Revisado pela Orientadora Professora Doutora Elisângela de Paula Silveira-Lacerda
Estudo de atividade citotóxica e inibição do ciclo celular de novos compostos a base de ouro.
Paula Roberta NUNES1, Elisângela de Paula SILVEIRA-LACERDA1. Hellen Karine Paes PORTO1, Flávia de Castro PEREIRA1
1
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia, Goiás, Brasil;
*e-mail: silveiralacerda@gmail.com
1.0. Introdução
Complexos de metais de transição têm sido o principal foco de vários grupos de pesquisa, devido ao seu potencial terapêutico e a ação biológica1,2. Complexos a base de ouro vem sendo utilizados há muitas décadas para o tratamento de artrite reumatóide, atividade antitumoral, atividade anti-HIV, malária e bronquite asmática3,4,5,6,7,8,9.
A auranofina é uma droga utilizada para a terapia artrite reumatóide desde os anos 7010. Na década de 80 observaram que a auranofina aumentou o período de vida de ratos portadores de leucemia P388 em comparação com a cisplatina11,12. Testes citotóxicos in vitro com complexos de ouro foram realizados frentes a linhagens murinas P815, B16 e P388 visando encontrar compostos com valores de IC50 que pudessem ser comparados com os resultados de compostos a base de
cisplatina13.
As fluoroquinolonas são uma importante classe de antibióticos sintéticos com ação contra bactérias Gram-positiva e Gram-negativa14. A complexação de metais as fluoroquinolonas aumenta suas atividades biológicas15. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade citotóxica e apoptótica dos complexos de Au(III) ligado a fluoroquinolonas frente as linhagens de células tumorais e normais.
2.0. Material e Métodos
2.1. Linhagens celulares e manutenção do cultivo celular
Utilizou-se as linhagens tumorais estabelecidas A20 (Linfoma murino), B16-F10 (Melanoma murino), K562 (Leucemia mielóide humana) e como células normais (controle), utilizou a linhagem estabelecida MCR-5 (fibroblasto de pulmão humano) e L919 (Fibroblasto de pulmão murino). As linhagens celulares foram mantidas em cultura a 37ºC, 5% CO2 em meio RPMI 1640 ou DMEM suplementado com 10% de
soro fetal bovino e antibióticos segundo protocolo estabelecido pela American Type
2.2. Ensaio de viabilidade celular por Ensaio de MTT
As células foram semeadas em placas de 96 poços. No dia seguinte, concentrações crescentes (0,2 a 200µM) de drogas foram adicionadas, incubando-se a incubando-seguir por 48 horas em incubadora com 5% de CO2 e a 37ºC. Ao final do
período adiciona-se a solução de MTT, deixando-se em incubação por 5 horas, para metabolização do reagente. A solubilização do reagente formazan foi feita com SDS. A quantificação de densidade óptica (DO) foi medida por espectrofotômetro O valor de IC50 foi determinada por meio da curva dose resposta utilizando o programa
estatístico GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
2.2. Citometria de fluxo: Avaliação das fases do ciclo celular.
Células tratadas e células controle mantidas em cultura líquida foram lavadas com tampão PBS com EDTA e fixadas em 1% de etanol gelado a 70%, sendo posteriormente tratadas com RNAse por 30 minutos e em seguida coradas com 5µg/mL de solução corante de iodeto de propídeo. Após o período de incubação, a intensidade da fluorescência foi determinada através de citometria de fluxo quantitativa, utilizando o Citômetro de Fluxo FACS Callibur (Becton Dickinson®, San José, CA).
2.4. Eletroforese em gel de Agarose
Para o ensaio de extração de DNA em gel de agarose as células de linhagens tumorais e normais foram incubadas com diferentes concentrações dos compostos em estudo por 48 h, incubados na estufa com 5% de CO2 e a 37ºC. As células
foram retiradas do tratamento e centrifugadas e lavadas com PBS seguindo o protocolo de Sambrook, 2001. O DNA foi transferido para um gel de agarose, que foi submetido a eletroforese. O DNA foi visualizado através de transiluminação por ultravioleta, após a coloração por brometo de etídio utilizando um sistema de imageamento Omega® (UltraLum Inc. Claremont, CA, EUA).
2.5. Análise estatística
Para comparação entre os grupos tratados e controle foi utilizado Anova segundo um único critério e pós-teste Dunnet’s (software GraphPad Prism V4). Como grau de significância de 95% (p<0.05).
3.0. Resultados
3.1. Ensaio de viabilidade celular por de MTT
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apresentou uma IC50 de 181µM frente à linhagem sadia L919 e 52,8µM para a
linhagem sadia MRC-5 e para a linhagem B16-F10 a IC50 foi de 28,8µM, ou seja,
quase duas vezes menor que a da MRC-5. Para as linhagens K562 e A20, a IC50 foi
de 50 e 48,9µM, respectivamente. Esses valores encontrados não foram estatisticamente significativos quando comparados com a linhagem sadia MRC-5, no entanto para a linhagem L919 a IC50 foi estatisticamente significativa, visto que elas
são três vezes menor que o da linhagem sadia como pode ser observado na tabela 1. O AuN apresentou uma IC50 de 79,2 µM para linhagem sadia L919 e IC50 de
65,1µM para MRC-5. As linhagens B16-F10 e A20 apresentaram uma IC50 de 26,6 e
24,9µM, respectivamente, menor que metade da concentração inibitória da linhagem MRC-5 e L919. Para a linhagem K562 a IC50 foi de 55µM. O composto AuS
apresentou uma IC50 104µM para a linhagem sadia MRC-5 e um IC50 de 65,1µM
para a linhagem L919. Já para as linhagens tumorais o composto apresentou uma maior atividade inibitória frente às linhagens B16-F10 e A20 cuja IC50 são 45 e
48,3µM, respectivamente. Testes feitos com os ligantes isolados mostraram que eles não apresentaram atividade significativa (>200 µM), mostrando que a ação deles é intensificada na presença do ouro.
Tabela 1 – Concentrações inibitória (IC50) dos compostos de ouro frente a linhagens tumorais e sadia.
Complexos IC50 (µM) MRC-5 L919 B16-F10 A20 K562 Au Levo 52,8 181 28,8 48,9 50 Au Nor 65,1 79,2 26,6 24,9 55 Au Spar 104 65,1 45 48,3 61,2 3.2. Ciclo celular
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concentrações, (1) Lader , (2) Controle negativo, (3) AuS 30µM, (4) AuS 45µM e (5) AuS 100µM.
4.0. Conclusão
Nesse estudo, dentre os compostos estudados, o composto AuS demonstrou uma melhor atividade citotóxica frente às células tumorais e sadia e capacidade de parada no ciclo celular na fase G1 frente a linhagem tumoral B16-F10. No entanto, o composto não demonstrou padrão de banda para apoptose no teste de eletroforese em gel de agarose para a célula B16-F10, mostrando-se a necessidade de outros testes para a comprovação do mecanismo de morte celular.
5.0. Referências Bibliográficas
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