MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE EM BIÓPSIAS DE PELE EMBLOCADAS EM PARAFINA COMPATÍVEIS COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR
AMERICANA
ROSILENE VIANA DE ANDRADE
MANAUS 2007
ROSILENE VIANA DE ANDRADE
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE EM BIÓPSIAS DE PELE EMBLOCADAS EM PARAFINA COMPATÍVEIS COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR
AMERICANA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para a obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
Orientador (a): Prof. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira
MANAUS 2007
FICHA CATALOGRAFICA
Andrade, Rosilene Viana
Reação em cadeia de polimerase em biópsias de pele emblocadas em parafina compatíveis com Leishmaniose Tegumentar Americana a histopatologia, 2007.
xiv, 56f.
Tese (Mestrado) – Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
Título em ingles: Reaction Chain polymerase in paraffine-embedded skin biopsies with histopathological features consistent with American Cutaneous Leishmaniasis.
A Deus, o idealizador de tudo. Á minha família, pela compreensão, pelo amor incondicional e pelo apoio nos momentos
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela sua imensa bondade para com a minha vida, pois tenho somente que agradecer pelos momentos bons, por todas as conquistas e forças nos momentos difíceis.
À minha família, pelo carinho e amor, sempre me apoiando em todos os momentos da minha vida e da vida das minhas filhas.
Às minhas filhas, que são motivo de alegria, amor e força para seguir enfrentando os bons e os maus momentos da vida.
Ao Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira, pela paciência, incentivo, e conhecimentos científicos - a pessoa mais importante na minha vida profissional, pois tem estado sempre comigo.
À Meline Nogueira, bolsista do PAIC, pelo carinho, ajuda e conhecimentos técnicos imprencidíveis na realização da técnica Reação em Cadeia de Polimerase.
Ao Programa de Mestrado e Doutorado da Universidade Estadual do Amazonas, pelos conhecimentos técnicos e pelo apoio financeiro; à Drª. Graça, Coordenadora do programa e aos secretários, pela atenção, apoio e simpatia sempre manifestados.
A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
Ao Sr Presidente Dr. Sinésio Talhari, pelo apoio pessoal, financeiro e disponibilização de suporte técnico e laboratorial desta Fundação.
A Gerência de Leishmaniose, pela disponibilização das Fichas de Atendimento Ambulatorial dos pacientes com biópsias c/c LTA.
A Gerência de Virologia, que nos permitiu a utilização do espaço físico e aparelhagem para a realização da reação em cadeia de polimerase.
Ao Laboratório de Anatomia Patológica; ao Dr. Araújo, pelo apoio neste trabalho; à Sandra Caranhas, pela ajuda na realização dos cortes histopatológicos das biópsias do estudo.
Ao Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA) e à Gerência de Leishmaniose, pela disponibilização de cepas de Leishmaniose, usadas nos controles positivos da PCR.
À Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA), pelo apoio financeiro na realização da pesquisa.
São muitas, Senhor Deus meu, as maravilhas que tens operado e também os teus desígnios para conosco; ninguém há que se possa igualar contigo.
RESUMO
Introdução. A Leishmaniose Cutânea é uma doença de alta incidência no Brasil e no ano de 2003 foram notificados 26.185 novos casos. No estado do Amazonas a doença é endêmica. Os métodos tradicionais de diagnóstico de LTA, como a cultura e histopatologia, requerem a presença de um número relativamente alto de microorganismos, porém, na fase crônica, o número de parasitas é muito baixo. Diagnosticar Leishmaniose Tegumentar Americana através da PCR em tecidos parafinizados com laudos histopatológicos compatíveis com leishmaniose tegumentar americana. Material e método O presente estudo avaliou a realização da PCR para o diagnóstico de Leishmaniose Cutânea em biópsias de pele emblocadas em parafina de pacientes c/c LTA a histopatologia. A amplificação de DNA de Leishmania utilizou primers de área conservada do kDNA com 120 pares de base. As biópsias foram também reavaliadas histopatologicamente e classificadas de acordo com Magalhães 1986. Resultados. A PCR amplificou DNA de Leishmania sp em 96,66% das amostras de biópsias compatíveis com LTA. Na reavaliação histopatológica, os achados mais comumente percebidos nas biópsias compatíveis com LTA e PCR positivo foram a presença de hiperplasia pseudoepiteliomatosa em 90% dos casos e reação granulomatosa em 90,69%. O tipo histopatológico mais frequentemente encontrado foi o tipo IV da classificação de Magalhães et al em 62,22% dos casos Conclusão. O PCR demonstrou alta sensibilidade para o diagnóstico de Leishmaniose Cutânea nas fases crônicas da doença.
ABSTRACT
Introduction.The Cutaneous Leishmaniasis is on of the infections-diseases of highest incidence in Brazil with 26.185 new cases in 2003, it has been observed in endemic area in North region. The diagnosis of chronic lesion using routine methods requires the presence of high numbers of the parasites, for example culture and histopathology but in chronic lesion, the number of parasite is low. Material and methods.In this study we assessed the ability of PCR to diagnostic cutaneous leishmaniasis. We used to amplify a 120 base pair fragment of Leishmania kinetoplast DNA (kDNA) minicircles of paraffin-embedded skin biopsies of specimens of cutaneous leishmaniasis with histopathological features consistent with cutaneous leishmaniasis but failed to detect parasite. The biopsies were reviewed and characteristic elements were descript and following grouped based with Magalhães classification. Results. The PCR amplify Leishmania DNA in 96,66% of the cases consistent with cutaneous leishmaniasis. The histopathological group more frequently observed were the group IV of Magalhães in 62,22%.The histopathological features more frequently observed were pseudoepitheliomatous hyperplasia and granulomatous reaction in 90% and 90,69% respectively . Conclusion.The PCR on paraffin-embedded tissue is highly sensitive test for diagnosis of chronic lesion of cutaneous leishmaniasis when others method failed to detect parasite.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com a faixa etária...22
Tabela 2 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com o número de lesões ulceradas...23
Tabela 3 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com o tempo de evolução das lesões ulceradas...24
Tabela 4 Distribuição dos casos de c/c LTA de acordo com o tipo histológico
baseados na Classificação de Magalhães...25
Tabela 5 Distribuição dos casos de acordo com a análise das características
histopatológicas das biópsias c/c LTA reavaliadas...26
Tabela 6 Distribuição do número médio de linfócitos e plasmócitos nos pacientes c/c LTA e pacientes com LTA a histopatologia...26
Tabela 7 Resultado do teste estatístico para proporções (Teste Z) das características histopatológicas...27
Tabela 8 Distribuição do número médio de linfócitos e plasmócitos nos pacientes c/c LTA e PCR positivo para gênero Leishmania e nos casos positivos para LTA a microscopia óptica...27
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Lista de espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose
Tegumentar no Brasil e seus principais vetores...02
Quadro 2 Amplificação da PCR no termociclador :números de ciclos, variação de temperatura e o tempo de cada etapa...18
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuição dos casos de Leishmaniose Tegumentar no Velho e Novo Mundo de acordo com a Organização Mundial de Saúde...03
Figura 2 Padrão histopatológico das biópsias compatível com Leishmaniose Cutânea...15
Figuras 3 Distribuição dos pacientes c/c LTA a histopatologia de acordo com o sexo...21
Figura 4 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com o localização das lesões ulceradas...22
Figura 5 Tipo IV, tipo histopatológico mais freqüentemente encontrado de acordo com a classificação de Magalhães...25
Figura 6 Gel de eletroforese do resultado da amplificação do DNA de Leishmania sp através da PCR...28
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS β minutos μ micro > Maior < Menor dNTP Desoxirribonucleosídios trifosfato DNA Ácido desoxirribonucléico
FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas INPA Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia LTA Leishmaniose Tegumentar Americana M molar
pb Pares de base
SDS Sulfato duodecil de Sódio
Taq Termus aquaticus - polimerase termo estável TBE Tampão de Tris-base e ácido bórico
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 1 1.1 Considerações Gerais... 1 1.2 Epidemiologia... 2 1.3 Diagnóstico Laboratorial... 4 2 OBJETIVO... 12 2.1 Geral... 12 2.2 Específico... 12 3 MATERIAL E MÉTODO... 13
3.1 População e modelo de estudo... 13
3.2 Delimitação da área de estudo... 13
3.3 Critérios de inclusão... 14
3.4 Comitê de ética... 14
3.5 Procedimentos realizados... 14
3.6 Análise estatística... 21
4 RESULTADOS... 22
4.1 Resultados do estudo clínico dos pacientes compatíveis com LTA... 22
4.2 Estudo laboratorial... 24
5 DISCUSSÃO... 29
6 CONCLUSÃO... 37
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 38
1.INTRODUÇÃO
1.1. Considerações gerais.
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença de evolução crônica que acomete, isoladamente ou em associação, a pele e mucosas do nariz, da boca, da faringe e da laringe (Veronesi et al) 2004. É causada por um protozoário do gênero Leishmania Ross 1903. Alexandre Cerqueira, em 1885, na Bahia, foi o primeiro a identificar a moléstia e a suspeitar do papel dos flebotomíneos como vetores. Gaspar Viana, em 1911, propôs a denominação de Leishmania brasiliensis para o agente da LTA. Apresenta-se agrupada em dois subgêneros: Viannia e
Leishmania, de acordo com o local de adesão e multiplicação do parasita no tubo
digestivo dos flebotomíneos, (Lainson & Shaw 1987).
Atualmente sete espécies do gênero Leishmania foram identificadas no Brasil, seis pertencentes ao subgênero Viannia: Leishmania (Viannia) brasiliensis,
Leishmania (Viannia) guyanenensis, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) lindembergi, Leishmania (Viannia) naiffi e uma espécie do subgênero Leishmania: Leishmania (Leishmania) amazonensis.
(Gontijo, Carvalho, 2003).
O protozoário da Leishmania apresenta duas formas evolutivas principais: uma forma flagelada ou promastigota, encontrada no tubo digestivo do inseto vetor e em meios de cultura, e outra com flagelo interno, a amastigota, observada nos hospedeiros vertebrados. (Veronesi 2004 et al).
A transmissão ao homem ocorre pela picada de vetores flebotomíneos. No Brasil diferentes espécies são responsáveis pela transmissão da leishmaniose, como estão relacionados abaixo. (Gontijo, Carvalho 2003). Referida no Quadro 1.
A leishmaniose é primariamente uma enzootia de animais silvestres, o homem representa um hospedeiro acidental. Um grande número de espécies de mamíferos como roedores, edentados, marsupiais, procionídeos, canídeos, primatas e ungulados agem como reservatório de Leishmania sp, (Arias et al 1981).
Quadro1. Espécies de Leishmania que acometem o homem no Brasil e seus principais vetores.
Espécies de Leishmania Principais vetores
Leishmania (V) brasiliensis. Leishmania (V) guyanensis Leishmania (V) naiffi Leishmania(V) shawi Leishmania (V) lansoni Leishmania (L) amazonensis
Lutzomyia whitmani, Lu. wellcomei e Lu. Intermédia
Lu. squamiventris e Lu. umbralitis, Lu. anduzei e Lu. whitmani
Lu. squamiventris , Lu. paraensis e Lu. ayrozai
Lu. whitmani Lu. umbiquitalis
Lu. flaviscutellata e Lu. Olmeca
A Leishmaniose Tegumentar Americana pode ser classificada de acordo com suas manifestações clínicas em forma cutânea localizada, sendo caracterizada por lesões ulceradas, indolores, únicas ou múltiplas e, menos freqüentemente lesões nodulares, vegetantes e em placa; a forma disseminada, que apresenta múltiplas úlceras cutâneas distribuídas em diversas áreas do tegumento; a forma cutâneo-mucosa, caracterizada por lesões mucosas agressivas que afetam as mucosas nasofaríngeas de forma isolada ou concomitante a lesão cutânea e, finalmente, a forma difusa, com lesões nodulares múltiplas. (Ramos-e-Silva , Jacques, 2002).
1.2. Epidemiologia
A Organização Mundial de Saúde estima uma incidência de 12 milhões de casos de leishmaniose no mundo, ocorrendo nos quatro continentes. Estimando-se dois milhões de novos casos (1,5 milhão de casos de leishmaniose cutânea e 500.000 mil de Leishmaniose Visceral), sendo endêmica em 88 países e de notificação compulsória em 32 destes. (OMS 2006). Figura 1.
Na distribuição Geográfica, 90 % dos casos de Leishmaniose Cutânea ocorrem no Afeganistão, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria e 90% dos casos de Leishmaniose Cutâneo-Mucosa ocorrem na Bolívia, Brasil e Peru. (OMS 2006).
Figura 1. Distribuição dos casos de leishmaniose cutânea no Velho e Novo Mundo (OMS 2006).
No Brasil, a doença é endêmica e de elevada incidência, uma vez que no ano de 2006 ocorreram 23.427 casos notificados de LTA, segundo o Ministério da Saúde (2006). Só no Amazonas, neste mesmo ano , foram notificados 1.437 casos e em 2005, a taxa de incidência da doença foi de 60,24/100.000 hab. No quadro abaixo se observa o número de casos notificados, distribuídos de acordo com a região e os estados com o maior número de notificações.
Na Amazônia, em particular no Estado do Amazonas, a incidência de LTA tem se mantido elevada, como acima citado. No ano de 2003 foram notificados 3.436 casos. A associação com atividades profissionais pode estar ausente em áreas onde surgiram condições para a transmissão domiciliar, por exemplo, em Manaus, no estado do Amazonas, onde a expansão urbana aproximou a população dos focos naturais da doença (Guerra 2006 et al ).
Nas florestas vicinais, a zoonose, mantida principalmente pelo gambá, passou a acometer indistintamente adultos e crianças de ambos os sexos (Arias 1981). A abertura de novas estradas, a instalação de núcleos residenciais em áreas de
floresta e os treinamentos militares constituem fatores importantes na epidemiologia da leishmaniose, (Guerra et al 2006).
Na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, centro de referência do estado em doenças infecciosas e parasitárias, foram registrados 828 casos de Leishmaniose Tegumentar no ano de 2004, 823 casos em 2005 e 462 casos em 2006, (Boletim Epidemiológico da FMTAM 2006).
1.3. Diagnóstico Laboratorial
O diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana abrange aspectos epidemiológicos, clínicos e laboratoriais. Os exames laboratoriais empregados são: pesquisa direta, isolamento em cultura, inoculação em animais de laboratório, exame histopatológico, exame sorológico e, mais recentemente, reação em cadeia da polimerase (PCR). (Safei 2002 et al ), (Gontijo et al 2003).
1.3.1. Escarificação
A pesquisa direta do parasito pode ser realizada em material obtido pela escarificação na borda da lesão ulcerada ou da lesão não ulcerada, com estilete descartável ou lâmina de bisturi. Realiza-se um esfregaço em lâmina, fixado em metanol por 3 minutos e corada pela técnica de Giemsa. O resultado positivo é dado pela presença, no microscópio óptico, de formas amastigotas de leishmania isoladas ou intracelularmente, (Gontijo, Carvalho 2003).
1.3.2. Cultura
O isolamento do parasito pode ser feito em cultura de tecidos biopsiados ou aspirados dos bordos da lesão ou a partir de inóculos em animais susceptíveis. A cultura permite a definição de espécie. O parasito cresce em meios de cultura como, por exemplo, Nicolle, Nevy e Mcneal ( NNN ), entre 24º a 26º C, após o quinto dia, formas promastigotas podem ser observadas, (Gontijo, Carvalho 2003).
1.3.3. Inoculação em animais de laboratório
Na inoculação, os animais utilizados são o camundongo e o hamster, o inóculo deve ser obtido a partir de uma suspensão homogeneizada do material de biópsia em solução salina estéril e aplicado preferencialmente nas extremidades
(patas posteriores). As lesões desenvolvem-se tardiamente (a partir de um mês), (Ministério da Saúde 2006).
1.3.4. Diagnóstico Imunológico
1.3.4.1.Intrademorreação de Montenegro: traduz a resposta de hipersensibilidade celular retardada a uma injeção de antígeno preparado com promastigotas. O resultado é positivo quando se observa pápula ou nódulo maior ou igual a 5 mm de diâmetro ou ulceração que é lida após 48 a 72 h. Em áreas endêmicas, deve-se considerar a possibilidade de leishmaniose anterior ou exposição ao parasito sem a doença.( Gontijo, Carvalho 2003).
1.3.4.2. Imunofluorescência Indireta (IFI) e Teste Imunoenzimático (ELISA): expressam os níveis de anticorpos circulantes. Nas lesões ulceradas por
Leishmania (V) braziliensis a sensibilidade da Imunofluorescência está em torno de
70%. Geralmente considera-se positiva a reação a partir da diluição de 1:40. (Ministério da saúde 2000).
1.3.5 Histopatologia
O exame histopatológico permite a visualização direta do parasito e/ou a presença de características histopatológicas sugestivas de LTA. Nos casos em que o exame histopatológico não visualiza o agente etiológico, o anatomopatologista emite o laudo histopatológico de “compatível com Leishmaniose Tegumentar”. Considera-se “compatível com Leishmaniose Tegumentar” as biópsias de pele com suspeita clínico-epidemiológica de LTA cujo exame histopatológico demonstre formações granulomatosas, constituídas por células epitelióides, células gigantes tipo Langhans, linfócitos, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, histiócitos vacuolizados e moderado infiltrado de plasmócitos. ( Safaei et al 2002).
A primeira classificação de Leishmaniose Tegumentar Americana foi proposta por Azulay, em 1960, que acreditava que um processo exsudativo agudo caracterizava histopatologicamente a fase inicial da doença e um granuloma tuberculóide surgisse na fase tardia.
Em 1980, Ridley e colaboradores classificaram histopatologicamente 60 biópsias de pacientes com leishmaniose cutânea em cinco grupos: grupo l, que foi quase normal exceto por leves alterações degenerativas do colágeno; grupo ll, a característica predominante foi um processo necrotizante mais severo que o grupo l. O grupo lll corresponde a um infiltrado inflamatório acentuado sem necrose e granuloma. O grupo lV e V foram associados a células epitelióides e células gigantes multinucleadas.
Magalhães et al 1986, na Bahia, através de um estudo histopatológico de 162 casos de Leishmaniose cutânea e mucosa, descreveram cinco padrões histopatológicos distintos:
-Tipo l reação exsudativo-celular com infiltrado inflamatório histiolinfoplasmocitário dérmico ou do córion da mucosa com proporções que tendem a equivalência;
-Tipo ll reação exsudativo-necrótica caracterizada por necrose tissular na derme ou córion da mucosa de amplitude variável, além do infiltrado histiolinfoplasmocitário;
-Tipo lll reação exsudativa e necrótico-granulomatosa consistente com reação granulomatosa desorganizada ao redor ou nas proximidades da área de necrose tissular, caracterizada pela presença de macrófagos ativados e de células gigantes. Presença de infiltrado histiolinfoplasmocitário.
- Tipo lV reação exsudativa e granulomatosa com reação granulomatosa desorganizada isolada no seio do infiltrado inflamatório, sem presença de necrose tissular. Presença de infiltrado histiolinfoplasmocitário;
- tipo V reação exsudativa e tuberculóide com reação granulomatosa constituída por macrófagos, células epitetióides e células gigantes, dispostas em arranjos tuberculóides bem delimitados, além do infiltrado histiolinfoplasmocitário.
Bittencourt et al, em 1991, realizaram avaliação das classificações histopatológicas anteriores de Leishmaniose Cutânea e Leishmaniose Mucocutânea
(Riddley et al 1980 e Magalhães et al 1986) propondo uma classificação mais simplificada com apenas três padrões. Aspectos histopatológicos distintos foram observados em diferentes lesões ou ainda na mesma lesão. Os autores concluem neste trabalho que os padrões histopatológicos não representam um estágio de leishmaniose tegumentar e então não podem ser correlacionados com prognóstico e resposta terapêutica como sugere a literatura.
Andrade-Narvaez et al 2005 avaliaram, através da histopatologia, 73 casos de leishmaniose cutânea localizada. Os achados histopatológicos foram baseados na classificação de Magalhães et al 1986 é o padrão mais comumente encontrado foi caracterizado pela presença de granulomas não organizados sem necrose (43,8%). A identificação do parasito foi positiva em 50/73(68,5%) dos casos.
Ramirez et al em 2000, realizaram um trabalho comparando a sensibilidade do exame de esfregaço do centro e das bordas de lesões ulceradas de 115 pacientes com leishmaniose cutânea, a sensibilidade do exame microscópico foi respectivamente de 90,4 e 78,3%. Quando o método da PCR foi utilizado com um grupo de 40 pacientes, observou-se alta sensibilidade nas amostras do cento das úlceras, com 80,8% versus 57,7% nas amostras colhidas das bordas da lesão. Outros métodos diagnósticos parasitológicos, tais como cultura e histopatológico, foram menos sensíveis com 67,5 e 64,3 respectivamente. A coleta simultânea para exame microscópico do centro e das bordas da úlcera aumentou a sensibilidade para 94%,sendo está rotina indicada pelo autor.
1.3.6. REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica in vitro que permite a amplificação de seqüências específicas de ácido desoxirribonucléico (DNA) ou de ácido ribonucléico (RNA), sendo este último realizado a partir da síntese de ácido desoxirribonucléico complementar. A PCR foi originalmente descrita por Mullis (1987) e desde então tem sido utilizada em vários campos da ciência. A aplicação do PCR permite rápida detecção e identificação do DNA dos parasitos sem a necessidade de isolamento, permitindo a geração de cópias de seqüências específicas de DNA.
No diagnóstico de leishmaniose, um dos principais alvos das técnicas moleculares desenvolvidas é o DNA do cinetoplasto (kDNA) Rodgers et al 1990. O kDNA é constituído por duas moléculas, os minicírculos de 1,42 Kb e os maxicírculos de cerca de 36 Kb. A reação em cadeia de polimerase pode ser usada para aumentar a sensibilidade da detecção de Leishmanias por métodos de hibridização através da amplificação de seqüências do minicírculo. O Método foi sensitivo o suficiente para detectar o kDNA de um simples organismo e essa sensibilidade permitiu o uso de métodos de hibridização não radioativos. (Rodgers et al 1990).
Os estudos da reação em cadeia da polimerase em tecidos, fixados em parafina, para diagnóstico de leishmaniose foram iniciados por (Laskay et al 1995) que avaliou a habilidade da PCR para detectar DNA de Leishmania aethiopica em biópsias de pele emblocadas em parafina nos 17 casos de leishmaniose cutânea, confirmados pela cultura e/ou exame histopatológico de 40 pacientes com diagnóstico clínico de leishmaniose sem a demonstração laboratorial do parasito. O PCR foi positivo nos 17 pacientes com o diagnóstico confirmado laboratorialmente de leishmaniose e em sete dos 22 pacientes com achados histopatológicos consistentes com leishmaniose e negativas em todos os 18 pacientes que histopatologicamente não apresentavam características suspeitas de leishmaniose.
Libório et al, em 2005, avaliaram a extração do DNA genômico de amostras de cavidade oral fixadas em parafina e arquivadas nos últimos 40 anos. Na reação em cadeia da polimerase, foram utilizados fragmentos de β globina de 268pb que amplificou o DNA em 55% das amostras, preferencialmente nos casos mais recentes. Nos fragmentos com 536 pb, o gene da β globina foi amplificado somente em 25% das amostras e também preferencialmente nos casos mais recentes. O fragmento do gene WAF1 com 149 pb apresentou amplificação fraca, mais presente em 75% dos casos, uma correlação positiva foi observada entre a quantidade de DNA e a idade das amostras. A eletroforese mostrou DNA genômico predominantemente nos fragmentos menores (com número menor de pares de base).
Cao et al, em 2003 compararam métodos de extração de DNA de 34 biópsias fixadas em parafina, analisando o gene da β globina, comparando a eficiência de 3 protocolos diferentes de extração. O resultado obtido foi 30/34 (88,2%) com o uso do “boiling method”, 29/34 (85,3%) com utilização de fenol-clorofórmio e 18/34 (52,9%) com um Minikit de extração. Os métodos de extração do DNA que utilizaram o fenol-clorofórmio e o “boiling method” foram os mais eficientes. Na amplificação da PCR de células bucais, com boiling método em 2/16 casos (12%), com fenol clorofórmio em 16/17 casos (94,1%) e com o Kit em 12/16 (75%).
Safaei et al, em 2002 mostrou que a reação em cadeia de polimerase em tecidos parafinizados apresenta-se como um método altamente sensível (92% de sensibilidade) e específico (100% de especificidade) no diagnóstico de leishmaniose cutânea. O estudo dividiu os pacientes em dois grupos: o grupo um, cujos pacientes apresentavam Leishmania a histopatologia, a PCR mostrou parasito em todos os 33 casos. No grupo dois, constituído de 29 pacientes que foram negativos à visualização microscópica de amastigotas, 24 amostras foram positivas através da PCR. Na avaliação histopatológica, os achados mostraram que a presença de granulomas imaturos foi diretamente correlacionada com a detecção de parasitos na biópsia e a presença de granulomas bem formados foi inversamente correlacionada.
Pirmez et al, em 1999 avaliaram 216 pacientes com diagnóstico clínico de leishmaniose, sendo o PCR positivo em 94% (203/216) dos casos, enquanto os métodos convencionais (esfregaço, cultura e reação de Montengro) em 62% destes pacientes. Na doença mucosa o impacto foi maior, pois enquanto o diagnóstico foi realizado em apenas 17% (4/24) dos pacientes por técnicas convencionais, o PCR foi positivo em 71%(17/24) dos pacientes.
Em estudos (Medeiros et al 2002), utilizaram a PCR em 54 biópsias de pele e mucosa de pacientes com diagnóstico clínico e/ou laboratorial de leishmaniose cutâneo americana usando primers gênero-específico (13A e 13B), com resultados positivos obtidos em 82% das amostras. Quando o PCR foi comparado com aqueles do histopatológico, o PCR mostrou resultados superiores com 81.5% de sensibilidade.
Rodrigues et al, 2002 avaliaram 119 biópsias de pele através de PCR do DNA do cinetoplasto de pacientes com Leishmaniose Cutânea Americana de áreas endêmicas do Norte do Brasil. Foram usados “primers” gênero-específico e subgênero Viannia. O PCR específico para o subgênero Viannia teve sensibilidade de 95.4%, enquanto o PCR gênero-específico detectou DNA em 88.2% das amostras testadas.
Faber et al, em 2003 na Holanda realizaram estudo de biópsias de pele de 46 pacientes com suspeita clínica de Leishmaniose Cutânea através de métodos convencionais e encontraram sensibilidade de 65% no esfregaço, 84% na cultura, 82% no histopatológico, 87% na reação de Montenegro, compararam-nos a PCR que identificou 100% , demonstrando ser o mais sensível teste diagnóstico para leishmaniose cutânea.
Mimori et al 1998 realizaram estudo para identificação das cinco principais espécies de Leishmania que causam Leishmaniose Cutânea do Novo Mundo em biópsias fixadas em parafina através da reação em cadeia de polimerase, enfatizando sua importância no arsenal de ferramentas utilizadas no diagnóstico de leishmaniose cutânea.
Na Amazônia, em particular no Estado do Amazonas, a incidência de LTA tem se mantido elevada. A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, que atende em média 47,5% dos casos de leishmaniose do Estado, vem registrando em torno de 1.000 casos novos a cada ano, quase todos oriundos do Município de Manaus, principalmente de áreas periféricas da cidade e das rodovias AM-010 e BR-174.
A doença é endêmica e de elevada incidência no estado do Amazonas; 3.436 casos notificados em 2003. Assim, trabalhos visando seu estudo são importantes, principalmente quando dão ênfase a fase crônica da doença, quando outros métodos falham em demonstrar o parasita na lesão, como exemplo, exame direto, cultura in vitro e histopatológico, pois requerem a presença de número relativamente alto de microorganismos intactos morfologicamente, sendo mais sensíveis apenas nos primeiros meses de doença .
A busca de técnicas mais especificas e reprodutíveis como a PCR ajudam na decisão de condutas clínicas e ações de caráter epidemiológico. Na reação em
cadeia da polimerase, o diagnóstico pode ser dado mesmo na presença de quantidades reduzidas de DNA do parasita, permitindo inclusive o conhecimento das espécies de Leishmania causadoras da doença e minimizando os falsos diagnósticos, como também os efeitos adversos da terapia para leishmaniose.
O presente estudo dá ênfase ao uso da PCR como ferramenta importante no diagnóstico de Leishmaniose Cutânea, principalmente na fase crônica da doença, quando os métodos tradicionais apresentam sua sensibilidade diminuída em decorrência do número reduzido de parasitos encontrados.
2 OBJETIVOS 2.1 Geral
- Diagnosticar Leishmaniose Tegumentar Americana através da PCR em tecidos parafinizados com laudos histopatológicos compatíveis com leishmaniose tegumentar americana.
2.2 Específicos
- Estudar a utilização do PCR no diagnóstico de LTA em tecidos parafinizados, tendo como padrão diagnóstico o laudo histopatológico de compatível com LTA;
- Estabelecer o padrão histopatológico através da microscopia óptica das biópsias de pele compatível com LTA e PCR positivo;
- Realizar estudo comparativo com biópsias de pele PCR positivo com ausência de amastigotas e PCR positivo e presença de amastigotas a histopatologia.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1) População e Modelo de Estudo
Foi realizado estudo transversal, retrospectivo com delineamento do tipo detecção de casos através da técnica de reação em cadeia de polimerase e revisão de 90 biópsias de pele com diagnóstico histopatológico compatível com Leishmaniose Tegumentar Americana (c/c LTA) da Gerência de Anatomia Patológica e análise das Fichas Ambulatoriais do arquivo da Gerência de Leishmaniose/Dermatologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM) no período de 2003 e 2004.
Foram usados como controles positivos biópsias com diagnóstico histopatológico de Leishmaniose tegumentar realizadas na FMTAM e amostras de cultura de leishmaniose cedidas pelo Laboratório de Leishmaniose do Instituto de Nacional de Pesquisa da Amazônia e como controles negativos biópsias de pele com outras patologias, a saber: eritema nodoso, hanseníase, doença de Jorge Lobo, cromomicose tuberculose cutânea e micobacteriose atípica realizadas na FMTAM no período de 2003 a 2004.
3.2) Delimitação da área de estudo
As amostras foram obtidas dos blocos em parafina de biópsias de pele arquivados no Laboratório de Patologia da FMTAM, Centro de Referência Terciária no atendimento de doenças infecciosas na cidade de Manaus.
A cidade de Manaus é a capital do estado do Amazonas e possui população estimada pelos dados do IBGE para 2006 de 1.688,524 habitantes, com área territorial de 11.401,06 km2, situada na margem esquerda do Rio Negro, a 92m acima do nível do mar e apresenta clima quente e úmido. A economia está baseada no turismo e montagem de artigos eletroeletrônicos e setor de duas rodas.
3.3) Critérios de Inclusão:
- Biópsia colhida devido a suspeita clínica de Leishmaniose Tegumentar Americana; - Biópsia com laudo histopatológico compatível com Leishmaniose Tegumentar Americana;
- Quantidade de tecido representativo para a realização da PCR. 3.4) Comitê de Ética:
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa de Seres Humanos da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas em janeiro de 2006 (n.1757/05).
3.5) Procedimentos realizados:
3.5.1) Estudo clínico dos pacientes c/c LTA a histopatologia
Foram analisadas 90 Fichas Ambulatoriais colhidas na gerência de Leishmaniose da FMTAM dos pacientes c/c LTA cujas biópsias foram examinadas na gerência de Anatomia Patológica.
3.5.2) Procedimentos histopatológicos:
Os procedimentos histopatológicos foram realizados no serviço de patologia do FMTAM e seguiram padronização técnica, (Prophet 1994).
Foram revisadas as 90 lâminas dos histopatológicos, com laudo de compatíveis com leishmaniose tegumentar americana, do arquivo da Gerência de Anatomia Patológica dos anos de 2003 e 2004,
O exame histopatológico permite a visualização direta do parasito e/ou a presença de características histopatológicas sugestivas de LTA. Nos casos em que o exame histopatológico não visualiza o agente etiológico, o anatomo-patologista emite o laudo histopatológico de “compatível com Leishmaniose Tegumentar”.
Considera-se “compatível com Leishmaniose Tegumentar” as biópsias de pele com suspeita clínico-epidemiológica de LTA cujo exame histopatológico demonstrou formações granulomatosas, constituídas por células epitelióides, células gigantes tipo Langhans, linfócitos, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, histiócitos vacuolizados e moderado infiltrado de plasmócitos. O desejável é o diagnóstico de certeza, visto que, outros agentes etiológicos podem exibir o mesmo padrão histopatológico, ou seja, inflamação granulomatosa crônica. Figura 2
IV
Figura 2. Padrão histopatológico das biópsias compatível com Leishmaniose cutânea: caracterizado por infiltrado inflamatório crônico granulomatoso constituído por linfócitos, histiócitos, plasmócitos células epitelióides e células gigantes multinucleadas.
As biópsias foram agrupadas de acordo com a classificação histopatológica de Magalhães et al 1986. Numa etapa posterior, 43 biópsias dos 90 pacientes c/c LTA e 40 biópsias dos pacientes com diagnóstico de LTA comprovado na microscopia pela visualização das amastigotas foram avaliadas histopatologicamente, sendo verificadas as seguintes características: hiperplasia, ulceração, necrose e presença de granulomas. O exame microscópico foi realizado avaliando-se seis campos com aumento de 200x em cada lâmina corada pela hematoxilina-eosina, provenientes do arquivo da Gerência de Anatomia Patológica da FMTAM.
Foram analisados também nos seis campos, em aumento de 200x, o número médio de linfócitos e plasmócitos em 36 pacientes c/c LTA à microscopia óptica e PCR positivo para gênero leishmania e 32 pacientes com diagnóstico de LTA à microscopia óptica (com presença de amastigotas).
3.5.3) Procedimentos Moleculares: No protocolo para a realização da PCR as seguintes etapas foram realizadas:
3.5.3.1) Cortes histológicos:
Os blocos de tecido parafinizados foram submetidos a cortes de 20 μm com navalhas descartáveis, uma navalha para cada bloco, em micrótomo usual. Os cortes foram acondicionados em microtubos estéreis e mantidos em geladeira até o momento dos procedimentos para PCR.
3.5.3.2) Desparafinização.
- Adicionou-se aos cortes de 20μm armazenados previamente 1,0 ml de xilol aquecidos em banho-maria a 65º C por 10 min e a seguir centrifugou-se a 13.000 rpm por 5 min a 4º C. Desprezou-se o sobrenadante. O procedimento de lavagem com xilol foi repetido por duas vezes. O sedimento foi mantido à temperatura ambiente em etanol a 100% até completa evaporação do etanol e obtenção de resíduo seco (em torno de 2h).
3.5.3.3) Extração do DNA:
1) Protocolo de fenol/clorofórmio. Isola et al (1994)
- Adicionou-se 500µL de solução tampão ao resíduo seco (0,1M de Nacl 0,01 de Tris Hcl pH 8,0 e 0,001M de EDTA com pH 8,0), 15μL de proteinase k a 1% e 75μL de sulfato de duodecil a 10%, misturando-se cuidadosamente os tubos por inversão. - As amostras permaneceram em banho-maria a 56º C em pernoite e foram misturadas para dissolver qualquer resíduo sólido. Adicionou-se 600μL de fenol agitando-se por inversão por 2 minutos, centrifugando-se as amostras a 14000 rpm por 10 minutos. Em novos tubos retirou-se a fase aquosa, preservando o que não pode ser coletado.
- Adicionou-se 600μL de fenol-clorofórmio/álcool isoamilico (24:24:1) e agitou-se por inversão durante 2 minutos. As amostras foram centrifugadas a 14000 rpm por 10 minutos e em novos tubos, desprezou-se o sobrenadante.
- Adicionou-se 600μL de clorofórmio e misturou-se por 2 minutos, realizou-se centrifugação das amostras a 14000 rpm por 10 minutos e troca para novos tubos, desprezando o sobrenadante.
- Adicionou-se 55μl de 5M NaCl em cada tubo (10% do volume total) e 1000μl de álcool absoluto (a 95%), misturou-se cuidadosamente os tubos por inversão.
- As amostras permaneceram à temperatura de - 20ºC em pernoite e então foram centrifugadas a 14000 rpm por 10 minutos. Desprezou-se o álcool, deixando o resíduo que foi lavado em 500μL de álcool a 70% . Removeu-se o álcool, deixando o resíduo de DNA secar a temperatura ambiente e depois se dissolveu o resíduo em 50μl de água. Armazenou-se o DNA à temperatura de -20º C em freezer.
2) Protocolo de extração com sal. (Disch et al 2004)
- Após a retirada da parafina, colocou-se em banho-maria e adicionou-se 500μl de solução tampão “STF buffer” e 15μl de proteinase k a 1% e 75μl de sulfato de duodecil a 10% em cada tubo, misturou-se cuidadosamente os tubos com movimentos de inversão. As amostras permaneceram em pernoite no banho-maria (56°C) e foram misturadas para dissolver qualquer fragmento sólido.
- Adicionou-se 60μl de 5M NaCl em cada tubo (volume total de 10%) e misturou-se o conteúdo dos tubos por inversão, permanecendo em refrigeração de 1h ao pernoite. Centrifugaram-se as amostras a 14000 rpm por 10 minutos.
- Retirou-se a parte aquosa e colocou-se o sobrenadante em novos tubos, permanecendo no gelo. Centrifugou-se o sobrenadante a 14000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi colocado em novos tubos e adicionou-se 1000μl de álcool absoluto (a 95%) que foram misturados cuidadosamente. As amostras permaneceram em pernoite no freezer a -20° C. Centrifugaram-se as amostras a 14000rpm por 10 minutos. Desprezou-se o álcool deixando o resíduo de DNA, adicionou-se 500μl de álcool a 70%. Repetiram-se as etapas de centrifugação e retirada do álcool, deixando o resíduo secar a temperatura ambiente. Quando os tubos secaram, o resíduo foi ressuspenso em 50μL de água. Armazenou-se o DNA a - 20°C em freezer.
Obs: Solução tampão (STE): 0,1M de NaCl, 0,01M deTris HCL (pH 8,0), 0,001M EDTA (pH 8,0).
3.5.3.4) Amplificação da PCR:
Para a realização da PCR utilizou-se uma enzima termoestável (DNA polimerase) que, na presença de oligonucleotídios iniciadores (primers) e dos nucleotídeos, que compõem a molécula de DNA, amplificou a região de interesse. Molina et al 2004. Foram usados primers para amplificar regiões do minicírculo do DNA do cinetoplasto da Leishmania (kDNA). A seqüência de nucleotídeos dos primers utilizada foi
Leishmania sp 13 A (5-GTGGGGGAGGGGCGTTCT-3), 13 B (5- ATTTTACACCAACCCCCAGTT-3) e seguiu protocolo de (Rodgers et al 1990).
Esta amplificação ocorreu durante repetidos ciclos de temperatura, a saber: 94ºC para a desnaturação (separação das fitas de DNA), de 45ºC a 70ºC para o anelamento (ligação) dos nucleotídeos iniciadores (primers da marca Invitrogen) às seqüências complementares e 72ºC para a síntese do DNA com a ligação dos nucleotídeos complementares da marca Invitrogen, realizada pela enzima taq polimerase da marca Invitrogen em equipamentos chamados de termocicladores, utilizou-se termociclador da marca Eppendorf Mastercycler gradient.
As amostras de DNA foram adicionadas à mistura contendo os seguintes reagentes: Tampão 1x, dNTP 1mM, MgCl 1,5mM, Primer 1mM, Taq polimerase 2,5 u/μL . A reação de amplificação ocorreu no termociclador com sucessivas mudanças de temperatura abaixo assinaladas. Quadro 3.
Quadro 3. Número de ciclos, tempo e temperatura da reação de amplificação no termociclador. Ciclos/Repetições Temperatura/Tempo Pré-ciclo – 1 94ºC - 2 min Ciclo – 40 94ºC - 45 seg. 50ºC - 45 seg. 72ºC - 45 seg. Pós-ciclo – 1 72ºC – 7 min
3.5.3.5) Detecção dos produtos da PCR
Após a reação PCR, as amostras foram submetidas a uma separação eletroforética (cuba de eletroforese Maxfill) em gel de agarose submerso em tampão TBE 1x e corado por brometo de etídio, o material amplificado foi visualizado como uma banda e analisado de acordo com o seu peso molecular, (Davis et al 1994).
3.5.3.6) Preparação do Gel
Adicionou-se 3g de agarose em 150mL de tampão TBE1x que foi completamente dissolvido sobre aquecimento em microondas durante 4 minutos. Adicionou-se 2,5μL de brometo de etídio para cada 50mL de solução contendo agarose e o tampão TBE.
3.5.3.7) Preparação das amostras
Aplicação do gel na cuba de eletroforese, aplicaram-se os “pentes” para a formação dos poços, adicionou-se solução tampão TBE1x, as amostras homogeneizadas 1mM e 2μl do Ladder de marca Invitrogen com intervalo para identificação de fragmentos de DNA entre 100 e 1500 pares de base foram transferidos com o auxilio de uma micropipeta para cada um dos poços do gel. A cuba foi conectada à fonte de eletroforese durante 60 min.
3.5.3.8) Visualização dos produtos da PCR
Após o termino da eletroforese, o gel de agarose foi retirado da cuba e levado para a visualização sobre luz ultravioleta no transiluminador UVP (Upland CA91786 USA Model, 115 v 60Hg, 60 Amps). As fotos foram obtidas com maquina fotográfica digital Canon Power Shot G6 e repassadas ao computador através de cabo de USB, as imagens obtidas foram gravadas em formato de arquivo “JPEG” para documentação e os produtos amplificados foram analisados.
A análise do gel consistiu na visualização das "bandas" dos produtos amplificados, comparativamente com os produtos amplificados relativos aos controles positivos negativos e os Ladder estipulados em cada PCR realizado.
3.5.3.9) Controles positivos e negativos
Em cada grupo de amplificações foram utilizados como controles positivos biópsias de pele com diagnóstico histopatológico de Leishmaniose Tegumentar Americana com moderada ou acentuada quantidade de parasitos visualizados à microscopia óptica e culturas de leishmaniose de cepas cedidas pelo INPA e como controles negativos biópsias de pele com diagnóstico histopatológico de outras doenças granulomatosas, a saber: eritema nodoso, hanseníase, doença de Jorge Lobo, cromomicose, tuberculose cutânea e micobacteriose atípica. Além desses, também foi incluída uma alíquota da mistura de reagentes, sem DNA, para descartar contaminações da mesma.
3.6) Análise estatística
Realizou-se um estudo através do Teste-t entre as médias do total do número de linfócitos e plasmócitos das biópsias c/c LTA e PCR positiva, comparando com os pacientes com Leishmanias evidenciadas a histopatologia.
4 RESULTADOS
4.1. Resultados do estudo clínico dos pacientes compatíveis com LTA
4.1. 1 . sexo.
O resultado da análise das 90 fichas ambulatoriais colhidas na gerência de Leishmaniose da FMTAM dos pacientes c/c LTA cujas biópsias foram examinadas na gerência de Anatomia Patológica, mostrou um predomínio do sexo masculino com 75 casos (85,2 %) sobre o feminino com 13 casos (14,8%). Figura 3.
Masculino 85,2%
Fem inino 14,8%
Figura 3. Distribuição dos pacientes c/c LTA a histopatologia quanto ao sexo. Mas = masculino, Fem = feminino. N (88).
4.1.2. Faixa etária.
A faixa etária mais acometida variou entre 20 e 39 anos de idade com 38 pacientes (42,69% dos casos), a idade média dos pacientes foi 32,36 anos (de dois até 72 anos). Tabela 1.
Tabela 1. Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com a faixa etária.
Faixa etária Freqüência %
0-12 13-19 20-39 40-59 ≥ 60 Total 4 20 38 20 7 89 4,49 22,47 42,69 22,47 7,86 100
4.1.3. Localização das lesões.
As lesões dos pacientes c/c LTA localizaram-se mais freqüentemente no membro inferior esquerdo com 19 amostras (26,02%) e membro superior esquerdo com 15 pacientes (20,54%). Figura 4.
MSE MSD MIE MID OU
LOCALIZAÇÃO 0 5 10 15 20 25 30 N ° D E C A S O S
Figura 4. Principais localizações das lesões ulceradas nos segmentos do corpo. MSD = membro superior direito, MID = membro inferior direito, MSE = membro superior esquerdo MIE = membro inferior esquerdo, OU = outras localizações.
4.1.4. Número de lesões ulceradas
Na maioria dos casos, 48 pacientes (75%) apresentavam uma ou duas lesões, o número de lesões variou entre um e 20 lesões ulceradas. A média do
número de lesões foi de 2,5 e em 33(51,56%) dos casos, o paciente apresentava apenas uma lesão. Tabela 2.
Tabela 2. Distribuição do número de lesões ulceradas dos pacientes c/c LTA ( N = 64).
Número de lesões Freqüência %
1 2 3 4 5 6 ≥ 7 Total 33 15 7 2 2 3 2 64 51,56 23,47 10,93 3,12 3,12 4,68 3,12 100
4.1.5. Tempo de evolução das lesões ulceradas.
O tempo de evolução das lesões ulceradas, correspondente ao período do início dos sintomas e a consulta no ambulatório de Leishmaniose, ocorreu predominantemente nos primeiros três meses de evolução em 59,32%, em 86,44% dos casos o tempo de evolução foi maior que de um mês. Tabela 3.
Tabela 3. Freqüência de casos de c/c LTA de acordo com o tempo de evolução em intervalo de meses. N=59. Tempo de lesão (meses) Freqüência % < 3 m 3-5 m 6-11 m ≥ 12 m Total 35 18 5 1 59 59,32 30,50 8,47 1,69 100
4.2. Estudo laboratorial.
4.2.1. Resultados da reavaliação histopatológica
As 90 biópsias dos pacientes c/c LTA a histopatologia foram revisadas e agrupadas de acordo com a classificação histopatológica de Magalhães et al 1986, 19 amostras (21,11%) foram classificados como do tipo I (reação exsudativa e celular), 11 (12,22%) do tipo III (reação exsudativa e necrótica-granulomatosa), 56 pacientes (62,22%), correspondendo à maioria dos casos, foram classificados como do tipo IV (reação exsudativa e granulomatosa), Figura 5. Um paciente (1,11%) foi classificado como do tipo V (reação exsudativa e tuberculóide), nenhum paciente foi agrupado como do tipo II (reação exsudativa e necrótica). Entre estes pacientes classificados de acordo com Magalhães et al, três demonstraram PCR negativa (dois casos classificados como do tipo III e um paciente do tipo IV), Tabela 7.
Figura 5. Tipo histopatológico mais freqüentemente encontrado no presente estudo. Tipo IV de Magalhães et al 1986.
Tabela 4. Distribuição do número de casos de acordo com o tipo histopatológico usando a classificação de (Magalhães et al 1986).
PCR + % PCR - % TOTAL % Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV Tipo V Não clas. Total 19 0 9 55 1 3 87 21,11 0 10 60 1,11 3,33 96,66 0 0 2 1 0 0 3 0 0 2,22 1,11 0 0 3,33 19 0 11 56 1 3 90 21,11 0 12,22 62,22 1,11 4,44 100
Outros três pacientes apresentaram PCR positiva mesmo com infiltrado inflamatório incipiente, constituído por escassos linfócitos, histiócitos e proliferação fibrovascular, não evidenciando características suficientes para serem agrupados na classificação acima utilizada.
Numa etapa posterior, 43 dos 90 pacientes c/c LTA, a partir do caso com numeração histopatológica mais baixa, foram escolhidos um caso sim e outro não, sendo verificadas as seguintes alterações histopatológicas: hiperplasia, ulceração, necrose e presença de granulomas. A ulceração foi presente em 11 casos (25,58%) e ausente na maioria dos casos 32 (74,41%). A hiperplasia do epitélio de revestimento ocorreu em 36 (90 %) dos casos e ausente em quatro (10 %). A necrose foi presente em apenas 11 casos (25,58%) e ausente em 32 (74,41%) correspondendo a maioria dos casos. Os granulomas foram presentes em 39 dos 43 casos correspondendo a 90.69% . Tabela 5.
Tabela 5. Resultado da análise das características histopatológicas das biópsias c/c LTA .
Ausente % Presente Total %
Ulceração Hiperplasia Necrose Granuloma 32 4 1. 32 4 74,41 10 74,41 9,3 11 36 11 39 43 40 43 43 25,58 90 25,58 90,69
Foram avaliadas as mesmas características em 40 biópsias de pacientes com LTA comprovada pela visualização das amastigotas a histopatologia, retiradas do arquivo da Gerência de Anatomia Patológica dos anos de Janeiro de 2004 a Fevereiro de 2007. A ulceração foi positiva em 25(62,5%) casos e negativa em 15(37,5%). A hiperplasia foi presente em 38 casos (95%) e negativa em dois casos (5%). A necrose surgiu em três casos (7,5%) e foi ausente em 37 (92,5%). A presença de granuloma foi encontrada em 15 casos (37,5%) e ausente em 25 (62,5 %). Tabela 6.
Tabela 6. Distribuição dos casos de LTA a microscopia óptica de acordo com características histopatológica.
AUSENTE % PRESENTE Total %
Ulceração Hiperplasia Necrose Granuloma 15 2 37 25 37,5 5 92,5 62,5 25 38 3 15 40 40 40 40 62,5 95 7,5 37,5
Realizou-se o Teste estatístico de Z para comparar as proporções das características histopatológicas descritas, a saber: ulceração, hiperplasia, necrose e presença de granuloma dos pacientes compatíveis com LTA e dos pacientes com LTA. O resultado demonstrou diferença estatística significativa quando correlacionada ulceração, necrose e presença de granuloma e diferença estatística não significativa quando analisada a presença de hiperplasia. Os resultados foram descritos na tabela 7.
Tabela 7. Resultado do teste estatístico para proporções (Teste Z) das características histopatológicas
c/c LTA LTA Valor do P
Ulceração Hiperplasia Necrose Granuloma 0,25 0,90 0,25 0,90 0,62 0,95 0,07 0,40 p= 0,00 p= 0,67 p= 0,02 p= 0,00
Foram analisados também o número de linfócitos e plasmócitos em 36 pacientes c/c LTA à microscopia óptica e PCR positivo para gênero leishmania e 32 pacientes LTA positivos à microscopia óptica. O número médio nos casos c/c LTA foi, linfócitos 13,35 e plasmócitos 11,72. Nos casos positivos para LTA, a microscopia apresentou um número médio de linfócitos de 7,34 e de plasmócitos foi de 7,37. Tabela 7.
Tabela 8. Distribuição do número médio de linfócitos e plasmócitos nos pacientes c/c LTA e PCR positivo e negativo para gênero Leishmania e nos casos positivos para LTA a microscopia óptica.
Nº. médio C/C LTA (PCR+) LTA
Linfócitos plasmócitos 13,35 11,72 7,34 7,37
Realizou-se um estudo através do Teste-t entre as médias do total do número de linfócitos e plasmócitos das amostras c/c LTA e PCR positiva, escolhidas de forma alternada dos 90 casos estudados e 32 amostras com diagnóstico de LTA a histopatologia. Evidenciando um p=0,0009 para a diferença do número de linfócitos entre os dois grupos e um p=0,017 para a diferença do número de plasmócitos, demonstrando assim diferença estatística significativa (p< 0,05).
4.2. 2. Resultados obtidos pelo estudo utilizando a PCR
Os resultados obtidos com a PCR para gênero demonstraram a presença de DNA de leishmania em 87 (96,66%) dos casos estudados. Na figura 6 Observa-se a amplificação de bandas de aproximadamente 120 pb, correspondentes a região conservada do minicírculo de kDNA, nas amostras 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 , sendo a amplificação negativa nas amostras 13 e 14. A amostra 17 corresponde ao controle negativo (biópsia de pele com outras patologias granulomatosas) e a amostra um apresentou banda fraca sendo posteriormente confirmada como positiva.
Figura 6. Eletroforese em gel de agarose a 2, 0% corado pelo brometo de etídio representando os produtos de amplificação de DNA de Leishmania através de PCR. Amostras de pacientes c/c LTA negativas para a amplificação do DNA de
5 DISCUSSÃO
A reação em cadeia de polimerase tem sido grandemente aplicada para a detecção de agentes infecciosos, tal como vírus, bactérias e protozoários, (Weigle et al 2002). O diagnóstico de Leishmaniose Cutânea através dos métodos diagnósticos tradicionais tal como cultura in vitro e o exame histopatológico requerem a presença de número relativamente alto de microorganismos morfologicamente intactos, porém, na fase crônica da Leishmaniose Cutânea o número de parasitos nas biópsias de pele é muito baixo, tornando difícil o diagnóstico nas fases tardias.( Laskay et al 1995); (Salman et al 1999). (Gontijo et al 2003).
Neste estudo, na avaliação dos dados clínicos e epidemiológicos, verificou-se um predomínio do sexo masculino, em idade produtiva, com uma variação ampla na faixa etária, de crianças a idosos, com maior freqüência nos membros inferiores, resultados semelhantes são amplamente referidos na literatura. O sexo masculino e a idade dentro da faixa produtiva seriam decorrentes de hábitos e profissões que manteriam o homem em contato maior com o vetor. Veronesi et al 2004.
Na literatura, vários trabalhos correlacionam a maior incidência de LTA em homens a profissões exercidas predominantemente pelo sexo masculino que adentrariam as matas, aproximando, assim, o homem do vetor transmissor da doença. Os treinamentos militares na selva amazônica constituem importantes fatores na incidência de leishmaniose tegumentar americana, (Guerra et al 2003).
Basano et al, em 2004 em Rondônia fizeram um estudo abordando histórico, epidemiologia e perspectivas de controle da Leishmaniose Tegumentar Americana, correlacionaram os perfis básicos de transmissão da LTA no Brasil: referem um perfil puramente silvestre, associado à abertura de estradas, mineração e agricultura, um perfil peridomiciliar menos freqüente e um perfil na interface da área peridomiciliar com nas áreas das matas relacionado com a agricultura.
Achados similares ao presente trabalho foram encontrados por Romero et al em 2001 que fizeram um estudo comparativo clínico e de achados laboratoriais de pacientes do estado da Bahia, Brasil com Leishmania brasiliensis (grupo A) e
pacientes do estado do Amazonas, Brasil com Leishmania guyanensis (grupo B) encontraram uma predomínio no sexo masculino com respectivamente 74% e 81% dos casos, a média de idade foi de 23 anos no grupo A (de 11-57 anos) e 25 anos no grupo B (de 8-60 anos). Correlacionando a localização das lesões ulceradas, o segmento corporal mais freqüentemente comprometido foram os membros inferiores, com 60% no grupo A e 47% no grupo B.
De forma similar ao presente estudo, outro trabalho demonstra o predomínio do sexo masculino, com faixa etária, e Ramirez et al em 2000 na Colômbia fizeram um estudo clinico e laboratorial da Leishmaniose Cutânea em 115 pacientes, encontrando também um predomínio do sexo masculino (81,7%), com lesão única (64,5%), mais freqüentemente na faixa etária de 18 a 35 anos (59,1%).
Nossos resultados aproximam-se também de Passos et al em 2001 que fizeram estudo descritivo retrospectivo com 358 pacientes com suspeita clínica de LTA, avaliando fatores clínicos, laboratoriais e terapêuticos, encontrando um predomínio em homens (65,3%), com idade média entre seis meses e 80 anos (mediana = 32 anos).
Passos et al em 2001 fizeram também referência às localizações das lesões ulceradas nos segmentos corporais, encontrando em ordem decrescente de freqüência: membro inferior, membro superior, cabeça, tronco, abdome e genitália. O predomínio de áreas expostas do corpo e do aspecto ulcerado corresponde à descrição mais freqüente das lesões cutâneas da LTA.
A distribuição por gênero e idade sugere a coexistência de dois modelos de transmissão da LTA compreendendo o maior grupo de homens, adultos, que sugere transmissão extradomiciliar em população economicamente ativa, enquanto que o atendimento de mulheres e crianças sugere uma transmissão intra e/ou peridomiciliar. Ampuero et al em 2006 na Bahia levantaram está possibilidade da transmissão peridomiciliar, fazendo um estudo retrospectivo, analisando 4.640 fichas de atendimento ambulatorial de LTA, encontrando 491 crianças de 0 a 5 anos de idade.
Na análise dos nossos dados, de acordo com a classificação histopatológica de Magalhães et al 1986, ocorreu um predominou do grupo IV(reação exsudativa e granulomatosa) correspondendo à maioria dos casos. Resultado semelhante foi encontrado por Andrade-Narvaez et al 2005 que fizeram um estudo histopatológico da leishmaniose cutânea na Penísula de Yucatan, no México, os achados foram agrupados de acordo com a classificação proposta por Magalhães et al 1986, encontrando com maior freqüência o tipo IV (reação exsudativa e granulomatosa) em 43,83% dos casos. As 73 biópsias de Leishmaniose Cutânea apresentaram um predomínio do sexo masculino 93,15%, a idade variou entre sete e 69 anos e mais comumente com uma única lesão em 82,19% e localizada na orelha em 35% dos casos.
Duarte et al, em 2002 fizeram um estudo em Alagoas de 21 pacientes com diagnóstico clínico e epidemiológico de Leishmaniose Cutânea, confirmados pelo uso de anticorpo policlonal anti-leishmania. Na análise histopatológica baseada na classificação de Magalhães et al 1986, encontraram um predomínio dos grupos I e II. No presente estudo os tipos histopatológicos mais encontrados fora o tipo I e IV. O estudo analisou e quantificou através da imunohistoquímica os dendrócitos dérmicos, FXIIIa+, as células de Langerhans CD1a+, os macrófagos CD68+, linfócitos B CD20 e linfócitos T CD3+, comparando os resultados com a pele normal.
Safei et al em 2002 no Iran também analisaram a presença de inflamação granulomatosa que foi encontrada em 52 dos 54 pacientes com PCR positivo nas biópsias de pele com suspeita clínica de LTA . No presente trabalho também encontramos a presença de granuloma na maioria dos casos, 83,72% dos pacientes compatíveis com leishmaniose cutânea e PCR positivo.
Medeiros et al em 2005 no estado de São Paulo, Brasil, fizeram um estudo com 54 biópsias de pele e mucosa e compararam o resultado da PCR com a presença de granulomas detectados a histopatologia. Das 44 amostras com PCR positiva, 25 apresentaram granulomas (56,8%) e sete dos 10 casos com PCR negativo não apresentavam formação de granulomas. No presente trabalho, os granulomas foram encontrados em 90.69% dos casos c/c LTA a histopatologia e PCR positiva.
O achado de reação granulomatosa como característica histopatológica importante no presente estudo pode denotar o tempo de evolução da doença, pois a maioria dos pacientes (86,44%) apresentava tempo de evolução maior que um mês. Alguns autores relatam uma estreita correlação com o tempo de doença e a presença de granuloma.
Azulay 1960 realizou estudo histopatológico descrevendo a inflamação exsudativa aguda como modalidade reacional de início na evolução da LTA e a formação de granulomas como um processo tardio. Laurenti et al 1990 realizaram um estudo dos eventos histopatológicos que ocorrem na formação do granuloma, concluindo que na pele a formação do granuloma é usualmente completada dentro de 45 dias após a inoculação do parasito.
No presente estudo, três pacientes apresentaram PCR positiva mesmo com granulomas incipientes, linfócitos, histiócitos e proliferação fibrovascular, não evidenciando características suficientes para serem agrupadas na classificação acima utilizada. Alguns estudos científicos demonstraram que, mesmo após a cura clínica, testes moleculares evidenciaram DNA de Leishmania e em alguns casos parasitos viáveis através da cultura de amostras de cicatrizes de Leishmaniose Cutânea. (Mendonça et al 2004); (Botelho et al 2003).
A PCR pode ser de especial importância para o diagnóstico de Leishmaniose Cutânea nas fases crônicas da doença quando outros métodos falham em demonstrar o parasito nas lesões granulomatosas, sendo alta a sua sensibilidade. Furtado 1980, em seu estudo refere que a chance de encontrar o parasito nas lesões ulceradas é inversamente proporcional ao tempo de evolução da doença que no caso de LTA causada por Leishmania (V) brasiliensis seria de 100% nos primeiros 2 meses, 75% até os 6 meses e 20% acima de 12 meses de evolução.
Os resultados obtidos com a PCR para gênero Leishmania no presente estudo demonstraram a presença de DNA de leishmania em 87 (96,66%) dos casos com suspeita clínica e histopatológica de LTA, porém, sem evidências do parasita à microscopia, vários estudos na literatura, de forma similar apontam a alta
sensibilidade do PCR como ferramenta no diagnóstico de Leishmaniose cutânea, mesmo em tecidos fixados em formol e emblocados em parafina.
No presente estudo, a extração de DNA de biópsias fixadas em formol e emblocadas em parafina permitiu a amplificação do DNA através da reação em cadeia de polimerase em 96,66% das biópsias de pacientes c/c LTA, demonstrando assim, alta sensibilidade. Alguns autores como Momeni et al 1996, no entanto, alegam uma baixa sensibilidade do método em decorrência da degradação do DNA pela fixação em formol e o tempo de emblocamento. Vários outros autores, Laskay et al 1995, Rodgers et al 1990.
Weigle em 2002 na Colômbia estudou casos agudos e crônicos de LTA através da PCR com primers para fragmentos do minicírculo do kDNA comparando com métodos utilizados habitualmente no diagnóstico de Leishmaniose Cutânea. Os métodos convencionais apresentaram sensibilidade variável, 4,5% no esfregaço, 22,7% na cultura de biópsia, 18,2%na cultura do aspirado e 45,5% no PCR. O estudo conclui que a PCR nos casos crônicos de LTA foi mais sensível que os métodos convencionais e deve ser considerada e incorporada nas estratégias diagnósticas de Leishmaniose Cutânea Crônica.
No estudo de Weigle os resultados demonstraram baixos índices de detecção da parasita da LTA nos exames convencionais e também na PCR, não sendo feito referência neste trabalho se os casos foram realizados em ambulatório geral de úlcera, o que traduziria estes resultados baixos dos exames realizados. No presente estudo os pacientes apresentaram história epidemiológica, achados clínicos e histopatológicos altamente sugestivos de leishmaniose cutânea, sendo provavelmente o motivo do alto número de pacientes que apresentaram PCR positivo.
A fixação de tecidos com formol a 10% é um método prático e eficiente para a preservação arquitetural do tecido, sendo assim um método largamente utilizado na anatomia patológica. Porém, esse tipo de fixação resulta no enovelamento de proteínas nucleares na forma de ligações entre proteínas e o DNA e vários estudos
