Angiogênese (células endoteliais)

No Figura 6 pode-se observar a viabilidade celular em células endoteliais (RAEC) na presença do chá verde e EGCG. Na figura é evidenciado que o chá verde e EGCG, nas diferentes concentrações (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL) não provocaram morte celular nas células endoteliais saudáveis, não sendo tóxicas nessas concentrações testadas.

FIGURA 6. Viabilidade celular (efeitos citotóxicos) do chá verde e EGCG sobre células endoteliais (RAEC), analisado pelo método MTT e Alamar Blue. Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey.

Nas figuras 7 e 8 pode ser observado o efeito do chá verde e EGCG na formação de capilares nas células endoteliais. As células endoteliais são capazes de se organizarem e conectarem às redes e formar capilares nos estágios finais da angiogênese. No câncer, processo de angiogênese é fundamental para o crescimento e metástase de tumores primários. As figuras 7 e 8, logo abaixo, evidenciam os níveis angiogênicos, antes (controle negativo) e após adição do extrato de chá verde e do composto EGCG nas diferentes concentrações (25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL). É observado a redução das estruturas tubulares dessas

células, principalmente na maior concentração da EGCG (100μg/mL). O tratamento com chá verde e EGCG induziu uma diminuição do número de estruturas capilares, demonstrando seu potente efeito inibitório na formação de novos vasos.

FIGURA 7. Potencial antiangiogênico do chá verde e EGCG sobre células endoteliais (RAEC), Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey. * p < 0.05 em comparação com o grupo controle negativo. # p < 0.05 em comparação com as diferentes concentrações testadas.

FIGURA 8. Potencial antiangiogênico do extrato do chá verde e EGCG nas diferentes concentrações.

O resultado das estruturas capilares obtidas no matrigel foram determinados e avaliados por software Image J.

Como pode ser observado na figura 7 e 8, o extrato de EGCG na concentração de 100μg/mL se sobressaiu diminuindo significativamente a angiogênese em média de 100% quando comparado ao controle negativo. Sendo esse um resultado excelente uma vez que inibir o processo de angiogênese que é um ponto forte no tratamento do câncer, inibindo o suprimento de sangue do tumor.

Como descrito por Almatroodi et al(2020) esse resultado na presença mecanismos moleculares que se ligam a uma ou mais proteínas alvo interferindo em fatores de transcrição, fatores de crescimento, receptores intermembranares, cinases, e essas ações inibem sinalização e vias metabólicas essenciais para o desenvolvimento tumoral.

5.8 INIBIÇÃO DA SECREÇÃO DE VEGF (CÉLULAS ENDOTELIAIS)

Logo abaixo, na figura 9 é observado o efeito do extrato do chá verde e da EGCG sobre a inibição da secreção de VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) em células endoteliais estimuladas com TNFα. Os resultados expostos na figura 9 demonstram que as amostras estudadas obtiveram desempenhos significativos, na diminuição da secreção de VEGF quando comparado com o

controle. O melhor resultado foi a EGCG na concentração de 100µg/mL e 50µg nas células estimuladas com TNFα, reduzindo a secreção de VEGF em cerca de 60% e 50% respectivamente, quando comparado ao controle; Os resultados obtidos com os extratos do chá verde mostram um valor bastante positivo em relação ao controle negativo estimulado com TNFα, nas concentrações de 100µg/mL e 50µg/mL o chá verde evidencia uma redução em aproximadamente 40% revelando assim valores satisfatórios na inibição da secreção de VEGF.

FIGURA 9. Potencial de inibição de secreção de VEGF frente aos extratos de EGCG e chá verde.

Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey. * p < 0.05 em comparação com o grupo controle negativo. # p < 0.05 em comparação com as diferentes concentrações testadas.

O Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) é uma proteína que funciona como sinalizadora para o crescimento de novos vasos sanguíneos, extremamente importante ao longo da vida para o organismo humano, possui diversas funções biológicas que incluem a regulação do desenvolvimento vascular embrionário, remodelação da matriz extracelular, geração de citocinas inflamatórias e aumento da permeabilidade vascular. Durante o processo de formação de tumores, a VEGF está envolvida diretamente no processo de angiogênese, por isso os valores estarão aumentados nas neoplasias, sendo assim o VEGF é um fator

determinante no crescimento do tumor e possíveis processos de metástases.

O efeito do chá verde e da EGCG obtido no experimento evidenciam um efeito extremamente positivo, principalmente, com a EGCG (100µg/mL); em paralelo, os valores do chá verde também apresentam resultados significativos na redução dos níveis de secreção da VEGF. A fim de observar os efeitos do composto EGCG sobre a secreção de VEGF, um estudo de Trompezinski et al (2003), demonstrou que EGCG nas concentrações de 10µMe 5µMinduziu uma diminuição dose dependente na secreção de VEGF em cerca de 88% e 63% respectivamente quando comparado ao controle, diminuindo dessa forma o processo de angiogênese tumoral. Sobre os resultados do chá verde as concentrações de 0,05% e 0,01% os resultados expressam cerca de 50% e 45% de diminuição da secreção de VEGF. Outro estudo realizado por Ghoshet al (2009) relatou que o chá verde inibe a expressão de VEGF e reduz, em parte, a fosforilação dos seus receptores. Além disso, uma revisão da literatura realizada por Rashidi et al (2017) destaca que o chá verde pode ter efeitos preventivos no processo da angiogênese tumoral e metástase, uma vez que causa redução de expressão de receptores VEGF. Tornando evidente o efeito positivo do composto EGCG e do extrato de chá verde atuando fortemente na regulação da produção de VEGF.

5.9 INIBIÇÃO DA SECREÇÃO DE IL-8 (CÉLULAS ENDOTELIAIS)

Pode-se observar na figura 10, o efeito do chá verde e EGCG na inibição de secreção de IL-8 em células endoteliais estimuladas por TNFα. Os valores extraídos evidenciam a EGCG, principalmente nas concentrações de 50µg/mL e 100µg/mL, apresentaram resultados bastante significativos, reduzindo por volta de 75% e 46%

respectivamente. Por outro lado, os extratos de chá verde obtiveram na concentração mais alta (100µg) cerca de 25% da inibição dos valores de IL-8 em relação ao controle.

FIGURA 9. Potencial de inibição de secreção de IL-8 frente aos extratos de EGCG e chá verde.

Comparações entre os grupos foram analisadas por ANOVA e pelo pós-teste de Tukey. * p < 0.05 em comparação com o grupo controle negativo. # p < 0.05 em comparação com as diferentes concentrações testadas.

A IL -8 é uma citocina autócrina multifuncional que pode desempenhar proliferação celular, migração por indução de enzimas de degradação da matriz extracelular e induz a neovascularização, sendo todos processos fundamentais para crescimento e metástase do melanoma. Resultados como esses foram descritos por Trompezinski et al (2003), o experimento com queratinócitos estimulados com a citocina pró-inflamatória TNFα revelou que os extratos EGCG nas concentrações mais altas de 10µM e 5µM reduziram de os níveis de IL-8 em aproximadamente 98% e 93% respectivamente de uma forma dose dependente; os extratos de chá verde, na concentração mais alta de 0,05%, apresentaram redução em cerca de 90% na inibição de IL-8. Dessa forma, é evidenciado que a ação do chá verde e EGCG sobre a inibição na secreção de IL-8 é dose dependente.

O extrato de chá verde e o composto de EGCG mostraram efeitos sobre a homeostasia primária através da agregação plaquetária; evidenciaram potencial antitumoral levando a células à morte; e ação antiangiogênica na formação de novos

vasos sanguíneos. Na maioria dos testes foi observado um efeito dose dependente.

6 CONCLUSÕES

Durante o estudo foi observado que o extrato de chá verde e o composto EGCG obtiveram resultados significativos na homeostasia primária atuando sobre a agregação plaquetária, e apresentando alto desempenho mesmo quando comparado a aspirina, fármaco amplamente utilizado na clínica. Além disso, os compostos exibiram importantes efeitos antitumorais nas células de melanoma, causando apoptose quando incubadas com DAPI. Ademais, no tocante da angiogênese os resultados foram positivos evidenciando um potente efeito antiangiogênico nas células de melanoma. Na produção de VEGF e IL-8 o chá verde e a EGCG mostram uma forte inibição na secreção dessas substâncias. Portanto, os resultados experimentais do chá verde e EGCG são promissores; entretanto, são necessários mais estudos para esclarecer o mecanismo de ação desses produtos na coagulação, morte celular e angiogênese. Com isso, será possível ofertar mais opções de terapias e maior qualidade de vida para os pacientes oncológicos.

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ANEXO A

ANEXO B