UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
PROGRAMA MULTI-INSTITUCIONAL DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA- PPGBIOTEC
LABORATÓRIO DE IMUNOQUÍMICA
POTENCIAL ANTIBACTERIANO E CITOTÓXICO DOS VENENOS
VARIEDADES ‘AMARELA’ E ‘BRANCA’ DA SERPENTE
AMAZÔNICA Crotalus durissus ruruima
ILIA GILMARA CARVALHO DOS SANTOS
ILIA GILMARA CARVALHO DOS SANTOS
POTENCIAL ANTIBACTERIANO E CITOTÓXICO DOS VENENOS
VARIEDADES “AMARELA” E “BRANCA” DA SERPENTE
AMAZÔNICA Crotalus durissus ruruima.
Orientadora: Professora Doutora Maria Cristina dos Santos Coorientadora: Professora Doutora Consuelo Latorre Fortes Dias
Tese apresentada ao Programa Multi-institucional de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutora em
Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia para Saúde
S237p Potencial antibacteriano e citotóxico dos venenos variedades 'amarela' e 'branca' da serpente amazônica Crotalus durissus ruruima / Ilia Gilmara Carvalho dos Santos. 2017
84 f.: il. color; 31 cm.
Orientadora: Maria Cristina dos Santos Coorientadora: Consuelo Latorre Fortes Dias
Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas.
1. Venenos de serpentes. 2. venenos amarelos e brancos . 3. fosfolipase A2. 4. citotoxicidade. I. Santos, Maria Cristina dos II. Universidade Federal do Amazonas III. Título
POTENCIAL ANTIBACTERIANO E CITOTÓXICO DOS VENENOS
VARIEDADES
“AMARELA”
E
“BRANCA”
DA
SERPENTE
AMAZÔNICA Crotalus durissus ruruima.
Tese apresentada aos Membros da banca Examinadora, abaixo constituída, conforme Portaria de número 07/2017, emitida pelo Programa Multi-institucional de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, como requisito necessário para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia:
COMISSÃO JULGADORA:
____________________________________________________
Professora Doutora Maria Cristina dos SantosUniversidade Federal do Amazonas - UFAM Presidente da banca
____________________________________________________
Professor Doutor Andreimar Martins SoaresFundação Oswaldo Cruz (Unidade de Rondônia - RO) Membro da banca
____________________________________________________
Professor Doutor Oscar Tadeu Ferreira da CostaUniversidade Federal do Amazonas - UFAM Membro da banca
____________________________________________________
Professora Doutora Marne Carvalho de VasconcellosUniversidade Federal do Amazonas - UFAM Membro da banca
____________________________________________________
Professor Doutor Luis Andre Morais MariubaDedico:
❖ A minha mãe Juraci Carvalho dos Santos (in memorian) por me ensinar desde criança que o conhecimento é libertador.
❖ Ao meu querido pai Jamil Feitosa dos Santos grande incentivador da minha vida acadêmica, pelo seu amor incondicional, carinho, apoio e incentivo em todas as fases da minha vida. Por jamais medir esforços para que eu atingisse meus objetivos mesmo nas condições mais adversas. Te amo pai...
❖ A minha mãe de coração Adriana Almeida Lima pelas lições de força e determinação que foram muito úteis para que eu pudesse chegar até aqui.
❖ Aos meus irmãos de sangue e alma Roberto, Carlos e Gilberto, por serem essenciais na minha vida, pelo companheirismo e por tornar minha vida mais leve e feliz.
Agradecimentos
À minha orientadora, Professora Doutora Maria Cristina dos Santos, por ter me acolhido e por todo conhecimento compartilhado, pela paciência e prazer em ensinar, e por toda ajuda concedida nos momentos em que precisei. Muito obrigada pela amizade!
À minha coorientadora, Doutora Consuelo Latorre Fortes Dias. Pelas oportunidades concedidas e pela valiosa ajuda no fracionamento dos venenos. Serei eternamente grata! Às amigas: Juliana Lameiras, Valéria Mourão e Maria Carolina, pela ajuda nos
experimentos e por tornarem meus dias no laboratório mais alegres. Vocês sempre terão minha eterna amizade e gratidão.
À amiga Patricia Danielle, pela ajuda com os experimentos de citotoxicidade. Obrigada amiga por dispor de seu tempo e conhecimento!
À Leilane Bentes pela ajuda no ensaio do cometa!
Ao Professor Doutor Boechat, pelas contribuições e ensinamentos.
A todos os integrantes do Laboratório do Serviço de Enzimologia Aplicada da FUNED, que me acolheram de forma carinhosa, especialmente a Ana Valentim e Gabriel Latorre Fortes Dias pela valiosa ajuda na realização das cromatografias.
À Universidade Federal do Amazonas e ao Programa Multi-Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia, pela oportunidade de capacitação a mim concedida.
À Fapeam pela concessão de bolsa de doutorado.
Enfim, agradeço a todos que aqui não foram mencionados, mas que colaboraram direta ou indiretamente para realização deste trabalho. OBRIGADA!
Jamais considere seus estudos como uma obrigação, mas como uma
oportunidade invejável para aprender a conhecer a influência libertadora da
beleza do reino do espírito, para seu próprio prazer pessoal e para proveito da
comunidade à qual seu futuro trabalho pertencer.
RESUMO
SANTOS, Ilia Gilmara Carvalho dos Santos. Potencial antibacteriano e citotóxico dos venenos variedades “amarela” e “branca” da serpente amazônica Crotalus durissus ruruima. 2017. 86p. Tese de doutorado em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia para a saúde. Universidade Federal do Amazonas - UFAM. Manaus, Amazonas, 2017.
Os venenos animais constituem uma das mais ricas fontes de substâncias biologicamente ativas encontradas na natureza e tal prerrogativa tem sido confirmada em estudos farmacológicos e bioquímicos, realizados com proteínas (enzimas), peptídeos, aminas bioativas, dentre outros compostos, isolados de venenos de serpentes. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial antibacteriano e antitumoral dos venenos individuais, variedade “amarela” (Cdr68 e Cdr69) e “branca” (Cdr110 e Cdr173) da cascavel Amazônica Crotalus durissus ruruima. A avaliação da atividade antimicrobiana dos venenos foi realizada pela técnica de difusão do disco contra as bactérias gram-positivas (Staphylococcus aureus e S. epidermidis) e gram-negativas (Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa). Os venenos amarelos apresentaram atividade
antibacteriana contra a bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus. A ação citotóxica dos venenos foi avaliada utilizando as seguintes linhagens celulares SK-Mel 103 (melanoma), MCF-7 (adecarcinoma de mama), HCT-116 (carcinoma colorretal) e MCR-5 (fibroblasto humano). Os venenos Cdr68 e Cdr69 foram citotóxicos para todas as linhagens tumorais, mas foram mais potentes para a linhagem de carcinoma colorretal (HCT-116) com CI50 de 1,8
µg/mL e 1,3 µg/mL para Cdr68 e Cdr69, respectivamente. Os venenos variedade branca não foram citotóxicos para as linhagens testadas. Os perfis cromatográficos de Cdr68, Cdr69, Cdr110 e Cdr173 de Exclusão Molecular apresentaram quatro picos principais. As frações isoladas foram submetidas aos testes de atividade coagulante, fosfolipásica A2, citotóxica e
antibacteriana, todas as atividades estavam presentes no Pico II de Cdr68, e nos Picos I (citóxica) e II do Cdr69. Os picos II de ambos os venenos foram submetidos à Cromatografia de Fase Reversa. Os picos FRP2 da Fase Reversa dos venenos apresentaram atividade fosfolipásica, citotóxica frente à linhagem HCT-116 na concentração de 100 µg/mL e antibacteriana contra S. aureus. A massa deste pico foi de aproximadamente 14 kDa, compatível com PLA2. Interessante notar, que o veneno total apresentou maior potencial
citotóxico do que as frações isoladas, mostrando um possível efeito sinérgico entre os constituintes do veneno.
Palavras-chave: Venenos de serpentes, venenos amarelos e brancos, fosfolipase A2,
ABSTRACT
SANTOS, Ilia Gilmara Carvalho dos Santos. Potencial antibacteriano e citotóxico dos venenos variedades “amarela” e “branca” da serpente amazônica Crotalus durissus ruruima. 2017. 86 p. Tese de doutorado em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia para a saúde. Universidade Federal do Amazonas - UFAM. Manaus, Amazonas, 2017.
Animal venoms are one of the richest sources of biologically active substances found in nature and such prerogative has been confirmed in pharmacological and biochemical studies of proteins (enzymes), peptides, bioactive amines, and other compounds isolated from snake venoms. In this context, the purpose of the present study was to evaluate the antibacterial and antitumor potential of the individual venoms "yellow" (Cdr68 and Cdr69) and "white" varieties of the Amazonian rattlesnake Crotalus durissus ruruima. The evaluation of the antimicrobial activity of the crude venoms was performed by the disc diffusion technique against gram-positive (Staphylococcus aureus and S. epidermidis) and gram-negative bacteria (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa). The yellow venoms presented antibacterial activity against gram-positive bacteria Staphylococcus aureus. The cytotoxic action of the venoms was evaluated using the following cell lines SK-Mel 103 (melanoma), MCF-7 (breast adecarcinoma), HCT-116 (colorectal carcinoma) and MCR-5 (human fibroblast). Cdr68 and Cdr69 venoms were cytotoxic to all tumor lines but were more potent for the colorectal carcinoma (HCT-116) with IC50 of 1.8 μg / mL and 1.3 μg / mL for
Cdr68 and Cdr69 respectively. The white variety venoms were not cytotoxic to the tested strains. The chromatographic profiles of Cdr68, Cdr69, Cdr110 and Cdr173 by molecular exclusion showed four major peaks. The isolated fractions were submitted to tests of coagulant, phospholipase A2, cytotoxic and antibacterial activity, all activities were present in
Peak II of Cdr68, and in Peaks I (cytotoxic) and II of Cdr69. Peaks II of both venoms were submitted to Reverse Phase Chromatography. The FRP2 peaks of the Reverse Phase of the venoms presented phospholipase activity, cytotoxic against the strain HCT-116 in concentration of 100 μg / mL and antibacterial against S. aureus. The mass of this peak was approximately 14 kDa, compatible with PLA2. It is interesting to note that the total venom
presented higher cytotoxic potential than the isolated fractions, showing a possible synergistic effect among the venom constituents.
LISTA DE FIGURAS
Capítulo II
Figura 1: Índice de dano de células MRC-5, em cometa alcalino e neutro, tratadas com os venenos Cdr68 e Cdr69...
32
Figura 2: Frequência e distribuição das classes de danos em células MRC-5, em cometa alcalino e neutro, tratadas com os venenos Cdr68 e Cdr69...
32
Figura 3: Índice de dano de células HCT-116, em cometa alcalino e neutro, tratadas com os venenos Cdr68 e Cdr69...
33
Figura 4: Frequência e distribuição das classes de danos em células HCT-116, em cometa alcalino e neutro, tratadas com os venenos Cdr68 e Cdr69...
34
Figura 5: Imagens da morfologia das células HCT-116 após 72 horas de tratamento com Cdr68 ou Cdr69, coradas com hematoxilina e eosina...
35
Figura 6: Percentual de Inibição do crescimento bacteriano dos Cdr68 e Cdr69 frente à cepa Staphylococcus aureus 25923...
36
Capítulo III
Figura 1: Perfís cromatográficos em exclusão molecular (Superdex 200 10X300 GL) dos venenos Cdr68 (A) e Cdr69 (B) e perfis sobrepostos dos venenos Cdr110, Cdr173 e Cdt (C)...
53
Figura 2: Curva de calibração da coluna cromatográfica de exclusão molecular Superdex 200 com proteínas de massa molecular conhecida...
53
Figura 3: Curva padrão de proteínas pré-coradas em SDS-PAGE, exemplificada para o gel de Cdr69...
54
Figura 4: Gel de poliacrilamida com gradiente de 8-25% com strip de SDS, dos picos PI a PIV cromatografia por exclusão molecular em Superdex S200 de Cdr68 (A) e Cdr69 (B), após coloração por azul de Coomassie ou prata...
55
Figura 5: Perfil cromatográgico (linha contínua) e perfís de atividade PLA2 (linha pontilhada) do veneno amarelo Cdr69 e branco Cdr 110 em gel filtração (Superdex 200 10X300 GL)...
56
Figura 6: Perfis de atividade coagulante dos venenos Cdr68 e Cdr69 de Crotalus durissus
ruruima em teste realizado com
plasma... 57
Figura 7: Perfil de atividade coagulante das frações 33 e 34 de Cdr68 e Cdr69 de Crotalus
durissus ruruima em teste realizado com
fibrinogênio... 58
Figura 8: Ensaio de citotoxicidade em células de fibroblasto humano linhagem MRC-5 e carcinoma colorretal linhagem HCT-116 realizado com frações cromatográficas da exclusão molecular do veneno Cdr68 e Cdr69...
58
Figura 9: Perfís cromatográficos em fase reversa dos picos II (PII) obtidos por exclusão molecular dos venenos amarelos Cdr68 e Cdr69, brancos Cdr110 e Cdr173 e Cdt (referência)...
59
(PIIAF); (C) Pico II somente das frações que apresentaram citotoxicidade (PIIAC) obtidos
no fracionamento de Cdr68 por exclusão
molecular... Figura 11: Ensaio de citotoxicidade em células de fibroblasto humano linhagem MCR-5 e carcinoma colorretal linhagem HCT-116 realizado com os picos FRP2 da Fase Reversa de Cdr68 e Cdr69 (100 µg/mL)...
63
Figura 12: Citotoxicidade de frações obtidas da Fase Reversa do Pico IIAF da Exclusão Molecular...
64
Figura 13: Inibição do crescimento bacteriano do FRP2 da Fase Reversa de Cdr68, frente à cepa Staphylococcus aureus 25923... 64 Figura 14: Espectros de massa em MALDI/TOF/TOF das frações da cromatografia de fase reversa de Cdr68, adquiridos na faixa m/z 2000-16000... 66 Figura 15: Espectros de massa em MALDI/TOF/TOF das frações da cromatografia de
Fase Reversa de Cdr68, adquiridos na faixa m/z
14000-100000... 67
Figura 16: Espectros de massa em MALDI/TOF/TOF das frações da cromatografia de
fase reversa de Cdr69, adquiridos na faixa m/z
2000-16000m/z... 68
Figura 17: Espectros de massa em MALDI/TOF/TOF das frações da cromatografia de
Fase Reversa de Cdr69, adquiridos na faixa m/z
LISTA DE TABELAS
Capítulo II
Tabela 1: Atividade citotóxica in vitro dos venenos, variedades branca e amarela, de Crotalus durissus ruruima frente à linhagem de células normais de fibroblasto humano (MRC-5) e linhagens de células tumorais: Melanoma (SK-Mel-103), Adenocarcinoma de mama (MCF-7), Carcinoma colorretal (HCT-116) e células THP-1 ...
31
Capítulo III
Tabela 1: Estimativa de massa molecular média (em kDa) das proteínas nos picos da cromatografia de exclusão molecular (Superdex 200) dos venenos de Cdr68, Cdr69 e Cdr 110...
54
Tabela 2: Estimativa da faixa de massa molecular (kDa) das bandas proteicas em SDS-PAGE, contidas nos picos PI e PII da cromatografia de exclusão molecular dos venenos amarelos Cdr68 e Cdr69...
56
Tabela 3: Dados quantitativos referentes aos picos da Fase Reversa de Cdr68...
61
Tabela 4: Atividade fosfolipásica dos picos cromatográficos originados da Fase Reversa dos venenos Cdr68 e Cdr69...
62
Tabela 5: Atividade coagulante de picos obtidos a partir de Fase Reversa do PicoII da Exclusão Molecular de Cdr68 e Cdr69...
62
Tabela 6: Sumário dos dados de espectrometria de massas (Maldi/TOF) das frações cromatográficas de Fase Reversa de Cdr68 em faixa de aquisição de 2.000 a 16.000 m/z...
70
Tabela 7: Sumário dos dados de espectrometria de massas (Maldi/TOF) das frações cromatográficas de Fase Reversa de Cdr69 em faixa de aquisição de 2.000 a 16.000 m/z...
71
Tabela 8: Sumário dos dados de espectrometria de massas (Maldi/TOF) das frações cromatográficas de Fase Reversa de Cdr68 em faixa de aquisição de 14.000 a 100.000 m/z...
72
Tabela 9: Sumário dos dados de espectrometria de massas (Maldi/TOF) das frações cromatográficas de Fase Reversa de Cdr69 em faixa de aquisição de 14.000 a 100.000 m/z...
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS.
°C = graus Celsius
Cdr = Crotalus durissus ruruima Cdt = Crotalus durissus terrificus
CI50 = Índice de citotoxicidade que causa morte celular de 50%
DMEM = “Dulbeco,s Modified Eagle Medium” (Meio de Cultura Dulbeco Modificado)
DMSO = Dimetilsulfóxido
DNA = Ácido Desoxirribonicleico DOX = Doxorrubicina
FUNED = Fundação Ezequiel Dias
HPLC = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (“High Performance Liquid Chromatography”)
mg = miligrama mL = mililitro
MTT = Sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium PLA2 = Fosfolipase A2
SFB = Soro Fetal Bovino
UFAM = Universidade Federal do Amazonas μg = micrograma
SUMÁRIO CAPÍTULO 1 ... 17 Revisão bibliográfica... 17 1. Objetivos... 18 1.1. Objetivo Geral... 18 1.2. Objetivos específicos... 18 Capítulo II ... 19 Resumo... 21 1. Introdução... 23 2. Material e Métodos... 25 2.1. Venenos... 25
2.2. Avaliação do potencial citotóxico – in vitro... 26
2.2.1. Avaliação da citotoxicidade pelo método Alamar Blue... 26
2.2.2. Avaliação da citotoxicidade pelo método MTT... 26
2.3. Avaliação da genotoxicidade – Ensaio Cometa... 27
2.4. Análise morfológica pela coloração por hematoxicilina e eosina... 28
2.5. Avaliação da atividade antimicrobiana... 29
2.5.1. Ensaio de atividade antimicrobiana pelo método de difusão do disco... 29
2.6. Análises Estatísticas... 30
3. Resultados... 30
3.1. Avaliação da citotoxicidade... 30
3.2. Avaliação da genotoxicidade – Ensaio cometa... 31
3.3. Análise morfológica pela coloração por hematoxicilina e eosina... 34
3.4. Atividade antimicrobiana... 35
Referências... 42
Capítulo III... 46
1. Introdução... 47
2. Material e Métodos... 48
2.1. Venenos... 48
2.2. Cromatografia de Exclusão Molecular... 49
2.3. Cromatografia de Fase Reversa... 49
2.4. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)... 50
2.5. Atividade Fosfolipásica A2... 50
2.6. Atividade Coagulante sobre plasma e sobre fibrinogênio... 50
2.7. Avaliação da citotoxicidade pelo método Alamar Blue... 50
2.8. Avaliação da atividade antimicrobiana – Teste microdiluição... 51
2.9. Espectrometria de massa... 51
2.10. Análises Estatísticas... 52
3. Resultados... 52
3.1. Etapa 1 – Cromatografia de Exclusão Molecular... 52
3.1.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)... 54
3.1.2. Atividade Fosfolipásica A2... 56
3.1.3. Atividade Coagulante sobre plasma e sobre fibrinogênio... 57
3.1.4. Avaliação da citotoxicidade pelo método Alamar Blue ... 58
3.2. Etapa 2 – Cromatografia de Fase Reversa... 59
3.2.1. Atividade Fosfolipásica A2... 61
3.2.2. Atividade Coagulante sobre plasma e sobre fibrinogênio... 62
3.2.3. Avaliação da citotoxicidade pelo método Alamar Blue ... 63
3.2.4. Atividade Antimicrobiana... 64
3.3. Espectrometria de massa... 65
Conclusões... 78
A presente Tese de Doutorado foi dividida em:
1. Capítulo I - Artigo de Revisão: Aplicações farmacológicas dos venenos de serpentes brasileiras enfoque para Crotalus durissus terrificus e Crotalus durissus ruruima. 2. Capitulo II- Atividade antitumoral e antibacteriana dos venenos individuais,
variedades branca e amarela de Crotalus durissus ruruima;
CAPÍTULO I
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Aplicações farmacológicas dos venenos de serpentes brasileiras enfoque
para Crotalus durissus terrificus e Crotalus durissus ruruima
1
42
Aplicações farmacológicas dos venenos de serpentes brasileiras enfoque para
Crotalus durissus terrificus e Crotalus durissus ruruima
1Ilia Gilmara Carvalho dos Santos2, Consuelo Latorre Fortes-Dias3, Maria Cristina dos Santos4
Submetido 07/11/2016 – Aceito 09/11/2016 – Publicado on-line 09/11/2016
Resumo
As peçonhas animais são secreções ricas em toxinas, sintetizadas e armazenadas em glândulas, altamente especializadas, e injetadas em suas vítimas por presas, ou dentes, ou acúleos para que possam exercer suas atividades biológicas. Alguns pesquisadores definem a peçonha como uma saliva modificada, contendo uma mistura de diferentes compostos usados, pelo animal, para sua defesa contra predadores ou para imobilizar presas, que servirão de alimentação. As peçonhas animais constituem uma das mais ricas fontes de substâncias biologicamente ativas encontradas na natureza. Estudos farmacológicos e bioquímicos, realizados nas últimas décadas, têm mostrado a diversidade de proteínas com atividade enzimática, toxinas, peptídeos, aminas bioativas, dentre outros compostos, nos venenos de serpentes. Nesse contexto, os venenos de serpentes brasileiras têm sido alvo de uma série de estudos, os quais resultaram, por exemplo, no desenvolvimento de medicamentos como o Captopril®—derivado de um peptídeo isolado do veneno de
Bothrops jararaca—e o Batroxobin®—uma enzima isolada do veneno de Bothrops atrox. Portanto, os
constituintes dos venenos podem ser ferramentas importantes no desenvolvimento de protótipos de novas drogas.
Palavras-Chave: cascavel amazônica, antitumoral, antimicrobiana, veneno, Crotalus durissus terrificus
.
Abstract
Pharmacological applications of Brazilian snake venoms with emphasis in Crotalus durissus
terrificus and Crotalus durissus ruruima
. Animal venoms are toxin-rich secretions, which are
synthesized and stored in highly specialized glands and injected into their victims by fangs, teeth or spines, so that they can exert their biological activities. Some authors believe that some venoms are a modified saliva composed of a mixture of different compounds aiming at defensing against predators or immobilizyingpreys for feeding. Animal venoms are among the richest natural sources of biologically active substances. Concerning snake venoms, in recent decades pharmacological and biochemical studies revealeda diversity of enzymes, toxins, peptides, bioactive amines, and other bioactive molecules in their composition. The results led to the development of important drugs, such as Captopril® — derived from a peptide isolated from Bothrops jararaca venom —, and Batroxobin®—an enzyme present in Bothrops atrox venom. Therefore, venom components can be important tools in the development of new drug prototypes.
Key-words: Amazonian rattlesnake, antitumor, antimicrobial, venom, Crotalus durissus terrificus
1 Revisão referente a parte da Tese de Doutorado do primeiro autor
2 Doutoranda no Programa de Pós-graduação em Biotecnologia na Universidade Federal do Amazonas.
e-mail:iliagilmara@hotmail.com
3 Serviço de Enzimologia, Diretoria de Pesquisa e Desenvolvimento, Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, Minas
Gerais
4 Laboratório de Imunoquímica, Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
43 1. Introdução
As peçonhas (ou venenos) de serpentes consistem em uma mistura complexa de proteínas, com ou sem atividade catalítica, como fosfolipases A2 (PLA2), serinoproteases,
hialuronidases, L-aminoácido oxidases (LAAO), acetilcolinesterases, fatores de crescimento, ativadores de proteína C, dentre outros. Compostos orgânicos de baixo peso molecular também fazem parte da composição das peçonhas como hidratos de carbono, serotonina, histamina, citrato, nucleosídeos, e íons inorgânicos, tais como cálcio, cobalto, magnésio, cobre, ferro e potássio, assim como inibidores enzimáticos (RAMOS; SELISTRE-DE-ARAUJO, 2006). A composição química quantitativa e qualitativa dos venenos pode apresentar variações interfamílias, intergêneros, interespécies e intraespécies. As variações intraespécies podem ocorrer devido à localização geográfica, sazonalidade, dieta, idade e sexo, além de outras (CHIPPAUX et al., 1991).
Embora grande número de compostos tenha sido isolado de diferentes venenos, as proteínas e peptídeos de baixa massa molecular representam aproximadamente 90% de seu peso seco e são responsáveis pela maioria dos efeitos biológicos observados (BIEBER, 1979).
Recentemente, a procura por substâncias farmacologicamente ativas tem aumentado consideravelmente, sendo que a busca, por compostos bioativos naturais, desperta grande interesse. O estudo dos compostos presentes em venenos tem se mostrado uma importante ferramenta nesta busca, pois podem servir de base para o desenho de protótipos e consequente desenvolvimento de novos agentes terapêuticos (KUMAR et al., 2013).
Atualmente já são utilizados, na clínica médica, fármacos derivados de venenos de serpentes, como, o Captopril®, derivado de um
peptídeo isolado do veneno de Bothrops jararaca, descoberto em 1975, graças à observação do efeito desse veneno sobre a pressão arterial de pacientes acidentados por essa espécie de serpente. O Captopril® foi o primeiro fármaco
derivado de veneno de serpente a chegar ao mercado farmacêutico e trata-se de um potente inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA) utilizado como anti-hipertensivo (KOH et al., 2006). Outro fármaco derivado de veneno de serpente é a hemocoagulase comercializada como Batroxobin®, uma enzima trombin-like utilizada
para prevenir e tratar hemorragias, que foi isolada
do veneno de Bothrops atrox, uma das espécies de jararaca encontrada na região Norte do Brasil. A tirofibana, comercializada como Agrastat®, é
derivada do veneno de uma serpente asiática, a
Echis carinatus, e é indicada para prevenir a
formação de coágulos de sangue, que podem causar ataque cardíaco e outros sérios problemas do fluxo sanguíneo (KOH et al., 2006).
Os venenos de serpentes brasileiras são alvo de uma série de estudos. No que se refere ao gênero Crotalus, grande parte das pesquisas foram realizadas com a espécie Crotalus durissus
terrificus, que segundo a ferramenta Derwent da
plataforma de busca Web of Science, resultaram em vinte patentes, sendo que apenas duas estão depositadas no Brasil. Este fato demonstra que são necessárias mais pesquisas a cerca das atividades farmacológicas de venenos e suas possíveis aplicações terapêuticas, visto que o Brasil possui um grande número de gêneros e espécies de serpentes peçonhentas.
2. Metodologia
Para a elaboração do presente artigo foram consultados os seguintes sítios de busca de bancos de dados: Pubmed, Scopus, Scielo,
ScienceDirect e Web of Science no período de
1938 a 2016. As palavras chaves utilizadas foram: “snake venom” associada com as palavras “isolation”, “biological activities”, “antimicrobial”, “antitumoral” e Crotalus durissus.
3. Serpentes Brasileiras enfoque para
Crotalus sp.
As serpentes da fauna brasileira de importância médica pertencem às famílias Colubridae (Philodryas olfersii, Philodryas patagoniensis) (ARAÚJO; DOS-SANTOS, 1997)
(Clelia sp). (ALBUQUERQUE et al., 2013) Elapidae (Micrurus sp.) e Viperidae (Bothrops sp,
Bothriopsis sp., Porthidium sp., Crotalus sp. e Lachesis sp).
As serpentes do gênero Crotalus sp. são encontradas somente no Novo Mundo (do sul do Canadá à Argentina Central). No Brasil, o gênero
Crotalus é amplamente distribuído, apesar de
possuir apenas uma espécie C. durissus e cinco subespécies: C. d. terrificus (regiões Sul e Sudeste), C. d. collilineatus (Minas Gerais e Goiás), C. d. cascavella (região de caatinga nordestina), C. d. ruruima (Roraima) e C. d.
44 RIBEIRO, 1992; PINHO; PEREIRA, 2001). Popularmente são conhecidas como cascavel, cascavel-quatro-ventas, boicininga, maracambóia, maracá, dentre outras denominações. Habitam campos abertos, áreas secas, arenosas, pedregosas e, raramente, a faixa litorânea. Porém, não são encontradas em florestas ou no Pantanal. Não tem por hábito atacar suas vítimas e, quando excitadas, denunciam sua presença pelo ruído característico do guizo ou chocalho, presente em sua cauda (BRASIL, 2001). As cascavéis são responsáveis por 7,7% dos acidentes ofídicos registrados no Brasil, podendo representar até 30% dos acidentes em algumas regiões, como no Estado de Roraima (BRASIL, 2001). O acidente crotálico apresenta alto coeficiente de letalidade, pois, frequentemente, evolui para insuficiência renal aguda (AMARAL et al., 1986).
Os venenos das subespécies de Crotalus
durissus são compostos por uma mistura de
moléculas de natureza proteica com ou sem atividade catalítica, como fosfolipases A2,
serinoproteases, hialuronidases, L-aminoácido oxidases, peptídeos, compostos orgânicos de baixo peso molecular como carboidratos, serotonina; íons inorgânicos como o cálcio, magnésio, cobre, ferro, bem como inibidores enzimáticos (RAMOS; SELISTRE-DE-ARAUJO, 2006). Diversos trabalhos foram realizados com os venenos brutos ou com frações isoladas dos venenos das subespécies de C. durissus e esses demonstraram uma variedade de ações farmacológicas, dentre as quais se destacam as atividades antifúngica, antileishmania, antiplasmódica, antiviral, antibacteriana e antitumoral (DIZ FILHO et al., 2009; SOARES et al., 2010; BARROS et al., 2011; MULLER et al., 2012; QUINTANA et al., 2012; VARGAS et al., 2013; BARROS et al., 2015; NEVES et al., 2015). Embora os venenos das subespécies apresentem um perfil eletroforético semelhante, existem diferenças em suas atividades biológicas, que podem ser atribuídas à existência de isoformas de proteínas, presentes nesses venenos (RANGEL-SANTOS et al., 2004).
3.1 O veneno de Crotalus durissus terrificus.
Dentre os venenos de cascavéis brasileiras, o mais estudado quanto à sua composição química e atividades biológicas, é o de Crotalus durissus terrificus; logo, a maior parte dos dados acerca das manifestações locais e
sistêmicas do acidente crotálico diz respeito a ações induzidas pelo veneno dessa subespécie (DOS-SANTOS, 2014). O veneno de C. d.
terrificus causa poucas manifestações no local da
picada. Segundo Jorge e Ribeiro (1992), as manifestações mais frequentes na região da picada são dor, edema, eritema e parestesia. Em relação a manifestações sistêmicas, esse veneno induz três ações principais: neurotóxica, miotóxica e coagulante (JORGE; RIBEIRO, 1992). O acometimento renal causado pela miotoxicidade sistêmica é frequente (AZEVEDO MARQUES et al.,1985) e associado a sinais decorrentes da ação neurotóxica do veneno como alterações do estado de consciência, ptose palpebral bilateral, fraqueza muscular generalizada e diplopia (AMARAL et al., 1986).
As proteínas e peptídeos de pequeno peso molecular representam aproximadamente 90% do veneno total seco (BIEBER, 1979). A peçonha de
Crotalus durissus terrificus, quando fracionada,
apresenta quatro principais toxinas: a crotoxina, convulxina, giroxina (trombina-similes) e, em alguns venenos, a crotamina (MARTINS et al., 2002; TOYAMA et al., 2003).
A crotoxina foi isolada pela primeira vez, em 1938, por Slotta e Fraenkel-Conrat, do veneno de Crotalus durissus terrificus e apresentou peso molecular de aproximadamente 30.000 daltons e ponto isoelétrico de 4.7 (SLOTTA; FRAENKEL-CONRAT, 1938; HENDON; FRAENKEL-CONRAT, 1971).
A crotoxina é o componente mais tóxico na peçonha de Crotalus durissus terrificus e está presente em grande proporção (cerca de 40 a 60% de seu peso seco). Essa neurotoxina é formada por duas subunidades, uma básica, a fosfolipase A2
(Componente B ou Crotoxina B)e a outra ácida, a crotapotina (Componente A ou Crotoxina A). Quando as subunidades são injetadas isoladamente apresentam baixa toxicidade, como é o caso da fosfolipase A2, ou não apresentam
ação tóxica, como a crotapotina. No entanto, quando é restaurada a interação iônica entre essas duas subunidades, formando a crotoxina, este complexo apresenta alta toxicidade (BANCHER et al., 1973). A crotapotina atua como chaperonina para a fosfolipase A2, direcionando esta enzima
para o alvo e, com isso, evita a sua ligação inespecífica, potencializando a ação tóxica (BOUCHIER et al., 1991).
45 que incluem, principalmente, neurotoxicidade, mas também miotoxicidade, nefrotoxicidade e a cardiotoxicidade. No entanto, nos últimos anos, uma variedade de outras importantes ações como imunomoduladora, anti-inflamatória, antitumoral, antimicrobiana e analgésica, foram descritas para este complexo proteico (YAN et al., 2006; ZHANG et al., 2006; ZAMBELLI et al., 2008; DIZ FILHO et al., 2009; NUNES et al., 2010).
A crotamina, presente apenas em alguns venenos de Crotalus durissus terrificus, foi isolada em 1950, pela primeira vez, por Moura-Gonçalvez e trata-se de um polipeptídeo composto por 42 aminoácidos, com massa molecular de aproximadamente 4.900 Daltons (LAURE, 1975). Sua estrutura tridimensional, determinada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear aplicada à proteína em solução, demonstrou que, pelo enovelamento apresentado, a crotamina pertence à família estrutural das defensinas β, que são peptídeos antimicrobianos encontrados em animais vertebrados (FADEL et al., 2005). A injeção intramuscular de crotamina de Crotalus
durissus terrificus em camundongos induz
hiperextensão imediata na pata afetada com posterior paralisia, ptose palpebral, hipersecreção lacrimal, dispneia, taquicardia e ausência de resposta a estímulos mecânicos, vinte minutos após a injeção. A paralisia total dos membros, taquicardia, dispneia, e ptose pronunciada podem permanecer até 24 horas após a injeção. O estudo histológico do músculo gastrocnêmico revelou vacuolização intensa do citoplasma (DOS-SANTOS et al., 1993a). A crotamina induz ação miotóxica sobre células musculares esqueléticas, causando danos ou até morte celular; acredita-se que este efeito se deve às alterações cinéticas dos canais de Na+ (MATAVEL et al., 1998). Além da
atividade miotóxica, já foram descritas atividades antibacteriana, antifúngica, antiparasitária e antitumoral para a crotamina (HAYASHI et al., 2008; OGUIURA et al., 2011; PEREIRA et al., 2011; YAMANE et al., 2013; MALUF et al., 2016).
A giroxina pertence ao grupo das enzimas trombina-símile, importantes serinoproteases, e foi isolada pela primeira vez do veneno de
Crotalus durissus terrificus por Barrio, em 1961.
Essa neurotoxina não é letal, mas causa uma síndrome, em animais, caracterizada por movimentos rotacionais em volta do eixo central do corpo. Daí a origem do seu nome (BARRIO, 1961). A giroxina é na realidade a enzima
trombina-símile, responsável pela ação coagulante do veneno, transformando diretamente fibrinogênio em fibrina (ALEXANDER et al., 1988). A ação girotóxica é devida a formação de neuropeptídeos, durante a clivagem do fibrinogênio endógeno pela trombina-símile ou giroxina (ALEXANDER et al., 1988).
A convulxina, encontrada no veneno de algumas subespécies de Crotalus durissus, recebeu essa denominação, pois acreditava-se ser a responsável pelas convulsões e distúrbios observados em vítimas de acidentes com essas serpentes. Porém, a convulxina não induz atividade convulsiva, sendo sim uma potente ativadora de plaquetas (MELLO; CAVALHEIRO, 1989).
3.2 O veneno de Crotalus durissus ruruima.
Apesar de Crotalus durissus ruruima ser responsável por um grande número de acidentes em Roraima e alguns espécimes dessa subespécie apresentarem atividade hemorrágica, os sinais e sintomas induzidos por seu veneno são pouco conhecidos. As atividades biológicas e os componentes bioquímicos de misturas de venenos das variedades “branca” e “amarela” da subespécie C. d. ruruima foram caracterizados, pela primeira vez por Dos-Santos e colaboradores, em 1993b, e foram observadas para a variedade branca as seguintes atividades: letal, coagulante, miotóxica, edematogênica e miolítica. A variedade amarela, além das atividades apresentadas pela “branca”, induziu hemorragia local, necrose e atividade caseinolítica. Embora, outros venenos de Crotalus sp. de exemplares oriundos das Américas Central e do Norte apresentem também hemorraginas, vale ressaltar que para os venenos de outras subespécies de C.
durissus, encontradas no Brasil, até o momento,
não foi relatada atividade hemorrágica, sendo, portanto esta atividade exclusiva da subespécie C.
d. ruruima (DOS-SANTOS et al., 1993b).
Dos-Santos e colaboradores (2005) analisaram, isoladamente, os venenos de seis exemplares de Crotalus durissus ruruima
46 a existência de uma variabilidade intrapopulacional nas composições dos venenos de C. d. ruruima, e a importância de usar misturas de venenos para a produção de antivenenos, a fim de assegurar a neutralização do maior número possível de toxinas produzidas por serpentes de dada espécie (DOS-SANTOS et al., 2005). Em 2010, Calvete e colaboradores, demonstraram que 82,7% do veneno de um desses exemplares da variedade branca de C. d. ruruima era composto por crotoxina e, dentre os venenos estudados, foi o que apresentou maior concentração desta toxina. No mesmo estudo, a concentração de crotoxina determinada no veneno de C. d. terrificus foi de 59,5%.
O fracionamento do veneno branco de
Crotalus durissus ruruima, por cromatografia de
fase reversa, resultou em dezoito frações e duas destas, a Cdr-12 e a Cdr-13, apresentaram atividade PLA2. O sequenciamento e posterior
alinhamento dos aminoácidos destas frações mostrou um alto grau de similaridade, tratando-se, portanto, de duas isoformas de PLA2. No entanto,
a análise comparativa da atividade enzimática dessas duas isoformas mostrou diferenças entre as atividades fosfolipásicas (PONCE-SOTO et al., 2007). As enzimas nativas, Cdr-12 e Cdr-13, foram submetidas ainda a um processo de modificação química e em seguida, suas características físico-químicas e biológicas foram avaliadas e apresentaram baixa atividade catalítica, revelando a importância de se conhecer a relação estrutura-função (VARGAS, 2007). Em 2009, Diz Filho também isolou duas isoformas de PLA2 distintas e denominou-as de PLA2A e
PLA2B. Após as caracterizações das estruturas
primárias de PLA2A e PLA2B, foram constatadas
semelhanças com as isoformas Cdr-12 e Cdr-13, confirmando a presença de duas isoformas de PLA2 distintas, com características farmacológicas
particulares. Fonseca e colaboradores, em 2010, modificaram as estruturas de fosfolipases A2,
isoladas do veneno de C. d. ruruima com etil 2-oxo-2H- chromen-3-carboxilato (EOCC), uma cumarina sintética. As PLA2 foram inibidas
irreversivelmente e apresentaram redução nas atividades de agregação plaquetária e de edema de pata, demonstrando o potencial antitrombótico e anti-inflamatório do EOCC frente à ação fosfolipásica A2.
Veneno total de Crotalus durissus
ruruima foi também comparado ao de C. d cumanensis, uma subespécie encontrada na
Venezuela e Colômbia. Efeitos neuromusculares dos venenos brutos e das crotoxinas isoladas, revelaram que ambos possuem atividade neurotóxica como consequência da presença de crotoxina. A crotoxina de C. d. cumanensis foi mais potente do que a de C. d. ruruima, pois, nas mesmas concentrações induziu atividades neurotóxica e miotóxica direta comparativamente mais altas (CAVALCANTE et al., 2015). A análise das sequências de aminoácidos amino-terminais das PLA2s de C. d. ruruima foram
semelhantes às de C. d. terrificus enquanto as PLA2 de C. d. cumanensis apresentaram maior
homologia com as PLA2 de C. d. cascavella e de
C. d. collilineatus (FONSECA, 2011).
Uma isoforma de crotamina denominada ILe19, foi isolada de um exemplar de Crotalus
durissus ruruima que secretava veneno amarelo,
coletado em Pacaraima (RR). A única diferença desta crotamina para a de C. d. terrificus é que a crotamina ILe19, apresenta uma isoleucina ao invés de leucina na posição 19 e essa troca de aminoácido impede a ação miotóxica da crotamina ILe19 (DOS-SANTOS et al., 1993a ALCÂNTARA et al., 2011). Outros venenos de
C. d. ruruima das variedades branca ou amarela,
coletados em Boa Vista (RR), não apresentaram crotamina em suas composições, corroborando com a existência de variabilidade interpopulacional (DOS-SANTOS et al., 2005; CALVETE et al., 2010). Quando a crotamina de
C. d. ruruima foi injetada em camundongos, foi
observada a hiperextensão da pata com subsequente paralisia dos membros posteriores, ptose e taquicardia, de forma semelhante ao que ocorre com a crotamina de C. d. terrificus. No entanto, todos os sinais e sintomas desapareceram 30 minutos após a injeção e não foram observadas lesões celulares (DOS-SANTOS et al., 1993a). Alcântara e colaboradores (2011) relataram mudanças conformacionais induzidas pela troca do aminoácido da posição 19, entre as moléculas de crotaminas de C. d. terrificus e de C. d.
ruruima, o que poderia explicar as diferenças nas
atividades biológicas observadas por Dos-Santos et al., 1993b.
3.3. Atividades antimicrobiana, antiviral, antiparasitária e antifúngica de venenos ofídicos.
47 do uso indiscriminado de antimicrobianos, tem sido o principal fator responsável pelo aumento da morbidade e mortalidade causadas por essas infecções (SANTOS, 2004). Assim, a busca de substâncias de origem animal e vegetal para o desenvolvimento de drogas mais eficazes constitui uma estratégia promissora no campo da Biotecnologia, uma vez que possibilita a iniciativa de prospecção de novas classes de moléculas naturais ou sintéticas (HEINEMANN et al., 2000).
Os primeiros relatos sobre a atividade antibacteriana em venenos de serpente foram feitos em 1948 e em 1968, envolvendo serpentes das famílias Elapidae e Viperidae (GLASER, 1948; ALOOF-HIRSCH et al., 1968). Os venenos de Naja spp. e Hemachatus haemachatus foram capazes de romper as membranas fosfolipídicas de
Staphylococcus aureus e Escherichia coli,
respectivamente (ALOOF-HIRSCH et al., 1968). Queiroz (2010) verificou que diferentes diluições do veneno bruto da serpente Bothrops moojeni inibiram o crescimento de bactérias gram-negativas produtoras e não produtoras de metalo-β-lactamases e metalo-β-lactamases, e que o tamanho do halo de inibição do crescimento bacteriano diminuiu na medida em que diminui a concentração do veneno bruto e consequentemente a quantidade de proteínas, demonstrando que o efeito foi dose dependente. Já Ferreira (2007) demonstrou que o veneno de B.
atrox possui atividade contra Staphylococcus epidermidis e Enterococcus faecalis, enquanto o
veneno de B. jararaca foi ativo contra a cepa de S.
aureus. Neste estudo, todos os venenos testados
foram tão promissores quanto os controles positivos utilizados (vancomicina, oxacilina e o cloranfenicol), o que sugere serem fontes potenciais para desenvolvimento de novos antimicrobianos.
Em estudos com subespécies de Crotalus
durissus, a fosfolipase A2 do veneno branco de C.
d. ruruima exibiu atividade antibacteriana notável
frente a Xanthomonas axonopodis pv passiflorae, uma vez que 75 µg de proteína foram capazes de inibir 96% da taxa de crescimento bacteriano (DIZ FILHO et al., 2009). O veneno bruto apresentou discreta inibição de crescimento de
Candida albicans (NEVES et al., 2015). No
veneno C. d. cascavella, a enzima L-amino ácido oxidase (LAO) inibiu o crescimento da bactéria gram-negativa X.s axonopodis pv passiflorae e da gram-positiva Streptococcus mutans, sugerindo
que o peróxido de hidrogênio produzido por LAO induz ruptura da membrana e, consequentemente, perda de conteúdo citoplasmático. Essa LAO também apresentou alta atividade leishmanicida in
vitro contra formas promastigotas de Leishmania
amazonensis (TOYAMA et al., 2006). A PLA2 de
C. d. cumanensis demonstrou ação antimalárica,
exercendo atividade antiplasmódica frente ao
Plasmodium falciparum, em doses que não são
letais para os camundongos e que não são citotóxicas para células mononucleares do sangue humano (QUINTANA et al., 2012).
Em relação à atividade antiviral, veneno bruto de Crotalus durissus terrificus conferiu resistência às infecções de células Vero E6 pelos vírus de dengue ou de febre amarela, porém as células que foram tratadas com crotoxina apresentaram maior proteção contra as infecções virais. Por outro lado, em células já infectadas com vírus dengue ou da febre amarela, que foram tratadas, posteriormente, com o veneno bruto ou toxinas, a replicação viral não foi inibida (MULLER et al., 2012).
Nos últimos anos, a crotamina se tornou alvo de estudos de atividade antimicrobiana, devido a sua semelhança estrutural com β-defensinas. Oguiura e colaboradores (2011) verificaram que crotamina de Crotalus durissus
terrificus exibiu atividade antibacteriana contra
cepas de E. coli, com valores de concentrações inibitórias mínimas variando de 25 a 100 µg/ml; no entanto, não foi observada atividade frente a
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella
typhimurium, S. aureus e Listeria monocytogenes.
Segundo os autores, a toxina mata as bactérias pela permeabilização da membrana. Posteriormente, Yamane et al, (2013) demonstraram que a crotamina não tem atividade contra fungos filamentos como Aspergillus
fumigatus e Trichophyton rubrum, mas tem
atividade antifúngica frente a levedura Candida spp. A crotamina de C. d. terrificus demonstrou atividade antiparasitária dose-dependente contra
Plasmodium falciparum e foi sugerido que o
efeito citotóxico observado pode envolver o rompimento de vesículas ácidas comprometendo a homeostase do parasita (MALUF et al., 2016). 3.4. Atividade citotóxica de venenos ofídicos.
48 quimioterapia, imunoterapia e terapia hormonal. Atualmente, o uso de quimioterápicos é a opção predominante para a terapia do câncer. No entanto, um dos principais problemas é que os pacientes muitas vezes não respondem ou, eventualmente, desenvolvem resistência após o tratamento inicial (KUMAR et al., 2013). Essa limitação levou ao aumento da busca por substâncias que auxiliem no tratamento e cura do câncer a partir de fontes naturais, como plantas e animais. A biodiversidade de venenos os torna fonte única, a partir da qual podem ser desenvolvidas novas terapias. De 1940 a 2007, das 155 novas moléculas citotóxicas desenvolvidas, 47% são produtos naturais ou derivados diretamente dessas fontes (NEWMAN; CRAGG, 2007). Estudos realizados durante as três últimas décadas, em busca de propriedades anticâncer, em venenos, levaram à descoberta de moléculas promissoras com essa atividade, algumas das quais estão em ensaios clínicos e poderão se tornar drogas terapêuticas, futuramente (GOMES et al., 2010).
Venenos brutos de serpentes das famílias Elapidae, Crotalidae e Viperidae causaram lise em células de sarcoma de Yoshida (BRAGANÇA et al., 1967). Mais especificamente, o veneno bruto de Crotalus durissus terrificus atua diretamente sobre as células tumorais e essa atividade pode ser devida a resposta inflamatória mediada pelas citocinas e quimiocinas (DA SILVA et al., 1996). Em linhagem de células tumorais de carcinoma ovariano de hamster CHO-K1, foram observadas alterações estruturais significativas em filamentos de actina, retículo endoplasmático e núcleo, além de fragmentação do DNA sugerindo que o veneno
C. d. terrificus induziu apoptose nessa linhagem
celular (TAMIETI et al., 2007). Efeito antitumoral foi também descrito para o mesmo veneno em células das glioblastoma (RT2) e adenoma benigno de pituitária (GH3), o que pode ser atribuído, pelo menos parcialmente, à crotoxina, indicando um potencial biotecnológico deste veneno na terapia do câncer (SOARES et al., 2010). A crotoxina de C. d. terrificus foi citotóxica para linhagens celulares Hs578T (carcinoma de ducto mamário humano) e SK-LU-1 (adenocarcinoma pulmonar - RUDD et al., 1994), células escamosas de carcinoma pulmonar humano SK-MES-1 (por apoptose e autofagia) (HAN et al., 2014), como também para eritroleucemia de murinos in vitro (mediada pela fosfolipase A2 - CORIN et al., 1993).
Em ensaio clínico de fase I, realizado em 2002, a PLA2 de Crotalus durissus terrificus
administrada em pacientes com câncer promoveu a inibição no crescimento tumoral, sendo 83% para carcinoma pulmonar, 69% para carcinoma mamário humano e 44% para leucemia. Os efeitos colaterais relatados foram diplopia, ptose palpebral, nistagmo, ansiedade, sialorréia, aumentos transitórios nos níveis de creatinina quinase, aspartato aminotransferase e alanina transaminase, efeitos esses atribuídos à miotoxicidade da crotoxina e à reação anafilática (CURA et al., 2002).
Hayashi e colaboradores (2008) observaram, que diferentemente de outras drogas anticâncer, a crotamina de Crotalus durissus
terrificus tem como alvo primário, a mitocôndria e
os lisossomos, levando a um aumento das concentrações de cálcio livre nas células cancerosas. Na concentração de cinco micrograma/ mL, a crotamina foi letal para as linhagens B16-F10 (melanoma de murino), SK-Mel-28 (melanoma humano) e Mia PaCa-2 (carcinoma pancreático humano) e inofensiva para células não tumorais. Tratamento com crotamina por 21 dias, em modelo de melanoma murino in
vivo, retardou significativamente a implantação do
tumor, inibiu o crescimento tumoral e aumentou a sobrevivência dos animais (PEREIRA et al., 2011).
4. Conclusão
Os compostos presentes no veneno da serpente amazônica Crotalus durissus ruruima se assemelham aos encontrados no veneno de C. d.
terrificus, porém, com variações quantitativas e
qualitativas que se refletem em suas atividades biológicas. Atividades antimicrobianas e antitumorais já foram descritas para os componentes do veneno de C. d. terrificus, principalmente em relação à crotoxina e crotamina, toxinas presentes também no veneno de C. d. ruruima. Diante do exposto, o veneno bruto e as frações isoladas do veneno de C. d.
ruruima e das demais espécies peçonhentas
amazônicas apresentam um elevado potencial biotecnológico, sendo relevante o estudo de suas ações e de seus potenciais farmacológicos.
Agradecimentos
49 Amazonas pela concessão da Bolsa de Doutorado a Ilia Gilmara Carvalho dos Santos. À FAPEMIG pela concessão de Bolsa de Incentivo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Tecnológico a Consuelo Latorre Fortes-Dias.
Divulgação
Este artigo é inédito e não está sendo considerado para qualquer outra publicação. O(s) autor(es) e revisores não relataram qualquer conflito de interesse durante a sua avaliação. Logo, a revista Scientia Amazonia detém os direitos autorais, tem a aprovação e a permissão dos autores para divulgação, deste artigo, por meio eletrônico.
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