CARACTERIZAÇÃO E MELHORAMENTO GENÉTICO DE PENICILLIUM
PINOPHILUM PARA EFICIÊNCIA NA SOLUBILIZAÇÃO DE FOSFATO
MINERAL.
Jéssica Ellen de Oliveira (PIBITI/Fundação Araucária/UEL) jeh.ellen@hotmail.com
Elisete Pains Rodrigues (orientador)
Universidade Estadual de Londrina – Departamento de Ciências Biológicas elisete@uel.br
Resumo
O fósforo (P) é um nutriente essencial para o crescimento e desenvolvimento vegetal. A maior parte do P do solo encontra-se complexado a compostos minerais ou constituindo moléculas orgânicas, o que leva frequentemente a deficiência deste nutriente. O uso de fertilizantes fosfatados encarece o custo da produção e pode levar a contaminação dos recursos hídricos. Uma alternativa mais sustentável ao uso de fertilizantes são os biofertilizantes contendo microrganismos solubilizadores de fosfato (MSP) que são capazes de solubilizar o fosfato disponibilizando-o para planta. Assim, o objetivo da pesquisa foi realizar melhoramento genético de Penicillium pinophilum para obtenção de linhagens com elevada capacidade de solubilização de fosfato. Para isso, foi feito a mutagênese da linhagem F14 pela ação da radiação UV a 254 nm e do composto metilmetanosulfonato (MMS). A exposição ao UV por 120 s e a adição de 100 μL de MMS (9,1 mM) foram estabelecidos como apropriados para obtenção dos mutantes. No total foram analisadas 466 colônias, dos quais foram selecionados 26 mutantes que apresentaram maior quantificação de fosfato livre que a linhagem selvagem F14. Dos quais sete mutantes solubilizaram aproximadamente 1400 a 1600 mg/L de P, equivalente a cerca de 40-80% a mais que a linhagem selvagem (controle) que solubilizou 1136 mg/L.
Palavras chave:
Fosfato, Mutagênese, Biofertilizante, Melhoramento
Introdução
O fósforo (P) é um dos macroelementos essenciais na nutrição de plantas participando de diversos processos metabólicos importantes, incluindo fotossíntese, respiração, transferência de energia e biossíntese macromoléculas (Khan et.al, 2010). O íon orto-fosfato (PO4-3) é extremamente reativo e no solo, torna-se indisponível quando reage com metais como alumínio, cálcio e ferro, sendo por isso, um fator limitante para o crescimento vegetal (Khan et al, 2007). Para garantir elevadas produtividades nas cul-turas agrícolas são utilizados os fertilizantes fosfatados, normalmente em quantidades elevadas devido à precipitação com Al, Fe, Ca ou adsorção em coloides, o que aumenta o custo de produção e, consequentemente, leva à contaminação de recursos hidrícos (Tilman et.al, 2001). Ainda, as fontes de rochas fosfaticas para produção de fertilizantes químicos estão se exaurindo; estima-se que as reservas presentes no mundo tem duração de cerca de 100 anos (Khan et.al, 2007).
Uma alternativa mais sustentável aos fertilizantes quimicos são os microrganimos solubilizadores de fosfato (MSFs), que desempenham um importante papel na
ciclagem de fósforo, seja solubilizando o P-mineral pela liberação de ácidos orgânicos ou mineralizando P-orgânico, pela ação de fosfatases (Richardson et al.,2009).
Fungos do gênero Penicillium apresentam grande pontencial biotecnológico em diversas áreas, como no biocontrole por micoparasitismo, produção de metabolitos secundários para produção de fármacos, enzimas de interesse industrial e na produção de biofertilizante, como ocorre com a espécie Penicillium bilali presente no produto JumpStart utilizado para solubilização de fosfato.
A espécie Penicillium pinophilium, esta espécie tem sido estudada para produção de antifúngico metilfunicone contra Rhizoctonia solani (Stefano et al., 1999). Em estudo realizado com bactérias e fungos isolados do Cerrado, Oliveria e colaboradores (2009) avaliaram a capacidade de solubilização de P mineral (OLIVEIRA, 2009), selecionado a linhagem F14 e Penicillium pinophilum utilizada no presente estudo. O objetivo desse trabalho foi realizar o melhoramento genético de Penicillium pinophilum para obtenção de linhagens com elevada capacidade de solubilização de fosfato, pela utilização da radiação ultravioleta (UV) e do composto metilmetanosulfonato (MMS) visando à utilização futura destas linhagens melhoradas no desenvolvimento de biofertilizantes mais eficientes.
Problema
A deficiência de P no solo leva frequentemente ao uso de elevadas quantidades de fertilizantes fosfatados nas culturas agrícolas, acarretando maiores custos na produção e contaminação do solo e recursos hídricos. No contexto da agricultura sustentável, o uso de biofertilizantes pode ser uma alternativa viável ao uso de fertilizantes químicos, pois possibilita a disponibilização de P às plantas com baixos custos e sem acarretar danos ambientais. Há, portanto, a necessidade de produtos biológicos mais eficiêntes na solubilização de fosfato para o desenvolvimento de biofertilizantes.
Solução e Benefícios
Para os ensaios de mutagênese, P. pinophilum F14 foi cultivado em meio sólido NBRIP-BPB com Ca3HPO4. Após crescimento, os esporos foram homogeneizados em solução salina contendo 0,01% Tween 80, contados em câmara de Neubauer e ajusta-dos para 108 esporos/mL. Na mutagênese física, a suspensão foi exposta por 30, 60, 90 ou 120 segundos à radiação UV em potencia de 15 W a 30 cm de distância, na au-sência de luz, evitando o reparo das células. Para a mutagênese química, 1 mL da suspensão foi homogeneizada com 50, 100 ou 200 µL de metilmetanosulfonato (MMS) a 100 mM e incubada a 25 oC por 30 min. Após exposição, a suspensão foi centrifuga-da e lavacentrifuga-da duas vezes com salina para retiracentrifuga-da do MMS.
As suspensões obtidas foram diluídas serialmente em salina contendo 0,001% de gelatina e alíquotas de 100 µL das últimas diluições foram plaqueadas, em triplica-ta, em meio NBRIP-BPB. Como controle utilizou-se a estirpe selvagem F14 sem ação dos agentes mutagênicos. As placas inoculadas foram incubadas por sete dias a 25º C e, após crescimento, foi realizada a contagem de colônias em cada tratamento. Os ex-perimentos permitiram obter uma curva de sobrevivência na qual foi obteve-se uma re-dução gradativa da contagem de colônias em meio NBRIP-BPB com o aumento do tempo de exposição ao UV e ao MMS. A concentração de MMS 9,1 mM (100 µL) foi a mais adequada para mutagênese com 2,17% de sobrevivência. Na mutagênese com
UV, os tempos entre 60s a 120s de exposição foram os mais apropriados com 1,2 e 1,5% de sobrevivência, respectivamente (Figura 1).
Figura 1: Curva de Sobrevivência de P. pinophilum sob efeito da radiação UV e do metilmetano sulfonato (MMS).
Para seleção dos mutantes, alíquotas de 100 µL das últimas diluições dos tratamentos físico (120s de exposição ao UV) e químico (exposição a 9,1 mM de MMS) foram pla-queadas, em meio mínimo e incubadas por 5 dias a 25 oC. Após crescimento, as colô-nias dos mutantes foram inoculadas com palito em placas de meio NBRIP-BPB, sendo 4 colônias por placa. Após crescimento por 7-9 dias, as placas foram incubadas a 4 oC por 7 dias e em seguida, o halo de solubilização das colônias foi analisado e o índice de solubilização de P (ISP) calculado pela razão entre diâmetro (mm) total/colônia.
No total foram analisadas 466 mutantes, dos quais foram selecionados 26 mu-tantes que apresentaram maior ISP que a linhagem selvagem F14. Estes mumu-tantes fo-ram analisados quanto à solubilização em meio líquido. Para isso, discos de 8 mm de diâmetro contendo micélio foram inoculados em frascos de 20 mL de meio NBRIP con-tendo CaHPO4 e cultivados a 120 rpm a 28oC por 10 dias. As amostras foram filtradas em papel filtro e 1 mL do sobrenadante foi centrifugado a 12000 rpm por 10 minutos, diluído (1000 x) e utilizado para determinação colorimétrica de fosfato, com molibdato de amônio e ácido ascórbico seguindo o protocolo Strickland e Parsons (1960), com três repetições técnicas. O experimento foi realizado duas vezes nas mesmas condi-ções, sendo também avaliados a biomassa seca (mg) e o pH do sobrenadante. Con-forme a tabela 1, sete mutantes solubilizaram aproximadamente 1400 a 1600 mg/L de P, equivalente a cerca de 40-80% a mais que a linhagem selvagem F14 (controle) que solubilizou 1136 mg/L. Este mutantes foram selecionados para novas análises
bioquí-micas visando a caracterização das linhagens e dos potencial de utilização no desen-volvimento de biofertilizantes.
Tabela 1. Quantificação de fosfato em meio de cultivo dos 26 mutantes selecionados Fosforo (P) % pH Biomassa (mg) P/biomassa (mg) % Q-16-A 1672,1 (±19,8) 47 3,6 41,7 40,1 (±0,48) 81 Q-19-B 1652,3 (±28,1) 45 3,4 46,1 35,8 (±0,61) 62 Q-30-B 1226,0 (±14,9) 8 3,4 36,7 33,4 (±0,41) 51 F-14-C 1327,6 (±18,2) 17 3,5 41,0 32,4 (±0,44) 46 F-22-B 1342,5 (±26,4) 18 3,4 42,4 31,7 (±0,62) 43 F-14-A 1394,5 (±41,3) 23 3,4 44,8 31,1 (±0,92) 40 F-11-A 1444,1 (±6,6) 27 3,3 46,5 31,1 (±0,14) 40 Q-13-C 1292,9 (±69,4) 14 3,6 42,2 30,6 (±1,64) 38 Q-33-A 1312,8 (±11,6) 15 3,5 43,9 29,9 (±0,26) 35 F-19-E 1154,2 (±23,1) 2 3,4 39,0 29,6 (±0,59) 34 F-14-B 1206,2 (±13,2) 6 3,6 43,2 27,9 (±0,31) 26 Q-45-A 1255,8 (±9,9) 10 3,4 45,8 27,4 (±0,22) 24 F-72-A 1238,4 (±18,2) 9 3,5 45,5 27,2 (±0,40) 23 Q-30-A 1166,5 (±14,9) 3 3,4 45,9 25,4 (±0,32) 15 Q-4-A 1102,1 (±26,4) -3 3,5 43,4 25,4 (±0,61) 15 F-54-A 1144,2 (±24,8) 1 3,4 47,0 24,3 (±0,53) 10 Q-43-A 1144,2 (±24,8) 1 3,5 48,7 23,5 (±0,51) 6 Q-56-A 1349,9 (±38,0) 19 2,9 60,5 22,3 (±0,63) 1 CONTROLE 1136,8 (±24,8) 0 3,6 51,3 22,2 (±0,48) 0 Q-1-A 1136,8 (±24,8) 0 3,3 55,5 20,5 (±0,45) -8 Q-20-B 1161,6 (±13,2) 2 3,4 57,6 20,2 (±0,23) -9 Q-9-A 1077,3 (±9,9) -5 3,5 56,3 19,1 (±0,18) -14 Q-55-A 1045,1 (±28,1) -8 3,4 55,5 18,8 (± 0,51) -15 F-54-C 1151,7 (±79,3) 1 3,5 64,2 17,9 (±1,24) -19 F-5-A 1332,6 (±38,0) 17 3,5 78,0 17,1 (±0,49) -23 Q-13-A 1030,2 (±21,5) -9 3,2 74,1 13,9 (±0,29) -37
Potencial de Mercado e Diferencial Competitivo
A estratégia clássica de melhoramento utilizada permitiu a seleção de mutantes de P. pinophilum melhorados na sua capacidade de solubilização, com baixo custo e com viabilidade para desenvolvimento e aplicação futura como biofertilizante.
Considerações Finais
Novos ensaios serão realizados incluindo a fusão de protoplasto dos mutantes selecio-nados, a caracterização dos mesmos em diferentes fontes de P-mineral (AlPO4,
Fe-PO4, CaPO4), bem como a análise dos ácidos orgânicos produzidos, visando uma melhor avaliação para desenvolvimento futuro de produtos biofertilizantes baseado nas linhagens melhoradas da espécie P. pinophilum.
Referências
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GAUME, A. Low-P tolerance of various maize cultivars: The contribution of the root exudation. PhD dissertation, Swiss Federal Institute of Technology, Zurich,Switzerland, 2000.
KHAN, M.S; ZAIDI,A; WANI,P.A. Role of phosphate-solubilizing microorganisms in sustainable agriculture—a review. Agron Sustain Develop 27: 29–43. 2007.
SANCHEZ, P.A. Tripling crop yields in tropical Africa. Nat Geosci 3: 299–300, 2010. TILMAN,D; et al,.Forecasting Agriculturally Driven Global Environmental Change. Published Science 292,281 (2001) DOI: 10.1126/science.1057544
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DE STEFANO; et al. Antagonis against Rhizoctonia solani and fungiotoxic metab-olite production by some Penicillium isolates. Mycopatologia 158: 465-474,2004. Estágio em que se encontra o desenvolvimento da tecnologia
( x ) Laboratório ( ) Mercado ( ) Scale-up (mudança de escala) ( ) Protótipo Contato Institucional
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