37
5.8. Inibição da secreção de secreção de VEGF (células endoteliais)...39
5.9. Inibição da secreção de secreção de IL-8 (células endoteliais)...41
6. CONCLUSÕES………...44
REFERÊNCIAS………...45
ANEXO A...49
ANEXO B...50
1 INTRODUÇÃO
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o câncer é uma das principais causas de morte no mundo e foi responsável por quase 10 milhões de mortes em 2020. A doença é caracterizada por um processo de transformação das células saudáveis em células cancerígenas, essas mudanças acontecem devido a interação entre fatores genéticos e algumas categorias de agentes externos, como a radiação ultravioleta e ionizante que é um dos principais fatores para o desenvolvimento do câncer de pele. Esse sendo um dos câncer mais prevalentes no mundo, tendo alta incidência em homens e mulheres (OMS, 2020).
A Organização Mundial da Saúde estima que, no ano de 2030, exista cerca de 27 milhões de novos casos de câncer de pele, podendo se apresentar como melanoma e não melanoma, sendo o melanoma responsável por 5% dos casos de câncer de pele, entretanto corresponde a 46% das mortes. Os melanomas geralmente são mais agressivos e letais, com chances de provocar metástase, processo em que ocorre a migração das células cancerígenas por via sanguínea ou linfática para outros orgãos (OMS, 2020; PRETTIet al,2020).
Os tratamentos para o câncer são realizados com o objetivo de parar a proliferação desordenada das células, impedindo a progressão da doença. Para isso, os tratamentos contam com terapias convencionais (quimioterapia, radioterapia, cirurgia) que buscam a inibição da proliferação das células de maneira não seletiva, com isso, além das células cancerígenas, as células saudáveis também são inibidas. Dentre os diversos efeitos colaterais dos tratamentos convencionais, a baixa do sistema imunológico é um deles, resultando em danos na produção das células da medula óssea e facilitando a vulnerabilidade do indivíduo às doenças como trombose venosa (MOKHTARIet al., 2017).
Entretanto, a queda na imunidade não é o único efeito adverso que pode surgir ao decorrer dos tratamentos, o risco de trombose é um outro problema identificado na oncologia, sendo a segunda principal causa de morte após o avanço
da doença. Nesses pacientes, a probabilidade de manifestação do tromboembolismo venoso (TEV) é de quatro a sete vezes maior que em indivíduos saudáveis. Uma das explicações para essa situação é o uso de cateteres venenos, agentes antiangiogênicos, terapia hormonal, radioterapia e medicamentos imunomoduladores (FERNANDESet al, 2019).
Com a alta susceptibilidade de tromboembolismo venoso em pacientes com câncer, há uma alta prescrição de substâncias que atuam sobre a hemostasia, bem como os antagonistas de vitamina K, como é o caso da heparina de baixo peso molecular (HBPM) uma vez que provoca menos efeitos adversos que a heparina não fracionada, exemplos de outros fármacos utilizados na clínica como anticoagulante é a varfarina e rivaroxabana. Porém, essas drogas precisam ser utilizadas com cautela, uma vez que, esses fármacos podem causar vários efeitos colaterais, como trombocitopenia e desordens hemorrágicas (PRINCE et al,2018).
Com o objetivo de melhorar a qualidade de vida desses pacientes, os estudos estão focando no desenvolvimento de novos agentes farmacêuticos, que apresentem um menor risco de efeitos adversos em comparação a terapêutica convencional, com base nisso, uma linha de pesquisa em constante ascensão é o uso de produtos naturais como agente terapêutico, podendo ser utilizados para quimioprevenção e tratamento de câncer (MOKHTARIet al, 2017).
A busca por compostos naturais como uma alternativa ou reforço ao tratamento do câncer tornaram-se essenciais para superar as limitações dos tratamentos convencionais, uma vez que, é esperado um menor efeito adverso dessas substâncias quando comparado aos fármacos sintéticos. Não é de hoje que as plantas são usadas pela sociedade para fins medicinais, o uso das plantas acompanha a história da humanidade, e uma das formas de uso das plantas é no formato do chá, que é uma das bebidas mais consumidas no mundo todo. Os estudos apontam que o consumo de chá, em particular do chá verde, que é produzido a partir das folhas frescas da planta Camellia sinensis, apresenta vantagens no tratamento de algumas doenças, incluindo o câncer (ZHANG et al, 2016).
A composição do chá verde é rica em polifenóis que na grande maioria se apresentam como flavonoides, e dentre estes, predominam as catequinas como é o
caso da epicalogatequina-3-galato (EGCG) que corresponde a cerca de 50-80% da quantidade total de catequinas presentes no chá verde, sendo assim o composto majoritário do chá verde. A EGCG vem sendo estudada através de modelosin vitro, modelos in vivoe estudos clínicos, devido sua natureza antineoplásica para diversos tipos de neoplasias como câncer de mama, osso, colo do útero. (ZHANG et al, 2016).
Diante do exposto, este estudo objetiva avaliar o extrato do chá verde e da EGCG como moduladores da hemostasia e do desenvolvimento e progressão tumoral em células de melanoma (B16-F10).
2 OBJETIVOS
2.1- Objetivo geral
- Avaliar os efeitos do extrato de chá verde (Camellia sinensis) e de seu composto majoritário epigalocatequina-3-galato (EGCG) sobre a hemostasia e o desenvolvimento tumoral do Melanoma em células B16-F10.
2.2- Objetivos específicos
- Investigar o potencial do extrato do chá verde (Camellia sinensis) e EGCG sobre a hemostasia primária;
- Investigar o potencial do extrato do chá verde (Camellia sinensis) e EGCG sobre a hemostasia secundária;
- Avaliar o efeito do Chá Verde (Camellia sinensis) e EGCG sobre a morte em células de melanoma B16-F10;
- Analisar o efeito do Chá Verde (Camellia sinensis) e EGCG sobre a produção de melanina em células B16-F10;
- Analisar o efeito do Chá Verde (Camellia sinensis) e EGCG sobre a angiogênese;
- Avaliar o efeito do extrato de chá verde (Camellia sinensis) e da EGCG sobre a produção de IL-8 e VEGF.
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 CÂNCER E SUA PREVALÊNCIA NA POPULAÇÃO MUNDIAL
O câncer pode ser definido por uma doença ou conjunto de doenças enigmáticas que atingem os seres vivos multicelulares há milhões de anos, nos ancestrais dos humanos modernos há evidência de câncer. Diferente das doenças infecciosas, parasitárias e das doenças ambientais, o câncer não é causado majoritariamente por algum corpo estranho ao corpo humano. Normalmente, os agentes causadores de destruição são células humanas que por um ou diversos motivos sofrem desordem e são transformadas em organismos patológicos, podendo progredir até a construção de tumores (HAUSMAN, 2019). O processo de desenvolvimento do tumor pode levar anos e ser detectado apenas quando já estiver estabelecido no organismo, sendo assim possível chegar ao diagnóstico preciso. Em todos os tipos de câncer o diagnóstico precoce aumenta as chances de efetividade dos tratamentos (HAUSMAN, 2019; DRAGANIet al, 2020).
O nome câncer é utilizado para definir diversas patologias diferentes entre si, porém que apresentam uma característica em comum, crescimento desordenado de células em algum órgão do corpo, quando não tratado ou em caso de tratamento não efetivo, podem causam formação de novos tumores em outros órgãos, assim se espalharem pelo corpo. O processo de desenvolvimento do tumor pode levar anos e ser detectado apenas quando já estiver estabelecido no organismo, sendo assim possível chegar ao diagnóstico preciso. Em todos os tipos de câncer o diagnóstico precoce aumenta as chances de efetividade dos tratamentos (HAUSMAN, 2019;
DRAGANIet al, 2020).
O câncer é a principal causa de mortes humanas no mundo, o que leva a graves danos. A Organização Mundial de Saúde (OMS), estima que o câncer foi responsável por cerca de 10 milhões de mortes em 2020. Além disso, é esperado que os números aumentem cada vez mais ao longo dos próximos anos, o que pode
ser explicado por diversos fatores relacionados, na maioria, com o estilo de vida da população mundial como, por exemplo, hábitos alimentares inadequados, sedentarismo, exposição solar. Esse último preocupa bastante uma vez que é um dos principais fatores de risco para desenvolvimento do câncer de pele que possui uma ocorrência mundial de 2 a 3 milhões de casos. Assim como nos outros tipos de câncer, o câncer de pele é resultado de uma série de transformações das células (OMS, 2020; TORRE et al, 2015).
3.2 CÂNCER DE PELE DO TIPO MELANOMA
O processo de transformação de células saudáveis em células cancerígenas normalmente vem de uma lesão pré-cancerosa e progride para tumores malignos.
Estudos apontam que essas mudanças acontecem devido a interação entre fatores genéticos e algumas categorias de agentes externos, como a radiação ultravioleta e ionizante que é um dos principais fatores para o desenvolvimento do câncer de pele (PRETTIet al, 2020).
O câncer de pele pode ser classificado em câncer de pele do tipo não melanoma e do tipo melanoma. Ambos têm como principal fator de risco a exposição excessiva ao sol, mas podem ter outros fatores contribuindo como feridas crônicas, contato com agentes químicos, genética. O melanoma tem alto índice de mortalidade devido a alta chances de causar metástase. Felizmente, os casos de melanoma são minoria quando comparado ao câncer de pele do tipo não melanoma.
O que caracteriza esses tipos de câncer é quais as células são afetadas, no caso do melanoma o câncer tem origem nos melanócitos, que são as células responsáveis pela produção de melanina, substância que determina a cor na pele (PAVRI et al, 2016).
O melanoma representa atualmente uma patologia de grande interesse clínico, por tratar-se de uma doença de difícil tratamento até mesmo para as terapias convencionais, que consistem em aplicações terapêuticas para variados tipos de cânceres, em que o principal objetivo é a destruição das células neoplásicas. São exemplos de terapias convencionais: quimioterapia e radioterapia. Para definir o tratamento do paciente com melanoma é necessário saber o estágio do tumor e da
lesão primária. Atualmente, o potencial de cura do melanoma, quando em estágios iniciais, encontra-se na excisão cirúrgica, imunoterapia, terapia genética e bioquimioterapia (YDEet al, 2018).
Durante o tratamento podem ser desencadeadas outras alterações no organismo em decorrência da susceptibilidade e grau de debilitação do paciente. No processo do tratamento o indivíduo poderá apresentar queda na imunidade, enjoo, fraqueza e trombose. Dessa forma, o paciente oncológico, em muitos casos, também precisa ser monitorado nesses aspectos e se necessário utilizar medicações, principalmente nos casos de trombose que pode levar a morte (AHMEDet al,2020)
3.3 TROMBOSE DESENVOLVIDA DURANTE O CÂNCER
Os indivíduos com câncer apresentam risco aumentado de tromboembolismo venoso (TEV), e acredita-se que esse risco varia de acordo com o tipo de câncer, estágio da doença e modalidade de tratamento. Estima-se que pelo menos 20% das mortes registradas por tromboembolismo venoso são entre pacientes com câncer (HORSTEDet al,2012).
As possíveis causas da trombose foram postuladas, em 1856 por Rudolf Virchow com sua tríade de fatores que levam à trombose: lesão endotelial, estase circulatória e hipercoagulabilidade. No câncer os pacientes demonstram várias condições que podem predispor esses fatores e assim gerar os trombos. Durante o tratamento, o indivíduo é submetido a procedimentos cirúrgicos, quimioterapia e colocação de cateteres podendo gerar lesão endotelial. O paciente oncológico pode permanecer muito tempo deitado na mesma posição causando compressão vascular, diminuindo o fluxo sanguíneo local levando a estase circulatório. A hipercoagulabilidade é ativada por um conjunto complexo de mecanismos na circulação sanguínea, acredita se que a ativação da coagulação nos pacientes oncológicos seja uma reação do hospedeiro ao desenvolvimento do tumor (FERNANDESet al,2019).
Com o alto índice de casos de tromboembolismo venoso em pacientes com câncer, como forma de tratamento há uma grande procura por fármacos que trabalhem sobre a hemostasia como é o caso dos anticoagulantes convencionais representados principalmente pela heparina ou varfarina, que assim como outros fármacos podem promover efeitos adversos. Por isso, a ciência segue evoluindo e procurando novos tratamentos ou terapias adjuvantes para o tratamento da trombose, uma das linhas de pesquisa que está em ascensão é a busca por plantas medicinais. (PRINCEet al,2018).
3.4 PLANTAS COM PROPRIEDADES MEDICINAIS DURANTE O TRATAMENTO ONCOLÓGICO
Cerca de 80% dos habitantes do mundo utilizam as plantas medicinais na forma de formulações tradicionais para o sistema de atenção primária à saúde, assim como alternativa terapêutica para tratamento de várias doenças desde os primórdios. A maioria dos fármacos utilizados atualmente surgiram a partir de conhecimentos populares sobre as plantas. O conhecimento nativo de plantas medicinais e as atividades de pesquisas modernas andam juntos para proporcionar uma abordagem mais confiável na procura por novos medicamentos (PANT, 2014).
A busca por fontes naturais de tratamento para as diversas doenças existentes na humanidade é acelerada e inovadora. Com o objetivo de revelar novos tratamentos que proporcionem menos efeitos adversos e melhor qualidade de vida na vida dos pacientes, os estudos na área das plantas medicinais são promissores e cada vez mais procurados. Existem várias formas de consumir essas plantas, uma delas é o chá que é uma das bebidas mais consumidas no mundo todo (COLALTO, 2017).
São diversos os tipos de plantas e apresentam diferentes propósitos, os estudos avançam e buscam entender os efeitos e mecanismo de ação dessas fontes. Sabe-se que os metabólitos secundários farmacologicamente ativos produzidos pelas plantas podem ser usados para finalidade simples como ajudar na digestão e finalidade mais complexa como no tratamento do câncer ou da trombose.
Alguns desses metabólitos inibem a divisão celular e, portanto, podem ser usados para o tratamento do câncer (BUYEL, 2018).
3.5CAMELLIA SINENSIS E SEU COMPOSTO MAJORITÁRIO EGCG
Uma das espécies amplamente estudada é o chá verde, produzido a partir das folhas frescas deCamellia sinensis e seu extrato tem sido amplamente utilizado pela população com finalidade terapêutica. Com isso, diferentes estudos têm mostrado seus benefícios à saúde e potencialidades medicinais para diversas enfermidades, inclusive contra o câncer. O consumo de chá verde ganhou espaço especial e popularidade na era moderna de mudança de estilo de vida (SAEED, 2017).
O chá verde tem uma composição rica em polifenóis que geralmente se apresentam como flavonoides, que por sua vez predominam as catequinas, sendo eles responsáveis por muitos efeitos positivos no consumo do chá verde. As catequinas encontradas no chá verde são epicatequina (EC), epigalocatequina, epicatequina-3-galato (ECG) e epigalocatequina-3-galato (EGCG). Sendo a EGCG a mais abundante, representando cerca de 60% do total de catequinas presentes no chá verde (REYGAERTet al, 2018)
A EGCG, assim como chá verde, é amplamente investigada pelo seu efeito antitumoral que é sugerido em diversos estudos, e é revelado que a epigalocatequina-3-galato possui potencial antineoplásico. Além desses efeitos, a EGCG apresenta ação anti-inflamatórias, inibe a atividade de citocinas pró-inflamatórias, possui propriedades antioxidantes e efeito quimiopreventivo por meio da inibição do processo de carcinogênese. Com isso, é estudado seu mecanismo de ação e o comportamento nos diferentes tipos de câncer, por isso é realizado experimentos in vitro e in vivo ao redor do mundo todo (FUJIKI, 2018;
ALMATROODIet al,2020).
4 METODOLOGIA
4.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE CHÁ VERDE E EGCG
O extrato de chá verde (Camellia sinensis) e o composto Epigalocatequina-3-galato foram gentilmente doados pela Farmácia de manipulação Farmafórmula. O controle de qualidade empregado nas amostras está como anexo A e B ao final do trabalho. O extrato comercial foi utilizado uma vez que é a opção mais usual pela sociedade. Para realização dos experimentos, as amostras foram pesadas e armazenadas em temperatura de 14ºC até a realização dos testes.
4.2 ENSAIO DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
O ensaio de agregação plaquetária foi realizado pelo método de turbidimétria utilizando um agregômetro (Chrono-Log, Havertown, PA, EUA). A diluição do plasma rico em plaquetas (PRP) foi realizada com solução Tyrode contendo 0,3% Albumina Soro Bovino (BSA) e regulado para 400 μl para resultar uma contagem de plaquetas de 2 x 108 células/mL. Na estimulação de agregação do PRP foi utilizado diferentes agentes de agregação, sendo as concentrações finais: colágeno, 2μg/ml; Adenosina Difosfato (ADP), 10μM; Ácido Aracdônico (AA), 100μM; e trombina, 0,2U/ml. Após 5 minutos da estimulação foi registrada a agregação plaquetária. Os valores da agregação de plaquetas foram avaliados e expressos como percentuais de mudanças na transmissão da luz em relação ao plasma pobre em plaquetas (PPP).
Na realização do experimento in vitro, o PRP foi pré-incubado com Chá verde (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) e pré-incubado com EGCG (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) ou aspirina a 37º C por 5 min antes da estimulação com os agentes indutores de agregação (KIMet al, 2016).
4.3 TESTES ANTICOAGULANTES
Os testes anticoagulantes foram realizados através do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPa) e Tempo de Protrombina (TP). O teste de TTPa avalia a influência dos compostos sobre os fatores de via intrínseca e comum da coagulação. O teste de TP serve para avaliar a influência sobre os fatores da via de extrínseca e comum da coagulação (LUZet al,2019).
4.3.1. TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA (TTPa)
O teste de TTPa avalia a influência dos compostos sobre os fatores de via intrínseca e comum da coagulação. O tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPa) foi realizado de acordo com o Kit (WAMA Diagnóstica, São Carlos, SP, Brasil) durante o estudo foi utilizado o plasma sanguíneo e adicionado os reagentes, posteriormente as amostras do extrato de chá verde (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) e o composto EGCG (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL), enquanto o tempo de coagulação foi medido em triplicata utilizando coagulômetro temporizador de coágulo (Drake Electronic Commerce Ltd., São Paulo, Brasil), foi utilizado o plasma sanguíneo e . (LUZet al,2019).
4.3.2. TEMPO DE PROTROMBINA (TP)
O teste de TP serve para avaliar a influência sobre os fatores da via de extrínseca e comum da coagulação. O ensaio do tempo de protrombina (TP) será realizado de acordo com as instruções do fabricante (CLOT Bios Diagnostica, São Paulo, SP, Brasil), durante o estudo foi utilizado o plasma sanguíneo e adicionado os reagentes, posteriormente as amostras do extrato de chá verde (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) e o composto EGCG (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL), enquanto o tempo de coagulação será medida em triplicata usando um coagulômetro (Drake Electronica Commerce Ltd., São Paulo, Brasil). (LUZet al, 2019).
.
4.4.CULTURA DE CÉLULAS
Para análise dos efeitos antiangiogênicos e redução na produção de VEGF e IL-8 foram cultivadas células endoteliais de aorta de coelho (RAEC), com a classificação da linhagem CRL-4052, em garrafas de cultura celular (60x100mm) contendo meio HAM-F12 enriquecido com 10% de soro bovino fetal (SBF), 20mM de bicarbonato de sódio e antibióticos (Cultilab, Campinas, SP, BRASIL), em temperatura de 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. Para avaliação das propriedades antitumorais do chá verde e EGCG, foram cultivadas células de melanoma murino (B16F10), classificação da linhagem celular de número CRL-6475, em 75 cm2frascos de cultura em Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de SBF, L-glutamina e antibióticos (Cultilab, Campinas, SP, BRASIL). As culturas foram realizadas em placas de cultura (Falcon BD, San Jose, CA, EUA) (PALHARESet al,2020).
4.5ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR (TESTES DE MTT E ALAMAR BLUE)
Para o ensaio de viabilidade celular foram cultivadas linhagem de células B16-F10, com número de classificação celular de CRL-6475, em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10⁴ células/poço. Em seguida foi realizado o tratamento com diferentes concentrações (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) de chá verde e EGCG (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) por um tempo de 24h, foi adicionado a célula 10μL de MTT (brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2 -il-2,5-difeniltetrazólio) e para o Alamar Blue 10 μL de Alamar Blue® (400 μg mL − 1 em solução salina de tampão fosfato, PBS). Adiante, as células foram incubadas por 4 h em uma incubadora de CO2 a 37 ° C. Usando um espectrofometro de microplaca Epoch tomômetro da BioTek Instruments Inc. (Winooski, VT, EUA) foi medido a absorbância de 570 nm para MTT; e 579 nm e 600 nm a absorbância para determinação de Alamar Blue.
Foram usadas como controle negativo durante o ensaio as células mantidas em meio de cultura DMEM (BARBOSAet al, 2020).
4.6 APOPTOSE POR CITOMETRIA DE FLUXO (ANEXINA-V/IODETO DE PROPÍDIO)
No ensaio de morte celular foram cultivadas células de B16-F10 (2x105 células/poço) em placas de 6 poços e expostas a 100μg/mL de chá verde e EGCG por 24 h células, as concentrações de 25μg/mL e 50μg/mL que inicialmente seriam realizadas foram excluídas devido aos resultados de viabilidade celular apresentarem resultados significativos principalmente na contração de 100μg/mL.
Em seguida, as células foram tripsinizadas, centrifugadas (800 x g, 4 ° C e 5 min), e lavado duas vezes com PBS. Depois disso as células foram então marcadas com anexina-V conjugada com Isotiocianato de fluoresceína (FITC) e iodeto de propídio, com as especificações do fabricante. Como controle negativo foi utilizado as células mantidas em meio de cultura DMEM ao longo do ensaio. Foi utilizado um citômetro de fluxo (FACSCanto II, BD Biosciences, Eugene, OR, USA) com o software FACSDiva ware, versão 6.1.2 (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, EUA) para a quantificação das porcentagens de células rotuladas. Os resultados foram avaliados usando o software FlowJo (FlowJo, Ashland, OR, EUA). (MELO-SILVEIRA et al., 2019).
4.7 APOPTOSE POR INCUBAÇÃO COM DAPI
Em lâminas circulares de 13 mm em uma placa de 24 poços (35,55 × 10⁴
células/poço) foi semeado a linhagem celular B16-F10 ficando 45 min a 37º C nessa condição. Em seguida, foi adicionado o meio DMEM suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) posteriormente colocadas em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2, até atingir um volume final de 1mL. Após 24h, o meio foi retirado e as células foram submetidas às amostras de chá verde e EGCG nas concentrações de 100μg/mL por 24h com meio sem soro, durante o experimento foi utilizado apenas a concentração de 100μg/mL em decorrência do resultado obtido na viabilidade celular em que não foi possível observar grandes efeitos nas contrações menores de 25μg/mL e 50μg/mL. Posteriormente as células foram tratadas com meio suplementado com óxido de cálcio (CaL) solubilizado a uma concentração de 100μg/mL (80,65nM), as células foram lavadas com tampão, em seguida foi utilizado paraformaldeído a 4% por 20 min para fixar e permeabilizadas com Triton a 0,1%
x-100 por volta de 20 min. Após isso foi usado o PBS para lavagem das células e foi realizada a incubação com DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindol) em uma concentração de 1mg/mL por 30 min, ficando longe da luz na temperatura ambiente. Para visualização das células foi utilizado um microscópio de fluorescência (microscópio de fluorescência OLYMPUS BX41) com o filtro de fluorescência 330–380 nm (RABELOet al, 2012).
4.8 PRODUÇÃO DE MELANINA
Para realização do teste de produção de melanina na presença do chá verde e EGCG foram cultivadas células B16-F-10 (5x10⁴ células/poço) em placas de 6 poços e envasado com DMEM (controle negativo) ou EGCG nas concentrações de (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) ou chá verde (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL).
Depois de 48h as células foram tripsinizadas com tripsina e centrifugadas (1600×g, 4°C, 5min). Com isso, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi duas vezes lavado com PBS. Após mais uma etapa de centrifugação as células foram lisadas com inclusão de 1M NaOH por 30 min como a finalidade de liberação das células de melanina contida. O valor de melanina liberada pelas células foi determinado pela absorbância medida em 475nm utilizando espectrofotômetro de microplaca Epoch da BioTek Instruments Inc. (Winooski, VT, EUA). Os valores obtidos da absorbância foram avaliados com uma curva padrão elaborada usando melanina sintética para comparação. Os resultados foram apresentados como porcentagem de melanina produzida em comparação às células que foram incubadas somente com DMEM (controle negativo) durante todo o experimento (BARBOSA et al, 2020).
4.9 FORMAÇÃO DO TUBO DE CÉLULAS ENDOTELIAIS DE MATRIGEL
Para estudar o potencial efeito antiangiogênico da EGCG e chá verde foram utilizadas placas de 24 poços, adicionado 200ul de uma preparação de membrana de base solubilizada (Matrigel) e foram deixadas a 37º C durante 16h para gelificação. Portanto, células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) (1,0 × 105) foram plaqueadas com meio F-12 contendo 10% de FBS. Quando as células
estiveram ligadas, F-12 meio com 10% de SBF, foi adicionado EGCG em diferentes concentrações (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL), chá verde (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) ou apenas foi adicionado meio (controle). Cada amostra foi realizada três vezes. Durante 24h as culturas ficaram a uma temperatura de 37º C em uma atmosfera umidificada com 2,5% de CO2. Um microscópio invertido com uma ampliação de 100 × foi utilizado para visualização da formação do tubo. Foi captada quatro imagens de forma aleatórias em áreas diferentes e contadas por dois observadores. O resultado das estruturas capilares obtidas no matrigel foram determinados e avaliados por software Image J (NIH, Bethesda, MD, EUA) (PALHARESet al, 2020).
4.10 INIBIÇÃO DA SECREÇÃO DE VEGF E IL-8
As células RAEC foram estimuladas com TNFα, os sobrenadantes da cultura foram coletados 48 h após a estimulação, centrifugado a 1000g por 10 min e armazenado a - 70 ° C. As células foram expostas às amostras de chá verde e EGCG (5μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL). Os valores de VEGF e IL-8 foram obtidos utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA; R&d Systems, Abingdon, UK) usando placas de microtitulação de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de VEGF e IL-8 foram calculados usando curvas padrão obtidas com VEGF recombinante humano (de 15,6 a 1000 pg/ml) e IL-8 recombinante humano (de 31,2 a 2000pg/ml), respectivamente. Todas as determinações foram realizadas em duplicado. Os resultados obtidos são expressos como picogramas por mililitro por 106 células (médias ± DP) e as diferenças analisadas usando o teste t estudo pareado (TROMPEZINSKI et al, 2003).
4.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão (DP). A análise de variância unidirecional (ANOVA) foi realizada pelo software GraphPad Prism 5. A comparação das médias foi realizada pelo teste de Tukey. As diferenças estatísticas foram consideradas significativas(p ≤ 0,05).
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 HEMOSTASIA PRIMÁRIA (AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA)
A figura 1, revela o efeito do chá verde e EGCG sobre agregação plaquetária utilizando diferentes indutores. Na figura 1A (AA), é possível visualizar que o composto de EGCG, na sua concentração mais alta (100μl/mL), obteve potencial significativo frente a diminuição da agregação plaquetária diminuindo cerca de 37%
quando comparado ao controle negativo, o chá verde, também na concentração de 100μg/mL, apresentou diminuição em média de 12%. No entanto a ação antiplaquetária da aspirina é significativamente maior frente ao extrato de Chá verde e ao composto EGCG em todas as concentrações e isso deve-se à acetilação irreversível da cicloxigenase, evitando a formação de tromboxane A2 (TXB 2) a partir da presença do AA, e assim, no final, diminuirá a mudança da glicoproteína IIbIIIa, elemento necessário para agregação plaquetária. Entretanto no Figura 1 (B, C, D) os extratos mostraram potencial redutor na agregação plaquetária induzida por três agonistas diferentes (ADP, Colágeno e Trombina, respectivamente), principalmente na presença da EGCG. Na figura 1 (B) a concentração de 100μl/mL da EGCG mostra redução de 87% da agregação plaquetária, com o extrato de chá verde (100μg/mL) revelou inibição por volta de 45%. Uma vez que o ADP presente no interior da plaqueta funciona como mensageiro químico que auxilia na indução da agregação irreversível. A figura 1 (C) evidencia um efeito significativo da EGCG (100μg/mL) reduzindo em cerca de 78% da agregação plaquetária; o chá verde (100μg/mL) apresenta diminuição por volta de 50%. Pode ser observado na figura 1 (D) redução da agregação em média 88% na concentração de 100μl/mL da EGCG e queda em média de 50% nas concentrações de 100μl/mL do chá verde.
FIGURA 1. Efeito sobre a Agregação plaquetária do chá verde e EGCG nas concentrações de 25, 50 e 100µg/mL. AA: Ácido Araquidônico (A); ADP: Adenosina Difosfato (B); Colágeno (C); Trombina (A).
Como controle positivo foi utilizado a Aspirina. Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey. * p < 0.05 em comparação com o grupo controle negativo. # <
0.05 em comparação entre as diferentes concentrações testadas. ª p <0.05 em comparação com o grupo controle positivo.
Efeito como esse é evidenciado no estudo Sinegre et al (2019) em que 100μM de epicatequina conseguiu reduzir os agonistas como a trombina e o colágeno, consequentemente a agregação plaquetária. Vale explicitar que a epicatequina, assim como a EGCG são fitonutrientes que derivam de grupos flavônicos, que são substâncias que atuam inibindo a agregação plaquetária. Quanto ao colágeno, também é observado ação antiplaquetária superior na concentração de 100μg/mL de EGCG, mas não é visualizado em concentrações de 25μg/mL e 50μg/mL ou mesmo em qualquer concentração do extrato de Chá verde em relação ao controle positivo. Na concentração de 100μg/mL de EGCG é possível inibir a agregação plaquetária, segundo Almatroodi et al, 2020 a EGCG é capaz de atenuar a formação de ROS e assim a TXB 2 o que diminuirá a agregação plaquetária por inibir o NADPH.
5.2 HEMOSTASIA SECUNDÁRIA (COAGULAÇÃO)
A tabela 1 representa os valores obtidos no teste Tempo de tromboplastina parcial ativada e o Tempo de protrombina na presença das diferentes concentrações (25μg/mL; 50μg/mL; 100μg/mL) de heparina, chá verde e EGCG. No resultado exposto na tabela 1 é evidenciado que o extrato de chá verde e do composto EGCG não atuam na hemostasia secundária, uma vez que os valores de TTPa e TP na presença dos compostos não apresentam diferença quando comparado com o controle.
TABELA 1. Potencial das amostras de chá verde e EGCG sobre a hemostasia secundária. Foi utilizado como controle positivo a heparina. Resultados obtidos em triplicata. Resultados foram expressos em Média ± Desvio Padrão.
Apesar do extrato de chá verde ser comprovadamente rico em metabólitos secundários (flavonoides, catequinas), como o que foi sugerido por Urzedo em 2020, estes exercerem atividade inibitória sobre a coagulação nesta via em específico, não houve resultados significativos no presente estudo. O mesmo ocorreu com o extrato predominante do chá verde, a EGCG. Resultados como esses obtidos eram esperados na análise do chá verde, uma vez que o chá verde é rico em vitamina K, que funciona como cofator no processo de ativação de proteínas envolvidas na ativação coagulação, como a protrombina. Então, dessa forma a presença dessa vitamina no chá verde poderia anular o possível efeito do chá verde como anticoagulante (FUSARO, 2017).
5.3 VIABILIDADE CELULAR (TESTE MTT E ALAMAR BLUE)
A figura 2 apresenta o teste de MTT e Alamar Blue na célula de melanoma (B16-F10), a partir da adição do extrato de Chá verde e o composto EGCG (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL). É possível observar que o EGCG, na concentração de 100µg/mL promoveu fortemente a morte das células de melanoma em cerca de 60% quando comparado ao controle negativo; já o extrato do chá verde apresentou um resultado menos significativo na redução das células de melanoma, uma vez que reduziu por volta de 25% na sua concentração mais alta (100μg/mL), quando comparado ao controle, como pode ser observado no gráfico 2.
FIGURA 2: Viabilidade celular (efeitos citotóxicos) do chá verde e EGCG sobre células de melanoma (B16-F10), analisado pelo método MTT e Alamar Blue. Meio de cultura celular DMEM foi utilizado como controle negativo de citotoxicidade. Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey. * p < 0.05 em comparação com o grupo controle negativo. # <
0.05 em comparação com as diferentes concentrações testadas..
Resultado semelhante, com concentrações mais baixas (<20µg/mL) atestaram não apresentam citotoxicidade significativas, em contrapartida, pode ser averiguado diminuição importante dos melanócitos e presença de morfologia alterada quando exposta a essa concentração no estudo de KIM, et al (2014). Na revisão realizada por Romano em 2021, foi sugerido a partir de pesquisas na literatura que a EGCG bloqueia a progressão do ciclo celular e modula as vias de sinalização que afetam a proliferação e diferenciação celular. Estudo realizado por
Almatroodi et al 2020 sugere que a EGCG desempenha um papel fundamental na proliferação celular uma vez que atua promovendo a apoptose.
5.4APOPTOSE POR CITOMETRIA DE FLUXO (CÉLULAS DE MELANOMA)
Na figura 3 é possível observar o experimento de apoptose das células de melanoma (B16-F10) na presença da cisplatina, chá verde, EGCG. Na figura, é evidenciado que o chá verde e EGCG não provocaram apoptose significativa nas células de melanoma, mostrando padrão de distribuição semelhante ao controle, em contrapartida, o uso da cisplatina, fármaco amplamente utilizado pelo seu efeito antineoplásico, demonstra grande aumento de granulosidade no quadrante 2. A falta de marcação de anexina ou iodeto de propídio dos grupos tratados com Chá verde e EGCG indica que citotoxicidade celular anteriormente observada no ensaio de MTT e Alamar Blue não está associada a ativação de processos na fase inicial de apoptose.
FIGURA 3. Potencial do chá verde e EGCG sobre apoptose por citometria de fluxo em células de melanoma (B16-F10). Como controle positivo foi utilizado a cisplatina.
Em contrapartida, o estudo realizado por Tang et al (2010) obteve um resultado distinto em que as células de condrossarcoma humano tratadas com 2-4µM de EGCG induziram apoptose tardia. Esse resultado é atribuído a altas concentrações de EGCG, o que não é observado no presente estudo. Além disso, Tang et al (2010) atribui a indução de apoptótica dos condrossarcomas a interação satisfatória entre a proteína Bcl-2, que desempenha papel no controle apoptótico, e o EGCG. Altas concentrações de Bcl-2 afetam a suscetibilidade de uma célula à indução de apoptose, alterando a proporção de promotores de morte para
supressores, fornecendo às células tumorais uma vantagem de sobrevivência e permitindo a expansão de células transformadoras que abrigam mutações em seu genoma.
5.5APOPTOSE POR INCUBAÇÃO COM DAPI (CÉLULAS DE MELANOMA)
Na figura 4 é observado apoptose por incubação de DAPI nas células de melanoma (B16-F10) suplementadas com chá verde e EGCG nas concentrações de 100μg/mL. A figura 3 está dividida em A e B que representam o controle negativo; C e D são referentes aos extratos de chá verde; no quadrado E e F está representado o resultado da EGCG. O que diferencia A de B; C de D; e E de F é a lente de aumento escolhida do microscópio. É possível observar na figura 4 (E, F) que na concentração máxima (100µg/mL) as células com EGCG coradas com o reagente DAPI demonstram estrutura nuclear fragmentada, condensadas e células com tamanhos diminuídos quando comparado ao grupo com extrato de chá verde, que também apresentou características semelhantes, mas em menor escala, e principalmente em relação ao grupo controle. Com isso, é sugerido que essas células morreram por apoptose tardia, uma vez que pode ser visualizada através da marcação por DAPI fragmentação nuclear, sendo sinal de apoptose tardia.
FIGURA 4. Efeito do chá verde e EGCG sobre a morte celular em células de melanoma (B16-F10) por apoptose de incubação por DAPI. Os resultados foram observados por microscópio de fluorescência com diferentes lentes de aumento. (A) e (B) controle nas ampliações de 50x e 100x no microscópio; (C) e (D) controle nas ampliações de 50x e 100x no microscópio; (E) e (F) controle nas ampliações de 50x e 100x no microscópio.
O mesmo ocorreu no estudo de Tang et al (2010) em que ao analisar a morfologia das células de condrossarcoma foi observado alterações morfológicas e estruturais. A coloração por DAPI foi realizada após o tratamento com a EGCG e chá verde em que ao ser concretizado foram examinadas as alterações morfológicas específicas nos núcleos com indução de apoptose. Então, a morte celular apoptótica induzida é constatada a partir de alterações morfológicas e estruturais, incluindo uma estrutura nuclear condensada, fragmentada e tamanho das células diminuídas.
Como observado, a EGCG demonstrou maior indução apoptótica na concentração máxima (100µg/mL) quando comparado às concentrações do extrato de chá verde. Qanungo, et al (2005) já sugeria, em seus estudos, que a EGCG iniciava o processo de morte através da parada do ciclo celular em uma fase anterior, bem com a oligomerização do regulador pró-apoptótico em células de câncer pancreático. E o autor no final do estudo sugere que processo de morte por
apoptose é desencadeada pela despolarização da membrana mitocondrial com posterior liberação do citocromo C para o citosol e ligação dos fosfolipídios da membrana interna com a externa, causando assim fragmentação celular, morte celular. Portanto, não se contrapondo com eficácia da EGCG frente a coloração por DAPI do presente estudo.
5.6 PRODUÇÃO DE MELANINA (CÉLULAS DE MELANOMA)
Na figura 5 é demonstrado o efeito do chá verde e EGCG na produção de melanina nas células de melanoma. Na Figura, é possível notar uma diminuição significativa na produção de melanina depois da adição da EGCG e chá verde nas concentrações de 100µg/mL. Essa redução na produção de melanina na presença do chá verde e EGCG chegou a cerca de 15% e 20%, respectivamente, em comparação com o controle, o que releva ação sobre a diminuição de melanina e . O que revela um efeito leve sobre a inibição da produção de melanina. É possível perceber que o resultado é dose dependente e que as amostras podem reduzir ainda mais a produção de melanina em concentrações superiores às utilizadas no presente estudo.
FIGURA 5. Potencial do chá verde e EGCG na produção de melanina em células de melanoma (B16-F10). Meio de cultura DMEM foi utilizado como controle negativo. Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey. * p < 0.05 em comparação com o grupo controle negativo. # p < 0.05 em comparação com as diferentes concentrações testadas..
O estudo de Kim et al (2004) constatou, ao estudar a melanogênese, a eficácia dos tratamentos com EGCG já que em relação ao controle positivo (ácido kójico) obteve melhor resultado na diminuição da síntese de melanina e ainda demonstrou o resultado combinado com outros compostos e assim como a EGCG age positivamente em sinergia. IM et al (2019) também apresentou resultados correlatos ao utilizar a 2mg/Ml de EGCG como controle positivo frente aos seus extratos de Phellinus vaninii e ainda sim a eficácia da EGCG foi significativamente maior. No estudo realizado por Zhang et al em 2020 foi avaliado e comparado os efeitos inibitórios das catequinas mais presentes no chá verde, galocatequina-3-galato (GCG), epigalocatequina-3-galato (EGCG) e epicatequina-3-galato (ECG), na melanogênese em células de melanoma B16F10;
ao final do estudo foi observado que catequinas do chá suprimiram significativamente a síntese de melanina em células B16F10, além disso, os efeitos inibitórios foram mais potentes que os da arbutina, que é conhecido por ser um agente despigmentante; ademais, a regulação de melanogênese nas células de
melanoma ocorreu por meio da via cAMP/CREB/MITF.
5.7ANGIOGÊNESE (CÉLULAS ENDOTELIAIS E MELANOMA)
No Figura 6 pode-se observar a viabilidade celular em células endoteliais (RAEC) na presença do chá verde e EGCG. Na figura é evidenciado que o chá verde e EGCG, nas diferentes concentrações (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) não provocaram morte celular nas células endoteliais saudáveis, não sendo tóxicas nessas concentrações testadas.
FIGURA 6. Viabilidade celular (efeitos citotóxicos) do chá verde e EGCG sobre células endoteliais (RAEC), analisado pelo método MTT e Alamar Blue. Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey.
Nas figuras 7 e 8 pode ser observado o efeito do chá verde e EGCG na formação de capilares nas células endoteliais. As células endoteliais são capazes de se organizarem e conectarem às redes e formar capilares nos estágios finais da angiogênese. No câncer, processo de angiogênese é fundamental para o crescimento e metástase de tumores primários. As figuras 7 e 8, logo abaixo, evidenciam os níveis angiogênicos, antes (controle negativo) e após adição do extrato de chá verde e do composto EGCG nas diferentes concentrações (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL). É observado a redução das estruturas tubulares dessas
células, principalmente na maior concentração da EGCG (100μg/mL). O tratamento com chá verde e EGCG induziu uma diminuição do número de estruturas capilares, demonstrando seu potente efeito inibitório na formação de novos vasos.
FIGURA 7. Potencial antiangiogênico do chá verde e EGCG sobre células endoteliais (RAEC), Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey. * p < 0.05 em comparação com o grupo controle negativo. # p < 0.05 em comparação com as diferentes concentrações testadas.
FIGURA 8. Potencial antiangiogênico do extrato do chá verde e EGCG nas diferentes concentrações.
O resultado das estruturas capilares obtidas no matrigel foram determinados e avaliados por software Image J.
Como pode ser observado na figura 7 e 8, o extrato de EGCG na concentração de 100μg/mL se sobressaiu diminuindo significativamente a angiogênese em média de 100% quando comparado ao controle negativo. Sendo esse um resultado excelente uma vez que inibir o processo de angiogênese que é um ponto forte no tratamento do câncer, inibindo o suprimento de sangue do tumor.
Como descrito por Almatroodi et al(2020) esse resultado na presença mecanismos moleculares que se ligam a uma ou mais proteínas alvo interferindo em fatores de transcrição, fatores de crescimento, receptores intermembranares, cinases, e essas ações inibem sinalização e vias metabólicas essenciais para o desenvolvimento tumoral.
5.8 INIBIÇÃO DA SECREÇÃO DE VEGF (CÉLULAS ENDOTELIAIS)
Logo abaixo, na figura 9 é observado o efeito do extrato do chá verde e da EGCG sobre a inibição da secreção de VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) em células endoteliais estimuladas com TNFα. Os resultados expostos na figura 9 demonstram que as amostras estudadas obtiveram desempenhos significativos, na diminuição da secreção de VEGF quando comparado com o
controle. O melhor resultado foi a EGCG na concentração de 100µg/mL e 50µg nas células estimuladas com TNFα, reduzindo a secreção de VEGF em cerca de 60% e 50% respectivamente, quando comparado ao controle; Os resultados obtidos com os extratos do chá verde mostram um valor bastante positivo em relação ao controle negativo estimulado com TNFα, nas concentrações de 100µg/mL e 50µg/mL o chá verde evidencia uma redução em aproximadamente 40% revelando assim valores satisfatórios na inibição da secreção de VEGF.
FIGURA 9. Potencial de inibição de secreção de VEGF frente aos extratos de EGCG e chá verde.
Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey. * p < 0.05 em comparação com o grupo controle negativo. # p < 0.05 em comparação com as diferentes concentrações testadas.
O Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) é uma proteína que funciona como sinalizadora para o crescimento de novos vasos sanguíneos, extremamente importante ao longo da vida para o organismo humano, possui diversas funções biológicas que incluem a regulação do desenvolvimento vascular embrionário, remodelação da matriz extracelular, geração de citocinas inflamatórias e aumento da permeabilidade vascular. Durante o processo de formação de tumores, a VEGF está envolvida diretamente no processo de angiogênese, por isso os valores estarão aumentados nas neoplasias, sendo assim o VEGF é um fator
determinante no crescimento do tumor e possíveis processos de metástases.
O efeito do chá verde e da EGCG obtido no experimento evidenciam um efeito extremamente positivo, principalmente, com a EGCG (100µg/mL); em paralelo, os valores do chá verde também apresentam resultados significativos na redução dos níveis de secreção da VEGF. A fim de observar os efeitos do composto EGCG sobre a secreção de VEGF, um estudo de Trompezinski et al (2003), demonstrou que EGCG nas concentrações de 10µMe 5µMinduziu uma diminuição dose dependente na secreção de VEGF em cerca de 88% e 63% respectivamente quando comparado ao controle, diminuindo dessa forma o processo de angiogênese tumoral. Sobre os resultados do chá verde as concentrações de 0,05% e 0,01% os resultados expressam cerca de 50% e 45% de diminuição da secreção de VEGF. Outro estudo realizado por Ghoshet al (2009) relatou que o chá verde inibe a expressão de VEGF e reduz, em parte, a fosforilação dos seus receptores. Além disso, uma revisão da literatura realizada por Rashidi et al (2017) destaca que o chá verde pode ter efeitos preventivos no processo da angiogênese tumoral e metástase, uma vez que causa redução de expressão de receptores VEGF. Tornando evidente o efeito positivo do composto EGCG e do extrato de chá verde atuando fortemente na regulação da produção de VEGF.
5.9 INIBIÇÃO DA SECREÇÃO DE IL-8 (CÉLULAS ENDOTELIAIS)
Pode-se observar na figura 10, o efeito do chá verde e EGCG na inibição de secreção de IL-8 em células endoteliais estimuladas por TNFα. Os valores extraídos evidenciam a EGCG, principalmente nas concentrações de 50µg/mL e 100µg/mL, apresentaram resultados bastante significativos, reduzindo por volta de 75% e 46%
respectivamente. Por outro lado, os extratos de chá verde obtiveram na concentração mais alta (100µg) cerca de 25% da inibição dos valores de IL-8 em relação ao controle.
FIGURA 9. Potencial de inibição de secreção de IL-8 frente aos extratos de EGCG e chá verde.
Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey. * p < 0.05 em comparação com o grupo controle negativo. # p < 0.05 em comparação com as diferentes concentrações testadas.
A IL -8 é uma citocina autócrina multifuncional que pode desempenhar proliferação celular, migração por indução de enzimas de degradação da matriz extracelular e induz a neovascularização, sendo todos processos fundamentais para crescimento e metástase do melanoma. Resultados como esses foram descritos por Trompezinski et al (2003), o experimento com queratinócitos estimulados com a citocina pró-inflamatória TNFα revelou que os extratos EGCG nas concentrações mais altas de 10µM e 5µM reduziram de os níveis de IL-8 em aproximadamente 98% e 93% respectivamente de uma forma dose dependente; os extratos de chá verde, na concentração mais alta de 0,05%, apresentaram redução em cerca de 90% na inibição de IL-8. Dessa forma, é evidenciado que a ação do chá verde e EGCG sobre a inibição na secreção de IL-8 é dose dependente.
O extrato de chá verde e o composto de EGCG mostraram efeitos sobre a homeostasia primária através da agregação plaquetária; evidenciaram potencial antitumoral levando a células à morte; e ação antiangiogênica na formação de novos
vasos sanguíneos. Na maioria dos testes foi observado um efeito dose dependente.
6 CONCLUSÕES
Durante o estudo foi observado que o extrato de chá verde e o composto EGCG obtiveram resultados significativos na homeostasia primária atuando sobre a agregação plaquetária, e apresentando alto desempenho mesmo quando comparado a aspirina, fármaco amplamente utilizado na clínica. Além disso, os compostos exibiram importantes efeitos antitumorais nas células de melanoma, causando apoptose quando incubadas com DAPI. Ademais, no tocante da angiogênese os resultados foram positivos evidenciando um potente efeito antiangiogênico nas células de melanoma. Na produção de VEGF e IL-8 o chá verde e a EGCG mostram uma forte inibição na secreção dessas substâncias. Portanto, os resultados experimentais do chá verde e EGCG são promissores; entretanto, são necessários mais estudos para esclarecer o mecanismo de ação desses produtos na coagulação, morte celular e angiogênese. Com isso, será possível ofertar mais opções de terapias e maior qualidade de vida para os pacientes oncológicos.
REFERÊNCIA
AHMED, B.; QADIR, M. I.; GHAFOOR, S. Malignant Melanoma: skin cancer-diagnosis, prevention, and treatment. Begell House, v. 30, n. 4, p. 291-297, 2020.
ALMATROODI, S. A.; ALMATROUDI, A.; KHAN, A. A.; ALHUMAYDHI, F. A.;
ALSAHLI, M. A.; RAHMANI, A. H. Potential Therapeutic Targets of Epigallocatechin Gallate (EGCG), the Most Abundant Catechin in Green Tea, and Its Role in the Therapy of Various Types of Cancer. MDPI AG. v. 25, n. 14, p. 3146, 2020.
BARBOSA, J. da S.; PALHARES, L. C. G. F.; SILVA, C. H. F.; SABRY, D. A.;
CHAVANTE, S. F.; ROCHA, H. A. O. In Vitro Antitumor Potential of Sulfated Polysaccharides from Seaweed Caulerpa cupressoides var. flabellata. Marine Biotechnology, v. 23, n. 1, p. 77-89, 2020.
BUYEL, J.F. Plants as sources of natural and recombinant anti-cancer agents.
Biotechnology Advances, v. 36, n. 2, p. 506-520, 2018.
COLALTO, C. What phytotherapy needs: evidence-based guidelines for better clinical practice.Phytotherapy Research, v. 32, n. 3, p. 413-425, 2017.
DRAGANI, T. A.; MATARESE, V.; COLOMBO, F. Biomarkers for Early Cancer Diagnosis: prospects for success through the lens of tumor genetics. Bioessays, v.
42, n. 4, p. 190, abr. 2020.
FERNANDES, C. J. et al. Cancer-associated thrombosis: the when, how and why.
European Respiratory Review, v. 28, n. 151, p. 180119, 27 mar. 2019.
FUJIKI, H.; WATANABE1, T.; SUEOKA, E.; RAWANGKAN, A.; SUGANUMA, M.
Cancer Prevention with Green Tea and Its Principal Constituent, EGCG: from Early Investigations to Current Focus on Human Cancer Stem Cells. Molecules And Cells, v. 2, n. 41, p. 73-82, 2018.
FUSARO, M. et al. Vitamin K plasma levels determination in human health. Clinical Chemistry And Laboratory Medicine, [S.L.], v. 55, n. 6, p. 789-799, 1 jun. 2017. Walter de Gruyter GmbH.
GHOSH, A. K.; KAY, N. E.; SECRETO, C. R.; SHANAFELT, T. D. Curcumin Inhibits Prosurvival Pathways in Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells and May Overcome Their Stromal Protection in Combination with EGCG. Clinical Cancer Research, v. 15, n. 4, p. 1250-1258, 2009.
HAUSMAN, D. M.. What Is Cancer? Perspectives In Biology And Medicine, v. 62, n. 4, p. 778-784, 2019.
HORSTED, F.; WEST, J.; GRAINGE, M. J.. Risk of Venous Thromboembolism in Patients with Cancer: a systematic review and meta-analysis. Plos Medicine, v. 9, n.
7, p. 1001275, 2012.
IM, K. H. et al. Antioxidant, anti-melanogenic and anti-wrinkle effects of Phellinus vaninii.Mycobiology, v. 47, n. 4, p. 494-505, 2019.
KIM, J. H.; LEE, J.; KANG, S.; MOON, H.; CHUNG, K. H.; KIM, K. R. Antiplatelet and Antithrombotic Effects of the Extract of Lindera obtusiloba Leaves. Biomolecules &
Therapeutics, [S.L.], v. 24, n. 6, p. 659-664, 2016.
KIM H.S; QUON M.J; KIM J. New insights into the mechanisms of polyphenols beyond antioxidant properties; lessons from green tea polyphenols, epigallocatechin-3-gallate.Redox Biology, n. 2, p. 187-195, 2014
KIM, D. S. et al. (−)-Epigallocatechin-3-gallate and hinokitiol reduce melanin synthesis via decreased MITF production. Archives of pharmacal research, v. 27, n. 3, p. 334-339, 2004.
LUZ, J. R. D. et al. Thrombin Inhibition: Preliminary Assessment of the Anticoagulant Potential of Turnera subulata (Passifloraceae). Journal of Medicinal Food. 1-9, 2019.
MELO-SILVEIRA, R. F. M. et al. O. Antiproliferative xylan from corn cobs induces apoptosis in tumor cells.Carbohydrate Polymers, v. 210, p. 245-253, 2019.
MOKHTARI, R. B. et al. Combination therapy in combating cancer.Oncotarget,v. 8, n. 23, p. 38022-30043, 2017. Canadá, 2017.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE (OMS). Paho: org, 2020. Tópico: câncer.
Disponível em: https://www.paho.org/pt/topicos/cancer. Acesso em: 03 de jun. de 2021.
PAVRI, S. N.; CLUNE, J.; ARIYAN, S.; NARAYAN, D. Malignant Melanoma. Plastic And Reconstructive Surgery, v. 138, n. 2, p. 330-340, 2016.
PANT, B. Application of Plant Cell and Tissue Culture for the Production of Phytochemicals in Medicinal Plants. Advances In Experimental Medicine And Biology, p. 25-39, 2014.
PALHARES, L. C.G.F. et al... In vitro antitumor and anti-angiogenic activities of a shrimp chondroitin sulfate.International Journal Of Biological Macromolecules, v.
162, p. 1153-1165, 2020.
PRETTI, M. A. M.; BERNARDES, S. S; CRUZ, J. G. V.; BORONI, M.; POSSIK, P. A.;
Extracellular vesicle-mediated crosstalk between melanoma and the immune system:
Impact on tumor progression and therapy response. Brazil, 2020.
