B
MAX StaphSR
443419
Para uso diagnóstico in vitro P0207(01)
Para uso com o Sistema BD MAX
2016-07
Português
4
I
UTILIZAÇÃO PRETENDIDA
O ensaio BD MAX StaphSR realizado no sistema BD MAX é um teste de diagnóstico in vitro qualitativo automatizado usado para a deteção direta e diferenciação de ADN de Staphylococcus aureus (SA) e ADN de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) a partir de zaragatoas nasais de pacientes em risco para colonização nasal. O teste utiliza a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real para a amplificação de ADN de MRSA/SA e sondas de hibridização fluorogénicas de alvo específico para a deteção do ADN amplificado. O ensaio BD MAX StaphSR destina-se a ser utilizado como um método auxiliar na prevenção e controlo de infeções por MRSA e SA em ambientes de cuidados de saúde. Não foi concebido para efetuar o diagnóstico de infeções por MRSA ou SA, nem para orientar ou monitorizar o tratamento de infeções por MRSA/SA. Um resultado negativo não exclui a colonização nasal. São necessárias culturas concomitantes para recuperar mircrorganismos para tipagem epidemiológica ou para testes de sensibilidade adicionais.
RESUMO E EXPLICAÇÃO DO PROCEDIMENTO
Staphylococcus aureus é uma causa importante de infeções nosocomiais, tais como infeções da corrente sanguínea e infeções
no local cirúrgico com manifestações clínicas que variam entre presença de pústulas, sépsis e morte.1 Este microrganismo é encontrado frequentemente no nariz ou na pele de indivíduos saudáveis (portadores assintomáticos). O tratamento das infeções por Staphylococcus aureus tornou-se num importante desafio com a emergência de estirpes resistentes a agentes antimicrobianos previamente eficazes. As estirpes de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina são cada vez mais encontradas em ambientes de cuidados de saúde e representam mais de 60% dos isolados de Staphylococcus aureus contraídos em hospitais em algumas instalações de saúde na América do Norte e Europa.2,3 No ambiente hospitalar, o MRSA pode ser transmitido entre pacientes através das mãos contaminadas dos profissionais de saúde. Entre os fatores de risco para colonização por MRSA em ambientes de cuidados de saúde inclui-se uma permanência hospitalar prolongada, proximidade com doentes infetados por MRSA, exposição a várias terapêuticas prolongadas com antibióticos de largo espetro e o estado de portador de MRSA. A infeção por MRSA aumenta em pacientes colonizados por MRSA.
Staphylococcus aureus é uma das principais causas de infeções no local cirúrgico (ILC). Este microrganismo é responsável
por 20% a 56% das ILC e o MRSA representa até 57% dos isolados destes casos.4 A taxa de mortalidade associada aos dois agentes patogénicos varia entre 5 e 22%.4,5 Na maioria dos pacientes com ILC, a infeção por Staphylococcus aureus tem uma origem endógena.4,6
As técnicas utilizadas tradicionalmente para a deteção de Staphylococcus aureus e MRSA exigem passos de cultura e o isolamento de colónias puras, seguidos de teste de aglutinação para identificação de Staphylococcus aureus e teste da sensibilidade à oxacilina, deteção do gene que confere resistência à meticilina mecA ou deteção da proteína de ligação à penicilina (PBP 2a) para identificação de MRSA. Estes métodos convencionais requerem um período mínimo de 24 horas para determinar o resultado para
Staphylococcus aureus e MRSA, com um tempo mediano superior a 48 horas.
Tendo em conta a maior morbilidade e mortalidade associadas a infeções por Staphylococcus aureus, a emergência de estirpes com gene mecA com efeito “desistente” ou “drop-out” (drop-out) e a propagação de um novo gene que confere resistência à meticilina (o gene mecC), a capacidade de deteção e diferenciação rápida de Staphylococcus aureus e MRSA dentro de horas, em vez de um ou mais dias, é uma vantagem importante em comparação aos métodos atuais e permite maior eficácia no tratamento e gestão dos pacientes.
É colhida e transportada para o laboratório uma amostra nasal utilizando a zaragatoa recomendada (consulte a secção Equipamento e Material Necessário Mas Não fornecido). A zaragatoa é colocada num BD MAX StaphSR Sample Buffer Tube (tubo com tampão para amostras). O Sample Buffer Tube é agitado num vórtex para libertar as células da zaragatoa para o tampão. O Sample Buffer Tube é colocado no sistema BD MAX e são realizados os seguintes procedimentos automáticos: as células bacterianas são lisadas; o ADN é extraído para esferas magnéticas e concentrado; em seguida, uma alíquota do ADN eluído é adicionada aos reagentes de PCR que contêm os iniciadores específicos de SA e MRSA utilizados para amplificar os alvos genéticos, caso estejam presentes. O ensaio também inclui um Controlo de Processamento da Amostra. O Controlo de Processamento da Amostra está presente no Extraction Tube (tubo de extração) e realiza os passos de extração, concentração e amplificação para deteção de substâncias inibidoras, assim como de ineficiências processuais devido a falhas no instrumento ou reagentes. Não é necessária qualquer intervenção do operador depois de colocar a amostra clínica, a BD MAX Unitized Reagent Strip (Tira de reagente unificado) e o BD MAX PCR Cartridges no sistema BD MAX. O sistema BD MAX automatiza os processos de lise de amostras, extração e concentração de ADN, reidratação de reagentes, amplificação de ácidos nucleicos e deteção da sequência alvo de ácidos nucleicos através da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Os alvos amplificados são detetados com sondas de hidrólise marcadas com fluoróforos suprimidos. A amplificação, deteção e interpretação dos sinais são efetuadas automaticamente pelo sistema BD MAX.
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O sistema BD MAX utiliza uma combinação de reagentes de lise e de extração para realizar a lise celular e extração de ADN. Após a realização da lise celular por ação enzimática a temperaturas elevadas, os ácidos nucleicos libertados são capturados por esferas magnéticas de afinidade. As esferas, ligadas aos ácidos nucleicos, são lavadas e os ácidos nucleicos são extraídos por eluição através de aquecimento no Tampão de Eluição. O ADN eluído é neutralizado pelo Tampão de Neutralização e transferido para o tubo de Master Mix para reidratar os reagentes de PCR. O reagente de amplificação reconstituído é introduzido no BD MAX PCR Cartridge (cartucho de PCR). As microválvulas no BD MAX PCR Cartridge são seladas pelo sistema antes de iniciar a PCR para impedir a evaporação e contaminação do amplicon.
Os alvos de ADN amplificados são detetados com sondas de hidrólise (TaqMan) marcadas numa extremidade com um corante reportador fluorescente (fluoróforo) e com uma porção de supressão na outra extremidade. São utilizadas sondas marcadas com fluoróforos diferentes para detetar um amplicon específico na junção da extremidade direita do SCCmec (MREJ), os genes que conferem resistência à meticilina mecA e mecC, o gene nuc que codifica uma nuclease termostável do Staphylococcus aureus e amplicons do Controlo de Processamento da Amostra em quatro canais óticos diferentes do sistema BD MAX: Os amplicons de MREJ são detetados no canal FAM, os amplicons de mecA e mecC são detetados no canal ROX, os amplicons de nuc são detetados no canal VIC e os amplicons do Controlo de Processamento da Amostra são detetados no canal Cy5.5. Quando as sondas estão no estado original, a fluorescência do fluoróforo está suprimida devido à proximidade do agente supressor. No entanto, na presença de ADN alvo, as sondas sofrem hibridização para as respetivas sequências complementares e são hidrolisadas através da atividade de exonuclease 5’–3’ da polimerase de ADN, à medida que esta percorre o modelo de ADN e sintetiza uma nova cadeia. Consequentemente, os fluoróforos são separados das moléculas de supressão e ocorre emissão de fluorescência. A intensidade de fluorescência detetada nos quatro canais óticos utilizados para o ensaio BD MAX StaphSR é diretamente proporcional à quantidade da sonda hidrolisada correspondente. O sistema BD MAX mede estes sinais no final de cada ciclo de amplificação e interpreta os dados para fornecer um resultado.
REAGENTES
REF Conteúdo Quantidade
443419
BD MAX StaphSR Master Mix (B7)
Master Mix para PCR liofilizada, que contém polimerase, nucleótidos e sondas moleculares e iniciadores
específicos, juntamente com a sonda molecular específica para o Controlo de Processamento da Amostra. 24 testes BD MAX StaphSR Unitized Reagent Strip
Tira de reagente unificado, que contém todos os reagentes líquidos e pontas de pipeta descartáveis
necessários para o processamento da amostra e extração de ADN. 24 testes
BD MAX StaphSR Extraction Tube (B8) (tubo de extração)
Reagente de extração liofilizado, que contém esferas magnéticas com afinidade a ADN, Acromopeptidase
e o Controlo de Processamento da Amostra 24 testes
BD MAX StaphSR Sample Buffer Tube 24 testes
Tampas de septo 25
EQUIPAMENTO E MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
• Zaragatoa simples ou dupla BD BBL CultureSwab Liquid Stuart (Becton Dickinson, n.º de catálogo 220099 ou 220109), zaragatoa simples ou dupla Copan (Venturi) Transystem* Liquid Stuart (Copan, n.º de catálogo 141C ou 139C) • Agitador de vórtex multitubos VWR (VWR, n.º de cat. 58816-115) • Suporte de frascos criogénicos NALGENE (VWR, n.º de cat. 66008-783) • Luvas descartáveis, sem pó • Tesouras estéreis (opcional) • Gaze estéril • Cronómetro ou temporizador • BD MAX PCR Cartridges (BD Diagnostic Systems, n.º de cat. 437519)
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES • O ensaio BD MAX StaphSR destina-se a uso diagnóstico in vitro. • Este produto apenas pode ser utilizado no sistema BD MAX. • Não utilize reagentes e/ou materiais após o prazo de validade. • Não utilize o kit se o rótulo de segurança da caixa exterior estiver partido quando fornecido. • Não utilize os reagentes se as bolsas protetoras estiverem abertas ou danificadas quando fornecidas. • Não utilize os reagentes se o exsicante não estiver presente ou estiver partido no interior das bolsas de reagente. • Não retire o exsicante das bolsas de reagentes. • Feche as bolsas protetoras dos reagentes rapidamente com o fecho de correr após cada utilização. Elimine a presença excessiva de ar nas bolsas antes de selar.
• Proteja os reagentes do calor e da humidade. A exposição prolongada à humidade afeta o desempenho do produto. • Não utilize os reagentes se a folha de alumínio estiver partida ou danificada.
• Não misture os reagentes de bolsas e/ou kits e/ou lotes diferentes.
• Não troque nem reutilize as tampas, dado que pode ocorrer contaminação e compromisso dos resultados do teste.
• Verifique se as Unitized Reagent Strips apresentam níveis corretos de líquido (certifique-se de que os líquidos estão no fundo dos tubos) (consulte a Figura 1).
• Verifique se todas as pontas de pipeta estão presentes nas Unitized Reagent Strips (consulte a Figura 1).
• Tenha cuidado ao utilizar soluções químicas, visto que podem alterar a legibilidade dos códigos de barras do Master Mix Tube e do Extraction Tube.
• Uma boa técnica de laboratório é essencial para o desempenho adequado deste ensaio. Em virtude da elevada sensibilidade analítica deste teste, deverá ser tomada extrema precaução para preservar a pureza de todos os materiais e reagentes. • Se forem realizados outros testes de PCR na mesma área geral do laboratório, deve ter-se o cuidado de assegurar que
o ensaio BD MAX StaphSR, todos os reagentes adicionais necessários para o teste, e o Sistema BD MAX não estão contaminados. Evite a contaminação microbiana e por desoxirribonuclease (DNase) dos reagentes em qualquer momento. As luvas devem ser substituídas antes de manusear reagentes e cartuchos.
• Para evitar a contaminação do ambiente com amplicons, não desfaça os BD MAX PCR Cartridges após a utilização. Os vedantes nos BD MAX PCR Cartridges destinam-se a impedir a contaminação.
• O laboratório deve efetuar monitorização ambiental de rotina para minimizar o risco de contaminação cruzada. • Os BD MAX Microfluidic Cartridges (Cartuchos microfluídicos) podem ser utilizados em duas execuções, no máximo. • A realização do ensaio BD MAX StaphSR fora dos intervalos de tempo recomendados pode produzir resultados inválidos.
Os ensaios não realizados dentro dos intervalos de tempo especificados devem ser repetidos.
• Podem testar-se controlos adicionais de acordo com as normas ou requisitos dos regulamentações locais, nacionais e/ou comunitários ou de organizações de acreditação.
• As amostras devem ser sempre manuseadas como se fossem infeciosas e de acordo com os procedimentos de segurança laboratorial, tais como os descritos no documento do CLSI M297 e em Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Segurança biológica em laboratórios de microbiologia e biomedicina).8
• Utilize vestuário protetor e luvas descartáveis durante o manuseamento de qualquer reagente. • Lave cuidadosamente as mãos depois de realizar o teste.
• Não pipete com a boca.
• Não fume, nem beba, não mastigue nem coma em áreas onde ocorre manuseamento de amostras e reagentes do kit. • Elimine os reagentes não utilizados e os resíduos em conformidade com os regulamentos locais, nacionais e/ou comunitários. • Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD MAX11 para obter advertências, precauções e procedimentos adicionais.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
As amostras colhidas devem ser mantidas entre 2 °C e 25 °C durante o transporte. Proteja contra a congelação ou exposição a calor excessivo.
As amostras podem ser armazenadas entre 25 ± 2 °C durante um período máximo de 48 horas, ou entre 2–8 °C durante um período máximo de 120 horas (5 dias) antes do teste.
Os reagentes e componentes do ensaio BD MAX StaphSR são estáveis a 2–25 °C até à data de validade indicada. Não utilize componentes após o prazo de validade.
Os tubos BD MAX StaphSR Master Mix e Extraction são fornecidos em bolsas seladas. Para proteger o produto da humidade, volte a selar imediatamente depois de abrir.
• Os tubos de reagentes são estáveis durante um período máximo de 14 dias a 2–25 °C após a abertura inicial e re-selagem da bolsa.
• Os tubos de reagentes Extraction e Master Mix não reconstituídos são estáveis durante um período máximo de 5 horas a 2–25 °C após a remoção da respetiva bolsa protetora.
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO Colheita/Transporte de Amostras
Utilizando um dispositivo de transporte de zaragatoas recomendado (consulte a secção Equipamento e Material Necessário
Mas Não fornecido), as amostras nasais devem ser colhidas de acordo com os procedimentos operacionais padrão institucionais e laboratoriais e/ou efetue o seguinte:
1. Humedeça a(s) zaragatoa(s) com duas gotas (aproximadamente 50 µL) de soro fisiológico estéril ou utilize-a(s) na forma seca. 2. Introduza cuidadosamente a(s) zaragatoa(s) na narina do paciente [a ponta da zaragatoa deve ser introduzida até uma
distância de 2,5 cm da extremidade das narinas].
3. Rode a(s) zaragatoa(s) ao longo da mucosa no interior da narina 5 vezes. 4. Introduza a(s) mesma(s) zaragatoa(s) na segunda narina e repita os passos 2 e 3. 5. Coloque a(s) zaragatoa(s) no respetivo tubo de transporte.
6. Rotule o tubo de transporte.
7. Transporte a(s) zaragatoa(s) para o laboratório de acordo com os procedimentos operacionais padrão institucionais e laboratoriais (Consulte a secção Armazenamento e Estabilidade).
Preparação das Amostras
NOTA: Para cada amostra e cada Controlo Externo a testar é necessário um (1) Sample Buffer Tube (tubo com tampão para
amostras), uma (1) tampa de septo, uma (1) Master Mix (B7), um (1) Extraction Tube (tubo de extração) (B8) e uma (1) Reagent Strip (tira de reagentes).
NOTA: Para obter informações acerca da cultura de amostras clínicas antes de efetuar o ensaio BD MAX StaphSR, consulte
a secção Cultura de Amostras Clínicas.
1. Obtenha o número de Sample Buffer Tubes correspondente ao número de amostras e controlos externos a testar.
2. Rotule cada Sample Buffer Tube com a identificação do paciente apropriado, certificando-se de que não tapa nem escreve por cima dos códigos de barras.
3. Retire a tampa do Sample Buffer Tube.
4. Retire a zaragatoa do tubo de transporte de amostras e coloque a zaragatoa no Sample Buffer Tube correspondente. 5. Segure a zaragatoa pela haste junto à margem do tubo (utilize uma compressa de gaze estéril para minimizar o risco de
contaminação). Levante a zaragatoa aproximadamente um (1) cm do fundo do Sample Buffer Tube e dobre a haste contra a margem do tubo para a quebrar. Método alternativo: utilize uma tesoura estéril para cortar a haste.
6. Feche o Sample Buffer Tube com uma tampa de septo.
7. Coloque o Sample Buffer Tube num NALGENE Cryogenic Vial Holder (suporte de frascos criogénicos) e agite num vórtex à velocidade máxima durante um (1) minuto com o Multi-Tube Vortexer (vórtex para vários tubos). É possível processar um máximo de 24 amostras simultaneamente no Multi-Tube Vortexer.
Operação do sistema BD MAX
NOTA: Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD MAX11 para obter instruções detalhadas (secção Operação).
NOTA: O teste do ensaio BD MAX StaphSR deve ser realizado imediatamente após o passo de agitação em vórtex indicado acima (Preparação de amostras, passo 7). Se for necessário repetir o teste, volte a agitar a(s) amostra(s) no vórtex.
1. Ligue o sistema BD MAX (se não estiver já ligado) e introduza o <user name> (nome de utilizador) e <password>
(palavra-passe) para iniciar sessão.
2. As luvas devem ser substituídas antes de manusear reagentes e cartuchos.
3. Retire o número necessário de Unitized Reagent Strips do kit BD MAX StaphSR. Bata suavemente com cada Unitized Reagent Strip contra uma superfície sólida para assegurar que todos os líquidos estão no fundo dos tubos.
4. Retire o número necessário de Extraction Tube(s) e Master Mix Tube(s) das respetivas bolsas protetoras. Elimine a presença excessiva de ar e feche as bolsas com o fecho de correr.
5. Por cada amostra para teste, coloque uma (1) Unitized Reagent Strip no BD MAX System Rack (Suporte do sistema), começando na posição 1 do suporte A.
6. Encaixe um (1) Extraction Tube (película branca) em cada Unitized Reagent Strip na posição 1, conforme ilustrado na Figura 1. 7. Encaixe um (1) Master Mix Tube (película verde) em cada Unitized Reagent Strip na posição 2, conforme ilustrado na Figura 1.
Tubos de encaixe Tubo de lise Reservatório de resíduos Pontas de pipeta Tampão de neutralização Extraction Tube
StaphSR Master Mix
Tampão de lavagem Tampão de
eluição #1 #2 #3
Figura 1: Encaixar os BD MAX StaphSR Master Mix e Extraction Tubes nas Unitized Reagent Strips.
8. Clique no ícone Run (Executar) e introduza o número de lote do kit para o ensaio BD MAX StaphSR (para fins de controlo do lote) manualmente ou efetuando a leitura do código de barras com o leitor para esse efeito.
NOTA: Repita o passo 8 sempre que for utilizado um novo lote de kit.
9. Navegue para Worklist (Lista de trabalho). Utilize o menu pendente para selecionar <BD MAX StaphSR 55>.
10. Introduza a Sample Buffer Tube ID (ID do tubo com tampão para amostras), Patient ID (ID do doente) e Accession Number (número de acesso) na Worklist (Lista de trabalho), manualmente ou efetuando a leitura do código de barras com o leitor para esse efeito. 11. Selecione o número de lote do kit apropriado (indicado na caixa exterior) no menu pendente. 12. Repita os passos 9 a 11 para todos os restantes Sample Buffer Tubes. 13. Coloque os Sample Buffer Tubes no(s) BD MAX System Rack(s) correspondentes às Unitized Reagent Strips montadas nos passos 5 a 7.
NOTA: Coloque os Sample Buffer Tubes no(s) suporte(s) de amostras com os rótulos de código de barras 1D virados para fora (para facilitar a leitura dos Sample Buffer Tubes durante o registo de amostras).
14. Coloque o número necessário de BD MAX PCR Cartridge(s) no sistema BD MAX (consulte a Figura 2). • Cada cartucho permite 2 execuções de um máximo de 12 amostras, obtendo um total de 24 amostras.
• O sistema BD MAX seleciona automaticamente a posição e linha no PCR Cartridge para cada execução. Os BD MAX PCR Cartridges podem ser usados várias vezes até ter utilizado todos os corredores.
• Para maximizar a utilização dos BD MAX PCR Cartridges, no modo 2.000 Sample Mode, selecione Run Wizard (Assistente de execução) no separador Worklist (Lista de trabalho) para distribuir os corredores.
Figura 2: Introduzir os BD MAX PCR Cartridges.
15. Introduza o(s) suporte(s) no sistema BD MAX (Figura 3).
Lado A Lado B
16. Feche a tampa do sistema BD MAX e clique em <Start> (Iniciar) para iniciar o processamento.
17. No final da execução, verifique os resultados imediatamente ou armazene os Sample Buffer Tubes a 2–8 °C durante um período de 5 dias OU a 25 ± 2 °C durante um período máximo de 48 horas até verificar os resultados.
NOTA: Se uma tampa de septo for danificada durante a execução, substitua por uma tampa nova antes de armazenar a amostra.
NOTA: Os BD MAX StaphSR Sample Buffer Tubes podem ser armazenados a 2–8 °C durante um período máximo de 120 horas (5 dias) OU a 25 ± 2 °C durante um período máximo de 36 horas após a adição da amostra ao Sample Buffer Tube. Quando for obtido um resultado Indeterminate (IND, Indeterminado), Unresolved (UNR, Não resolvido) ou Incomplete (INC, Incompleto), ou quando ocorre uma falha do Controlo Externo, é necessário repetir o teste a partir do mesmo Sample Buffer Tube preparado dentro deste período de tempo (consulte a secção Procedimento de Repetição do Teste).
CONTROLO DE QUALIDADE
Os procedimentos de controlo de qualidade monitorizam o desempenho do ensaio. Os laboratórios devem estabelecer o número, tipo e frequência dos materiais de controlo do teste de acordo com as normas ou requisitos dos regulamentos locais, nacionais e/ ou comunitários ou de organizações de acreditação. Para obter orientações gerais de Controlo de Qualidade, o utilizador pode pretender consultar o documento CLSI MM3 e EP12.9,10
1. Os materiais de Controlo Externo não são fornecidos pela BD. Os Controlos Externos, Positivo e Negativo, não são utilizados pelo software do sistema BD MAX para fins de interpretação dos resultados de teste das amostras. Os Controlos Externos são tratados como amostras de doente. (Consulte o quadro na secção Interpretação dos Resultados para obter informações sobre a interpretação dos resultados de ensaio do Controlo Externo.)
2. Um (1) Controlo Positivo Externo e um (1) Controlo Negativo Externo devem ser executados diariamente, no mínimo, até obter uma validação adequada do processo no sistema BD MAX em cada ambiente de laboratório. Uma frequência reduzida de testes de controlo deverá estar em conformidade com os regulamentos aplicáveis.
3. O Controlo Positivo Externo destina-se a monitorizar uma falha significativa dos reagentes. O Controlo Negativo Externo destina-se a detetar contaminação dos reagentes ou ambiental (ou “carryover”) por ácidos nucleicos alvo.
4. As estirpes de controlo devem ser testadas de acordo com as orientações ou requisitos dos regulamentos locais, nacionais e/ou comunitários ou de organizações de acreditação, com vista a monitorizar a eficácia de todo o processo analítico. 5. Recomendam-se vários tipos de Controlo Externo para permitir ao utilizador selecionar o controlo mais adequado para
o programa de controlo de qualidade do laboratório.
a. Controlo Negativo Externo: Material de controlo disponível comercialmente [p. ex., uma estirpe Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228)] ou uma amostra caracterizada previamente como negativa. A BD recomenda que o Controlo Negativo Externo seja preparado antes do Controlo Positivo Externo para reduzir a probabilidade de contaminação derivada da preparação do controlo.
b. Controlo Positivo Externo: Materiais de controlo disponíveis comercialmente [p. ex., uma estirpe MRSA de referência (ATCC 43300) e uma estirpe Staphylococcus aureus sensível à meticilina (p. ex., ATCC 29213)] ou uma amostra caracterizada previamente como positiva.
Para a preparação de suspensões do Controlo Externo, proceder à ressuspensão dos isolados em soro fisiológico até obter uma turvação de 0,5 McFarland (~1 X 108 UFC/mL). Efetue diluições em série com solução salina para obter uma suspensão final de ~1,0 X 104 UFC/mL. Mergulhe uma zaragatoa na suspensão bacteriana diluída, pressione para expulsar o líquido e coloque a zaragatoa num Sample Buffer Tube correspondente. Efetue o processamento e teste como uma amostra (consulte as secções Preparação das Amostras e Operação do Sistema BD MAX).
6. Todos os Controlos Externos devem produzir os resultados esperados (positivo para o Controlo Positivo Externo, negativo para o Controlo Negativo Externo), sem falhas nos controlos externos (resultados Não Resolvido ou Indeterminado).
7. A obtenção de um resultado de teste positivo num Controlo Negativo Externo indica um problema no manuseamento da amostra e/ou ocorrência de contaminação. Reveja a técnica de manuseamento de amostras para evitar trocas e/ou contaminação. A obtenção de um resultado negativo num Controlo Positivo Externo indica um problema no manuseamento/ preparação da amostra. Reveja a técnica de manuseamento/preparação de amostras.
8. A obtenção de um resultado de teste Unresolved (Não resolvido), Indeterminate (Indeterminado) ou Incomplete (Incompleto) num Controlo Externo indica uma falha num reagente ou no sistema BD MAX. Verifique a presença de mensagens de erro no monitor do sistema BD MAX. Consulte a secção Resumo de Erros do Sistema no Manual do Utilizador do Sistema BD MAX11 para obter informações acerca da interpretação dos códigos de advertência e de erro. Se o problema persistir, utilize reagentes de uma bolsa não aberta ou utilize um novo kit de ensaio.
9. Cada Extraction Tube contém um Controlo de Processamento da Amostra, o qual consiste num plasmídeo com uma sequência sintética de ADN alvo. O Controlo de Processamento da Amostra monitoriza a eficiência da captura, lavagem e eluição de ADN durante os passos de processamento da amostra, assim como a eficiência da amplificação e deteção de ADN durante a análise de PCR. Se o resultado do Controlo de Processamento da Amostra não cumprir os critérios de aceitação, o resultado da amostra é assinalado como Unresolved (Não resolvido); no entanto, todos os resultados de ensaio positivos (POS) serão comunicados e nenhum alvo será notificado como NEG. Um resultado Unresolved (Não resolvido) indica inibição associada à amostra ou falha dos reagentes. Repita as amostras com resultados Unresolved (Não resolvidos) de acordo com a secção Procedimento de Repetição do Teste.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Os resultados são disponibilizados no separador Results (Resultados) na janela Results (Resultados) no monitor do sistema BD MAX. O software do sistema BD MAX interpreta os resultados de teste automaticamente. Um resultado de teste pode ter a designação [SA NEG, MRSA NEG (negativo)], [SA POS, MRSA POS (positivo para MRSA)], [SA POS, MRSA NEG (positivo para SA)] ou [SA UNR, MRSA UNR (não resolvido)] com base no estado de amplificação do alvo e do Controlo de Processamento da Amostra. Os resultados IND (indeterminado) ou INC (incompleto) devem-se a falhas do sistema BD MAX. Os resultados são baseados no seguinte algoritmo de decisão (Quadro 1):
Quadro 1: Interpretação dos resultados do ensaio BD MAX StaphSR
Resultado de ensaio indicado Interpretação do Resultado
SA POS
MRSA POS ADN de MRSA detetado
SA POS
MRSA NEG ADN de SA detetado; ADN de MRSA não detetado
SA NEG
MRSA NEG ADN de SA e de MRSA não detetado
SA UNR
MRSA UNR amplificação do alvo ou do Controlo de Processamento da AmostraNão resolvido – amostra inibidora ou falha dos reagentes; sem
IND Resultado indeterminado devido a falha do sistema BD MAX(com códigos de Advertência ou Erroa)
INC (com códigos de Advertência ou ErroExecução incompleta a)
a Consulte a secção Resolução de Problemas do Manual do Utilizador do Sistema BD MAX11 para obter informações acerca da interpretação dos
códigos de advertência e de erro.
SA POS, MRSA POS (ADN de MRSA detetado)
• Sinal de fluorescência detetado para os alvos MREJ (específico de Staphylococcus aureus) e mecA ou mecC; e,
• O alvo do gene nuc pode ser ou não detetado, visto que foi demonstrado que, em situações raras, o gene nuc pode não estar presente em MRSA;12 e,
• O Controlo de Processamento da Amostra foi ignorado, visto que a amplificação do alvo de MRSA tem prevalência sobre este controlo.
SA POS, MRSA NEG (ADN de SA detetado; ADN de MRSA não detetado)
• Sinal de fluorescência detetado apenas para o alvo do gene nuc (indicativo de uma estirpe SA); ou
• Sinal de fluorescência detetado para os alvos do gene nuc e mecA ou mecC com ausência de sequências MREJ (indicativo de uma estirpe de SA presente com co-colonização por uma estirpe bacteriana não-SA resistente à meticilina); ou,
• Sinal de fluorescência detetado para os alvos do gene nuc e MREJ (indicativo de uma variante de cassete vazia); ou • Sinal de fluorescência detetado apenas para o alvo MREJ (indicativo de uma variante Staphylococcus aureus de cassete
vazia). MREJ é específico da espécie Staphylococcus aureus e, por isso, indicativo de estirpe SA. A deteção do gene nuc não é necessária para obter um resultado SA POS, MRSA NEG A numa variante de cassete vazia;
• O Controlo de Processamento da Amostra foi ignorado, visto que a amplificação do alvo de SA tem prevalência sobre este controlo.
SA NEG, MRSA NEG (ADN não detetado para SA e MRSA)
• Sinal de fluorescência não detetado pelo ensaio BD MAX StaphSR para qualquer alvo (nuc, mecA, mecC e MREJ) e sinal de fluorescência detetado para o Controlo de Processamento da Amostra.
• Sinal de fluorescência detetado apenas para o gene mecA ou mecC [os genes mecA e mecC não são exclusivos da espécie
Staphylococcus aureus e podem surgir noutros géneros bacterianos (p. ex., Staphylococcus epidermidis)].
SA UNR, MRSA UNR (Resultado não resolvido)
• Sinal de fluorescência não detetado para os alvos do gene nuc, mecA, mecC ou MREJ; e
• Sinal de fluorescência não detetado para o Controlo de Processamento da Amostra (amostra inibitória ou falha dos reagentes).
IND (Resultado Indeterminado)
• Falha do sistema BD MAX com códigos de Advertência ou Erro. Consulte a secção Resolução de Problemas do Manual do Utilizador do Sistema BD MAX11 para obter informações acerca da interpretação dos códigos de advertência e de erro.
INC (Execução incompleta)
• Falha do sistema BD MAX com códigos de Advertência ou Erro. Consulte a secção Resolução de Problemas do Manual do Utilizador do Sistema BD MAX11 para obter informações acerca da interpretação dos códigos de advertência e de erro.
PROCEDIMENTO DE REPETIÇÃO DO TESTE
NOTA: O Sample Buffer Tube (tubo com tampão para amostras) apenas contém volume suficiente para uma repetição do teste
no sistema BD MAX. No caso de Sample Buffer Tubes armazenados entre 25 ± 2 °C, o teste deve ser repetido dentro de um período de 36 horas após os passos descritos na secção Preparação das Amostras acima. No caso de Sample Buffer Tubes armazenados entre 2–8 °C, o teste pode ser repetido dentro de um período de 120 horas (5 dias) após os passos descritos na secção Preparação das Amostras acima.
RESULTADO NÃO RESOLVIDO
Os resultados Unresolved (Não resolvidos) podem ser obtidos quando uma substância inibidora ou uma falha dos reagentes impede a amplificação correta do alvo ou do Controlo de Processamento da Amostra. A(s) amostra(s) pode(m) ser repetida(s) a partir do(s) Sample Buffer Tube(s) correspondente(s) dentro dos períodos de tempo definidos acima. Agite a(s) amostra(s) num vórtex durante um (1) minuto e reinicie o processo seguindo a secção Operação do Sistema BD MAX.
RESULTADO INDETERMINADO
Os resultados Indeterminados podem ser obtidos quando ocorre uma falha do sistema. A(s) amostra(s) pode(m) ser repetida(s) a partir do(s) Sample Buffer Tube(s) correspondente(s) dentro dos períodos de tempo definidos acima. Agite a(s) amostra(s) num vórtex durante um (1) minuto e reinicie o processo seguindo a secção Operação do Sistema BD MAX. Para obter informações acerca da interpretação das mensagens de código de advertência ou de erro, consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD MAX11 (secção Resolução de Problemas).
RESULTADO INCOMPLETO
Os resultados Incompletos podem ser obtidos quando ocorre um código de advertência ou de erro crítico ou caso a Preparação de Amostras ou a PCR não tenha atingido os pontos temporais previstos. Os resultados Incompletos podem ser aplicáveis a uma execução ou um corredor. A(s) amostra(s) pode(m) ser repetida(s) a partir do(s) Sample Buffer Tube(s) correspondente(s) dentro dos períodos de tempo definidos acima. Agite a(s) amostra(s) num vórtex durante um (1) minuto e reinicie o processo seguindo a secção Operação do Sistema BD MAX. Para obter informações acerca da interpretação das mensagens de código de advertência ou de erro, consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD MAX11 (secção Resolução de Problemas).
FALHA DO CONTROLO EXTERNO
Os Controlos Externos devem produzir os resultados de teste esperados. Se for necessário repetir as amostras devido a um resultado incorreto do Controlo Externo, devem ser repetidas a partir dos respetivos Sample Buffer Tubes em conjunto com preparações novas de Controlos Externos dentro dos períodos de tempo definidos acima. Agite as amostras num vórtex durante um (1) minuto e reinicie o processo seguindo a secção Operação do Sistema BD MAX.
CULTURA DE AMOSTRAS CLÍNICAS
Com vista a realizar testes da sensibilidade antimicrobiana ou de tipagem epidemiológica, é possível produzir culturas de amostras clínicas a partir do dispositivo de colheita (zaragatoa) antes da realização do procedimento de Preparação de amostras (através de um método de espalhar em placa) ou após o procedimento de Preparação de amostras (através de um método de caldo de enriquecimento). Imediatamente após o fim da execução de PCR inicial, as zaragatoas podem ser conservadas entre 2–8 °C durante um período de 36 horas em Sample Buffer Tubes antes da cultura, seguindo os procedimentos hospitalares.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
• Este produto destina-se a ser utilizado com amostras de zaragatoa nasal colhidas com dispositivos de colheita e transporte de amostras enumerados na secção Equipamento e Material Necessário Mas Não fornecido. O desempenho do ensaio BD MAX StaphSR com meio líquido de Amies ou dispositivo de transporte de zaragatoas duplo não foi estabelecido.
• Este produto deve ser utilizado apenas com o sistema BD MAX.
• Podem ocorrer resultados do teste incorretos decorrentes de uma colheita, manuseamento ou armazenamento de amostras incorreto, erro técnico, troca de amostras ou quando o número de microrganismos na amostra é inferior à sensibilidade analítica do teste. As instruções do folheto informativo e do Manual do Utilizador do Sistema BD MAX11 devem ser cumpridas rigorosamente para evitar a obtenção de resultados errados.
• O rastreio determina o estado da colonização num determinado momento. A colonização pode variar dependendo do tratamento do paciente (p. ex., regime de descolonização), do estado do paciente (p. ex., colonização transitória por SA ou MRSA) ou da exposição a ambientes de alto risco (p. ex., contacto com portadores de SA ou MRSA e/ou hospitalização prolongada). O estado de colonização deve ser monitorizado de acordo com as políticas institucionais.
• Um resultado positivo no ensaio BD MAX StaphSR não indica necessariamente uma falha do tratamento de erradicação, dado que a presença de ADN pode persistir. Um resultado negativo após um resultado positivo num teste prévio pode indicar sucesso do tratamento de erradicação ou pode ocorrer devido a colonização intermitente.
• Um resultado de teste positivo não indica necessariamente a presença de organismos viáveis. Um resultado positivo é indicativo da presença de ADN de SA ou MRSA. O ensaio BD MAX StaphSR deteta simultaneamente o gene mecA ou mecC integrado na cassete SCCmec e uma sequência específica do Staphylococcus aureus localizada na junção da cassete SCCmec e o gene orfX (MREJ). O ensaio BD MAX StaphSR também deteta o gene nuc específico de Staphylococcus aureus. • O ensaio BD MAX StaphSR foi concebido para detetar os genótipos de MREJ i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv e xxi, os quais
representam a maioria das estirpes de MRSA que apresentam os genes mecA e mecC (pertencentes a tipos SCCmec/MREJ diferentes) e que representam mais de 98% das estirpes mundiais testadas pela BD até à data. Não é conhecida a capacidade de deteção de outros genótipos MREJ pelo ensaio BD MAX StaphSR.
• O ensaio BD MAX StaphSR não notifica Staphylococcus aureus com resistência limite à oxacilina (BORSA) como MRSA (estes microrganismos são notificados apenas como SA). O mecanismo de resistência à oxacilina nas estirpes BORSA é causado por um aumento da produção de β-lactamases e não pelo gene mecA ou mecC. As estirpes BORSA são raras.
• Não é conhecido o desempenho do teste BD MAX StaphSR na deteção de Staphylococcus aureus modificado (MOD-SA), visto que essas estirpes não foram avaliadas. O mecanismo de resistência à oxacilina nas estirpes MOD-SA é causado por alterações na afinidade à oxacilina das proteínas ligantes à penicilina. As estirpes MOD-SA são raras.
• O ensaio BD MAX StaphSR gera um resultado falso positivo para MRSA ao testar uma amostra nasal co-colonizada com
Staphylococcus resistentes à meticilina e negativos para a coagulase (MRCoNS) e com uma variante de SA de “cassete vazia”
sensível à meticilina. A co-colonização com MRCoNS e SA de “cassete vazia” sensível à meticilina é rara.
• Tal como acontece com todos os testes de diagnóstico in vitro baseados em PCR, é possível detetar níveis extremamente baixos de alvo, abaixo do LdD do ensaio, mas pode não ser possível reproduzir estes resultados.
• A tobramicina pode ter um efeito inibidor no ensaio BD MAX StaphSR (consulte a secção Substâncias Interferentes para obter mais informações).
• Os resultados falsos negativos podem ocorrer devido a perda de ácidos nucleicos resultante de colheita, transporte ou armazenamento de amostras incorreto, ou devido a uma lise celular bacteriana desadequada. O Controlo de Processamento da Amostra foi adicionado ao teste para auxiliar na identificação de amostras que contêm inibidores da amplificação da PCR e como um controlo da integridade dos reagentes e do sistema de ensaio de uma forma geral. O Controlo de Processamento da Amostra não indica se ocorreu perda de ácidos nucleicos resultante de colheita, transporte ou armazenamento incorreto das amostras, nem se a lise celular bacteriana é desadequada.
• Numa cultura mista, a deteção de MRSA ou SA é variável quando estão presentes concentrações elevadas de MRSE. Foi observada concorrência de MRSE a uma razão MRSA:MRSE de 1: ≥ 1 x 102 e a uma razão SA:MRSE de 1: ≥ 1 x 105. • Numa cultura mista, a deteção de MRSA é variável quando estão presentes concentrações elevadas de MSSA. Foi observada
concorrência de MSSA a uma razão MRSA:MSSA de 1: ≥ 1 x 103.
• Os resultados do ensaio BD MAX StaphSR podem por vezes ser Não resolvidos devido a um Controlo de Processamento da Amostra inválido, ou Indeterminados ou Incompletos devido a uma falha do instrumento, e obrigarem a repetição do teste, o que pode dar origem a atrasos na obtenção dos resultados finais.
• Mutações ou polimorfismos em regiões de ligação ao iniciador ou à sonda podem afetar a deteção de variantes novas ou desconhecidas de MRSA ou SA, produzindo um resultado falso negativo com o ensaio BD MAX StaphSR.
• Tal como acontece com todos os testes de diagnóstico in vitro, os valores preditivos positivos e negativos são altamente dependentes da prevalência. O desempenho do ensaio BD MAX StaphSR pode variar dependendo da prevalência e da população testada.
• O ensaio BD MAX StaphSR requer a utilização de quatro (4) canais óticos no sistema BD MAX: canal FAM (475–520 nm), canal ROX (585–630 nm), canal VIC (530/565 nm) e canal Cy5.5 (680/715 nm). O desempenho do canal ótico restante não foi estabelecido com este ensaio.
VALORES ESPERADOS
No estudo clínico do ensaio BD MAX StaphSR, foi obtido um total de 2.393 resultados reportáveis, a partir de amostras em conformidade ao nível da amostra e da PCR, de 3 diferentes localizações geográficas, tendo sido efetuada uma comparação com a cultura Direta e Enriquecida. A população em estudo foi dividida entre as categorias de pacientes internos e externos. O número e a percentagem de casos positivos, conforme determinado pelo ensaio BD MAX StaphSR, são apresentados no Quadro 2:
Quadro 2: Resumo de amostras em conformidade incluídas no ensaio clínico por grupo de pacientes
Grupo Número Total de Amostrasa Número de Positivas Quanto a MRSA Número de Positivas Quanto a SA Percentagem de Positivas Quanto a MRSA Positivas Quanto a SAPercentagem de
Pacientes Internos 1.683 172 545 (172/1.683)10,2% (545/1.683)32,4% Pacientes Externos 710 28 182 (28/710)3,9% (182/710)25,6% Totala 2.393 200 727 8,4% (200/2.393) (727/2.393)30,4%
a Número de amostras total com base em resultados em conformidade ao nível da PCR.
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO Desempenho Clínico
As características do desempenho clínico do ensaio BD MAX StaphSR foram determinadas num estudo investigacional prospetivo multicêntrico: No estudo participaram três (3) centros clínicos investigacionais. Para serem incluídos no estudo, os pacientes tiveram de ser elegíveis para os testes de MRSA e SA, de acordo com as políticas institucionais. De acordo com as políticas do centro clínico, os requisitos de seleção para o rastreio específico incluíram, entre outros: pacientes admitidos no sistema de cuidados de saúde específico; pacientes admitidos na unidade de cuidados intensivos; pacientes transferidos para a unidade de cuidados intensivos; pacientes pré-cirurgia eletiva; e pacientes admitidos provenientes de instalações de cuidados de longa duração. Foram excluídas as amostras de pacientes previamente incluídos no estudo.
O Método Comparativo de Referência consistiu na cultura direta complementada por cultura enriquecida. A análise de cultura enriquecida foi realizada para todas as amostras com resultado negativo para MRSA ou SA na cultura direta. Foram realizadas subculturas em ágar de sangue (BA) de colónias presuntivas para Staphylococcus aureus observadas em meio cromogénico seletivo (Staphylococcus aureus). A identificação foi confirmada através de um teste de aglutinação e a resistência à meticilina foi confirmada pelo teste de sensibilidade com difusão de disco de cefoxitina (30 μg). O enriquecimento em meio líquido Trypticase Soy Broth com NaCl a 6,5% (TSB 6,5% NaCl) foi realizado na ausência de confirmação de MRSA ou SA através do método inicial de cultura direta. O meio líquido Turbid TSB 6,5% NaCl foi utilizado para inocular meio cromogénico e placas de BA adicionais; a confirmação de MRSA foi realizada conforme descrito acima.
Resultados obtidos com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com o método de referência
No total, foram incluídas 2.451 amostras no estudo. Entre estas amostras, 94 foram consideradas como não conformes ao nível dos critérios do protocolo e quatro (4) amostras em conformidade total apresentaram resultados de PCR não reportáveis. No total, foram utilizados 2.353 resultados de amostras para determinar o desempenho clínico do ensaio BD MAX StaphSR em comparação com o método de referência (Quadros 3 a 6).
Em comparação com o método de referência (cultura direta/enriquecida), o ensaio BD MAX StaphSR identificou 93,1% das amostras positivas para MRSA e 97,8% das amostras negativas para MRSA (Quadros 3 e 4). Para a população testada, isto resultou num Valor Preditivo Negativo (NPV) de 99,5% e num Valor Preditivo Positivo (PPV) de 75,5%.
Quadro 3: Resultados obtidos para MRSA com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com o Método de Referência
Todos os Centros MRSA PositivoMétodo de ReferênciaNegativo Total
Ensaio BD MAX StaphSR
Positivo 149 48a 197 Negativo 11a 2.145 2.156 Total 160 2.193 2.353 Sensibilidade: 93,1% (149/160) (IC de 95%: 88,1%, 96,1%) Especificidade: 97,8% (2.145/2.193) (IC de 95%: 97,1%, 98,3%) PPV: 75,5% (IC de 95%: 70,0%, 80,5%) NPV: 99,5% (IC de 95%: 99,1%, 99,7%)
a Foi realizada uma investigação adicional às amostras com resultados discordantes entre o Método de Referência e o ensaio BD MAX StaphSR.
• Após uma repetição do Método de Referência, também se obteve um resultado positivo para 11 das 48 amostras com resultado falso positivo para MRSA no BD MAX StaphSR
• Após uma repetição do Método de Referência, também se obteve um resultado negativo para 5 das 11 amostras com resultado falso negativo para MRSA no BD MAX StaphSR
Quadro 4: Desempenho, por centro, obtido para MRSA com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com o Método de Referência
Centros Clínicos Prevalência a Sensibilidade (IC de 95%) b Especificidade (IC de 95%) b
Centro 1 4,3% (41/960) (80,6%, 97,5%)92,7% (38/41) 99,0% (909/918)(98,1%, 99,5%) Centro 2 5,8% (38/650) (72,7%, 94,2%)86,8% (33/38) 98,6% (584/592)(97,4%, 99,3%) Centro 3 10,6% (81/765) (89,7%, 98,7%)96,3% (78/81) 95,5% (652/683)(93,6%, 96,8%)
Global 6,7% (160/2.375 c) 93,1% (149/160)
(88,1%, 96,1%) 97,8% (2.145/2.193)(97,1%, 98,3%)
a Prevalência baseada apenas no método de referência b Intervalo de confiança
c 2.375 amostras estiveram conforme o método de referência
Em comparação com o método de referência (cultura direta/enriquecida), o ensaio BD MAX StaphSR identificou 92,0% das amostras positivas para SA e 93,2% das amostras negativas para SA (Quadros 5 e 6). Para a população testada, isto resultou num NPV de 96,9% e num PPV de 83,8%.
Quadro 5: Resultados obtidos para SA com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com o Método de Referência
Todos os Centros Método de Referência
SA Positivo Negativo Total
Ensaio BD MAX StaphSR
Positivo 599 115a 714 Negativo 52a 1.587 1.639 Total 651 1.702 2.353 Sensibilidade: 92,0% (599/651) (IC de 95%: 89,7%, 93,9%) Especificidade: 93,2% (1.587/1.702) (IC de 95%: 92,0%, 94,3%) PPV: 83,8% (IC de 95%: 81,3%, 86,1%) NPV: 96,9% (IC de 95%: 96,0%, 97,6%)
a Foi realizada uma investigação adicional às amostras com resultados discordantes entre o Método de Referência e o ensaio BD MAX StaphSR.
• Após uma repetição do Método de Referência, também se obteve um resultado positivo para 28 das 115 amostras com resultado falso positivo para SA no BD MAX StaphSR
• Após uma repetição do Método de Referência, também se obteve um resultado negativo para 23 das 52 amostras com resultado falso negativo para SA no BD MAX StaphSR
Quadro 6: Desempenho, por centro, obtido para SA com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com o Método de Referência
Centros Clínicos Prevalência a Sensibilidade com IC de 95% b Especificidade com IC de 95% b
Centro 1 27,2% (261/960) 90,0% (235/261)(85,8%, 93,1%) 96,3% (672/698)(94,6%, 97,4%) Centro 2 27,5% (179/650) 91,5% (162/177)(86,5%, 94,8%) 90,9% (412/453)(88,0%, 93,3%) Centro 3 27,8% (213/765) 94,8% (202/213)(91,0%, 97,1%) 91,3% (503/551)(88,6%, 93,4%)
Global 27,5% (653/2375 c) 92,0% (599/561)
(89,7%, 93,9%) 93,2% (1.587/1.702)(92,0%, 94,3%)
a Prevalência baseada apenas no método de referência b Intervalo de confiança
c 2.375 amostras estiveram conforme o método de referência
Resultados obtidos com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com a Cultura Direta
No total, foram incluídas 2.451 amostras no estudo. Entre estas amostras, 54 foram consideradas como não conformes ao nível dos critérios do protocolo e seis (6) amostras em conformidade total apresentaram resultados de PCR não reportáveis. No total, foram utilizados 2.391 resultados de amostras para determinar a concordância percentual positiva e negativa do ensaio BD MAX StaphSR em comparação com a Cultura Direta (Quadros 7 a 10).
Em comparação com a cultura direta, o ensaio BD MAX StaphSR identificou 96,5% das amostras positivas para MRSA e 97,2% das amostras negativas para MRSA (Quadros 7 e 8).
Quadro 7: Resultados obtidos para MRSA com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com a Cultura Direta
Todos os Centros Cultura Direta
Positivo Negativo Total
BD MAX StaphSR Positivo 137 63 200 Negativo 5 2.186 2.191 Total 142 2.249 2.391 Concordância percentual positiva: 96,5% (137/142) (IC de 95%: 92,0%, 98,5%) Concordância percentual negativa: 97,2% (2.186/2.249) (IC de 95%: 96,4%, 97,8%)
Quadro 8: Desempenho, por centro, obtido para MRSA com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com a Cultura Direta
Centros Clínicos Concordância percentual positiva com IC de 95% a Concordância percentual negativa com IC de 95% a
Centro 1 (90,1%, 100%)100% (35/35) 98,7% (912/924)(97,7%, 99,3%) Centro 2 (79,3%, 98,2%)93,5% (29/31) 98,0% (587/599)(96,5%, 98,9%) Centro 3 (89,0%, 98,6%)96,1% (73/76) 94,6% (687/726)(92,7%, 96,0%) Global 96,5% (137/142)(92,0%, 98,5%) 97,2% (2.186/2.249)(96,4%, 97,8%) a Intervalo de confiança Em comparação com a Cultura Direta, o ensaio BD MAX StaphSR identificou 95,1% das amostras positivas para SA e 91% das amostras negativas para SA (Quadros 9 e 10).
Quadro 9: Resultados obtidos para SA com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com a Cultura Direta
Todos os Centros Cultura Direta
Positivo Negativo Total
BD MAX StaphSR Positivo 564 161 725 Negativo 29 1.637 1.666 Total 593 1.798 2.391 Concordância percentual positiva: 95,1% (564/593) (IC de 95%: 93,1%, 96,6%) Concordância percentual negativa: 91,0% (1.637/1.798) (IC de 95%: 89,6%, 92,3%)
Quadro 10: Desempenho, por centro, obtido para SA com o ensaio BD MAX StaphSR em comparação com a Cultura Direta
Centros Clínicos Concordância Percentual Positiva com IC de 95% a Concordância Percentual Negativa com IC de 95% a
Centro 1 93,0% (213/229)(89,0%, 95,7%) 93,4% (682/730)(91,4%, 95,0%) Centro 2 94,9% (149/157)(90,3%, 97,4%) 88,6% (419/473)(85,4%, 91,1%) Centro 3 97,6% (202/207)(94,5%, 99,0%) 90,1% (536/595)(87,4%, 92,2%) Global 95,1% (564/593)(93,1%, 96,6%) 91,0% (1.637/1.798)(89,6%, 92,3%) a Intervalo de confiança Das 2.399 amostras de zaragatoa nasal em conformidade ao nível da amostra e da PCR, testadas com o ensaio
BD MAX StaphSR, 17 (0,7%) apresentaram um resultado Não resolvido após o teste inicial. A taxa de Não resolvidos após a repetição do teste foi de 0,1% (3/2.399) (Quadro 11).
Quadro 11: Taxas de Não Resolvidos
Não Resolvidos Iniciais Taxas de Não Resolvidos após Repetição
0,7% (17/2.399)a
(IC de 95%: 0,4%, 1,1%) (IC de 95%: 0%, 0,4%)0,1% (3/2.399)
a Número total com base em resultados do ensaio BD MAX StaphSR e amostras em conformidade
Entre as mesmas 2.399 amostras de zaragatoas nasais testadas com o ensaio BD MAX StaphSR, 14 (0,6%) foram inicialmente reportadas como Indeterminadas. Nenhum resultado permaneceu Indeterminado após a repetição (duas amostras não foram testadas de novo). Oito (8) (0,3%) foram reportadas inicialmente como Incompletas. Nenhum resultado permaneceu Incompleto
após a repetição (uma amostra não foi testada de novo).
Variantes de Cassete Vazia
Para que uma amostra seja identificada como positiva para MRSA no ensaio BD MAX StaphSR, é necessário obter um resultado positivo para MREJ e mecA ou mecC (o gene nuc não é obrigatório). Uma amostra que contenha MREJ, mas sem o gene mecA ou
mecC, é negativa para MRSA, visto ser sensível à meticilina. Esta situação ocorre quando o gene mecA ou mecC é removido da
cassete SCCmec, mas o fragmento da extremidade direita (MREJ) permanece, originando um resultado positivo para MREJ. Este tipo de amostra é por vezes referido como “variante de cassete vazia.” A capacidade de deteção dos genes mecA e mecC permite ao ensaio BD MAX StaphSR distinguir e identificar corretamente esta variante como SA POS; MRSA NEG.
Entre as 2.353 amostras elegíveis incluídas na determinação do desempenho clínico (Quadro 3), um total de 10 amostras correspondeu ao perfil de cassete vazia, sendo detetada a sequência MREJ e não detetados os genes mecA ou mecC. Todas as 10 amostras foram confirmadas como negativas verdadeiras para MRSA e positivas verdadeiras para SA no Método de Referência.
Sensibilidade Analítica
A sensibilidade analítica (Limite de Deteção ou LdD) do ensaio BD MAX StaphSR foi determinada da seguinte forma: foram preparadas amostras positivas simuladas por imersão de zaragatoas numa vasta gama de suspensões bacterianas MRSA ou MSSA preparadas e quantificadas por cultura. As estirpes testadas incluíram 11 estirpes de MRSA para representação de 11 genótipos MREJ (i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv e xxi) correspondentes a 5 tipos SCCmec (I, II, III, IV e XI), assim como 2 estirpes de MSSA. Em seguida, as zaragatoas foram eluídas em matriz nasal simulada. Cada estirpe de MRSA e MSSA foi testada em réplicas de 24 por concentração por 2 operadores diferentes, utilizando 3 lotes de produção diferentes do ensaio BD MAX StaphSR. A sensibilidade analítica (LdD), definida como a concentração mais baixa à qual pelo menos 95% de todas as réplicas apresentaram um resultado positivo, situou-se entre 71 e 454 UFC/zaragatoa (Quadro 12) para a deteção de estirpes de MRSA e entre 174 e 211 UFC/zaragatoa (Quadro 13) para a deteção de estirpes de MSSA.
Quadro 12: Limite de deteção de genótipos de MRSA pelo ensaio BD MAX StaphSR
Estirpe de MRSA Genótipo MREJ SCCmec tipoa Concentração LdD [UFC/zaragatoa (IC de 95%b)]
1 Tipo i I 91 (55, 150)
2 Tipo ii II 110 (68, 176)
3 Tipo iii III 181 (102, 322)
4 Tipo iv III 81 (48, 136) 5 Tipo v IV 128 (74, 224) 6 Tipo vi NDc 454 (246, 839) 7 Tipo vii II 269 (134, 538) 8 Tipo ix NDc 199 (111, 356) 9 Tipo xiii NDc 71 (41, 121) 10 Tipo xiv NDc 96 (57, 163) 11 Tipo xxid XI 108 (64, 183)
Quadro 13: Limite de deteção de MSSA pelo ensaio BD MAX StaphSR
Estirpe de MSSA Concentração LdD [UFC/zaragatoa (IC de 95%a)]
1 174 (88, 346)
2 211 (104, 429)
a IC: Intervalos de confiança
Inclusividade Analítica
Foi realizado um estudo de inclusividade analítica que utilizou várias estirpes de MRSA e MSSA, tendo em conta a origem geográfica, genótipo MREJ (tipo selvagem e mutante), tipo SCCmec, tipo eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), diversidade temporal e padrão de sensibilidade. Foram testadas setenta e sete (77) estirpes de MRSA de 27 países e 51 estirpes de MSSA de 16 países neste estudo, incluindo estirpes de coleções públicas e de isolados clínicos bem caracterizados, incluindo estirpes de Staphylococcus
aureus resistente à vancomicina (VRSA) e Staphylococcus aureus intermédio para a vancomicina (VISA).
O ensaio BD MAX StaphSR detetou os tipos MREJ i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv e xxi quando realizado com uma carga bacteriana baixa (2–3 x LdD). O ensaio BD MAX StaphSR detetou os tipos SCCmec de MRSA, I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII e XI, assim como os tipos PFGE de MRSA USA 100 a 800, 1.000 e 1.100, a um nível 2–3x LdD. Todas as estirpes de MRSA que apresentam resistência adicional à vancomicina (VRSA e VISA) também foram detetadas. O ensaio BD MAX StaphSR detetou todas as 51 estirpes de MSSA, incluindo as variantes mecA de cassete vazia.
Avaliação de um Painel de Estirpes de Provocação Bem Caracterizado
Foi realizado um estudo analítico adicional para avaliar o desempenho analítico do ensaio BD MAX StaphSR com recurso a um painel de estirpes de provocação bem caracterizado:
• Dezassete(17) de 17 estirpes de MRSA com concentrações inibitórias mínimas (CIMs) altas e baixas de oxacilina, incluindo os tipos PFGE USA 100 a 800, 1.000, tipo PFGE IV/IBERIAN e variante mecC (estirpe de Staphylococcus aureus com mecA LGA251), testadas a uma concentração de 2–3x LdD, apresentaram resultados SA POS, MRSA POS.
• Quatro (4) de 4 estirpes de BORSA (Staphylococcus aureus com resistência limite à oxacilina), testadas a uma concentração ≥106 UFC/zaragatoa, apresentaram resultados SA POS, MRSA NEG.
• Cinco (5) de 5 estirpes de MSSA, testadas a uma concentração ≥106 UFC/zaragatoa, apresentaram resultados SA POS, MRSA NEG.
• Uma (1) de 1 estirpe de Staphylococcus epidermidis resistente à meticilina (MRSE), testada a uma concentração ≥106 UFC/ zaragatoa, apresentou um resultado negativo (SA NEG, MRSA NEG).
Especificidade Analítica
O ensaio BD MAX StaphSR foi realizado em amostras com altos níveis de organismos não-alvo e estirpes de MSSA, no sistema BD MAX, para demonstrar a especificidade do ensaio na deteção de MRSA e SA.
• Quinze (15) de 15 estirpes de variante de cassete vazia de MSSA, testadas a uma concentração de ≥106 UFC/zaragatoa, produziram resultados SA POS, MRSA NEG.
• Cinquenta e sete (57) de 57 estirpes de várias espécies não estafilocócicas, testadas a uma concentração ≥106 UFC/mL (excepto a Cryptococcus neoformans, testada a 3x105 UFC/zaragatoa), produziram resultados negativos (SA NEG, MRSA NEG).
• Quarenta e cinco (45) estirpes estafilocócicas negativas para a coagulase (CoNS) e estirpes estafilocócicas positivas para a coagulase (CoPS), representantes de um total de 28 espécies, foram testadas a uma concentração de 0,5 McFarland com o ensaio BD MAX StaphSR. Quarenta e cinco (45) das 45 estirpes testadas apresentaram resultados negativos (SA NEG, MRSA NEG).
• Cinquenta (50) de 50 estirpes de MSSA, testadas a concentrações elevadas (≥106 UFC/zaragatoa), produziram resultados SA POS, MRSA NEG.
• Dezassete (17) vírus, representantes de 12 espécies virais diferentes, foram testados a uma concentração ≥ 105 UFP/mL. Todos os 17 vírus produziram resultados negativos (SA NEG, MRSA NEG).
Substâncias Interferentes
Procedeu-se à avaliação de vinte e nove (29) microrganismos e compostos químicos que podem ser utilizados nas narinas ou encontrados em amostras de zaragatoa nasal, relativamente à interferência potencial com o ensaio BD MAX StaphSR (Quadro 14). As amostras negativas para MRSA e as amostras positivas para MRSA a um nível 2–3x LdD foram testadas com a maior quantidade de cada composto ou microrganismo que seria previsivelmente encontrada no local de amostragem ou na amostra de zaragatoa nasal. Os resultados não demonstraram qualquer interferência identificável por parte de microrganismos ou substâncias químicas, com exceção da tobramicina, a qual demonstrou inibir o ensaio BD MAX StaphSR quando testada a uma concentração de 4,5 x 10-3 g/zaragatoa.
Quadro 14: Substâncias endógenas e exógenas testadas com o ensaio BD MAX StaphSR
Substância Resultadoa Substância Resultadoa
Mucina, de glândulas submaxilares bovinas NI Rhinocort aqua* NI Solução oftálmica USP de fosfato de sódio de
dexametasona
equivalente a 0,1% de fosfato de dexametasona NI
Gel* nasal líquido sem gotas
Zicam*para alívio da congestão extrema* NI Clorasséptico* NI Propionato de fluticasona NI Taro-mupirocina, pomada de mupirocina USP, 2% NI Luffeel* NI Spray nasal de longa duração Dristan* NI Staphylococcus epidermidis NI
Neo-sinefrina* NI Micrococcus luteus NI
Spray nasal descongestionante Equate* NI Enterococcus faecium NI
Beconase AQ* NI Enterococcus faecalis NI
Solução nasal USP de flunisolida, 0,025% NI Escherichia coli NI
Nasacort* AQ NI Corynebacterium flavescens NI
Nasonex* NI Moraxella catarrhalis NI
Relenza* NI Staphylococcus hominis subsp hominis NI
Tobramicina I Haemophilus influenzae NI
Sangue NI Streptococcus pneumoniae NI
Flumist* NI
a NI: Nenhuma interferência reportável com o ensaio BD MAX StaphSR.
I: Interferência reportável com o ensaio BD MAX StaphSR.
Efeito Inibidor de Concorrência Microbiana
O efeito inibidor microbiano potencial foi avaliado com:
• concentrações progressivamente maiores de MRSE co-introduzidas com uma baixa concentração (1–2 x LoD) de MRSA ou MSSA, e
• concentrações progressivamente maiores de MSSA co-introduzidas com uma baixa concentração (1–2 x LoD) de MRSA. Os resultados demonstraram concorrência de:
• MRSE a uma razão MRSA:MRSE de 1: ≥1 x 102 • MRSE a uma razão MSSA:MRSE de 1: ≥1 x 105 • MSSA a uma razão MRSA:MSSA de 1: ≥1 x 103
Precisão
Procedeu-se à avaliação da precisão entre laboratórios para o ensaio BD MAX StaphSR num (1) local. O painel de Precisão foi constituído por 4 categorias de amostras próximas do LdD. Cada amostra continha matriz nasal simulada. As estirpes de MRSA e MSSA foram testadas da forma seguinte:
• Positivo moderado (MP) MRSA (MREJ ii): ≥ 2 e ≤ 5 x LdD • Positivo baixo (LP) MRSA (MREJ ii): ≥ 1 e < 2 x LdD • Positivo baixo (LP) MRSA (MREJ vii): ≥ 1 e < 2 x LdD • Positivo baixo (LP) MSSA: ≥ 1 e < 2 x LdD • Negativo alto (HN) MRSA (MREJ ii): < 1 x LdD • Negativo alto (HN) MSSA: < 1 x LdD • Negativo verdadeiro (TN): Amostras negativas (sem alvo)
O teste foi efetuado em duplicado, ao longo de 12 dias, com 2 execuções por dia, por 2 técnicos diferentes. Os resultados do estudo de precisão para as amostras de MRSA TN, MP, LP e HN demonstraram concordâncias de 100%, 97,9%, 95,8% e 33,3%, respetivamente. Os resultados do estudo de precisão para as amostras de MSSA LP e HN demonstraram concordâncias de 100% e 56,2%, respetivamente.
Capacidade de Reprodução
O estudo da capacidade de reprodução foi realizado com recurso às mesmas categorias de amostras definidas acima para o estudo da Precisão.
As amostras em cada categoria foram testadas em triplicado, em 5 dias distintos, com 2 painéis testados em cada dia por 2 técnicos diferentes, em 3 centros clínicos e com 1 único lote de reagentes (entre centros). Um (1) destes centros clínicos participou num estudo alargado em que foram testados 2 lotes adicionais de reagentes (entre lotes). Os resultados são
apresentados para cada categoria de amostras com os dados agrupados das duas estirpes de MRSA e dados das estirpes MSSA. Relativamente à capacidade de reprodução entre centros, a concordância percentual global foi de 97,8% e 100% para as categorias MRSA MP e MRSA TN; 96,7% e 97,8% respetivamente para MRSA LP e MSSA LP; e 37,8% e 30,0% respetivamente para MRSA HN e MSSA HN (Quadro 15).
Quadro 15: Resultados do estudo sobre a capacidade de reprodução entre centros utilizando um lote do ensaio BD MAX StaphSR
Categoria Concordância Centro 1 Centro 2 Centro 3 Concordância Percentual Global
Percentual Contagem Concordância Percentual Contagem Concordância Percentual Contagem
HNa MSSA 16,7% 5/30 23,3% 7/30 50,0% 15/30 30,0% (21,5%, 40,1%)b HN MRSA 40,0% 12/30 26,7% 8/30 46,7% 14/30 37,8% (28,5%, 48,1%) LP MSSA 96,7% 29/30 100,0% 30/30 96,7% 29/30 97,8% (92,3%, 99,4%) LP MRSA 95,0% 57/60 98,3% 59/60 96,7% 58/60 96,7% (92,9%, 98,5%) MP MRSA 100,0% 30/30 100,0% 30/30 93,3% 28/30 97,8% (92,3%, 99,4%) TN 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% (95,9%, 100,0%)
a A concordância percentual está correlacionada com a percentagem de resultados negativos. b Intervalo de Confiança
Relativamente à capacidade de reprodução entre lotes, a concordância percentual global foi de 100% para as categorias MRSA TN; 96,7% para MRSA MP; 96,1% para MRSA LP e 96,7% para MSSA LP; 45,6% e 44,4% respetivamente para MRSA HN e MSSA HN (Quadro 16).
Quadro 16: Resultados do estudo sobre a capacidade de reprodução entre lotes utilizando três lotes do ensaio BD MAX StaphSR
Categoria
Lote 1 Lote 2 Lote 3
Concordância Percentual Global
Concordância
Percentual Contagem Concordância Percentual Contagem Concordância Percentual Contagem
HNa MSSA 50,0% 15/30 36,7% 11/30 46,7% 14/30 44,4% (34,6%, 54,7%)b HN MRSA 46,7% 14/30 50,0% 15/30 40,0% 12/30 45,6% (35,7%, 55,8%) LP MSSA 96,7% 29/30 93,3% 28/30 100,0% 30/30 96,7% (90,7%, 98,9%) LP MRSA 96,7% 58/60 96,7% 58/60 95,0% 57/60 96,1% (92,2%, 98,1%) MP MRSA 93,3% 28/30 100,0% 30/30 96,7% 29/30 96,7% (90,7%, 98,9%) TN 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% (95,9%, 100,0%)
a A concordância percentual está correlacionada com a percentagem de resultados negativos. b Intervalo de Confiança
A abscissa do pico da segunda derivada (SDPA, Second Derivative Peak Abscissa), um valor numérico subjacente utilizado para determinar um resultado final do ensaio, foi selecionada como um meio adicional de avaliação da capacidade de reprodução do ensaio. Os valores de SDPA médios globais com componentes de variância (DP e %CV) são mostrados no Quadro 17.
Quadro 17: Resultados gerais da SDPA numérica subjacente no estudo sobre a capacidade de reprodução entre centros e entre lotes
Entre centros Entre lotes
HN MRSA LP MRSA MP MRSA HN MRSA LP MRSA MP MRSA
MREJa (tipos de MREJ agrupados, canal FAM) N 33 174 88 32 173 87 Média 33,5 31,1 30,7 33,4 31,0 30,8 DP 0,72 1,05 0,71 0,70 0,94 0,38 %CV 2,2% 3,4% 2,3% 2,1% 3,0% 1,2% mecA ou mecCb (tipos de MREJ agrupados, canal ROX) N 33 174 88 32 173 87 Média 35,1 31,8 31,1 35,1 31,6 31,2 DP 1,16 1,42 0,78 1,07 1,36 0,53 %CV 3,3% 4,5% 2,5% 3,1% 4,3% 1,7% HN MREJ
Tipo ii HN MSSA LP MSSA HN MREJ Tipo ii HN MSSA LP MSSA
nucc (canal VIC)
N 23 63 88 17 50 87
Média 34,8 34,8 32,0 35,0 34,8 32,0
DP 1,62 1,69 1,12 1,76 1,57 0,78
%CV 4,6% 4,9% 3,5% 5,0% 4,5% 2,4%
HN MREJ
Tipo ii HN MSSA TN HN MREJ Tipo ii HN MSSA TN
Controlo de Processamento da Amostrad (canal Cy5.5) N 34 27 90 41 40 90 Média 30,0 30,3 30,2 29,9 30,0 30,0 DP 0,78 0,68 0,63 0,49 0,43 0,45 %CV 2,6% 2,2% 2,1% 1,6% 1,4% 1,5%
a Os valores apresentados foram obtidos para o alvo MREJ nas amostras com resultado SA POS, MRSA POS b Os valores apresentados foram obtidos para o alvo mecA ou mecC nas amostras com resultado SA POS, MRSA POS c Os valores apresentados foram obtidos para o alvo nuc nas amostras com resultado SA POS, MRSA NEG
d Calculado para o Controlo de Processamento da Amostra das amostras com resultado SA NEG, MRSA NEG
Carry-Over/Contaminação Cruzada
Foi realizado um estudo para investigar o potencial de carry-over/contaminação cruzada entre amostras de concentração alta de MRSA (≥107 UFC/zaragatoa) e amostras negativas ao longo do fluxo de trabalho do BD MAX StaphSR. Foram testadas doze (12) réplicas da amostra positiva alta e 12 réplicas da amostra negativa em cada execução, com alternância das amostras negativas e positivas. Quatro (4) operadores processaram um total de 18 execuções de 24 amostras. No geral, entre 203 resultados reportáveis das 216 amostras com resultado negativo esperado, foram obtidos 3 resultados falsos positivos (3/203, 1,5%) devido a contaminação por “carry-over”.
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