Estrutura genética espacial de população de duas espécies simpátricas de Tabebuia no parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco, GO

I

Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Stricto Sensu

em Ciências Genômicas e Biotecnologia

ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL DE POPULAÇÃO DE

DUAS ESPÉCIES SIMPÁTRICAS DE

Tabebuia

NO PARQUE

ESTADUAL ALTAMIRO DE MOURA PACHECO, GO

Brasília - DF

2011

Autora: Marina Lopes Ribeiro

Orientadora:

Dra. Rosane Garcia Collevatti

II

MARINA LOPES RIBEIRO

ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL DE POPULAÇÃO DE DUAS ESPÉCIES

SIMPÁTRICAS DE Tabebuia NO PARQUE ESTADUAL ALTAMIRO DE MOURA

PACHECO, GO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação “Stricto Sensu” em Ciências

Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia.

Orientadora: Dra. Rosane Garcia Collevatti

Co-orientadora: Dra. Mariana Pires de

Campos Telles

III Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB

R484e Ribeiro, Marina Lopes

Estrutura genética espacial de população de duas espécies simpátricas de Tabebuia no Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco, GO. / Marina Lopes Ribeiro – 2011.

64f. : il.; 30 cm

Dissertação (mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2011.

Orientação: Rosane Garcia Collevatti

Co-orientação: Mariana Pires de Campos Telles

1.Genética de populações. 2. Ipê. 3. Cerrado. 4. Biotecnologia. I. Collevatti, Rosane Garcia, orient. II. Telles, Mariana Pires de Campos, co-orient. III.Título.

IV Dissertação defendida e aprovada como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia, defendida e aprovada, em 17 de dezembro de 2010 pela banca examinadora constituída por:

Brasília 2011

Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho

Dr. Dario Grattapaglia

Dra. Mariana Pires de Campos Telles

V

RESUMO

Limitações do fluxo gênico que levem a estruturação espacial da população podem gerar consequências como a redução da variabilidade genética intra-populacional e o aumento dos níveis de endocruzamento afetando a dinâmica e a viabilidade das populações em longo prazo. Dessa forma, o estudo da estrutura genética espacial é muito importante para entender a dinâmica de uma população, assim como para as aplicações práticas desse conhecimento na manutenção sustentável de florestas produtivas e áreas conservadas. Esse trabalho, realizado dentro do Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco (PEAMP), tem o objetivo de estudar a estrutura genética espacial de uma população das espécies Tabebuia chrysotricha

(Ipê-amarelo) e Tabebuia roseo-alba (Ipê-branco) com a finalidade de gerar conhecimento

adicional para o desenvolvimento de estratégias de conservação e manejo sustentável das espécies no Cerrado. Para isso, todos os indivíduos dessas espécies presentes em cinco transectos traçados de forma sistemática na área foram mapeados e tiveram suas folhas coletadas. Posteriormente, foram realizados testes sistemáticos de transferibilidade de locos microssatélites desenvolvidos para Tabebuia aurea e a genotipagem dos indivíduos foi feita

para os locos com resultados promissores. A heterozigosidade média esperada em equilíbrio de Hardy-Weinberg (He), a heterozigosidade observada (Ho), o número médio de alelos por loco (A) e o índice de fixação (Fis) foram mensurados para a população de cada espécie

estudada. A estrutura genética espacial foi estudada com a utilização do programa SPAGeDi que calcula um coeficiente de parentesco par-a-par e o relaciona com a distância espacial entre os indivíduos. A transferibilidade dos locos microssatélites se mostrou difícil dentro do gênero Tabebuia. A população de T. roseo-alba apresentou indícios de endogamia que podem

ser atribuídos ao elevado cruzamento entre indivíduos aparentados. Esse efeito pode ser observado em populações com limitação na distância de polinização. A análise da estrutura genética espacial intra-populacional indicou que as duas espécies estudadas apresentam estruturação espacial significativa, apesar de em T. chrysotricha essa estruturação ser mais

forte (Sp = 0,020) com um claro padrão de isolamento por distância com indivíduos de até 29,1 m sendo mais aparentados entre si. Esse padrão pode ocorre em espécies com limitação na dispersão de sementes. Já em T. roseo-alba (Sp = 0,008) não se verificou um padrão claro

VI esses resultados podem ter sido influenciados pela amostragem. Como as espécies estudadas se encontrarem em uma Área de Conservação de Proteção Integral, o Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco (PEAMP), a análise da estrutura genética espacial dessas populações pode auxiliar no planejamento da gestão dessa unidade de conservação. Além disso, esses dados podem ser utilizados no planejamento de projetos de manejo florestal em remanescentes próximos ao local de estudo.

VII

ABSTRACT

Gene flow limitations that lead to a population spatial structure can cause consequences such as the genetic variability reduction and increased levels of inbreeding affecting the populations dynamic and viability in the long term. So, spatial genetic structure studies are very important to understand a specie population genetic as well as the practical applications of this knowledge in the productive forests and preserved areas sustainable maintenance. This study, conducted in the Altamiro de Moura Pacheco State Park (PEAMP) –

GO, aims to study the population spatial genetic structure of Tabebuia chrysotricha e Tabebuia roseo-alba in order to produce additional knowledge for the development of

conservations strategies and sustainable management of this species in Cerrado. For this, all individuals of this species find in five transects systematically traced in the area were mapped and had their leaves collected. Later, systematic transferability tests of microsatellites loci developed for Tabebuia aurea were conduct and all individuals were genotyped for the loci

with promising results. The mean expected heterozygosity in Hardy-Weinberg equilibrium (He), observed heterozygosity (Ho), mean number of alleles per polymorphic loco (P), and fixation index (Fis) were measure for the population of each species studied. The spatial

genetic structure was study using the SPAGeDi program that computes a pairwise kinship coefficient and related it with spatial distances between the individuals. The microsatellites locos transferability was difficulty in Tabebuia genera. T. roseo-alba population shows

endogamy tracks that can be explain by the high levels of relative mating. This effect can by observe in populations with limited pollination distance. The intra-population spatial genetic structure analyses demonstrated that both studied species showed significant spatial structure, although in T. chrysotricha this structure were much more intense (Sp = 0,020) and a clear

isolation by distance pattern were found with individuals up to 29.1 m more closely related to each other. This pattern occurs in species with limited seed dispersion. In T. roseo-alba (Sp =

0,008) the pattern between kinship coefficient and distance was not clear. The distance of gene dispersal was found higher in T. roseo-alba (Nb = 122,78) than in T. chrysotricha (Nb =

VIII this area. Furthermore, this results can be used in the planning of forest management projects in nears remaining natural fragments.

IX

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: LOCALIZAÇÃO DO PARQUE ALTAMIRO DE MOURA PACHECO, DENTRO DO CONTEXTO DAS MICRORREGIÕES DO ESTADO DE GOIÁS PRÓXIMAS AO PARQUE.FONTE:SEMARH(2008). ... 3

FIGURA 2:ASPECTOS MORFOLÓGICOS DE TABEBUIA CHRYSOTRICHA _{(MART. EX A.DC.)STANDL. A} –_FLORES;

B –CASCA; C –FOLHAS; D –FRUTOS.FONTE:KRAUSET AL.,2005. ... 7

FIGURA 3: ASPECTOS MORFOLÓGICOS DE TABEBUIA ROSEO-ALBA (R_IDL.)S_AND. _A –F_LORES; _B – F_RUTOS

VERDES (OBSERVAR AS FOLHAS COMPOSTAS TRIFOLIOLADAS); C – FRUTO COM DEISCÊNCIA PARA DISPERSÃO DAS SEMENTES. ... 9

FIGURA 4:LOCALIZAÇÃO DA BR-060/153 CORTANDO O PARQUE ALTAMIRO DE MOURA PACHECO (PEAMP),

GOIÁS.FONTE:GOOGLE EARTH (2007). ... 16

FIGURA 5:MAPA HIDROGRÁFICO DA REGIÃO DO PARQUE ALTAMIRO DE MOURA PACHECO, QUE PERTENCE A

BACIA DO PARANÁ.FONTE:SEMARH(2008). ... 17

FIGURA 6: DETALHE DE USO DO SOLO NA REGIÃO DO PARQUE ALTAMIRO DE MOURA PACHECO (ACIMA, À DIREITA) E DO PARQUE DOS IPÊS (À ESQUERDA), CIRCUNDADOS EM AMARELO. VERDE ESCURO – VEGETAÇÃO NATIVA, ROSA – ÁREA URBANA, VERDE ACLARO – ÁREAS CULTIVADAS. FONTE: SEMARH (2008). ... 18

FIGURA 7: REGIÃO QUE FOI ALAGADA PELA REPRESA DO RIBEIRÃO JOÃO LEITE, DENTRO DO PEAMP E

PARQUE DOS IPÊS (ÁREAS CIRCUNDADAS EM AMARELO).ABAIXO, À ESQUERDA (AZUL CLARO), CANTEIRO

DE OBRAS DA REPRESA.FONTE:SEMARH(2008). ... 18

FIGURA 8: DISTRIBUIÇÃO DOS INDIVÍDUOS DE TABEBUIA _{NOS TRANSECTOS AMOSTRADOS NO} P_ARQUE

ESTADUAL ALTAMIRO DE MOURA PACHECO – GO. OS EIXOS X E Y REPRESENTAM DISTÂNCIAS EM METRO NAS DUAS DIMENSÕES. ... 19

FIGURA 9:DISTRIBUIÇÃO DE ALTURA DOS INDIVÍDUOS COLETADOS DE TABEBUIA CHRYSOTRICHA E T.

ROSEO-ALBA. ... 20

FIGURA 10: DISTRIBUIÇÃO DAS FREQUÊNCIAS ALÉLICAS ENCONTRADA NAS POPULAÇÕES DE TABEBUIA

CHRYSOTRICHA (TC) _E TABEBUIA ROSEO-ALBA(TR) _NO PEAMP.O _{EIXO DAS ORDENADAS INDICA AS}

FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E O EIXO DAS ABSCISSAS INDICA OS ALELOS ENCONTRADOS PARA CADA LOCO...

... 29

FIGURA 11: DISTRIBUIÇÃO DAS DISTÂNCIAS PAR-A-PAR DOS INDIVÍDUOS DE T. CHRYSOTRICHA (TC) _E T.

X

FIGURA 12:RELAÇÃO ENTRE O COEFICIENTE DE PARENTESCO (FIJ ±SE) E O LOGARITMO DA DISTÂNCIA ENTRE

INDIVÍDUOS PARA A POPULAÇÃO DE TABEBUIA CHRYSOTRICHA.A_{S LINHAS TRACEJADAS CORRESPONDEM}

AO INTERVALO DE CONFIANÇA A 95% DE PROBABILIDADE BASEADO NA HIPÓTESE NULA DE AUSÊNCIA DE ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL. OS ASTERISCOS (*) INDICAM OS VALORES DE PARENTESCO SIGNIFICATIVAMENTE MAIORES OU MENORES QUE O ESPERADO PARA UMA DISTRIBUIÇÃO DE GENÓTIPOS

ESPACIALMENTE ALEATÓRIA (P < 0,05) BASEADO EM 10.000 PERMUTAÇÕES. VEJA NA TABELA 6 A DISTÂNCIA MÁXIMA DAS CLASSES. ... 31

FIGURA 13:RELAÇÃO ENTRE O COEFICIENTE DE PARENTESCO (FIJ ±SE) E O LOGARITMO DA DISTÂNCIA ENTRE INDIVÍDUOS PARA A POPULAÇÃO DE TABEBUIA ROSEO-ALBA.A_{S LINHAS TRACEJADAS CORRESPONDEM AO}

INTERVALO DE CONFIANÇA A 95% DE PROBABILIDADE BASEADO NA HIPÓTESE NULA DE AUSÊNCIA DE ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL. OS ASTERISCOS (*) INDICAM OS VALORES DE PARENTESCO SIGNIFICATIVAMENTE MAIORES OU MENORES QUE O ESPERADO PARA UMA DISTRIBUIÇÃO DE GENÓTIPOS

XI

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: DESCRIÇÃO DOS LOCOS MICROSSATÉLITES, DESENVOLVIDOS PARA TABEBUIA AUREA (BRAGA, 2006), UTILIZADOS NOS TESTES DE TRANSFERIBILIDADE. ... 21

TABELA 2: TEMPERATURA DE ANELAMENTO NA TRANSFERIBILIDADE DE PRIMERS MICROSSATÉLITES DE

TABEBUIA AUREA _PARA T.CHRYSOTRICHA (TC) _E T.ROSEO-ALBA(TR). _{... 25}

TABELA 3: CARACTERIZAÇÃO DOS LOCOS MICROSSATÉLITES DESENVOLVIDOS PARA TABEBUIA AUREA (TA)

(BRAGA,2006) E UTILIZADOS PARA GENOTIPAGEM DE T.CHRYSOTRICHA (TC) _E TABEBUIA ROSEO-ALBA

(TR). ... 26

TABELA 4:CARACTERIZAÇÃO DOS LOCOS UTILIZADOS EM TABEBUIA CHRYSOTRICHA _E TABEBUIA ROSEO-ALBA.

... 26

TABELA 5:VALORES DE P PARA O TESTE DE DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO DOS LOCOS UTILIZADOS EM TABEBUIA

CHRYSOTRICHA E TABEBUIA ROSEO-ALBA. ... 27

TABELA 6:DISTÂNCIA MÁXIMA EM CADA CLASSE DE DISTÂNCIA USADA PARA ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL EM TABEBUIA CHRYSOTRICHA _E TABEBUIA ROSEO-ALBA._{... 31}

TABELA 7: ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL E DISTÂNCIA DE DISPERSÃO PARA TABEBUIA CHRYSOTRICHA _E

XII

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 1

1.1. BIOMA CERRADO E SEU ESTADO DE CONSERVAÇÃO 1

1.2. MATAS SECAS 3

1.3. FAMÍLIA BIGNONIACEAE 5

1.3.1. TABEBUIA CRHYSOTRICHA ₆

1.3.2. TABEBUIA ROSEO-ALBA ₈

1.4. ESTRUTURA ESPACIAL GENÉTICA 10

1.5. MICROSSATÉLITES 13

2. OBJETIVOS 15

2.1. OBJETIVO GERAL 15

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 15

3. MATERIAIS E MÉTODOS 16

3.1. CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO 16

3.2. AMOSTRAGEM E EXTRAÇÃO DE DNA 19

3.3. TRANSFERIBILIDADE 20

3.4. GENOTIPAGEM 21

3.5. CARACTERIZAÇÃO DOS LOCOS MICROSSATÉLITES 22

3.6. ESTRUTURA ESPACIAL GENÉTICA 23

4. RESULTADOS 25

4.1. TRANSFERIBILIDADE E CARACTERIZAÇÃO DOS LOCOS 25

4.2. ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL 30

5. DISCUSSÃO 33

XIII

5.2. ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL 35

6. CONCLUSÕES 39

1

1.

INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

1.1.

B

C

O Bioma Cerrado abriga um gradiente de fitofisionomias savânicas variando de campo limpo, onde as árvores cobrem menos de 10% do terreno, até o cerradão com 70% de cobertura de copas (RIBEIRO & WALTER, 1998), incluindo também outros tipos de vegetação associadas, como as matas ciliares e de galeria e as matas secas (floresta estacional semidecidual ou decidual). Acompanhando a variação fitofisionômica, a vegetação do cerrado apresenta uma alta riqueza florística, com 6.429 espécies listadas para todo o domínio (MENDONÇA et al., 1998).

Originalmente, o Bioma Cerrado ocupava 23% do território brasileiro (RATTER et al., 1997), estendendo-se desde o Planalto Central Brasileiro, abrangendo parte do Nordeste e

uma pequena porção da região Sul, sendo considerado o segundo maior bioma do país com uma área de aproximadamente 2.000.000 km² (FURLEY & RATTER, 1988).

Até a década de 60 a região do Cerrado era considerada como marginal para a agricultura intensiva. Sua ocupação foi motivada principalmente pelas mudanças radicais na estrutura rodoviária iniciada com a implantação de Brasília e, também, pela criação do Programa de Desenvolvimento do Centro-Oeste (Polocentro), na década de 70, que levou a uma intensa migração em busca de terras a custos mais baixos em relação ao sul do país e com incentivos fiscais para abertura de novas áreas agrícolas (MACEDO, 1995).

Como resultado dessa política, grandes áreas de Cerrado foram desmatadas, sendo o Bioma Cerrado atualmente considerado como um dos 25 ecossistemas do planeta, com alta biodiversidade, que estão ameaçados (MYERS et al., 2000).

Estima-se que 50% do Cerrado estejam ocupados com áreas agrícolas, como pastagens cultivadas, culturas anuais ou perenes, ou áreas altamente degradadas sem utilidade agrícola (KLINK & MACHADO, 2005), embora outras estimativas indiquem porcentagens de uso e degradação ainda maiores, na escala de 80% (MYERS et al., 2000). Entretanto, somente

2 O Estado de Goiás, particularmente, é uma das regiões com maior nível de degradação do Cerrado, com mais de 50% de sua área total com menos que 15% de cobertura vegetal nativa de Cerrado (MACHADO et al., 2004). Apesar disso, o estado de Goiás é apontado

como região importantíssima para a conservação do Cerrado, pela presença de áreas preservadas representativas da biodiversidade do Cerrado, tanto para espécies vegetais como para vertebrados e invertebrados (MACHADO et al., 2004). Entretanto, menos de 1% do

território do Estado de Goiás está representado em Unidade de Conservação de Proteção Integral (OLIVEIRA, 2002).

Uma das regiões mais degradadas do Goiás, devido à consolidação da ocupação humana, é a região do Mato Grosso Goiano (centro-sul do Estado). A vegetação nativa dessa área caracterizava-se por um mosaico de formações florestais, composto de florestas estacionais, cerradões e matas de galeria e ciliares, que cobria originalmente 40.000 km² (OLIVEIRA-FILHO & RATTER, 2002).

Entretanto, atualmente restam apenas pequenos fragmentos conservados, principalmente de áreas de reserva legal e área de proteção permanente, circundados de áreas com atividades agropecuárias (HAIDAR, 2008). Nessa região, a única unidade de conservação de proteção integral existente é o Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco –

3 Figura 1: Localização do Parque Altamiro de Moura Pacheco, dentro do contexto das microrregiões do Estado de Goiás próximas ao Parque. Fonte: SEMARH (2008).

1.2.

M

S

As Matas Secas são formações florestais fechadas, sem associação com cursos d’água,

que apresentam diferentes níveis de caducifolia e dependem essencialmente da ocorrência de manchas de solos mesotróficos (fertilidade média) e profundos dentro do Bioma Cerrado (RIBEIRO & WALTER, 2008). A terminologia Mata Seca para esse tipo de floresta no Bioma Cerrado foi proposta por RIBEIRO & WALTER (1998), porém, essa formação é também conhecida por Matas Mesofíticas (RIBEIRO et al., 1983) ou Floresta Estacional

(NASCIMENTO et al., 1999; SILVA & SCARIOT, 2003; PAULA et al., 2004; KUNZ et al.

2009; HOLANDA et al., 2010, dentre outros).

O clima característico de Matas Secas apresenta duas estações climáticas bem definidas, uma chuvosa e uma seca (VELOSO et al. 1991). Na estação seca há um pico de

floração nessas Matas, principalmente de espécies com síndromes de dispersão anemocóricas e autocóricas. O início das chuvas marca o início dos picos de frutificação e produção de novas folhas nas Matas Secas, embora as espécies anemocóricas frutifiquem e dispersem duas sementes ainda na estação seca (VIEIRA & SCARIOT, 2006; RAGUSA-NETTO & SILVA, 2007).

As sementes nesse ambiente tendem a germinar imediatamente após as primeiras chuvas. Essa característica parece ser evolutivamente favorável por maximizar o aproveitamento das chuvas pela plântula, aumentando as chances de seu estabelecimento e desenvolvimento (GARWOOD, 1983).

De acordo com o tipo de solo, a composição florística e o nível de queda das folhas durante a estação seca, as Matas secas podem ser classificadas em: Mata Seca Sempre-Verde, com cobertura arbórea de 70% a 95% durante todo ano; Mata Seca Semidecídua, com cobertura arbórea de 70% a 95% durante a estação chuvosa e de 50% a 60% durante a estação seca; e Mata Seca Decídua, com cobertura arbórea de 70% a 95% durante a estação chuvosa e de 30% a 50% durante a estação seca (RIBEIRO & WALTER, 2008). A caducifolia normalmente tem início no começo da estação seca, sendo que normalmente não atinge as espécies de dispersão zoocórica (RAGUSA-NETTO & SILVA, 2007).

4 beneficiadas por ventos mais fortes. Já espécies com síndrome zoocórica são predominantes em áreas de vales úmidos (RAGUSA-NETTO & SILVA, 2007).

A área de ocorrência natural de Matas Secas se estende do México e Caribe até o sudeste do Brasil e os Chacos na Argentina, porém, essa formação costuma ocorrer em manchas disjuntas em toda a região Neotropical (PENNINGTON et al., 2000). Estima-se que

existam aproximadamente 1.048.700 km² de remanescentes florestais de Matas Secas dos 3.000.000 km² originalmente existentes no mundo (MILES et al., 2006; HUBER, 1987). A

maior parte desses remanescentes está situada nas Américas e, nessa região, a principal ameaça é a mudança climática. Mesmo nessa condição, estima-se que apenas 215.400 km² estejam dentro de algum tipo de área protegida na América do Sul (MILES et al., 2006).

A presença de espécies produtoras de madeira de lei como Aroeira, Angico e Ipês torna as Matas Secas alvos frequentes de exploração madeireira. Mesmo em áreas bem preservadas são registradas marcas de extração madeireira, principalmente de Aroeira (Myracrodruon urundeuva) e Ipê (Tabebuia sp.) (SILVA & SCARIOT, 2003).

Essa atividade é normalmente realizada sem o manejo adequado da floresta e é uma grande ameaça para a manutenção e conservação dos remanescentes após a exploração (SEMARH, 2008). Mesmo assim, a obrigatoriedade de plano de manejo e reposição para a exploração de Matas Secas no Cerrado não é uma política pública no Brasil, como é na Amazônia Legal, sendo necessários apenas planos de corte ou desmatamento (FELFILI, 2004).

Além da exploração madeireira, as Matas Secas são comumente convertidas em cultivos agrícolas devido à fertilidade inicial dos solos nessas formações. Frequentemente, essa conversão ocorre após se esgotarem os recursos madeireiros da área explorada. Outra ameaça às Matas Secas é a prática de criação extensiva de gado bovino e equino no interior da Mata que impede a sucessão secundária e introduzem espécies exóticas (SEMARH, 2008).

Essa formação florestal apresenta grande valor ecológico e botânico, pois apresenta fisionomia e florística próprias (IVANAUSKAS & RODRIGUES, 2000; SANTOS et al.,

5 Já existem indícios de que apenas a regeneração natural em períodos relativamente curtos é suficiente para que a espécies pioneiras dêem lugar a espécies secundárias iniciais e tardias em áreas de Mata Secas perturbadas (WERNECK et al., 2000; PAULA et al., 2004).

Dessa forma, apenas a proteção das áreas contra fatores de perturbação já seria suficiente para assegurar a manutenção e conservação dessas florestas pelo processo de sucessão natural.

1.3.

F

B

A família Bignoniaceae está entre as dez famílias de plantas lenhosas mais diversas nas florestas úmidas da região Neotropical. Entretanto, a família é especialmente diversa em Florestas Estacionais, sendo a segunda família mais representativa (GENTRY, 1986).

Na América tropical, ocorre cerca de 600 espécies de Bignoniaceae. Assim, essa família pode ser considerada como um modelo apropriado para o estudo da evolução da diversificação que originou a grande diversidade de espécies nas comunidades de plantas dos trópicos (GENTRY, 1990).

Uma das hipóteses para explicar a grande diversidade de espécies nessa família seria a de que espécies simpátricas de Bignoniaceae possuem nichos específicos, sendo a interação planta-polinizador considerada como o principal fator determinante da alta diversidade intracomunidade (GENTRY, 1974).

Quase todas as Bignoniaceae neotropicais possuem flores grandes, e estudos de polinização indicam que são obrigatoriamente alógamas e auto-incompatíveis (GIBBS & BIANCHI, 1993). No Cerrado, a família Bignoniaceae é amplamente representada pelos gêneros Tabebuia, Tecoma e Jacaranda (GOODLAND, 1979).

As espécies do gênero Tabebuia, os Ipês, geralmente apresentam padrão de floração

simultânea intra e inter-indivíduo podendo ter duas classificações: “big bang” onde ocorre

floração explosiva por um período curto (alguns dias); e a floração cornucópia onde ocorre floração maciça por um período mais longo (3 a 10 semanas). A polinização dentro desse gênero geralmente se dá por abelhas de tamanho corporal médio a grande (GENTRY, 1974).

O período de floração no gênero Tabebuia ocorre a partir de junho/julho, quando

6 Apesar da grande importância e ampla distribuição, as espécies mais estudadas do gênero Tabebuia são da floresta Amazônica, principalmente em estudos sobre o aspecto da

distribuição, polinização e fenologia (e.g. GENTRY, 1974, 1990) havendo poucos estudos com espécies do Cerrado (mas veja GIBBS & BIANCHI, 1993; BARROS, 2001), principalmente envolvendo aspectos genéticos. Entretanto, BRAGA (2006) desenvolveu 21 marcadores microssatélites para T. aurea, o que iniciou muitos estudos genéticos dentro desse

gênero através da transferibilidade desses marcadores (ver MARTINEZ, 2008; MOREIRA et al., 2009; FERES, 2009).

1.3.1. TABEBUIA CRHYSOTRICHA

Tabebuia chrysotricha (Mart. ex A. DC.) Standl., conhecida pelos nomes populares

Ipê-amarelo, Ipê-amarelo-cascudo, Ipê-dourado e Pau-d'arco-amarelo, é uma árvore de pequeno porte, crescimento rápido e ciclo de vida curto, heliófita e seletiva higrófita (LORENZI, 2002).

Na América Latina, essa espécie ocorre do Brasil à Argentina em Floresta Estacional Semidecidual e Floresta Ombrófila (LLAMAS, 2003; YAMAZOE & VILAS BÔAS, 2003). No Brasil, pode ser encontrada do Espírito Santo à Santa Catarina na Floresta Atlântica e em Matas de Galeria e Matas Secas do Bioma Cerrado (LORENZI, 2002; SALOMÃO et al.,

2003).

Como árvore adulta, T. chrysotricha atinge alturas de 4 a 10 metros, apresentando

tronco com casca rugosa e diâmetro de 30 a 40 centímetros. Tem como característica marcante a densa pilosidade ferrugínea nas folhas, frutos, ramos novos e pecíolos (LORENZI, 2002; KRAUS et al., 2005).

As folhas são compostas 5-folioladas com folíolos discolores pubescentes em ambas as faces, ásperos e coriáceos (CRAVO, 1996; LORENZI, 2002). As flores são tubulares de cor amarelo-ouro apresentando-se reunidas em cachos, sendo considerada a flor símbolo oficial do Brasil. A floração ocorre após a queda das folhas de agosto a setembro (LORENZI, 2002; KRAUS et al., 2005) (Figura 2).

O fruto de T. chrysotricha é uma cápsula loculicida alongada, pilosos e secos

7 Os frutos maduros podem ser encontrados de setembro a novembro (FONSECA et al., 2005;

KRAUS et al., 2005; SOUZA et al., 2005).

Os frutos produzem anualmente grande quantidade de sementes que são dispersas pelo vento. Contudo, essa dispersão é descontínua e irregular, geralmente ocorrendo com baixa fre-quência. (LORENZI, 2002).

As sementes são leves, fibrosas, aladas, com baixa reserva energética, podendo apresentar poliembrionia. Aproximadamente 77% do comprimento e 34,7% da largura da semente resultam da presença da ala (SOUZA et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2008). Seu

pequeno peso possibilita uma melhor dispersão, mas seu estabelecimento pode ser dificultado devido à menor reserva energética.

Figura 2: Aspectos morfológicos de Tabebuia chrysotricha (Mart. ex A. DC.) Standl. a – Flores; b – Casca; c – Folhas; d – Frutos. Fonte: KRAUS et al., 2005.

a b

8 As sementes apresentam alto poder germinativo, mas têm curta longevidade (MAEDA & MATTHES, 1984). A conservação das sementes é favorecida com o armazenamento de sementes com baixo teor de água a temperaturas de 10°C e -12°C (MARTINS et al., 2009b).

A maturidade fisiológica das sementes de Tabebuia chrysotricha ocorre antes da

dispersão com os frutos em início da deiscência, momento ideal para se realizar sua coleta (FONSECA et al., 2005; MARTINS et al., 2008).

A germinação é indiferente a luz e possui faixa ótima de temperatura entre 20° e 30°C (SANTOS et al., 2005), sendo favorecida pela utilização de substrato areia onde há um

melhor crescimento da raiz e maior desenvolvimento da parte aérea das plântulas (MARTINS

et al., 2008). SARZI et al. (2008a; 2008b) sugere que a produção de mudas de Tabebuia chrysotricha seja realizada com fibra de coco 100% granulada e soluções de adubação com

1,06 dS m-¹ de condutividade elétrica.

Essa espécie é muito estudada devido ao seu grande valor ecológico, paisagístico e econômico. A árvore é extremamente ornamental, sendo a espécie de ipê-amarelo mais cultivada em praças e ruas estreitas e sob redes elétricas em virtude de seu pequeno porte. Sua madeira é própria para obras externas com grande durabilidade sendo utilizada na construção civil e naval (LORENZI, 2002; KRAUS et al., 2005).

Testes de progênies indicam que a variabilidade genética e a herdabilidade dos parâmetros de altura e diâmetro em Tabebuia chrysotricha são promissoras para o emprego de

melhoramento genético na espécie (COSTA et al., 2007), o que favoreceria sua utilização

econômica.

1.3.2. TABEBUIA ROSEO-ALBA

Tabebuia roseo-alba (Ridl.) Sand., conhecida popularmente por ipê-branco,

pau-d’arco ou ipê-do-cerrado, é uma árvore de porte médio, crescimento lento, decídua, heliófita e seletiva xerófita.

Na América Latina, essa espécie é encontrada na Bolívia, Brasil, Colômbia, Peru e Paraguai. No Brasil, ocorre ao norte dos estados de São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e Goiás (DURIGAN et al., 2002; LORENZI, 2002).

9 interior da mata primária como em formações secundárias (DURIGAN et al., 2002;

LORENZI, 2002).

Essa espécie possui alto valor econômico como planta ornamental e pela utilização de sua madeira na construção civil, principalmente para acabamentos internos. Além disso, lhe é atribuído um alto valor ecológico, sendo utilizada para recomposição da vegetação arbórea, principalmente em terrenos secos e pedregosos devido à sua grande adaptabilidade a esse tipo de ambiente (LORENZI et al., 2002).

Como árvore adulta, T. roseo-alba atinge alturas de 7 a 16m, apresentando tronco

ereto com casca suberosa, superficialmente fissurada e diâmetro de 40 a 60 cm. Suas folhas são compostas trifolioladas, com folíolos levemente pubescentes em ambas as faces. A folhagem densa de cor verde azulada forma uma copa alongada de forma piramidal (LORENZI, 2002).

As folhas caem com a floração exuberante da árvore que ocorre principalmente entre junho e julho, mas pode acontecer eventualmente mais de uma vez ao ano em diferentes épocas (Figura 3). Os frutos amadurecem geralmente entre agosto e setembro, sendo as sementes rapidamente dispersas (DURIGAN et al., 2002).

Figura 3: Aspectos morfológicos de Tabebuia roseo-alba (Ridl.) Sand. a – Flores; b – Frutos verdes (observar as folhas compostas trifolioladas); c – Fruto com deiscência para dispersão das sementes.

A germinação das sementes dessa espécie acontece em um período de 7 a 20 dias com mais de 70% das sementes germinando (SALOMÃO et al., 2003). A condição mais favorável

para germinação das sementes é à temperatura de 30ºC em substrato papel, tanto sobre papel como em rolo de papel (STOCKMAN et al., 2007). A germinação em vermiculita não é

10 aconselhada, pois a semente mostra dificuldade para romper a camada do substrato. Essa característica pode ser explicada pelas características morfológicas e ecológicas dessas sementes que, após a deiscência dos frutos, se depositam naturalmente na superfície do solo e raramente são enterradas (STOCKMAN et al., 2007).

As sementes de T. roseo-alba podem ser armazenadas em latas com manutenção em

geladeira (BORDA FILHO & PERES, 2009), sendo que sua conservação depende do teor de água na semente e da temperatura e umidade no armazenamento. Sem controle de temperatura e umidade, as sementes de T. roseo-alba com baixo teor de água podem ser bem

conservadas por até 60 dias, sendo que em condições de umidade controlada (em torno de 40%) esse período aumenta para 120 dias (DUARTE et al., 2010).

Com manutenção da temperatura de armazenamento a 10 ºC ou -20 °C pode-se conservar as sementes por pelo menos 360 dias sem grandes alterações no seu potencial germinativo (MARTINS et al., 2009a). A manutenção das sementes por até 24 meses pode

ser realizada em temperaturas de 10°C a -20ºC se acondicionadas em embalagens herméticas (SALOMÃO et al., 2003). Alterações no vigor de sementes dessas espécies são

primeiramente identificadas pela redução da velocidade de germinação (BORDA FILHO & PERES, 2009).

Estudos genéticos envolvendo essa espécie demonstram que suas populações possuem diversidade genética de média a alta, podendo esta diversidade ser afetada pela fragmentação e urbanização da paisagem (MARTINEZ, 2008; FERES, 2009).

Um estudo de experimentos de polinizações controladas e análises histológicas relata que eventos de autopolinização resultaram em 100% de aborto, apesar de os tubos polínicos penetrarem e fecundarem a maioria dos óvulos em pistilos autopolinizados havendo um ligeiro crescimento dos óvulos e do ovário (GANDOLPHI & BITTENCOURT JR., 2010). Entretanto, FERES (2009), com base na genotipagem de locos microssatélites polimórficos analisados com o programa Multilocos MLTR (RITLAND, 2004) que atribui o sistema reprodutivo da planta, encontrou taxas de autofecundação de até 16% em duas populações dessa espécie.

1.4.

E

11 genética dentro e entre populações (ALVAREZ-BUYLLA & GARAY, 1994). O fluxo gênico é um dos fatores que mais influencia a escala espacial em que a estrutura genética é observada.

Vários processos genéticos de diferenciação entre populações, como deriva gênica, efeito de fundador e seleção natural, são grandemente influenciados pelo fluxo gênico (WRIGHT, 1978; HASTING & HARRISON, 1994). Se o fluxo gênico for restrito, permite-se que esses processos genéticos atuem, diferenciando uma população da outra (BOSHIER et al.,

1995). Contudo, na presença de altos níveis de fluxo gênico, esse pode agir como uma força conservadora, mantendo as populações geneticamente homogêneas, mesmo se essas estiverem localizadas em habitats seletivamente divergentes (SCHNABEL & HAMRICK, 1995). Isso porque o fluxo gênico alto também aumenta o tamanho populacional efetivo e enfraquece os efeitos de diversificação da deriva genética.

A base teórica para muitos estudos de estrutura genética espacial dentro de populações de plantas é o isolamento por distância – IBD. O termo “isolamento por distância”, introduzido por WRIGHT (1943), refere-se a desvios locais da frequência genética global esperada em locos neutros (HEYWOOD, 1991; LOISELLE et al., 1995). Assim, quando

ocorre IBD, espera-se que a similaridade genética entre indivíduos ou subdivisões da população para locos seletivamente neutros decaia com o aumento da separação espacial (WILLIANS, 1994). O IBD é uma consequência importante da restrição do fluxo gênico.

Em populações de plantas, o fluxo gênico ocorre em dois diferentes estágios de vida da planta: como pólen (haplóide) e como sementes fertilizadas (diplóide). Dessa forma, a extensão em que os genes estão dispersos é determinada pela polinização e dispersão de sementes (LOISELLE et al., 1995). Alguns estudos demonstram que espécies de plantas onde

a dispersão de pólen e/ou de semente é espacialmente limitada têm estruturação diferenciada em escalas espaciais distintas (JUMP & PEÑUELAS 2006; TORIMARU et al., 2007).

Embora limitações tanto na distância de dispersão de pólen como de sementes possam contribuir para a construção de IBD, os dois não tem o mesmo efeito.

12 de pólen responsável por diminuir (se amplo) ou intensificar (se restrito) a estruturação encontrada. Enquanto isso, sementes que são ampla e independentemente dispersas resultam em estruturas mais fracas ou próximas à aleatória, mesmo na presença de dispersão restrita de pólen (CHUNG et al., 2003).

Contudo, se as sementes são dispersas em conjunto, como acontece com muitas plantas que têm frutos com várias sementes, mesmo a dispersão a longas distâncias poderá resultar em uma estruturação se proporções significantes das sementes tiverem pais fortemente relacionados (ou iguais) (TORIMARU et al., 2007).

O parentesco entre as sementes, além de ser determinado pela extensão da dispersão de pólen, também é influenciado pela variação da fenologia da floração (tempo de floração e número de flores) entre indivíduos. A floração asincrônica de plantas vizinhas pode levar a uma maior distância de polinização, assim como a floração simultânea pode levar a uma redução dessa distância (KITAMOTO et al., 2006). O mesmo efeito pode ser encontrado com

relação à densidade de indivíduos, sendo que populações com maiores densidades tendem a ter uma distância de dispersão de pólen menor, e populações com menores densidades tendem a ter maiores distâncias de dispersão de pólen. Assim, o parentesco entre as sementes tende a ser maior quanto maior a variação da fenologia da floração e menor a densidade de indivíduos.

Alguns estudos também investigam as mudanças que populações de plantas podem exibir em sua estrutura genética espacial entre diferentes estágios de vida (ALDRICH et al.,

1998; CHUNG et al., 2003; JONES & HUBBELL, 2006). Os padrões de estrutura genética

nos estágios iniciais são a base para o desenvolvimento dos padrões nos estágios demográficos subsequentes e mudanças na escala espacial dessa estrutura e no parentesco entre os indivíduos com a mudança dos estágios de vida fornecem indicações sobre a história demográfica (efeito do fundador ou gargalos) da população, a operação de seleção diferencial devido à adaptação a condições locais, a mudança na extensão e padrões de dispersão ou a condições de desequilíbrio na população (JONES & HUBBELL, 2006).

As consequências das limitações do fluxo gênico que levam a estruturação de uma população são, em geral, a redução da variabilidade genética e ao aumento dos níveis de endocruzamento (FRANKLIN, 1980), o que pode afetar a dinâmica das populações em longo prazo (e.g. LAURANCE et al., 1998; CORDEIRO et al., 2003; MORAN et al., 2004;

13 do padrão espacial e da estrutura da variação genética é vital para entender a genética de uma população assim como para as aplicações práticas desse conhecimento na manutenção sustentável de florestas produtivas e áreas conservadas (BOSHIER et al., 1995).

1.5.

M

Microssatélites, também conhecidos por SSR (‘simple sequence repeat’), STR (‘short tandem repeats’), SSLP (‘simple sequence length polymorphism’) ou VNTR – (‘variable

number of tandem repeats’), são um tipo único de sequência genômica repetidas em tandem (em fila) presente em todos os tipos de organismos (RAKOCZY-TROJANOWSKA & BOLIBOK, 2004).

Esses marcadores são co-dominantes de tamanho relativamente pequeno e podem facilmente ser amplificados por reações de polimerização em cadeia (PCR) através de primers específicos para suas regiões flanqueadoras (CHISTIAKOV et al., 2006).

Os microssatélites são formados pela sequência de dois ou mais nucleotídeos,

chamados de motivos (‘motifs’) repetidos em tandem. Quando essa repetição se dá sem interrupções os microssatélites são chamados de perfeitos ou compostos (mais de um motivo se repetindo). Contudo, quando a estrutura dos microssatélites é mais complexa com sequências não repetitivas entre os motivos repetitivos esses marcadores são considerados imperfeitos (WEBER, 1990; RAKOCZY-TROJANOWSKA & BOLIBOK, 2004).

Em plantas, os microssatélites são frequentemente compostos por motivos de dinucleotídeos, principalmente (AT)n e (GT)n, no entanto, alguns microssatélites parecem ser

específicos ou muito mais presentes em um grupo particular de plantas (RAKOCZY-TROJANOWSKA & BOLIBOK, 2004).

Os microssatélites foram descritos simultaneamente em três diferentes estudos (ver LITT et al., 1989; TAUTZ, 1989; WEBER et al., 1989). Desde a sua descrição, esses

marcadores são considerados neutros. Contudo, estudos mostram evidências de que os microssatélites possuem distribuição não aleatória nas regiões codantes e não-codantes do genoma (BALLOUX & LUGO-MOLIN, 2002), sendo mais frequentes em regiões transcritas (RAKOCZY-TROJANOWSKA & BOLIBOK, 2004).

14 do DNA, dentre outros (CHISTIAKOV et al., 2006; LI et al., 2002). Portanto, ao menos essas

regiões microssatélites funcionais podem não ser evolutivamente neutras (LI et al., 2002).

Muitos estudos biológicos, especialmente estudos de parentesco, eram limitados pela falta de marcadores genéticos segregantes. Nesse cenário, os microssatélites surgiram como uma alternativa para atender a essa demanda (QUELLER et al., 1993), principalmente devido

ao alto polimorfismo e grande abundância normalmente encontrados nesses marcadores (KUMAR, 1999). O alto polimorfismo desses marcadores é atribuído às altas taxas de mutação nessas regiões, que estão em torno de 10-2 a 10-6 eventos por loco por geração (GOLDSTEIN, 1999). Contudo, essa característica pode subestimar a diferenciação entre populações em estudos genéticos devido à dificuldade de se distinguir eventos de mutação com eventos de migração (BALLOUX & LUGO-MOLIN, 2002).

Atualmente, diversos trabalhos utilizam marcadores microssatélites para estudos de parentesco e de estrutura genética espacial (ALDRICH et al., 1998; JONES & HUBBELL,

2006; KITAMOTO et al., 2006; dentre outros), encontrando baixas probabilidades de

identidade genética e altas probabilidades de exclusão de paternidade em estudos de parentesco (ver BRAGA, 2006; MOREIRA et al., 2009).

A utilização de marcadores microssatélites heterólogos, usados a partir da transferibilidade de primers microssatélites para espécies relacionadas, tem frequentemente apresentado sucesso devido à alta conservação das regiões flanqueadoras desses locos (RAKOCZY-TROJANOWSKA & BOLIBOK, 2004), facilitando, assim, a disseminação do uso desses marcadores.

Após o advento e popularização dos marcadores microssatélites, outros tipos de marcadores, como os SNPs (single nucleotide polymorphisms) e AFLPs (amplified fragment length polymorphisms), foram desenvolvidos e vem aos poucos substituindo o uso de

15

2.

OBJETIVOS

2.1.

O

G

Este trabalho tem como objetivo estudar a estrutura de parentesco em Tabebuia chrysotricha (Ipê-amarelo) e T. roseo-alba (Ipê-branco) no Parque Estadual Altamiro de

Moura Pacheco – PEAMP, gerando conhecimento adicional para o desenvolvimento de estratégias de conservação e manejo sustentável das espécies no Cerrado.

2.2.

O

- Analisar a diversidade genética e determinar a estrutura genética espacial dentro de população das espécies Tabebuiachrysotricha e Tabebuiaroseo-alba, a fim de se verificar se

indivíduos espacialmente mais próximos são mais aparentados do que indivíduos mais distantes.

16

3.

MATERIAIS E MÉTODOS

3.1.

C

O PEAMP é uma unidade de conservação estadual de proteção integral que foi criada com o objetivo de proteger um dos últimos vestígios de floresta estacional (ou mata seca) no Estado de Goiás (SEMARH, 2008). Esse Parque foi criado em 30 de dezembro de 1992 pela Lei Estadual n° 11.878.

Inicialmente, o PEAMP abrangia uma área de 3.183 ha, mas posteriormente houve a inclusão de uma área, localizada ao sul, com cerca de 940 ha conhecida como Parque dos Ipês. A área incluída é separada do restante do PEAMP por áreas totalmente desmatadas e transformadas em pasto, trilhas, pequenas estradas, além da rodovia BR-060, que liga Goiânia à Anápolis (Figura 4).

Figura 4: Localização da BR-060/153 cortando o Parque Altamiro de Moura Pacheco (PEAMP), Goiás. Fonte: Google Earth (2007).

17 Está previsto ainda a construção da represa do Ribeirão João Leite para garantir a continuidade de abastecimento de água para Goiânia. Pelas condições topográficas favoráveis, a construção da barragem está sendo feita dentro da área do Parque dos Ipês (SEMARH, 2008).

Figura 5: Mapa hidrográfico da região do Parque Altamiro de Moura Pacheco, que pertence a Bacia do Paraná. Fonte: SEMARH (2008).

A vegetação predominante dentro do PEAMP é a floresta estacional semidecidual, mas existem também áreas de matas de galeria e pequenas manchas de cerrado sensu stricto e

cerradão, com características de zona de transição cerrado/floresta estacional (HAIDAR, 2008), sendo a família Bignoniaceae, família das espécies em estudo, a segunda mais representativa no PEAMP (HAIDAR et al., 2005). Contudo, a vegetação se encontra em

diferentes condições de perturbação, uma vez que antes da criação do Parque a área foi utilizada como fazenda, havendo muitos pastos abandonados, clareiras para a extração de madeira e antigos roçados intercalados com trechos mais preservados (SEMARH, 2008).

Por estar inserido dentro da região mais populosa do Estado de Goiás, o PEAMP sofre bastante pressão antrópica. A região do entorno se encontra extremamente modificada pela ação antrópica, principalmente pela atividade agropecuária e os vários núcleos urbanos existentes (Figura 6). Além do parque, apenas um fragmento dentro da Fazenda Santa Branca possui mais de 1000 ha de área conservada, sendo este parte de um empreendimento que envolve tanto a proteção de remanescentes de mata seca, quanto à formação de “ecovilas”

18 A consequência dessa fragmentação é a dificuldade de dispersão e polinização para as espécies da flora que dependem de animais para a dispersão de sementes e/ou pólen e, logo, um isolamento entre os fragmentos. A futura represa do ribeirão João Leite, por inundar uma grande área de mata de galeria e alguns fragmentos de floresta estacional semidecidual do PEAMP (Figura 7), representa mais um fator de pressão antrópica sobre a área de preservação e um maior isolamento das populações dentro do parque.

Figura 6: Detalhe de uso do solo na região do Parque Altamiro de Moura Pacheco (acima, à direita) e do Parque dos Ipês (à esquerda), circundados em amarelo. Verde escuro – vegetação nativa, rosa – área urbana, verde aclaro – áreas cultivadas. Fonte: SEMARH (2008).

19 O estudo foi realizado em uma área dentro do PEAMP, próxima à Trilha do Tamanduá

(16°30’ – 16°35’S e 4λ°07’ – 4λ°13’O) (Figura 4), sendo esta um fragmento de floresta estacional que grada para ambientes ripários ao longo dos cursos d’água estando a sua maior parte em terreno acidentado. O clima da região é do tipo Aw, conforme a classificação de Köeppen – Savana do tipo subúmido com duas estações bem distintas: a chuvosa e a seca (SEMARH, 2008).

3.2.

A

DNA

A amostragem dos indivíduos de Tabebuia roseo-alba e T. chrysotricha no PEAMP

foi feita de forma sistemática traçando-se cinco transectos perpendiculares a trilha do tamanduá, sendo cada transecto dividido em oito parcelas de 20m x 20m. Todos os indivíduos, adultos, jovens e plântulas, encontrados dentro ou nas proximidades das parcelas tiveram amostras coletadas de suas folhas expandidas ou do seu câmbio.

A localização de cada parcela foi registrada com uso de GPS e a posição de cada indivíduo dentro das parcelas foi medida com fita métrica para mapeamento e determinação da distância entre indivíduos (Figura 8). As amostras dos indivíduos foram identificadas e acondicionados em sacos plásticos com sílica para sua preservação até serem levadas ao laboratório da Universidade Católica de Brasília onde foram conservadas em freezer a -20°C.

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0 170 340 510 680

Tabebuia chrysotricha 0 20 40 60 80 100 120 140 160

0 170 340 510 680

Tabebuia roseo-alba

Figura 8: Distribuição dos indivíduos de Tabebuia nos transectos amostrados no Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco – GO. Os eixos X e Y representam distâncias em metro nas duas dimensões.

Ao todo, foram mapeados e coletados 60 indivíduos de T. chrysotricha e 37 indivíduos

de T. roseo-alba com altura média de 1,88 m e 5,00 m e diâmetro basal médio de 12,93 mm e

16,17 mm, respectivamente. Tabebuia chrysotricha apresentou grande concentração de

20 apresentaram altura inferior a 1 m. Já para T. roseo-alba a situação foi inversa, sendo

encontrada grande quantidade de indivíduos adultos e apenas 9% de indivíduos com altura inferior a 1 m (Figura 9).

Figura 9: Distribuição de altura dos indivíduos coletados de Tabebuia chrysotricha e T. roseo-alba.

O DNA foliar foi extraído pelo método de DOYLE & DOYLE (1987), utilizando CTAB 2%. A quantificação do DNA foi realizada em gel de agarose 1% (0,30g de agarose e 30 ml de TBE 1X) utilizando -DNA na concentração de 20, 60 e 100ng/ml como marcador. Posteriormente as amostras foram diluídas para obtenção de DNA em concentração final de 3 ng/µl e volume final de 100 µl.

3.3.

T

Foram realizados testes de transferibilidade de 21 locos microssatélites desenvolvidos por BRAGA (2006) para Tabebuia aurea (Tabela 1). Para isso, foram utilizados oito

indivíduos de cada espécie do presente estudo, sendo inicialmente testados para a temperatura de anelamento de 56°C. Nesses testes, as reações de PCR foram feitas em um volume total de 15 µl contendo 0,3 µM de cada primer, 1 unidade de Taq DNA polimerase (Phoneutria, BR), 250 µM de cada dNTP, 1X de tampão (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM

MgCl2), BSA 0,25 mg/ml, 0,5 M de MgCl2 e λ ng de DNA.

As reações de PCR foram quantificadas em gel de agarose 3% (0,90g de agarose e 30 ml de TBE 1X) utilizando-se DNA ladder standard (Invitrogen, MD) como controle para o tamanho dos fragmentos. Os locos adequados foram selecionados com base na amplificação

0 15 30 45 60

0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

%

indi

ví

duos

Altura (m)

21 dentro do tamanho esperado (entre 100 e 200 pb) e na presença de bandas inespecíficas. Os locos que não apresentaram amplificação ou apresentaram bandas inespecíficas foram então testados para as seguintes temperaturas de anelamento: 48°C, 50°C, 52°C, 54°C e 58°C. Tabela 1: Descrição dos locos microssatélites, desenvolvidos para Tabebuia aurea (Braga, 2006), utilizados nos testes de transferibilidade.

Loco

SSR Repetição do motivo (Braga, 2006)

Classificação (Braga, 2006) Amplitude dos alelos (pb) Temperatura de Anelamento (ºC)

Tau07 (AG)25 Perfeito 142-204 56

Tau08 (TC)6(CC)(TC)27 Imperfeito 168-230 56

Tau09 (AG)25 Perfeito 146-204 56

Tau10 (AG)34 Perfeito 198-274 56

Tau12 (TC)8(TA)(TG)29 Composto 146-212 56

Tau13 (TC)22(ACTCCC)(TC)4(AC)11 Imperfeito 110-168 56

Tau14 (CT)3(TCC)(CT)20 Imperfeito 144-186 56

Tau15 (AG)32 Perfeito 104-166 56

Tau16 (CT)33(CA)11 Composto 162-236 56

Tau17 (GA)7(GC)(GA)3(GC)5(AG)21(GGGAGG)

(GA)7 Imperfeito 148-240 56

Tau18 (GT)10(GA)35 Composto 180-256 56

Tau19 (GA)33 Perfeito 182-248 56

Tau20 (GA)42 Perfeito 92-162 56

Tau21 (GA)26 Perfeito 198-290 56

Tau22 (CT)18(CCCTCTCGTCA)(GT)3 Imperfeito 132-166 56

Tau23 (CT)28 Perfeito 190-230 56

Tau24 (GA)33 Perfeito 136-184 56

Tau27 (CT)24(CA)8(CC)(CA)7 Composto 146-200 56

Tau28 (CT)33 Perfeito 140-190 56

Tau30 (TC)23 Perfeito 216-249 56

Tau31 (CT)28(CA)10(CTT)(GT)5 Imperfeito 210-270 56

3.4.

G

Todos os indivíduos coletados foram genotipados com primers marcados com fluorescência 6-FAM (), HEX (@) e NED. As reações de PCR foram feitas em um volume total de 10 l contendo 0,5 M de cada primer, 1 unidade de Taq DNA polimerase (Phoneutria, BR), 250 M de cada dNTP, 1X de tampão (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2), BSA 0,25 mg/ml, 0,5 M de MgCl2 e 9 ng de DNA. As condições da

22 por 1 min. (35 ciclos); e 72° C por 30 min., variando apenas a temperatura de anelamento (TA) para cada par de primers.

Posteriormente, as reações foram diluídas, quando necessário, em 1:4 e 1 µl de cada reação de PCR foi utilizado para o procedimento de genotipagem. A genotipagem foi realizada em dois sequenciadores automáticos, ABI Prism 377 automated DNA (Perkin-Elmer, CA) e ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, CA).

Para o ABI Prism 377 automated DNA, foi adicionado à reação de PCR 0,25 L do marcador interno (GeneScan 500 internal lane standard, ROX, Perkin-Elmer, CA), 0,45 L de tampão de corrida (25mM EDTA e 50 mg/ml Blue-Dextran) e 2,3 L de formamida deionizada.

Para o sequenciador ABI Prism 3130, a reação de PCR foi adicionada a 1,0 L do

padrão interno GeneScan 500 internal lane standard (ROX, Perkin-Elmer, CA) e 8,0 L

formamida deionizada. As reações foram desnaturadas a 95 ºC por 5 minutos, mantidas em gelo e submetidas à eletroforese em géis desnaturante de poliacrilamida 5% no ABI Prism 377 automated DNA, ou à eletroforese capilar no ABI Prism 3130.

Em todas as corridas e para todos os locos foram utilizados indivíduos controles para padronização da análise da genotipagem. Essa análise foi realizada utilizando-se os programas GeneScan v. 3.7.1 (Applied Biosystems) e Genotyper v. 3.7 (Applied Biosystems).

3.5.

C

A caracterização dos locos microssatélites nas espécies estudadas foi feita com base em todos os indivíduos genotipados. Para isso, foi calculado a frequência alélica, o número médio de alelo por loco (A), a heterozigosidade média esperada em equilíbrio de Hardy-Weinberg (He), a heterozigosidade observada (Ho) e o índice de fixação (Fis) de cada loco

utilizando-se o programa FSTATS 2.9.3.2 (GOUDET, 2002).

Com o mesmo programa foram realizados testes de permutação para testar o desequilíbrio de ligação entre os locos e a significância do valor de Fis. Foram consideradas

ainda a amplitude dos alelos e a temperatura de anelamento dos locos para realizar comparação com os mesmos fatores em T. aurea, espécie para a qual foram desenvolvidos os

23

3.6.

E

Para analisar a diversidade genética das populações, foram calculados os seguintes parâmetros de variabilidade utilizando o programa FSTATS 2.9.3.2 (GOUDET, 2002): heterozigosidade média esperada em equilíbrio de Hardy-Weinberg (He), heterozigosidade observada (Ho), número médio de alelos por loco (A) e o índice de fixação de Writgh (Fis).

Com o mesmo programa, foi realizado um teste de permutação para testar a significância do valor de Fis e para testar o desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg.

A estrutura genética espacial foi analisada utilizando-se o programa SPAGeDi (HARDY & VEKEMANS, 2002). Com esse programa, os coeficientes de parentesco, também conhecidos como coeficientes de coancestria, são calculados para cada par de indivíduos. Nesse estudo, foi utilizado o coeficiente de parentesco estimado de acordo com o proposto por J. Nason (LOISELLE et al., 1995). Para analisar como esses coeficientes estão

relacionados com a distância geográfica, o programa calcula valores médios do coeficiente de parentesco para cada intervalo de distância, de modo similar a análise de autocorrelação, e realiza uma regressão linear dos valores com a distância geográfica, ou seu logaritmo. Todos os cálculos individuais são feitos para cada loco e uma média ponderada multiloco é calculada. Uma reamostragem jackknife entre locos é realizada para calcular o erro padrão aproximado ( ) para a estimativa multiloco e um teste de 10.000 permutações (nível de significância de 0,05) é utilizado para testar a hipótese nula de não haver estruturação genética espacial fornecendo um intervalo de confiança a 95% de probabilidade para o coeficiente de parentesco (HARDY & VEKEMANS, 2002).

Para se mensurar a intensidade da estrutura genética, foi estimada a estatística para comparações par-a-par. Essa estatística é uma maneira sintética de calcular a força da estruturação genética espacial e permite comparações entre espécies. O Sp pode ser calculado da seguinte forma (VEKEMANS & HARDY, 2004):

Onde, F1 é o coeficiente de parentesco médio entre indivíduos da primeira classe de

distância e bln é a inclinação da regressão baseado no logaritmo da distância espacial.

24 aproximadamente de forma linear com o logaritmo da distância em um ambiente bidimensional. Assim, a inclinação da regressão do coeficiente de parentesco com a distância geográfica pode ser usada para obter estimativas indiretas de parâmetros da distância de dispersão de genes (equivalentes ao tamanho de vizinhança de Wright’s), fornecendo uma medida sintética da extensão da estrutura genética. Nesse caso, a distância de dispersão de genes (Nb) pode ser inferida da seguinte forma, considerando-se ausência de autofertilização (HARDY & VEKEMANS, 2002):

Onde, F1 é o coeficiente de parentesco médio entre indivíduos da primeira classe de

25

4.

RESULTADOS

4.1.

T

Nos testes de transferibilidade realizados, os locos Tau07, Tau08, Tau09, Tau10, Tau13, Tau14, Tau19, Tau20, Tau23 e Tau30 não amplificaram nas espécies e temperaturas testadas. Apenas seis e nove pares de primers amplificaram em Tabebuia chrysotricha e T. roseo-alba respectivamente.

A maioria dos locos apresentou amplificação em temperatura inferior àquela para qual foi desenvolvido, especialmente em T. chrysotricha (Tabela 2). Nenhum primer mostrou

indícios de bandas inespecíficas na quantificação da PCR em gel de agarose 3% na temperatura escolhida.

Tabela 2: Temperatura de anelamento na transferibilidade de primers microssatélites de Tabebuia aurea para T. chrysotricha (TC) e T. roseo-alba (TR).

Locos TC TR

Tau12 50°C 50°C

Tau15 52°C Na

Tau16 Na 56°C

Tau17 48°C 50°C

Tau18 Na 56°C

Tau21 Na 56°C

Tau22 52°C 56°C

Tau24 54°C Na

Tau27 Na 56°C

Tau28 56°C 56°C

Tau31 Na 56°C

Na - Não amplificou nas temperaturas testadas.

Após a genotipagem, o loco Tau24 para T. chrysotricha e os locos Tau12, Tau16 e

Tau17 para T. roseo-alba foram descartados devido ao grande número de falhas (maior que

70%). Resultando em um número total de locos efetivamente transferidos de cinco para T. chrysotricha e seis para T. roseo-alba. A descrição dos locos foi feita com base em todos os

indivíduos genotipados (Tabela 3).

A maioria dos locos apresentou uma amplitude de alelos maior nas espécies estudadas (principalmente em T. crhysotricha) do que em T. aurea, espécie para a qual foram

26 Todos os locos utilizados mostraram-se polimórficos e em equilíbrio de ligação nas duas espécies, com exceção dos locos Tau17 e Tau22 que se mostraram em desequilíbrio de ligação em T. chrysotricha (Tabela 4 e Tabela 5).

Tabela 3: Caracterização dos locos microssatélites desenvolvidos para Tabebuia aurea (TA) (Braga, 2006) e utilizados para genotipagem de T. chrysotricha (TC) e Tabebuia roseo-alba (TR).

Loco SSR Amplitude dos alelos (pb) Temperatura de anelamento

Tau12 146-212 _160-230 TA TC 56ºC

TA

50ºC TC

Tau15 104-166 _102-166 TA TC 56ºC

TA

52ºC TC

Tau17 _106-120 148-240 TA TC 56ºC

TA

48ºC TC

Tau18 _138-276 180-256 TA TR 56ºC TA; TR

Tau21 198-290 _164-246 TA TR 56ºC TA; TR

Tau22

132-166 TA

110-212 TC 122-154 TR

56ºC TA; TR

52ºC TC

Tau27 146-200 _108-286 TA TR 56ºC TA; TR

Tau28 140-190

TA

108-184 TC

128-258 TR

56ºC TA;TC

54ºC TR

Tau31 210-270 _108-272 TA TR 56ºC TA; TR

Tabela 4: Caracterização dos locos utilizados em Tabebuia chrysotricha e Tabebuia roseo-alba.

Espécie Locos N A Ho He Fis p

Tabebuia crhysotricha

Tau12 38 7 0,7900 0,702 -0,125 0,9310

Tau15 52 12 0,5580 0,844 0,339 0,0002

Tau17 59 6 0,7960 0,604 -0,318 0,9998

Tau22 58 16 0,8960 0,742 -0,208 10,0000

Tau28 55 10 0,5820 0,530 -0,098 0,8838

Todos 52,40 10,20 0,7240 0,684 -0,059 0,9456

Tabebuia roseo-alba

Tau18 34 12 0,1474 0,801 0,816 _0,0002

Tau21 32 15 0,8127 0,895 0,092 0,1113

Tau22 36 9 0,7497 0,743 -0,009 _0,6123

Tau27 31 20 0,5803 0,933 0,378 0,0002

Tau28 28 15 0,4994 0,870 0,426 _0,0002

Tau31 29 12 0,8621 0,857 -0,006 0,6107

Todos 31,67 13,83 0,6090 0,850 0,284 0,0002

N - Número de indivíduo analisados por loco; A - Número de alelos por loco; He – Heterozigosidade esperada sob equilíbrio de Hardy-Weinberg; Ho - Heterozigosidade observada; Fis - índice de fixação; p– valores de p para o Fis - realizado com FSTAT

baseado em 5.000 permutações com p-valor corrigido (Bonferroni - nível nominal de 5%) igual a 0,01000 para T. chrysotricha e

27 O número médio de alelos por loco foi menor em T. chrysotricha (10,20) do que em T. roseo-alba (13,83), variando de 6 (Tau17) a 16 (Tau22) em T. chrysotricha e de 9 (Tau22) a

20 (Tau27) em T. roseo-alba.

A distribuição das frequências alélicas mostra que a maioria dos locos (50% a 81% dos alelos de cada loco) apresenta frequência inferior a 0,05, sendo que a menor e a maior frequência alélica encontrada foi de 0,008 (Tau17) e 0,645 (Tau28) para T. chrysotricha e de 0,014 (Tau22) e 0,382 (Tau18) para T. roseo-alba (Figura 10).

Tabela 5: Valores de p para o teste de desequilíbrio de ligação dos locos utilizados em Tabebuia chrysotricha e Tabebuia roseo-alba.

Pares de Locos p

Tabebuia crhysotricha

Tau12 X Tau15 0,0418

Tau12 X Tau17 0,0013

Tau12 X Tau22 0,0312

Tau12 X Tau28 0,0025

Tau15 X Tau17 0,1598

Tau15 X Tau22 0,2547

Tau15 X Tau28 0,5010

Tau17 X Tau22 0,0003

Tau17 X Tau28 0,1731

Tau22 X Tau28 0,0012

Tabebuia roseo-alba

Tau18 X Tau21 _0,6742

Tau18 X Tau22 0,8567

Tau18 X Tau27 _0,6561

Tau18 X Tau28 0,7528

Tau18 X Tau31 _0,3606

Tau21 X Tau22 0,5283

Tau21 X Tau27 _0,2242

Tau21 X Tau28 100,0000

Tau21 X Tau31 _0,0419

Tau22 X Tau27 0,0204

Tau22 X Tau28 _0,2146

Tau22 X Tau31 0,1588

Tau27 X Tau28 _0,0538

Tau27 X Tau31 0,3009

Tau28 X Tau31 _100,0000

Teste realizado com FSTAT baseado em 100.000 permutações com p-valor corrigido (Bonferroni - nível nominal de 5%) igual a 0,000500 para T. chrysotricha e 150.000 permutações e p-valor corrigido igual a 0,000333 para T. roseo-alba.

Em T. chrysotricha, o Tau28 foi o loco que apresentou o alelo com maior frequência e

também o que obteve a maior diferença, em relação ao segundo alelo mais frequente. Para T.

28 A heterozigosidade observada foi maior que a esperada para todos os locos de T. chrysotricha e, portanto os valores de Fis foram negativos e não significativos. A exceção foi

o Tau15 que mostrou um Fis positivo e significativo. Considerando todos os locos, T.

chrysotricha apresentou heterozigosidade observada maior que a esperada, porém com Fis não

significativo (Tabela 4).

Em T. roseo-alba, dois locos apresentaram heterozigosidade observada maior que a

esperada, porém os valores de Fis não foram significativos. Dos quatro locos que apresentaram

valores de heterozigosidade menores que o esperado, apenas três (Tau18, Tau27 e Tau28) obtiveram valores significativos, e positivos, de Fis. Considerando todos os locos, T.

roseo-alba apresentou heterozigosidade observada menor que a esperada com valor de Fis positivo e

29

0 0,15 0,3

0,45 Tau12

TC

0 0,15

0,3 Tau15 _TC

0 0,15 0,3 0,45

0,6 Tau17 TC

0 0,15 0,3

0,45 Tau18 TR

0 0,15

0,3 Tau21 TR

0 0,2

0,4 Tau 22 _TC

TR

0 0,15

0,3 Tau27 TR

0 0,35

0,7 Tau 28 _TC

TR

0 0,15

0,3 Tau31 TR