UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA
CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS
AVALIAÇÃO DO HEMOGRAMA, BIOQUÍMICA SÉRICA E PERFIL ELETROFORÉTICO DE PROTEÍNAS DE TARTARUGAS
MARINHAS Caretta caretta (LINNAEUS, 1758) DE VIDA LIVRE E EM CATIVEIRO.
THAÍS TORRES PIRES
Salvador – Bahia 2007
Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária
Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos
AVALIAÇÃO DO HEMOGRAMA, BIOQUÍMICA SÉRICA E PERFIL ELETROFORÉTICO DE PROTEÍNAS DE TARTARUGAS
MARINHAS Caretta caretta (LINNAEUS, 1758) DE VIDA LIVRE E EM CATIVEIRO.
THAÍS TORRES PIRES
Salvador – Bahia 2007
THAÍS TORRES PIRES
AVALIAÇÃO DO HEMOGRAMA, BIOQUÍMICA SÉRICA E PERFIL ELETROFORÉTICO DE PROTEÍNAS DE TARTARUGAS MARINHAS
Caretta caretta (LINNAEUS, 1758) DE VIDA LIVRE E EM CATIVEIRO.
Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal.
Orientador: Prof. Dr. José Eugênio Guimarães
Salvador – Bahia 2007
AVALIAÇÃO DO HEMOGRAMA, BIOQUÍMICA SÉRICA E PERFIL ELETROFORÉTICO DE PROTEÍNAS DE TARTARUGAS MARINHAS
Caretta caretta (LINNAEUS,1758) DE VIDA LIVRE E EM CATIVEIRO.
THAÍS TORRES PIRES
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.
Salvador, 29 de junho de 2007.
Comissão Examinadora:
______________________________________ Prof. Dr. José Eugênio Guimarães – UFBA
Orientador
______________________________________ Profa. Dra. Eliana Reiko Matushima – USP
______________________________________ Prof. Dr. Luis Fernando Pita Gondim – UFBA
Ao meu marido, John, por seu amor incondicional.
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter iluminado o meu trajeto para alcançar esta vitória. Aos meus pais por toda dedicação e carinho.
Ao meu marido, John, pela colaboração e companheirismo.
Aos meus irmãos, Dalmar e Danilo, pelo apoio para que eu pudesse alcançar meus objetivos.
Ao Professor José Eugênio Guimarães pelo exemplo de profissionalismo, orientação, colaboração e incentivo durante a realização desta pesquisa.
À Professora Maria Ângela Ornelas de Almeida, pela orientação e esclarecimentos a respeito da eletroforese.
Ao Projeto Tamar-Ibama, em especial a Gonzalo Rostan, Cecília Baptistotte, Guy Marcovaldi e Neca Marcovaldi pela receptividade e apoio para realização deste trabalho.
À base de Arembepe, em especial a Thiago, Mari, Eduardo e Michele, pelas
madrugadas na praia e apoio, sem o qual seria impossível a realização deste estudo. À Professora Thereza Cristina Calmon Bittencourt, pela ajuda com a análise estatística. A todos aqueles que de alguma forma colaboraram com este trabalho, em especial aos amigos Bruno Bastos, Elitiere Neto, Sue Yohii, Uiara Burghgrave, Gustavo
Rodamilans, Jaciara Moreira e Marcelo Renan. Às companheiras de laboratório Romana, Íris e Rose.
Aos maravilhosos amigos Beta, Nando, Manu, Bebel, Sam, Wi, Erica, Pedro, Bel, Driks, Marquinhos, Leo, Mari e Fred pelo incentivo constante.
À CAPES pela concessão de bolsas e FAPESB pelo apoio financeiro ao projeto de mestrado.
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS ... vii
LISTA DE FIGURAS ... x LISTA DE ABREVIATURAS ... xi RESUMO ... xii SUMMARY ... xiii 1 INTRODUÇÃO GERAL ... 1 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 7
2.1 Exames complementares em tartarugas marinhas...7
2.1.1 Importância dos exames complementares em tartarugas marinhas ... 7
2.1.2 Colheita sangüínea ... 7
2.1.3 Anticoagulantes... 9
2.1.4 Eritrograma ... 9
2.1.4.1 Volume Globular ... 9
2.1.4.2 Morfologia e Contagem de Hemácias ... 10
2.1.4.3 Concentração de Hemoglobina ... 11
2.1.4.4 Índices Hematimétricos ... 11
2.1.5 Leucograma ... 11
2.1.5.1 Contagem de Leucócitos ... 12
2.1.5.2 Contagem Diferencial de Leucócitos ... 12
2.1.6 Contagem de Trombócitos... 15
2.1.7 Parâmetros Bioquímicos ... 16
2.1.7.1 Proteína Total, Albumina e Globulina ... 16
2.1.7.2 Relação Albumina: Globulina (A:G) ... 18
2.1.7.3 Glicose... 18 2.1.7.4 Ácido úrico ... 19 2.1.7.5 Creatinina ... 20 2.1.7.6 Colesterol... 20 2.1.7.7 Triglicerídeos... 21 2.1.7.8 Fosfatase Alcalina ... 21 2.1.7.9 Aspatato Aminotransferase ... 22
3 ARTIGOS CIENTÍFICOS... 25
3.1 Artigo I:Hemograma e bioquímica sérica de tartarugas cabeçudas (Caretta caretta) de vida livre e mantidas em cativeiro, no Litoral Norte da Bahia ... 25
3.1.1 Introdução ...26 3.1.2 Materiais de Métodos ...27 3.1.3 Resultados...29 3.1.4 Discussão ...31 3.1.5 Conclusão ...36 3.1.6 Referências Bibliográficas...37
3.2 Artigo II: Eletroforese de proteínas séricas de tartarugas cabeçudas (Caretta caretta) de vida livre e mantidas em cativeiro no Litoral Norte da Bahia ...40
3.2.1 Introdução ...41 3.2.2 Materiais de Métodos ...42 3.2.3 Resultados...43 3.2.4 Discussão ...45 3.2.5 Conclusão ...47 3.2.6 Referências Bibliográficas ...48 4 CONSIDERAÇÕES GERAIS ... 50 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 51 ANEXOS... 57
LISTA DE TABELAS
ARTIGO CIENTÍFICO I
Tabela 01 - Médias, desvios-padrão, valores máximo e mínimo das variáveis do eritrograma e contagem de trombócitos de tartarugas marinhas (Caretta caretta) de vida livre (n = 22) e de cativeiro (n = 5). Bahia - 2006 ... 29 Tabela 02 - Médias, desvios-padrão, valores máximo e mínimo das variáveis do
leucograma de tartarugas marinhas (Caretta caretta) de vida livre (n = 22) e de cativeiro (n = 5). Bahia - 2006 ... 30 Tabela 03 - Médias, desvios-padrão, valores máximo e mínimo dos parâmetros da
bioquímica sérica de tartarugas marinhas (Caretta caretta) de vida livre (n = 22) e em cativeiro (n = 5). Bahia - 2006 ... 30
ARTIGO CIENTÍFICO II
Tabela 01 - Médias, desvios-padrão, valores máximo e mínimo de proteína total, das frações albumina, alfa-1 e alfa-2 globulina, beta globulina e gama globulina, obtidas pela separação eletroforética, e relação A:G de amostras séricas de tartarugas marinhas (Caretta caretta) de vida livre (n=20), de cativeiro (n=5) e de vida livre e cativeiro juntas (n=25). Bahia - 2006... 45
ANEXOS
Tabela 01 - Valores individuais do comprimento curvilíneo de carapaça (CCC), variáveis do eritrograma e contagem de trombócitos de tartarugas marinhas (Caretta caretta) de vida livre (n = 22). Bahia - 2006 ... 59 Tabela 02 - Valores individuais do comprimento curvilíneo de carapaça (CCC),
variáveis do eritrograma e contagem de trombócitos de tartarugas marinhas (Caretta caretta) em cativeiro (n = 5). Bahia - 2006 ... 60 Tabela 03 - Valores individuais das variáveis do leucograma de tartarugas
marinhas (Caretta caretta) de vida livre (n = 22). Bahia - 2006 ... 61 Tabela 04 - Valores individuais das variáveis do leucograma de tartarugas
Tabela 05 - Valores individuais de parâmetros da bioquímica sérica de tartarugas marinhas (Caretta caretta) de vida livre (n = 22). Bahia - 2006 ... 63 Tabela 06 - Valores individuais de parâmetros da bioquímica sérica de tartarugas
marinhas (Caretta caretta) em cativeiro (n = 5). Bahia - 2006 ... 64 Tabela 07 - Valores individuais de proteína total, das frações albumina, alfa-1 e
alfa-2 globulina, beta globulina e gama globulina, obtidas pela separação eletroforética, e relação A:G de amostras séricas de tartarugas marinhas (Caretta caretta) de vida livre (n=18). Bahia - 2006 ... 65 Tabela 08 - Valores individuais de proteína total, das frações albumina, alfa
globulina, beta globulina e gama globulina, obtidas pela separação eletroforética, e relação A:G de amostras séricas de tartarugas marinhas (Caretta caretta), de vida livre (n=2). Bahia - 2006 ... 66 Tabela 09 - Valores individuais de proteína total, das frações albumina, alfa-1 e
alfa-2 globulina, beta globulina e gama globulina, obtidas pela separação eletroforética, e relação A:G de amostras séricas de tartarugas marinhas (Caretta caretta) em cativeiro (n = 5). Bahia - 2006 ... 66
LISTA DE FIGURAS
ARTIGO CIENTÍFICO II
Figura 01 - Representação do eletroforetograma das proteínas séricas de tartarugas cabeçudas (Caretta caretta). A – Albumina, B – Alfa-1 globulina, C – Alfa- 2 globulina, D – Beta globulina, e E – Gama globulina. ... 44
ANEXOS
Figura 01 - Exemplar de tartaruga cabeçuda (Caretta caretta) ... 57
LISTA DE ABREVIATURAS
AST – Aspartato Aminotransferase
CCC – Comprimento Curvilíneo de Carapaça
CHGM – Concentração de Hemoglobina Globular Média EDTA – Ácido etileno diamino tetracético
EMV – Escola de Medicina Veterinária
IBAMA – Instituto Brasileiro de Meio Ambiente IUCN – World Conservation Union
Relação A:G – Relação Albumina:Globulina SPSS – Statistical Package for the Social Sciences UFBA – Universidade Federal da Bahia
VG – Volume Globular
PIRES, T.T. Avaliação do hemograma, bioquímica sérica e perfil eletroforético de proteínas de tartarugas marinhas Caretta caretta (Linnaeus,1758) de vida livre e em cativeiro. Salvador, Bahia, 2007. 66p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2007.
Resumo
A obtenção de valores hematológicos é de grande importância na clínica médica para o diagnóstico e tratamento das enfermidades que acometem tartarugas marinhas, por se tratar de espécies vulneráveis à extinção. Com o objetivo de obter dados que auxiliem na rotina clínica destes animais, avaliou-se o hemograma, alguns parâmetros bioquímicos e eletroforese de proteínas de tartarugas cabeçudas (Caretta caretta), fêmeas, adultas e clinicamente sadias. Os indivíduos foram divididos em dois grupos: G1 de vida livre (n=22), que desovam no litoral norte da Bahia, e G2 de cativeiro (n=5) mantidos no Centro de Visitantes do Projeto Tamar-Ibama, na Praia do Forte, município de Mata de São João, Bahia. Os achados hematológicos incluíram a contagem de eritrócitos, dosagem da concentração de hemoglobina, determinação do volume globular, contagens total e diferencial de leucócitos, índices hematimétricos (VGM e CHGM) e avaliação microscópica de esfregaços sangüíneos. Para a avaliação da bioquímica sérica determinou-se a proteína total, albumina, glicose, colesterol, triglicerídeos, ácido úrico, creatinina, aspartado aminotransferase e fosfatase alcalina, por meio de kits comerciais, e corrida eletroforética de proteínas séricas em gel de agarose, com estabelecimento da relação A:G. Os valores obtidos para os dois grupos foram comparados, sendo que a análise estatística revelou diferenças significativas ao nível de 5% para as contagens relativas de eosinófilos e monócitos, contagem absoluta de eosinófilo, proteína total, globulina, glicose, colesterol, e aspartato aminotransferase e fração gama globulina na eletroforese. Conclui-se no geral que não houve diferença entre os grupos estudados, apesar de alguns parâmetros mostrarem alterações, possivelmente pelo número reduzido de animais, condições ambientais, nutricionais e/ou reprodutivos, a que estes animais estavam submetidos.
PIRES, T.T. Evaluation of hemogram, serum biochemistry and protein electrophoretic profile for captive and free-ranging sea turtles Caretta caretta (Linnaeus,1758). Salvador, Bahia, 2007. 66p. Dissertation (Master of Science in Tropical Veterinary Medicine) – School of Veterinary Medicine, Federal University of Bahia, 2007.
SUMMARY
The study of hematological values has been very important in the clinical work for the diagnostic and treatment of diseases that affect sea turtles, especially because these species are endangered of extinction. The objective of this study was to obtain information to be used in the clinical evaluation of sea turtles. It was analyzed the hemogram, biochemical and protein electrophoresis parameters for loggerhead sea turtles (Caretta caretta), female, adult and clinically healthy. The animals were separated in two groups: G1 the free-ranging (n=22), which nest in the north coast of Bahia, and G2 from captivity (n=5) which are kept in the visitor center of the Projeto Tamar-Ibama, in Praia do Forte, municipality of Mata de São João, Bahia, Brazil. The hematological findings included the red blood cell count, hemoglobin concentration, packed cell volume, white blood cell count and differential count, red blood cell indices (VGM and CHGM) and blood smear microscopic analysis. The biochemical evaluation was based on the total protein, albumin, glucose, cholesterol, triglycerides, uric acid, creatinine, aspatate aminotransferase and alkaline phosphatase, using commercial kits, and serum protein electrophoresis in agarosis gel, with the determination of the A:G ratio. Statistical comparisons between the two groups exhibit significant differences at 5% level for the relative eosinophil and monocyte count, absolute eosinophil count, total protein, globulin, glucose, cholesterol, aspatate aminotransferase and gamma globulin fraction from the electrophoresis analysis. Although it had been observed variation in a few parameters, probably related to the reduced number of animals or in the environmental, nutritional and reproductive conditions, there was no difference between the two groups.
FICHA CATALOGRÁFICA
PIRES, Thaís Torres
Avaliação do hemograma, bioquímica sérica e perfil eletroforético de proteínas de tartarugas marinhas Caretta caretta (Linnaeus,1758) de vida livre e em cativeiro. Thaís Torres Pires – Salvador, 2007. 66p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, 2007.
Professor Orientador: José Eugênio Guimarães
Palavras-chaves: hemograma, bioquímica sérica, eletroforese, tartaruga cabeçuda.
1 INTRODUÇÃO GERAL
As tartarugas marinhas existem há mais de 150 milhões de anos e conseguiram sobreviver a todas as mudanças do planeta. Sua origem foi na terra e durante a evolução desenvolveram características de adaptação ao ambiente marinho, como a diminuição do número de vértebras e a fusão das que restaram às costelas, formando uma carapaça resistente, embora leve. Perderam os dentes, ganharam um tipo de bico córneo e suas patas se transformaram em nadadeiras.
Existem sete espécies de tartarugas marinhas, agrupadas em duas famílias distintas: Dermochelyidae, com uma única espécie, Dermochelys coriacea (tartaruga de couro), e Cheloniidae, com cinco gêneros e seis espécies: Chelonia mydas (tartaruga verde), Caretta caretta (tartaruga cabeçuda), Eretmochelys imbricata (tartaruga de pente), Lepidochelys olivacea (tartaruga oliva), Lepidochelys kempii (kemps ridley) e Natator depressa (Australian flatback) (DAVENPORT, 1997; SOSLAU et al., 2005).
No Brasil ocorrem cinco espécies de tartaruga: Caretta caretta, Eretmochelys imbricata, Lepidochelys olivacea, Chelonia mydas e Dermochelys coriacea, que desde 1986 são protegidas pela legislação brasileira (MARCOVALDI & MARCOVALDI, 1999; BAPTISTOTTE et al., 2003). Essas espécies são classificadas pelo IUCN (World Conservation Union) como ameaçadas ou criticamente ameaçadas de extinção. Durante muito tempo o consumo da carne e ovos de tartarugas marinhas, e a utilização de sua carapaça na produção de adornos, contribuíram para o declínio de suas populações, além de fatores como a degradação de seu habitat e a interação com a atividade pesqueira (TROËNG & DREWS, 2004).
Devido à pressão internacional para criação de um programa de conservação para as tartarugas marinhas no Brasil, já que são animais que realizam grandes migrações, visitando águas de diferentes países, em 1980 o governo brasileiro estabeleceu o Programa Nacional de Conservação das Tartarugas Marinhas (Projeto Tamar), vinculado ao Instituto Brasileiro de Meio Ambiente (IBAMA). Atualmente, o Projeto Tamar possui 22 bases de conservação e pesquisa, em praias do continente e
ilhas oceânicas, monitorando cerca de 1100 km de praias (MARCOVALDI & MARCOVALDI, 1999; BAPTISTOTTE et al., 2003).
O litoral norte da Bahia caracteriza-se por ser uma das principais áreas remanescentes de desova de Caretta caretta e Eretmochelys imbricata (D’AMATO & MARCOVALDI, 1997), possuindo grande importância biológica para as tartarugas marinhas, pois grande parte das desovas registradas na costa brasileira ocorre em praias baianas. O projeto Tamar possui quatro bases e uma sub-base nesta área, protegendo cerca de 200km de praia (MARCOVALDI et al., 1999), destacando-se as bases de Praia do Forte e de Arembepe.
A base de pesquisa e conservação da Praia do Forte, município de Mata de São João na Bahia, foi uma das três primeiras fundadas em 1982 (Comboios, no Espírito Santo; e Pirambu, em Sergipe, foram as outras bases) e é a praia continental com maior densidade de desova de tartaruga marinha do Brasil (MARCOVALDI & LAURENT, 1996). A área monitorada por esta base é visitada principalmente pela tartaruga cabeçuda (Caretta caretta), ocorrendo também desovas de tartaruga de pente (Eretmochelys imbricata), oliva (Lepidochelys olivacea) e verde (Chelonia mydas) em ordem decrescente de ocorrência (SANTOS et al., 2000). A Praia do Forte conta com um centro de visitação, onde a comunidade local e turistas podem conhecer o trabalho de conservação destas espécies (MARCOVALDI & LAURENT, 1996). Nestes centros de visitação são mantidas tartarugas marinhas em diferentes estágios de maturidade, em condições saudáveis, com a finalidade de educação ambiental (MARCOVALDI & MARCOVALDI, 1999).
A base de Arembepe atualmente monitora uma área de 47 km de praia, inserida em três municípios: Salvador, Lauro de Freitas e Camaçari, e possui grande importância por abranger áreas com grande aglomerado urbano e fluxo turístico intenso. Localizada à 30Km da Base de Praia do Forte, conta com um Centro de Visitantes, tendo a tartaruga cabeçuda como a espécie que mais desova nesta área.
A tartaruga cabeçuda pertence à família Cheloniidae e é diferenciada das outras espécies de tartarugas marinhas por possuir a cabeça proporcionalmente larga, com dois pares de escudos prefrontais, e o bico muito forte. Sua carapaça possui cinco pares de
escudos laterais (MARQUEZ, 1990). Esta espécie apresenta maior índice de desova nas praias do continente, no Brasil (MARCOVALDI & MARCOVALDI, 1999; BAPTISTOTTE et al., 2003), contribuindo com 72 a 89% dos ninhos durante cada estação reprodutiva na Praia do Forte, sendo que o pico de desova da tartaruga cabeçuda ocorre entre outubro e dezembro (MARCOVALDI & LAURENT, 1996).
Cada espécie de tartaruga marinha possui um regime alimentar, sendo esses animais bastante eficientes no aproveitamento de sua dieta especializada, a qual se encontra diretamente relacionada à flora bacteriana de seu sistema digestório. A forma do bico indica quais os itens da dieta de cada espécie, e na Caretta caretta ele é extremamente forte servindo para triturar conchas, carapaças de moluscos e crustáceos; sua alimentação ainda inclui peixes, camarões, caramujos e algas (FRAIZER, 2001).
Como resultado do trabalho que está sendo desenvolvido no Projeto Tamar, a matança de fêmeas e a coleta de ovos de tartarugas marinhas foram drasticamente reduzidas (MARCOVALDI & MARCOVALDI,1999), mas a captura incidental, por diversas artes de pesca, juntamente com o crescimento urbano desordenado, constituem ameaças atuais às populações destas espécies.
Recentemente as tartarugas marinhas têm adquirido uma importância para fins de não consumo, como objeto para o turismo, atividades educacionais e pesquisas científicas, gerando oportunidades de empregos, assim como outros ganhos econômicos. Outra consideração menos aparente, mas de valor insubstituível, é como recurso ecológico. Estes répteis são componentes singulares de sistemas ecológicos complexos, cuja vitalidade se inter-relaciona com outros recursos exploráveis, como peixes, moluscos e áreas de mangue. Devido às migrações que realizam de milhares de quilômetros e da maturidade sexual tardia, as tartarugas servem como importantes indicadores da saúde dos ambientes costeiros e marinhos, tanto em escala local como mundial (FRAZIER, 1999).
É fundamental compreender que a condição ambiental está intimamente relacionada com a qualidade de vida das comunidades humanas, e em muitos casos, a conservação com base na comunidade se considera parte do processo de desenvolvimento desta mesma comunidade, sendo indispensável à conservação de
recursos uma visão realista e de longo prazo (FRAZIER, 1999). O uso de não consumo, como o turismo de observação de tartarugas marinhas, vem ganhando popularidade mundial. Estudos sugerem que este tipo de exploração pode render muito mais, tendo ao mesmo tempo menos impacto nas populações destes indivíduos que o uso de consumo, caracterizado pela utilização da carne, ovos e carapaças (TROËNG & DREWS, 2004).
Animais mantidos em cativeiro proporcionam uma oportunidade única para o estudo de alguns aspectos da biologia das tartarugas marinhas, permitindo uma manipulação e experimentação que não é possível no habitat natural desses indivíduos. Entretanto, estão sujeitas a uma ampla variedade de patógenos e parasitas, que em condições naturais e com densidades populacionais silvestres, podem ter conseqüências imperceptíveis, mas em cativeiro, onde estes animais encontram-se confinados, as enfermidades podem causar grandes danos (ROSS, 2000). Assim como em aves e mamíferos, a avaliação do estado de saúde e diagnóstico de doenças em tartarugas marinhas requer amostras sangüíneas para investigação laboratorial (JACOBSON, 1998).
A avaliação hematológica é de grande valor na investigação de doenças em répteis, assim como possivelmente pode mostrar alterações fisiológicas entre animais de vida livre e em adaptação ao cativeiro (DIVERS et al., 1996). Contudo, são poucas as informações de valores sanguíneos para as tartarugas marinhas. A maior parte dos estudos apresenta um número reduzido de parâmetros bioquímicos baseados em uma pequena quantidade de amostras de animais em cativeiro ou de histórico desconhecido. Tartarugas mantidas em cativeiro podem apresentar diferenças significativas em seus valores hematológicos, resultantes principalmente da dieta artificial ou de condições de estresse, não sendo desta forma, recomendada a utilização destes valores para tartarugas de vida livre (BOLTEN & BJORNDAL, 1992).
O estabelecimento do perfil bioquímico sangüíneo para populações selvagens, saudáveis, de espécies de tartarugas marinhas ameaçadas de extinção é de grande importância. A avaliação do estado fisiológico destas populações se faz necessário para o desenvolvimento apropriado de planos de manejo e conservação. Para auxiliar na avaliação de causas de doenças e estimar populações que estão potencialmente em risco, são necessários estudos de grupos naturais de tartarugas marinhas que não sofram
impactos negativos por poluição ou degradação de habitat (BOLTEN & BJORNDAL, 1992).
Para qualquer animal o conhecimento do padrão sangüíneo normal é importante, já que as mudanças na química sangüínea podem estar relacionadas com o estado fisiológico, podendo ainda ser usado na identificação de condições patológicas. Com exceção da tartaruga marinha, existem muitos estudos e revisões sobre as mudanças sazonais na química sangüínea de répteis (LUTZ & DUNBAR-COOPER, 1987). Além da influência da sazonalidade, dados avaliados indicam que fatores como idade, tamanho, sexo, estação do ano, saúde, habitat e dieta podem afetar os parâmetros hematológicos (WOOD & EBANKS, 1984). Embora alguns trabalhos sejam publicados sobre valores hematológicos de tartarugas, é difícil o uso dessas informações em estudos comparativos, por causa dos métodos de coleta das amostras, manipulação, processamento e análise bioquímica, que variam muito entre esses trabalhos (BOLTEN et al., 1992). Outra dificuldade bastante comum diz respeito à identificação e descrições das características morfológicas de células sangüíneas de quelônios marinhos (WORK et al., 1998).
A eletroforese de proteínas plasmáticas pode ser utilizada como uma importante ferramenta de avaliação da saúde de tartarugas marinhas. Entretanto, é necessário o estabelecimento de intervalos de referência dos valores normais (GICKING et al., 2004). Mudanças nas frações protéicas são evidentes em diversas doenças e podem auxiliar no diagnóstico quando outros testes não são conclusivos. Esta técnica proporciona informações importantes sobre vários componentes de proteínas do soro ou plasma, os quais auxiliam na redução do número de possibilidade de diagnóstico diferencial na maioria dos casos. Aliado a isso, a eletroforese de proteínas requer pequena quantidade de sangue do espécime, e é um teste diagnóstico que ainda precisa ser explorado na clínica de répteis e anfíbios (ZAIS & CRAY, 2002).
Este trabalho propõe a realização do hemograma, bioquímica sérica e a determinação do perfil eletroforético das proteínas séricas em tartarugas marinhas cabeçudas de vida livre e em cativeiro, observando as possíveis diferenças entre esses grupos, permitindo assim que os valores obtidos possam ser utilizados como método auxiliar para o diagnóstico clínico de enfermidades que acometem esses animais,
avaliação da terapia e monitoramento do processo que o acomete. Ressalta-se aqui a importância desses parâmetros no tratamento de animais de vida livre, por se tratar de uma das espécies de tartarugas marinhas vulnerável à extinção, a reintrodução na natureza desses indivíduos comprovadamente saudáveis, através dessas avaliações, é de grande necessidade para os projetos de conservação. Portanto, torna-se imprescindível a realização de trabalhos que visem a determinação do padrão hematológico dessa espécie no Brasil, especificamente na Bahia, considerando todos os fatores que os influenciam.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Exames complementares em tartarugas marinhas
2.1.1 Importância dos exames
Algumas características anatômicas e fisiológicas das tartarugas marinhas dificultam o exame físico. A carapaça e plastrão ósseos limitam a auscultação, palpação e a realização de exames como ultra-sonografia e radiografias. Por serem animais pecilotérmicos necessitam de temperaturas ambiente confortáveis para manutenção das funções fisiológicas normais (PAGE & MAUTINO, 1990; WHITAKER & KRUM, 1999). Os exames hematológicos e bioquímicos podem ser realizados através de simples colheitas de amostras e permitem a avaliação de informações importantes sobre o estado de saúde das tartarugas marinhas (HERBST & JACOBSON, 2003).
2.1.2 Colheita sangüínea
O volume sangüíneo total varia entre as espécies, geralmente corresponde a cerca de 5 a 8% do peso corporal. Assim, uma tartaruga com 100g tem um volume sangüíneo estimado em 5 a 8ml e, estando clinicamente saudável pode-se coletar 10% deste volume sem conseqüências prejudiciais a sua saúde (JACOBSON, 1998).
Os locais de escolha incluem o coração, veia jugular, veia braquial, veia ventral coccígena, seio orbital, borda da unha e seio cervical dorsal (OWENS & RUIZ, 1980; ROSSKOPF, 1982; JACOBSON, 1998) e, com base na literatura, a punção cardíaca e venipunção do seio cervical dorsal são os métodos mais utilizados (WOOD & EBANKS, 1984; LUTZ & DUNBARCOOPER, 1987; WORK et al., 1998).
O método de coleta do seio cervical dorsal é considerado superior aos outros procedimentos para colheita de sangue em tartarugas marinhas, já que reduz o estresse e o risco de danos permanentes, requer o mínimo de equipamento, é de fácil realização e
permite a obtenção de amostras sem contaminações. O seu sucesso depende de uma adequada contenção, que consiste em manter o animal em posição inclinada, com a região anterior mais baixa e o pescoço estirado (OWENS & RUIZ, 1980).
Diferenças significativas podem ser encontradas quando se compara os valores hematológicos e bioquímicos obtidos de amostras sangüíneas de jabutis do deserto (Gopherus agassizii) através da punção do plexo venoso postocciptal e veia jugular. Essa diferença é justificada pela contaminação por fluido extracelular e pela linfa, levando a valores inferiores de hematócrito, contagens de eritrócitos e leucócitos, e concentração de hemoglobina. Os répteis, incluindo os quelônios, possuem um sistema linfático amplamente desenvolvido, com vasos adjacentes ao sistema venoso. A contaminação também afeta os valores da bioquímica sangüínea, isto é, a atividade enzimática e a concentração de proteínas totais, albumina e globulina. Assim, a hemodiluição com linfa promove valores mais baixos dessas proteínas, fosfatase alcalina, aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase (GOTTDENKER & JACOBSON, 1995).
MARKS & CITINO (1990) ao trabalharem com tartarugas da espécie Testudo radiata também observaram diferenças nos valores hematológicos relacionados ao local da coleta sangüínea, onde amostras obtidas da veia coccígena apresentaram hemodiluição. Entretanto, WOOD & EBANKS (1984) não encontraram diferença significativa associada ao método de coleta das amostras em trabalho com tartarugas verdes (Chelonia mydas), onde o sangue foi coletado através de punção cardíaca, do seio cervical dorsal e do fluxo sangüíneo livre após o corte do pescoço dos animais sacrificados, sendo que o tamanho do animal determinou o método de coleta de sangue. SAMOUR e colaboradores (1998) relataram que em algumas colheitas sangüíneas em tartarugas verdes realizadas através da venipunção da jugular, observou-se um fluido transparente na seringa, porém quando a colheita foi realizada no seio cervical dorsal esta contaminação não ocorreu.
2.1.3 Anticoagulantes
A conservação adequada das amostras sangüíneas é de grande importância para se obter resultados confiáveis. Em avaliações hematológicas de quelônios a heparina é o anticoagulante de escolha, já que o EDTA quela o cálcio e outros íons metálicos, causando hemólise extensa em sangue de répteis (PAGE & MAUTINO, 1990; BOLTEN et al., 1992; KNOTKOVÁ et al., 2002). A heparina impede a coagulação sangüínea por interferir na conversão da protombina em trombina, sendo eficaz por um período de 10 a 12 horas (COLES, 1984).
2.1.4 Eritrograma
2.1.4.1 Volume Globular
A dieta, estado de saúde, exercício, hormônio circulante, temperatura e estresse podem afetar o volume globular (VG) de tartarugas mantidas em cativeiro, além de algumas doenças como infecções do plastrão, hemorragias prolongadas, deficiências nutricionais ou inanição, podem ser relacionadas à sua diminuição, atingindo nestes casos, valores abaixo de 20% (FRAIR, 1977a).
FRAIR (1977b) mostrou haver uma correlação significativa entre o tamanho corporal e o valor do hematócrito em tartarugas marinhas. Contudo, BOLTEN & BJORNDAL (1992) relatam que o VG de tartarugas verdes não apresentou relação significativa entre sexo ou tamanho, sendo obtido valor médio de 35,2% (± 3,2). Tal fato também foi constatado por WOOD & EBANKS (1984) que trabalharam com a mesma espécie, verificando que não houve diferença significativa entre sexos para valores desta variável, e que os mesmos parecem aumentar com a idade. A média encontrada por estes autores foi de 45% (± 7) para 13 animais adultos.
LUTZ & DUNBARCOOPER (1987) em estudo com tartarugas marinhas cabeçudas, encontraram valores constantes de hematócrito, os quais não sofreram influência da estação do ano. A variação para este parâmetro foi de 28 a 48%, tendo como média 35,4%. Entretanto, SOUTHWOOD e colaboradores (2003) observaram
valores mais elevados no VG de Chelonia mydas durante condições de baixas temperaturas, obtendo valores de 33,6% (± 0,5) a 26ºC, e 40,0% (± 1,3) a 16ºC, justificando que nestes períodos há uma diminuição do metabolismo, assim um VG mais alto poderia ser uma maneira de manter a capacidade de transporte de oxigênio para os tecidos durante os períodos de bradicardia.
Alguns autores obtiveram valores do hematócrito de tartarugas cabeçudas mantidas em cativeiro: BALDASSIN (2003) encontrou valor de 22% (± 2,9), PIRES e colaboradores (2006) 33,12% (± 2,35) e CUBAS & BAPTISTOTTE (2006) de 29,5% (± 7,3). Para 48 juvenis de vida livre desta espécie, o valor encontrado por KELLER e colaboradores (2004) foi de 31,5% (± 4,3).
2.1.4.2 Morfologia e Contagem de Hemácias
A morfologia dos eritrócitos de tartaruga marinha é similar às de outros quelônios. São células ovais, com citoplasma homogêneo circundando completamente o núcleo, que se apresenta em posição central e é fortemente basofílico (WOOD & EBANKS, 1984; ALLEMAN et al.,1992; CASAL & ORÓS, 2007).
O número de hemácias foi alvo de estudo por parte de WOOD & EBANKS, (1984) que trabalharam com a espécie Chelonia mydas, obtendo um valor médio para esta variável de 341.000/µL de sangue. Já, WHITAKER & KRUM (1999) trabalhando com a espécie Caretta caretta, com menos de 2 Kg, e mantidas em cativeiro, obtiveram valores médios de 390.000/µL, enquanto que a média, encontrada por PIRES e colaboradores (2006), para oito indivíduos desta espécie, foi de 275.000/µL. Valores semelhantes a estes foram apresentados por BALDASSIN (2003) e CUBAS & BAPTISTOTTE (2006) que obtiveram valores de 254.000 (n=7) e 288.000 (n=13) de hemácias por microlitro de sangue, respectivamente, trabalhando com tartarugas da mesma espécie em cativeiro.
Com relação à análise morfológica do esfregaço sangüíneo de tartarugas, alterações como anisocitose, poiquilocitose e hipocromia podem ser observadas em anemias regenerativas e por deficiência de ferro ou perda crônica de sangue
(CAMPBELL,1996), enquanto que a policromasia foi observada em tartarugas cabeçudas expostas a petróleo bruto (LUTCAVAGE et al., 1995).
2.1.4.3 Concentração de Hemoglobina
A concentração de hemoglobina aparentemente aumenta com a idade e/ou tamanho do animal, mas não apresenta diferença significativa entre sexos (WOOD & EBANKS,1984), porém segundo ALKYNDI & MAHMOUD (2002) permanece estável durante a temporada reprodutiva, apesar do exaustivo esforço físico realizado pelas tartarugas durante as diferentes fases reprodutivas.
AGUIRRE e colaboradores (1995), ao trabalharem com cinco tartarugas verdes, encontraram valor médio de 8,54g/dL (± 1,44) para a concentração de hemoglobina. Em tartarugas cabeçudas ALKINDI & MAHMOUD (2002), BALDASSIN (2003), PIRES e colaboradores (2006) e CUBAS & BAPTISTOTTE (2006), obtiveram valores médios de 8,87 g/dl (± 1,41), 6,10 g/dl (± 2,40), 8,65 g/dl (± 0,80) e 8,60 g/dl (± 2,00) para esta variável, respectivamente.
2.1.4.4 Índices Hematimétricos
AGUIRRE e colaboradores (1995) obtiveram valores médios para volume globular médio (VGM), hemoglobina globular média (HGM) e concentração de hemoglobina globular média (CHGM) de 725,00fL (± 312,35), 198,18pg (± 83,52) e 27,50% (± 1,25) respectivamente, em estudo com Chelonia mydas. Em trabalhos com tartarugas Caretta caretta, PIRES e colaboradores (2006) apresentaram valores de VGM de 1.214,36fL (± 131,99), HGM de 317,12pg (± 38,66) e CHGM de 26,10% (± 1,21), enquanto que para CUBAS & BAPTISTOTTE (2006) esses valores foram 1.106,20fL (± 413,10), 315,90pg (± 93,40) e 29,5% (± 4,90), respectivamente.
2.1.5 Leucograma
2.1.5.1. Contagem de Leucócitos
Assim como os mamíferos, os glóbulos brancos dos répteis são classificados em granulócitos e agranulócitos, entretanto descrições morfológicas das características destas células em quelônios marinhos são limitadas. Mesmo quando métodos consistentes são utilizados, a contagem total de leucócitos em répteis pode ser altamente variável, mas são bastante úteis em estudos comparativos ou quando se monitora a evolução do quadro clínico (WORK et al., 1998).
O número total de leucócitos foi objeto de estudo para tartarugas juvenis da espécie Chelonia mydas por AGUIRRE e colaboradores (1995), que obtiveram o valor de 9.340/µL, enquanto que WORK e colaboradores (1998) e WORK & BALAZS (1999) encontraram médias de 13.000/µL (n=120) e 11.890/µL (n=28), respectivamente, e KELLER e colaboradores (2004) trabalhando com a espécie Caretta caretta obtiveram valor de 14.800/µL. Para adultos desta espécie, PIRES e colaboradores (2006) encontraram 3.656 leucócitos por microlitro de sangue, valor próximo ao encontrado por CUBAS & BAPTISTOTTE (2006), de 4.249/µL.
Condições de cativeiro podem causar elevação nos valores da contagem total de leucócitos, devido ao estado nutricional ou de estresse dos animais (WOOD & EBANKS, 1984). Tartarugas marinhas expostas à contaminação por petróleo apresentaram um aumento de até quatro vezes da contagem destas células (LUTCAVAGE et al., 1995).
2.1.5.2 Contagem Diferencial de Leucócitos
WORK e colaboradores (1998) e CASAL & ORÓS (2007), utilizando-se de técnicas citoquímicas, identificaram na corrente sangüínea de tartarugas verdes e cabeçudas os seguintes leucócitos: linfócitos, monócitos, heterófilos, eosinófilos e basófilos. As células mononucleares circulantes como linfócitos e monócitos são similares entre os vertebrados superiores, mas é considerável a heterogeneidade da série
granulocítica. Diferentemente dos animais domésticos, o heterófilo é um granulócito encontrado em répteis e aves e corresponde ao neutrófilo dos mamíferos. Outra terminologia usada é acidófilo que pode ser aplicado para os heterófilos e eosinófilos, já que estas células apresentam em seu citoplasma grânulos eosinofílicos (MONTALI, 1988).
Alguns pesquisadores ainda divergem sobre a terminologia e critérios para distinguir os granulócitos acidofílicos (HARMS et al., 2000). Os neutrófilos são raros em répteis, mas têm sido descritos em estudos com tartarugas cabeçudas (GEORGE, 1997) e verdes (WOOD & EBANKS, 1984; AGUIRRE et al. 1995). Entretanto, alguns destes autores não utilizaram a citoquímica ou outra técnica mais específica para confirmar e identificar os diferentes tipos de leucócitos (CASAL & ORÓS, 2007). A descrição de azurófilos é rara em tartarugas marinhas, mas tem-se relatado este tipo celular em poucos trabalhos (SAMOUR et al., 1998; KELLER et al, 2004), embora outros não tenham identificado estas células (WOOD & EBANKS, 1984; CANNON, 1992; AGUIRRE et al., 1995; WORK et al., 1998; WORK & BALAZS, 1999; HARMS et al., 2000; CASAL & ORÓS, 2007).
Os linfócitos são células que apresentam grande variação quanto à forma e ao tamanho, o seu citoplasma é escasso (WORK et al., 1998; SAMOUR et al., 1998) e o núcleo segue em geral a forma da célula, apresentando cromatina nuclear fortemente condensada quando maduros (WOOD & EBANKS, 1984; ALLEMAN et al.,1992; CASAL & ORÓS, 2007). Alterações no número de linfócitos podem ser causadas por estresse, neoplasia ou resposta inflamatória não específica (CRAY et al., 2001), ao passo que o estresse e a imunossupressão em tartarugas marinhas com fibropapilomatose podem provocar linfopenia (AGUIRRE et al., 1995; WORK & BALAZS, 1999).
Os monócitos são as maiores células encontradas no esfregaço sangüíneo (WORK et al., 1998; SAMOUR et al., 1998), são arredondadas ou irregulares, com citoplasma não muito abundante, podendo apresentar vacúolos. O núcleo é excêntrico com contorno irregular, e sua cromatina menos densa que a do linfócito (WOOD & EBANKS, 1984; CASAL & ORÓS, 2007). A presença de monocitose sugere um processo infeccioso e/ou inflamatório crônico, sendo a proliferação monocítica
associada à granulomas, enquanto que a ausência de monócitos, na contagem diferencial, é considerada normal (AGUIRRE et al., 1995; WORK & BALAZS, 1999).
Os heterófilos são células com funções análogas às dos neutrófilos dos mamíferos. É uma célula grande, arredondada e de formato irregular (WORK et al., 1998). O núcleo do heterófilo maduro é esférico, não lobulado, e de localização excêntrica no citoplasma; este por sua vez, é preenchido com numerosos grânulos fusiformes eosinofílicos (MONTALI, 1988; ALLEMAN et al., 1992; SAMOUR et al., 1998; CASAL & ORÓS, 2007). Heterofilias são observadas em tartarugas marinhas com fibropapilomatose, condições de estresse (AGUIRRE et al., 1995; WORK & BALAZS, 1999) e em inflamações agudas (ROSSKOPF, 1982).
Os eosinófilos são células esféricas, com quantidade abundante de citoplasma contendo grânulos arredondados eosinofílicos, que coram-se mais fracamente que os dos heterófilos (MONTALI, 1988; CANNON, 1992) O núcleo tem forma arredondada a irregular, em posição excêntrica, (ALLEMAN et al.,1992; WORK et al., 1998; SAMOUR et al., 1998; CASAL & ORÓS, 2007). Uma eosinofilia é esperada em casos de estímulo parasitário (ROSSKOPF, 1982; CAMPBELL, 1996), enquanto que eosinopenia pode ocorrer em situações de estresse (AGUIRRE et al., 1995). WORK & BALAZS (1999) observaram eosinopenia em casos de infecções por trematódeos vasculares em tartarugas verdes, o que pode estar associado ao seqüestro de eosinófilos nos tecidos como uma resposta inflamatória a estes parasitas. Existe uma correlação entre esta célula e a idade do animal, com diminuição do seu número e aumento de heterófilos com o envelhecimento (WOOD & EBANKS, 1984).
O basófilo é uma célula pequena que apresenta núcleo denso, de posição central, estando freqüentemente encoberto por grandes grânulos citoplasmáticos arredondados e fortemente basofílicos (WOOD & EBANKS, 1984; ALLEMAN et al., 1992; WORK et al., 1998; SAMOUR et al., 1998). Contudo, sua presença na circulação de animais hígidos é rara, como relatam WOOD & EBANKS (1984), CANNON (1992) e WORK e colaboradores (1998) que trabalharam com as espécies Lepidochelys kempi e Chelonia mydas, respectivamente. A basofilia pode ocorrer em resposta à inflamações crônicas (ROSSKOPF, 1982).
No que diz respeito aos valores relativos de leucócitos obtidos na contagem diferencial, CUBAS & BAPTISTOTTE (2006) obtiveram para tartarugas cabeçudas mantidas em cativeiro, os seguintes resultados: heterófilos 54% (± 13,1); linfócitos 17,5% (± 8,4); eosinófilos 13,6% (± 7,7); monócitos 12,5% (± 7,2); e basófilos 0,1% (± 0,3), correspondendo a valores absolutos de: heterófilos 2.170,3/µL (± 738,5); linfócitos 800,8/µL (± 602,6); eosinófilos 594,7/µL (± 477,6); monócitos 560,5/µL (± 422,9); e basófilos 4,2/µL (± 15,2). PIRES e colaboradores (2006), também trabalhando com a espécie Caretta caretta em cativeiro, apresentaram os seguintes valores relativos e absolutos, respectivamente: heterófilos 59,4% (± 16,3) e 2.156,9/µL (± 703,5); linfócitos 29,2% (± 17,1) e 1.110,9/µL (± 783,6); eosinófilos 10,4% (± 6,3) e 366,9/µL (± 216,4); monócitos 0,9% (± 2,1) e 19,1/µL (± 42,34); e basófilos 0,1% (± 0,3) e 2,5/µL (± 7,1). Valores relativos ligeiramente diferentes de heterófilos 75,8% (± 9,1); linfócitos 18,4% (± 7,1); eosinófilos 4,5% (± 6,3); monócitos 1,2% (± 1,4); e basófilos 0% (± 0) foram obtidos por CASAL & ORÓS (2007) para 35 tartarugas desta mesma espécie.
Heterofilia, linfocitopenia e eosinopenia foram observadas em tartarugas verdes 24 horas após a captura. Essa mudança no leucograma foi atribuída ao estresse agudo de captura, similar ao que ocorre em outros répteis. Já a linfocitopenia severa em tartarugas marinhas com fibropapilomatose podem indicar uma supressão do sistema imunológico destes animais (AGUIRRE et al., 1995; WORK & BALAZS, 1999).
2.1.6 Contagem de Trombócitos
Trombócitos são células nucleadas com função hemostática análoga às plaquetas dos mamíferos (SOSLAU et al., 2005). São células elípticas ou arredondadas, possuem núcleo oval, central e fortemente basofílico (WORK et al., 1998). Essas células geralmente são encontradas aglutinadas em esfregaços sangüíneos (WOOD & EBANKS, 1984; HARMS et al., 2000; CASAL & ORÓS, 2007), podendo ser confundidas com pequenos linfócitos, sendo diferenciadas destes por apresentar citoplasma incolor, e uma relação núcleo/citoplasma menor (ALLEMAN et al.,1992).
O valor obtido na contagem de trombócitos de tartarugas cabeçudas mantidas em cativeiro, por PIRES e colaboradores (2006) foi de 10.968,1/µL, enquanto que CUBAS & BAPTISTOTTE (2006) apresentaram uma média de 21.932,1/µL para a mesma espécie.
2.1.7 Parâmetros Bioquímicos
Mudanças nos valores de parâmetros bioquímicos em tartarugas marinhas podem indicar seu estado fisiológico ou condições patológicas. Esses valores podem ser afetados por muitos fatores intrínsecos como: espécie, sexo e idade, e extrínsecos como sazonalidade, temperatura, habitat e dieta (LUTZ & DUNBAR-COOPER, 1987; AGUIRRE et al., 1995). Além de ser utilizado como meio diagnóstico de um exemplar de determinada espécie, os dados bioquímicos podem auxiliar na avaliação do estado de sanidade de populações (SWIMMER, 2000). Sendo assim, o estabelecimento do perfil da bioquímica sangüínea de tartarugas marinhas de vida livre saudáveis é uma das prioridades na tentativa de conservação destas espécies (AGUIRRE & BALAZS, 2000).
Entretanto ainda não se tem estudos aprofundados relacionando os parâmetros bioquímicos as enfermidades em tartarugas marinhas, destacando-se somente a fibropapilomatose. Esta é uma doença que apresenta alta prevalência entre as populações de tartarugas verdes, e por este motivo, vem sendo alvo de investigações quanto as alterações bioquímicas e hematológicas que produz nos indivíduos afetados (WORK & BALAZS, 1999; SWIMMER, 2000; WORK et al., 2001; CRAY et al., 2001).
2.1.7.1 Proteína Total, Albumina e Globulina
Há pelo menos uma centena de proteínas plasmáticas descritas e identificadas, no homem e nos animais, com inúmeras funções no organismo. As principais e mais conhecidas proteínas são a albumina, globulina e suas frações, e o fibrinogênio, cujos valores normais variam de acordo com a idade, espécie animal e condições fisiológicas (KANEKO, 1997). Em répteis os valores normais de proteína plasmática total
geralmente variam de 3 a 8 g/dL (CAMPBELL, 1996), e em estudos realizados com tartarugas cabeçudas BOLTEN e colaboradores (1992 e 1994) obtiveram uma média de 4,1g/dL (± 1,2), enquanto que em Caretta caretta juvenis valor de 4,0g/dL (± 0,8) foi obtido por KELLER e colaboradores (2004).
Em situações de cativeiro as tartarugas podem apresentar níveis protéicos mais elevados como resultado da dieta rica em proteína oferecida (SWIMMER, 2000). Para exemplares de tartarugas cabeçudas, mantidos nesta condição, a média encontrada por CUBAS & BAPTISTOTTE (2006) foi de 4,2g/dL (± 0,4). Contudo, em tartarugas verdes na Austrália, submetidas à baixas temperatura (17oC/16 semanas), simulando condições de inverno, pode-se obter valores mais baixos de proteína total, o que se justifica pelo menor consumo de alimento nestas condições, onde a taxa metabólica encontra-se diminuída (SOUTHWOOD et al., 2003).
Para a albumina, em pesquisa realizada com tartarugas marinhas cabeçudas, foram obtidos os seguintes valores: 0,9g/dL (± 0,3) em 23 amostras de plasma e 0,7g/dL (± 0,2) em 168 amostras séricas (BOLTEN et al., 1992 e 1994), enquanto que 1,1g/dL (± 0,2) e 0,7g/dL (± 0,2) foram apresentados por KELLER e colaboradores (2004) e CUBAS & BAPTISTOTTE (2006) ao avaliarem plasma.
Quanto a globulina, valores de 3,2g/dL (± 0,9) e 2,9g/dL (± 0,7) foram obtidos para tartarugas marinhas cabeçudas por BOLTEN e colaboradores (1994) e KELLER e colaboradores (2004), respectivamente.
Com relação a alterações de valores sangüíneos, a hipo ou hiperproteinemia são atribuídas principalmente a diminuição de albumina e/ou aumento de globulina. As hipoalbuminemias em répteis estão associadas freqüentemente à má nutrição, podendo-se incluir também má absorção e má digestão, geralmente associadas a parasitismo intestinal, enteropatias, severa perda de sangue, e doenças hepáticas ou renais crônicas (CAMPBELL, 1996). Em tartarugas marinhas Chelonia mydas com fibropapilomatose relatou-se hipoproteinemia-hipoalbuminemia (NORTON et al., 1990; AGUIRRE et al., 1995; AGUIRRE E BALAZS, 2000; CRAY et al., 2001). As hiperproteinemias ocorrem com a hemoconcentração (desidratação) ou elevação das globulinas em doenças inflamatórias crônicas (CAMPBELL, 1996).
2.1.7.2 Relação Albumina: Globulina (A:G)
A relação entre a albumina e globulina é de grande valor na clínica veterinária, servindo de base na classificação do perfil eletroforético das proteínas, bem como na natureza deste perfil. A relação A:G obtida em estudo com tartarugas cabeçudas de vida livre foi de 0,3 (± 0,1) (BOLTEN et al., 1994), valor próximo ao encontrado por KELLER e colaboradores (2004) de 0,4 (± 0,08), em trabalho com a mesma espécie.
Em trabalho realizado com a espécie Caretta caretta, KELLER e colaboradores (2004) observaram uma diminuição da relação A:G, associada a concentrações de contaminantes organoclorados no sangue e gordura, e CRAY e colaboradores (2001) relatam também um decréscimo nessa relação em um grupo de Chelonia mydas com fibropapilomatose, devido a uma diminuição na concentração de albumina e aumento na de gamaglobulinas. Em trabalho com tartarugas verdes, severamente acometidas por fibropapilomatose, constatou-se também diminuição da albumina e globulinas, entretanto não houve diferença entre a relação A:G, quando comparada com animais sem tumores ou aqueles levemente acometidos pela doença (WORK et al., 2001).
2.1.7.3 Glicose
A concentração sangüínea de glicose em répteis varia de acordo com a espécie animal, o estado nutricional e condições ambientais, podendo ainda apresentar variação sazonal em algumas espécies (CAMPBELL, 1996). Em 168 amostras plasmáticas de tartarugas marinhas, um valor médio de 97mg/dL (± 21) foi obtido por BOLTEN e colaboradores (1994), enquanto que valores de 109mg/dL (± 18) e 102,8mg/dL (± 17) foram obtidos por KELLER e colaboradores (2004) e CUBAS & BAPTISTOTTE (2006), respectivamente. Em outro estudo utilizando soro a média encontrada foi de 80,1mg/dL (± 22,3) (BOLTEN et al., 1992).
A hipoglicemia nestes animais pode ser resultado de má nutrição, dietas com altos níveis protéicos, hepatopatias severas e endocrinopatias, enquanto que a hiperglicemia (valores de glicose acima de 200mg/dL) raramente é documentada nestas espécies, sendo forte indício de diabetes mellitus (CAMPBELL, 1996). Estudos relatam
hiperglicemia em resposta ao estresse agudo em tartarugas marinhas, assim como nos mamíferos (AGUIRRE et al., 1995; GREGORY & SCHMID, 2001).
2.1.7.4 Ácido úrico
O ácido úrico é o produto final do catabolismo primário das proteínas, nitrogênio não protéico e purinas em répteis, sendo grande parte do nitrogênio excretado desta forma. A dieta pode influenciar os valores do ácido úrico sangüíneo, especialmente aquelas ricas em proteínas e uréia (CAMPBELL, 1996). Alguns trabalhos apresentam valores deste parâmetro para tartarugas cabeçudas de vida livre, BOLTEN e colaboradores (1992) obtiveram uma média de 0,8mg/dL (±0,2), assim como KELLER e colaboradores (2004) 0,8mg/dL (±0,7), enquanto que para indivíduos desta espécie mantidos em cativeiro CUBAS & BAPTISTOTTE (2006) relatam valores de 1,0mg/dL (±0,4).
Em estudo com juvenis de tartarugas verdes, BOLTEN & BJORNDAL (1992) observaram diferença entre os valores de ácido úrico obtidos para machos e fêmeas, onde os machos (n=38) apresentaram valores mais elevados, de 1,8mg/dL (±0,6) que as fêmeas (n=60), de 1,4mg/dL (±0,5).
Tartarugas verdes mantidas em cativeiro apresentaram valores significativamente mais elevados que animais de vida livre, devido a uma alimentação exclusivamente protéica, entretanto animais cativos que recebem alimentação balanceada apresentam níveis de ácido úrico similares àqueles encontrados em animais de vida livre (SWIMMER, 2000).
Hiperuricemia pode ser associada à doença renal severa e gota. O uso de drogas nefrotóxicas, como aminoglicosídeos e sulfa, pode resultar em necrose tubular renal, causando aumento do ácido úrico plasmático (CAMPBELL, 1996).
2.1.7.5 Creatinina
A determinação da concentração de creatinina sérica pode ser pouco conclusiva em doenças pré-renais e renais em répteis, uma vez que nestes animais o nitrogênio é eliminado como ácido úrico, razão pela qual as tartarugas são considerados indivíduos uricotélicos. Nestas espécies os valores normais de creatinina sérica são geralmente muito baixos, inferiores a 1 mg/dL, e espera-se valores elevados na desidratação severa e doenças renais (CAMPBELL, 1996)
BOLTEN e colaboradores (1994) encontraram uma média de 0,3mg/dL (± 0,1) de creatinina no plasma de tartarugas Caretta caretta. Valor idêntico foi obtido em estudo com amostras de soro desta espécie (BOLTEN et al., 1992). A determinação da concentração de creatinina também foi objeto de estudos de KELLER e colaboradores (2004) que apresentaram valor inferior a 0,1mg/dL, e de CUBAS & BAPTISTOTTE (2006) que obtiveram média de 0,2mg/dL (± 0,1), ainda para a espécie cabeçuda.
2.1.7.6 Colesterol
Distúrbios do metabolismo lipídico podem ser mensurados através das alterações no colesterol sérico. Algumas causas do aumento dos seus níveis incluem dietas ricas em gorduras, lesões hepáticas e renais (MEYER et al., 1995). Tartarugas marinhas mantidas em cativeiro podem apresentar níveis mais elevados de colesterol devido à dietas ricas em gorduras (SWIMMER, 2000).
BOLTEN & BJORNAL (1992) relataram correlação positiva entre os níveis de colesterol e o peso corporal, assim como concentrações mais elevadas em fêmeas que em macho de tartaruga verde.
Para a espécie Caretta caretta de vida livre, BOLTEN e colaboradores (1994) obtiveram uma média de 170mg/dL (± 89) de colesterol total em amostras de plasma, enquanto que no soro de tartarugas cabeçudas este valor foi de 106mg/dL (± 57) (BOLTEN et al., 1992). Por outro lado, em tartarugas cabeçudas cativas a média
apresentada foi de 107mg/dL (± 26,1) para esta mesma variável (CUBAS & BAPTISTOTTE, 2006).
Valores baixos de colesterol sérico foram relatados associados a fibropapilomatose severa em tartarugas verdes, devido a condição crônica debilitante da enfermidade (AGUIRRE et al., 1995; AGUIRRE & BALAZS, 2000).
2.1.7.7 Triglicerídeos
Os valores plasmáticos médios de triglicerídeos apresentados em estudos com tartarugas cabeçudas foram de 179mg/dL (± 68,5) (CUBAS & BAPTISTOTTE, 2006), e 212mg/dL (± 334) (BOLTEN et al., 1994), enquanto que BOLTEN e colaboradores (1992) ao avaliarem o soro de exemplares desta espécie obtiveram o valor de 81mg/dL (± 204) e BALDASSIN (2003) de 587,2mg/dL (± 533,3) para animais cativos.
Em répteis mantidos em cativeiro, a causa mais comum de aumento nos níveis de triglicerídeos é um defeito metabólico no transporte dos lipídios ou síntese de proteínas, resultando em obesidade, causado por superalimentação. Assim, valores elevados encontrados em tartarugas marinhas cativas são devido à dieta rica em gorduras, exercício insuficiente ou ambos (SWIMMER, 2000).
Diferenças significativas nos níveis de triglicerídeos foram relatados, ao se comparar populações de tartarugas verdes juvenis, clinicamente saudáveis e acometidas por fibropapilomatose em ilhas do Hawaii (AGUIRRE & BALAZS, 2000), sendo que este fato já tem sido constatado e com valores baixos em tartarugas marinhas com esta alteração severa (AGUIRRE et al., 1995).
2.1.7.8 Fosfatase Alcalina
Poucos estudos são realizados a respeito das alterações enzimáticas em répteis. Geralmente os valores obtidos são interpretados da mesma forma que para mamíferos e aves domésticos. A fosfatase alcalina está presente em vários tecidos e a sua
determinação não é considerada um teste específico para determinado órgão. Esta enzima pode estar aumentada na atividade osteoblástica ou doença hepatobiliar em algumas espécies; animais mais jovens podem apresentar valores mais elevados que os adultos (CAMPBELL, 1996). São reportados ainda elevação da fosfatase alcalina no hiperparatireoidismo, doenças ósseas e insuficiência renal (SWIMMER, 2000).
BOLTEN e colaboradores (1994) ao avaliarem o plasma de tartarugas marinhas cabeçudas, obtiveram média de 15U/L (± 9) para fosfatase alcalina, enquanto que em amostras de soro desta mesma espécie o valor encontrado foi de 13U/L (± 4) (BOLTEN et al., 1992). Por outro lado, valores mais elevados de 23U/L (± 14) e 36,3UI/L (± 16,3) foram obtidos para esta variável em plasma de juvenis de tartarugas marinhas cabeçudas, e animais em cativeiro por KELLER e colaboradores (2004) CUBAS & BAPTISTOTTE (2006), respectivamente.
2.1.7.9 Aspartato Aminotransferase
A Aspartato Aminotransferase (AST) está presente em todos os tecidos dos répteis. Embora a sua análise não seja considerada um teste específico, altas concentrações são encontradas em tecidos muscular e hepático. Assim, elevações do seu nível sérico relacionam-se a danos destes tecidos. Geralmente, os valores considerados normais são inferiores a 250 U/L nestas espécies e, valores superiores aqueles são sugestivos de danos hepático, na musculatura esquelética ou no miocárdio. Em doenças generalizadas o aumento da AST está relacionado com necrose celular de diferentes tecidos (CAMPBELL, 1996), enquanto que em tartarugas verdes esta elevação foi observada em animais com fibropapilomatose (AGUIRRE et al., 1995; NORTON et al., 1990).
A AST foi avaliada no soro de tartarugas marinhas cabeçudas de vida livre, apresentando um valor médio de 180U/L (± 84) (BOLTEN et al., 1992). Amostras de plasma desta espécie apresentaram um valor médio de 204U/L (± 90) para esta variável (BOLTEN et al., 1994), e 229U/L (± 54) em juvenis (KELLER et al., 2004) e para Caretta caretta mantidas em cativeiro o valor foi de 323,2UI/L (± 178,4) (CUBAS & BAPTISTOTTE, 2006).
2.1.8 Eletroforese das Proteínas Séricas
A eletroforese de proteínas pode ser utilizada tanto para avaliar o estado de saúde, quanto para auxiliar no diagnóstico de doenças em tartarugas marinhas (GICKING et al., 2004). As técnicas atuais permitem uma alta qualidade na separação das frações protéicas, com custo acessível e pequeno volume de amostra, sendo ainda considerado como método acurado para mensurar albumina e frações de globulinas, constituindo em um importante complemento na rotina dos exames hematológicos e bioquímicos (CRAY & TATUM, 1998).
A albumina é considerada a mais abundante das proteínas séricas na eletroforese, constituindo de 35 a 50% do seu total. E, sua magnitude auxilia, não só em termos fisiológicos, mas também na interpretação do gráfico obtido por esta técnica, sendo assim um guia útil para diferenciar os picos monoclonais de globulina (KANEKO, 1997).
A determinação das proteínas séricas através da eletroforese pode auxiliar também no diagnóstico laboratorial de répteis com hiperglobulinemia; as frações α, β e γ podem estar aumentadas em doenças infecciosas e, geralmente as α-globulinas se elevam em necrose tecidual estando diminuídas em doenças hepáticas severas, má nutrição e má absorção. Além disso, importantes proteínas de fase aguda compõem esta fração, como a seromucoide, ceruloplasmina e haptoglobina, sendo consideradas marcadores de doença inflamatória aguda. A fração β-globulina é formada por proteínas de grande valor diagnóstico, entre elas o fibrinogênio e a proteína C-reativa, que estão também aumentadas em doenças inflamatórias agudas. As alterações das proteínas de fase aguda geralmente ocorrem antes das mudanças dos valores bioquímicos e hematológicos. A gama globulina, na maioria dos animais, é observada como duas frações: gama 1 e gama 2, onde as imunoglobulinas (anticorpos) migram nestas duas regiões (CAMPBELL, 1996; KANEKO, 1997; CRAY & TATUM, 1998).
FRAIR (1982) utilizou eletroforese de proteínas séricas em estudo taxonômico de diferentes espécies de tartarugas marinhas e concluiu que aparentemente todas têm linhas de migração similares, e também tem padrões relativamente curtos quando
comparados com humanos. No entanto, alguma variabilidade intraespecífica ocorreu, sendo mais quantitativa (altura das linhas) do que qualitativa (posição das linhas).
CRAY e colaboradores (2001) detectaram bandas fracionadas, em estudo com 16 tartarugas verdes, equivalentes àquelas observadas em mamíferos: albumina, α1-globulina, α2-globulina, β-globulina e γ-globulina. Ao realizar a eletroforese de proteínas plasmáticas de 29 tartarugas cabeçudas, GICKING e colaboradores (2004) encontraram uma concentração média de albumina de 1,0g/dL (±0,17), para a α-globulina a média encontrada foi de 0,48g/dL (±0,1), enquanto que para β-α-globulina o valor obtido foi de 0,80g/dL (±0,2) e para concentração de γ-globulina a média foi de 1,94g/dL (±0,62), valor considerado alto quando os autores compararam com espécies de aves e mamíferos.
Poucos são os estudos com eletroforese em tartarugas marinhas, entretanto já há um interesse em utilizar este meio diagnóstico nestas espécies, principalmente em animais acometidos pela fibropapilomatose, que é uma doença debilitante, podendo causar a morte do animal e, que tem crescido bastante entre a espécie Chelonia mydas, alcançando altas incidências em algumas populações, tornando-as ameaçadas (SWIMMER, 2000; AGUIRRE & BALAZS, 2000; CRAY et al., 2001). Tartarugas verdes com fibropapilomatose severa apresentam diminuição dos valores de α1, α2 e γ-globulinas (WORK, et al., 2001), sendo que valores baixos da fração gama são indicativos de imunossupressão (KANEKO, 1997; WORK et al., 2001).
3 ARTIGOS CIENTÍFICOS
3.1 Artigo Científico I:
Hemograma e bioquímica sérica de tartarugas cabeçudas (Caretta caretta) de vida livre e mantidas em cativeiro, no Litoral Norte da Bahia.
Hemogram and serum biochemistry for loggerhead sea turtles (Caretta caretta), free-ranging and captive in north coast of Bahia, Brazil.
Thaís Torres Pires1,3, Gonzalo Rostan3, Thereza Cristina Calmon de Bittencourt2 e José Eugênio Guimarães1
1- Departamento de Patologia e Clínicas – Hospital de Medicina Veterinária - EMV/UFBA – Salvador/BA - Brasil
2- Departamento de Produção Animal – EMV/UFBA – Salvador/BA - Brasil 3- Projeto Tamar-Ibama – Mata de São João/BA - Brasil
RESUMO
Com o objetivo de se obter dados que auxiliem na rotina clínica de tartarugas marinhas, realizou-se o hemograma e a determinação de alguns parâmetros bioquímicos séricos de fêmeas de tartarugas cabeçudas (Caretta caretta) de vida livre (n = 22), animais que desovam no Litoral Norte da Bahia, e em cativeiro (n = 5), animais mantidos no Centro de Visitantes do Projeto Tamar-Ibama, na Praia do Forte. Os valores obtidos para os dois grupos foram comparados, onde observou-se diferença estatística significativa (p<0,05) para as contagens relativas e absolutas de eosinófilos e contagem relativa de monócitos dentre as variáveis do hemograma e, para a proteína total, globulina, glicose, colesterol e aspartato aminotransferase. Possivelmente, diferenças nas condições ambientais, nutricionais e reprodutivas, as quais estes animais foram submetidos, influenciaram nos resultados.
SUMMARY
The aim of this study was to improve the clinical evaluation in sea turtles by analyzing the hemogram and serum biochemistry in loggerhead sea turtles (Caretta caretta), female, free-ranging (n=22) nesting in the north coast of Bahia and in captivity (n=5) in the visitor center of the Projeto Tamar-Ibama, in Praia do Forte, municipality of Mata de São João, Bahia, Brazil. The values obtained were compared between the two groups and it was observed that there was statistically significant difference (p<0,05) for the relative and absolute eosinophil count, relative monocyte count, total serum protein, globulin, glucose, cholesterol and aspartate aminotransferase. The results variation is probably related to the differences in environmental, nutritional and reproductive conditions.
Keywords: hemogram, serum biochemistry, loggerhead sea turtles.
3.1.1 Introdução
Na investigação clínica de répteis, amostras sangüíneas podem ser facilmente obtidas e são de grande valor diagnóstico. Entretanto, a patologia clínica é uma área da medicina herpetológica que ainda necessita de vários estudos (DIVERS et al., 1996). A bioquímica sérica representa uma importante ferramenta de monitoramento da saúde e estado fisiológico de tartarugas marinhas. Pesquisas sobre este tema podem fornecer informações fundamentais para a manutenção e conservação das populações selvagens destas espécies (NORTON et al., 1990; BOLTEN & BJORDAL, 1992; AGUIRRE et al., 1995; SAMOUR et al., 1998). Alguns trabalhos foram realizados, porém a comparação dos dados obtidos é limitada devido as possíveis diferenças entre as populações, bem como as variações de técnicas utilizadas (BOLTEN et al., 1992; SWIMMER, 2000). Fatores como idade, tamanho, sexo, sazonalidade, saúde, habitat e dieta podem afetar os parâmetros hematológicos, tanto em tartarugas marinhas como em répteis de maneira geral (WOOD & EBANKS, 1984; GOTTDENKER & JACOBSON, 1995). Além disso, as descrições de características morfológicas de células sangüíneas de quelônios marinhos são limitadas (CANNON, 1992; WORK et al., 1998; CASAL & ORÓS, 2007).
Com a necessidade crescente de avaliação do estado de saúde em tartarugas marinhas, para uma possível manutenção de animais saudáveis em cativeiro e reabilitação de indivíduos de vida livre, se faz necessário um maior empenho em desenvolver estudos relacionados aos meios auxiliares de diagnóstico clínico, onde a avaliação hematológica possui grande destaque (PIRES et al., 2006).
Este trabalho propõe a determinação e comparação dos valores do hemograma e de alguns parâmetros da bioquímica sérica de tartarugas cabeçudas (Caretta caretta) selvagens que visitam o litoral norte da Bahia e de exemplares desta espécie criadas em cativeiro, obtendo-se assim valores que possam auxiliar no diagnóstico clínico de enfermidades que acometem estes animais.
3.1.2 Material e Métodos
Foram analisados dois grupos distintos de tartarugas marinhas cabeçudas (Caretta caretta): animais de vida livre e animais em cativeiro. As amostras de sangue dos animais de vida livre foram coletadas de 22 exemplares fêmeas que desovam no Litoral Norte da Bahia, em áreas protegidas e monitoradas pelas bases do Projeto Tamar-Ibama da Praia do Forte (12º34’S 38º00’W) e Arembepe (12º45'S 38º10'W), logo após a desova, durante as temporadas reprodutivas, setembro a março, de 2004/2005 e 2005/2006.
Para os animais em cativeiro, colheu-se amostras sangüíneas de cinco fêmeas que estão no Centro de visitantes do Projeto Tamar-Ibama da base de Praia do Forte – Bahia, desde o nascimento, e com idades de 18 a 20 anos, no mês de março de 2006. Os mesmos são alimentados diariamente com três tipos de peixe: corvina, galo e sardinha, e mantidos em tanques com volume de 102 e 30 m3, recebendo água diretamente captada do mar, em sistema aberto, que passa por filtros de areia.
As tartarugas foram mensuradas, e os valores médios do comprimento curvilíneo de carapaça (CCC) foram de 1,00 m (±0,05) para os animais de vida livre e 0,96 m (±0,03) para aquelas mantidas em cativeiro, caracterizando-os assim animais adultos. Todos os animais foram avaliados clinicamente, onde se observou condição corporal,
presença de ectoparasitas, tumores e lesões cutâneas, sendo coletadas amostras apenas dos animais considerados clinicamente saudáveis.
Após a contenção dos animais, segundo recomendações de OWENS & RUIZ (1980), cinco mililitros de sangue foram coletados do seio cervical dorsal de cada tartaruga. As amostras foram imediatamente armazenadas em tubos com heparina de sódio para a realização do hemograma, e em tubos sem anticoagulante para obtenção de soro, que foi congelado a -20ºC até o momento das análises bioquímicas. Em seguida foram enviadas e processadas no Laboratório de Patologia Clínica Veterinária da Escola de Medicina Veterinária da UFBA.
O volume globular (VG) foi determinado através da técnica de microhematócrito (JAIN, 1986), enquanto que a concentração de hemoglobina, pelo método da cianometahemoglobina, através de kit comercial (Doles). As contagens de eritrócitos e leucócitos foram realizadas em Câmara hematimétrica de Neubauer, tendo como diluente a solução de NATT & HERRICK (1952). As contagens diferencial de leucócitos e de trombócitos foram estabelecidas em esfregaço sangüíneo corado segundo a técnica de Rosenfeld descrita por BIRGEL e colaboradores (1983). A partir das variáveis do eritrograma estabeleceu-se matematicamente os índices hematimétricos: Volume Globular Médio (VGM) e Concentração de Hemoglobina Globular Média (CHGM).
Para a determinação dos parâmetros da bioquímica sérica foram utilizados kits comerciais (Labtest), onde a proteína sérica total foi determinada pelo método do biureto modificado, com leitura espectrofotométrica em 550nm, e a albumina pelo método Verde de bromocresol modificado com leitura espectrofotométrica em 630nm. Através da diferença dos valores obtidos para essas variáveis, obteve-se o valor total de globulina. A relação Albumina:Globulina (A:G) foi calculada a partir destes resultados. As concentrações de fosfatase alcalina e aspartato amino transferanse foram obtidas pelos métodos de Bowers & McComb modificado e cinética UV-IFCC, com leitura espectrométrica em 405nm e 340nm, respectivamente, enquanto que para a creatinina utilizou-se o método Labtest em comprimento de 510nm. O ácido úrico, o colesterol e os triglicérideos foram obtidos através do método enzimático-Trinder com leitura em espectrofotômetro utilizando o comprimento de onda de 520, 500 e 505nm,
