Sazonalidade na exposição a flebotomíneos em cães e humanos em área endêmica para leishmaniose visceral: um estudo de intervenção

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA. INGRYD CAMARA MORAIS. SAZONALIDADE NA EXPOSIÇÃO A FLEBOTOMÍNEOS EM CÃES E HUMANOS EM ÁREA ENDÊMICA PARA LEISHMANIOSE VISCERAL: UM ESTUDO DE INTERVENÇÃO. NATAL 2016.

(2) SAZONALIDADE NA EXPOSIÇÃO A FLEBOTOMÍNEOS EM CÃES E HUMANOS EM ÁREA ENDÊMICA PARA LEISHMANIOSE VISCERAL: UM ESTUDO DE INTERVENÇÃO. Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Selma Maria Bezerra Jerônimo. NATAL 2016.

(3)

(4)

(5) Resumo A leishmaniose visceral, no Brasil, é causada pelo protozoário Leishmania infantum, possuindo como vetor Lutzomyia longipalpis e como principal reservatório o cão doméstico. A principal medida de controle dessa endemia no Brasil é a eutanásia de cães infectados por Leishmania. No entanto, essa medida não tem sido efetiva devido a vários fatores, incluindo a defasagem temporal de sua realização. A utilização de coleiras impregnadas com deltametrina por cães tem sido uma das medidas alternativas potenciais de controle. Essa estratégia parece diminuir o risco de exposição desses animais aos vetores, com consequente diminuição do risco de infecção. Esse trabalho objetivou verificar as taxas de exposição ao vetor e a Leishmania em humanos e cães após adoção do uso de coleiras impregnadas com deltametrina por cães residentes em área endêmica para leishmaniose visceral em Natal, RN. O estudo foi do tipo casocontrole. Cães de área de intervenção receberam coleiras impregnadas com deltametrina, além das medidas tradicionais de controle, incluindo a eutanásia daqueles que estavam infectados por L. infantum; enquanto cães da área controle foram submetidos à conduta habitual, que é a remoção dos cães infectados. Cães e pessoas das duas áreas tiveram amostras de sangue coletadas, sendo uma coleta para humanos e três coletas para cães (momento de intervenção, 6 meses e um ano após). Para determinação dos níveis de exposição ao vetor, foi realizada a pesquisa de anticorpos anti-saliva de flebotomíneo, através da técnica de ELISA, com homogenato de glândula salivar de L. longipalpis (para humanos e cães) e proteínas recombinantes LJM11/LJM17 (para humanos). Foi verificado que na área controle houve diferença entre os níveis de anticorpos das três coletas caninas (P<0.0001), enquanto que na área de intervenção, não foi observada diferença nos níveis de anticorpos das três coletas (p=0,15). Na área de intervenção, os humanos demonstraram menores títulos de anticorpos anti-SGH (p<0,0001), antiLJM11/17 (p=0,0002) e anti-Leishmania (p<0,0001), quando comparados a indivíduos da área controle. Homens e mulheres se mostraram igualmente expostos ao vetor, independentemente da área de estudo. Os níveis de anticorpos anti-homogenato de glândula salivar apresentaram correlação com os níveis de anticorpos de proteínas recombinantes em humanos (r=0,56). O trabalho demonstra a necessidade de investigar a eficácia de novas medidas de controle da leishmaniose, levando em consideração o ciclo biológico do parasita, o aspecto sazonal da densidade e exposição vetorial, bem como as condições ambientais específicas de cada localidade.

(6) Abstract Visceral leishmaniasis in Brazil is caused by the protozoan Leishmania infantum. The main vector for L. infantum transmission is Lutzomyia longipalpis and domestic dogs are considered the main reservoir of this protozoan. The major control’s measure of this disease in Brazil is the euthanasia of infected dogs. However, this measure has not been effective due to several factors, including the time lag of implementation after human infection. The use of deltamethrinimpregnated dog collars has been one of the potential alternative measures of infection control. This strategy seems to reduce the risk of exposure of these animals to phlebotomines, with consequent decrease in canine exposure. The aim of this work was to determine the rate of exposure of humans and dogs to the vectors after adoption of deltamethrin impregnated collars by dogs resident in an endemic area for visceral leishmaniasis in Natal, RN, Brazil. A case-control study was designed, in which in the intervention area dogs received collars impregnated with deltamethrin, in addition to traditional control measures; while in the control area only euthanasia was performed. Dogs and people from both areas had blood samples collected, one collection for humans and three for dogs (intervention time, 6 months and one year after). In order to determine the levels of vector exposure, anti-salivary antibodies were obtained by ELISA using salivary gland homogenate of L. longipalpis (for humans and dogs) and recombinant proteins LJM11 / LJM17 (for humans). It was verified that in the control area there was a difference between the levels of antibodies of the three canine collections (p <0.0001), whereas in the intervention area, no difference was observed in the antibody levels of the three collections (p=0.15). In the intervention area, humans showed lower titers of anti-SGH antibodies (p <0.0001), anti-LJM11/17 (p=0.0002) and anti-Leishmania (p<0.0001) when compared to individuals in the control area. Men and women were equally exposed to the vector, regardless of the study area. Salivary gland antihomogenate antibody levels correlated with recombinant protein antibody levels in humans (r=0.56). This work demonstrates the need to investigate the efficacy of new leishmaniasis control measures, taking into account the biological cycle of the parasite, the seasonal aspect of density and vector exposure, as well as the specific environmental conditions of each locality..

(7) Lista de figuras e tabelas Figura/Tabela Tabela 1. Legenda. Página. Descrição das condições ambientais das áreas de intervenção e. 26. controle Tabela 2. Frequência dos níveis de escolaridade entre as duas populações de. 27. estudo Figura 1. Mapa da área de estudo. 22. Figura 2. Cronologia do estudo. 24. Figura 3. Fluxograma do desenho de estudo canino. 24. Figura 4. Fluxograma do desenho de estudo humano. 25. Figura 5. Comparação entre os níveis de anticorpos anti-SGH das primeira,. 29. segunda e terceira coleta canina na área de intervenção Figura 6. Comparação entre os níveis de anticorpos anti-SGH das primeira,. 30. segunda e terceira coleta canina na área controle Figura 7. Níveis de anticorpos anti-SGH em humanos quanto a área de estudo. 32. Figura 8. Níveis de anticorpos anti-LJM11/LJM17 em humanos quanto a área de 33 estudo. Figura 9. Níveis de anticorpos anti-SGH em humanos quanto ao sexo na área. 34. com intervenção Figura 10. Níveis de anticorpos anti-LJM11/LJM17 em humanos quanto ao sexo 34 na área controle. Figura 11. Correlação entre níveis de anticorpos anti-SGH e anti-LJM11/LJM17. 35. em humanos Figura 12. Níveis de anticorpos anti-SLA em humanos quanto à área de estudo. 36.

(8) Lista de abreviações. ADP. Adenosina difosfato. BE. Boa Esperança. DDT. Dicloro difenil tricloro etano. DTH. Delayed-type hypersensivity. DPP. Dual Path Platform. ELISA. Enzyme-linked immunosorbent assay. F. Feminino. HIV. Human immunodeficience virus. IFN-ϒ. Interferon gama. Ig. Imunoglobulina. IL. Interleucina. JP. Jardim Progresso. LV. Leishmaniose visceral. M. Masculino. Nm. Nanômetro. OD. Optic density. SGH. Salivary gland homogenate. SLA. Soluble Leishmania antigen. Th. T helper. T1. Tempo 1. T2. Tempo 2.

(9) Sumário Resumo ............................................................................................................. 5 Abstract ............................................................................................................. 9 Lista de figuras e tabelas............................................................................... 10 Lista de abreviações ...................................................................................... 11 1. Introdução .................................................................................................. 9 1.1. Aspectos gerais das leishmanioses ........................................................................ 9. 1.2. Características clínicas da leishmaniose visceral humana e canina................ 10. 1.3 Tratamento da leishmaniose visceral humana .......................................................... 11 1.4. Epidemiologia e Urbanização da Leishmaniose visceral ................................... 11. 1.5. Controle da leishmaniose visceral no Brasil......................................................... 13. 1.6. Imunologia da leishmaniose visceral ..................................................................... 15. 1.7. Diagnóstico da leishmaniose visceral ................................................................... 16. 1.8. O vetor da Leishmania infantum ............................................................................ 16. 1.9. A saliva do vetor é um fator influenciador da infecção ....................................... 17. 2. Objetivos .................................................................................................. 21 2.1 Objetivo geral: ................................................................................................................ 21 2.2 Objetivos específicos: ................................................................................................... 21. 3. Metodologia .............................................................................................. 22 3.1. Área de estudo .......................................................................................................... 22. 3.2. Desenho de estudo .................................................................................................. 22. 3.3. Determinação da infecção por L. infantum .......................................................... 25. 3.4. Determinação da exposição a antígenos de saliva de flebotomíneo por ELISA 25. 3.5. Análise estatística..................................................................................................... 26. 3.6. Aprovação ética ........................................................................................................ 26. 4. Resultados ............................................................................................... 27 4.1. Caracterização da área de estudo ......................................................................... 27. 4.1.1. Caracterização ambiental.................................................................................... 27. 4.1.2. Caracterização da população humana ............................................................. 28. 4.1.3. Caracterização da população canina ................................................................ 28. 4.2. Níveis de anticorpos anti-SGH em cães: Área de intervenção ......................... 29. 4.3. Níveis de anticorpos anti-SGH em cães: Área Controle .................................... 30. 4.4. Soroconversão de anticorpos anti-SLA em cães após 6 meses e 1 ano ........ 31. 4.5 Níveis de anticorpos anti-SGH em humanos quanto a área de estudo, após intervenção ............................................................................................................................ 31.

(10) 4.6 Níveis de anticorpos anti-LJM11/LJM17 em humanos quanto a área de estudo, após intervenção .................................................................................................... 32 4.7. Níveis de anticorpos anti-SGH quanto ao sexo ................................................... 33. 4.8. Níveis de anticorpos anti-LJM11/LJM17 quanto ao sexo .................................. 33. 4.9 Correlação entre níveis de anticorpos anti-SGH e anti-LJM11/LJM17 em humanos ................................................................................................................................ 34 4.10 Níveis de anticorpos anti-SLA em humanos segundo a área de estudo, após intervenção. ........................................................................................................................... 35. 5. Discussão ................................................................................................. 36 6. Conclusões .............................................................................................. 45 7. Referências .............................................................................................. 46.

(11) 9. 1. Introdução. 1.1 Aspectos gerais das leishmanioses. As leishmanioses compreendem um conjunto de doenças causadas pela infecção por parasitas do gênero Leishmania sp., pertencentes à ordem kinetoplastida. e. família. Trypanosomatidae. (DESJEUX,. 1992).. Esses. protozoários são transmitidos para o hospedeiro vertebrado através da picada da fêmea do vetor flebotomíneo (ALMEIDA; VILHENA; BARRAL, 2003). Dependendo da espécie de Leishmania infectante, diferentes formas clínicas humanas da doença são observadas: leishmaniose visceral (LV), leishmaniose cutânea e mucocutânea e leishmaniose disseminada. No entanto, a maioria das pessoas. infectadas por. espécies. de. Leishmania. evoluem. de. forma. assintomática. Esses indivíduos são identificados por exames sorológicos específicos para Leishmania e/ou intradermorreação de Montenegro positiva (LIMA et al., 2012). As Leishmanias são protozoários dimórficos: possuem uma forma extracelular promastigota, alongada e com flagelo, presente no vetor invertebrado; e uma forma intracelular amastigota, esférica e sem flagelo, presente no hospedeiro vertebrado (HOMMEL, 1999). Durante o repasto sanguíneo, o vetor infectado deposita, através de sua probóscide, os protozoários na forma promastigota metacíclica na pele do hospedeiro vertebrado. Nesse momento, os parasitas infectam células da linhagem fagocítica mononuclear, especialmente macrófagos, células de Langerhans e monócitos. Uma vez no interior da célula, o protozoário reprograma sua expressão gênica, expressando genes que o fazem mudar de forma, transformando-se em amastigota (HOMMEL, 1999). Por sua vez, o ciclo é mantido quando os vetores, no repasto sanguíneo, picam um hospedeiro vertebrado infectado, adquirindo assim os protozoários na forma amastigota. Esses se depositam no intestino médio do inseto, onde se multiplicam e se transformam na forma pró-cíclica. Nesta fase, o intestino médio do inseto é revestido pela membrana peritrófica, necessária ao amadurecimento do parasita. Finalmente, na parte anterior do aparelho digestório do vetor, os parasitas.

(12) 10. amadurecem até a fase infectiva, promastigota metacíclica, adquirindo flagelo e forma alongada, aptos a infectar novos indivíduos durante um novo repasto sanguíneo (HOMMEL, 1999).. 1.2 Características clínicas da leishmaniose visceral humana e canina. A Leishmania infantum é o agente causal da leishmaniose visceral (LV) ou calazar no Brasil. Esse patógeno é considerado de comportamento oportunista, com curso da infecção bastante variável, incluindo a forma clássica, intermediária e assintomática. A LV humana é caracterizada por febre, anemia, esplenomegalia, emagrecimento, linfoadenopatia, hipergamaglobulinemia e astenia. A hepatoesplenomegalia e pancitopenia são provenientes da proliferação da Leishmania em macrófagos do fígado, baço e medula óssea (MCGWIRE; SATOSKAR, 2014). Há aumento de IgG e IgM no soro, devido à expansão policlonal de células B. No entanto, esses anticorpos não são protetores e parecem estar envolvidos com a patogênese (MILES et al., 2005). É vista uma clara depressão de imunidade celular, Leishmania específica, durante a doença. Por isso pacientes desenvolvem pancitopenia e tornam-se propensos a infecções secundárias (CHOI; LERNER, 2001). As formas intermediárias ou oligossintomáticas da doença são caracterizadas por no mínimo uma manifestação clínica, tais como linfoadenopatia ou sintomas brandos: febre, tosse, diarreia, mal-estar, hepatomegalia leve e, eventualmente, esplenomegalia (BADARO et al., 1986). No cão, o espectro clínico da leishmaniose visceral é também bastante variável. Cães infectados podem ter a forma sintomática, podem permanecer assintomáticos, ou também desenvolvem um ou mais sintomas leves e são classificados como oligossintomáticos. O espectro clínico de cães sintomáticos inclui: linfoadenopatia, anemia, diarreia, alopecia, dermatite, onicogrifose, perda de peso, caquexia, problemas de locomoção, conjuntivite e epistaxe (CIARAMELLA et al., 1997). De forma análoga ao que ocorre em humanos, a LV em cães tem sido associada com disfunções imunológicas envolvendo linfócitos T. Essas alterações incluem ausência de resposta DTH positiva frente à antígenos de Leishmania (PINELLI et al., 1994) e diminuição de linfócitos T no sangue periférico (DE LUNA et al., 1999)..

(13) 11. 1.3 Tratamento da leishmaniose visceral humana A droga de primeira escolha no tratamento da leishmaniose visceral humana é o antimônio pentavalente, introduzido no Brasil na década de 40. No Brasil, a única formulação disponível é o antimoniato N-metil glucamina. conhecido como Glucantime, o qual é distribuído pelo Ministério da Saúde. Recomenda-se o uso do fármaco por via endovenosa ou intramuscular, por 30 dias, na dose de 20mg/kg ao dia. Os principais efeitos colaterais se relacionam ao sistema cardiovascular e se refletem na forma de distúrbios de repolarização. Nos casos de resposta insatisfatória ao uso desse medicamento, é utilizada a anfotericina B, a droga leishmanicida de maior eficácia disponível no mercado (RIBEIRO et al., 2013). Em algumas regiões da Índia e Sudão, tem sido cada vez mais frequente a resistência aos antimoniais, adotando-se a Anfotericina B como esquema principal. O único composto oral com conhecida eficácia frente a Leishmania é a miltefosina (MONGE-MAILLO; LÓPEZ-VÉLEZ, 2015). Os principais efeitos colaterais da droga incluem distúrbios gastrointestinais, mas os sintomas são transitórios ou reversíveis. No entanto, o principal efeito colateral relatado é teratogenicidade (SUNDAR; OLLIARO, 2007). O uso cuidadoso desta droga deve ser obrigatório, uma vez que há relatos de resistência e esta pode ser facilmente induzida em experimentos in vitro (PÉREZ-VICTORIA et al., 2003). No Brasil, o uso desta droga se tornou permitido apenas no tratamento canino a partir do ano de 2016. O uso da droga para tratamento de casos humanos não é recomendado pelo Ministério da Saúde, não sendo permitido pela ANVISA. 1.4 Epidemiologia e Urbanização da Leishmaniose visceral. A leishmaniose visceral é uma doença que afeta principalmente as classes sociais mais pobres de países subdesenvolvidos (WHO, 2010). A cada ano, são estimados 300.000 novos casos da doença no mundo, com mais de 20.000 mortes e 310 milhões de pessoas em situação de risco de infecção. Países como Índia, Sudão, Sudão do Sul, Etiópia, Bangladesh e Brasil são responsáveis por 90% dos casos de doença (“WHO | Leishmaniasis,” 2012.).

(14) 12. No Brasil, foram registrados 3.253 casos de LV no ano de 2013, sendo 64 destes no Estado do Rio Grande do Norte (SINAN/SVS/Ministério da Saúde 2014). No período de 2007 a 2011, foram notificados 474 casos humanos da doença no estado, com média de 94,8 casos por ano. A incidência média no período foi de 3,02 casos/100.000 habitantes (BARBOSA, 2013). Até a década de 1980, a doença se caracterizava pela predominância na zona rural. No, entanto, teve início então a urbanização da LV, com a ocorrência de surtos em cidades maiores, como Natal, por exemplo (JERONIMO et al., 1994). A urbanização da doença coincidiu com as grandes migrações populacionais provenientes de áreas rurais para áreas urbanas, com a ocupação desenfreada das periferias das grandes cidades e presença do reservatório e do vetor nesses locais. Com o processo de disseminação por todo território brasileiro, a região nordeste do país, a qual concentrava 90% dos casos notificados, passou a notificar 77% destes. Sendo assim, a LV passa por um processo de diminuição de seu espaço natural, favorecendo o aparecimento de surtos (WERNECK, 2008). Com a epidemia global do HIV, observou-se um aumento do número de casos de LV, especialmente no Brasil, Índia e Europa, continente este, que até então possuía poucos casos da doença. A maioria dos casos de coinfecção foram encontrados em países do Mediterrâneo, particularmente na Espanha. A partir do início de 1990, até 60 % dos casos de leishmaniose visceral ocorreram em indivíduos infectados pelo HIV. Dada sua condição oportunista, a infecção pelo vírus favorece a desfechos clínicos mais severos da LV. No RN, os casos de coinfecção costumam ser mais comuns em homens adultos, ao contrário dos casos de LV sem coinfecção, os quais aparentam ser mais comuns em crianças e adolescentes (NASCIMENTO et al., 2011). A leishmaniose visceral canina está presente em cerca de 50 países, principalmente na América do Sul, na região do Mediterrâneo e África (DANTASTORRES et al., 2012). Vários estudos têm revelado o surgimento da infecção canina em novos locais, como os Estados Unidos e Canadá (DUPREY et al., 2006; FREEMAN et al., 2010). No entanto, a infecção na América do Norte parece ser difundida em cães caçadores de raposas, cujas fêmeas inicialmente foram infectadas na Europa. A transmissão na América do Norte é vertical, aparentemente não há participação do vetor (DUPREY et al., 2006)..

(15) 13. No Brasil, a doença canina também se mostrava restrita as áreas rurais até a década de 1980. A urbanização da LV humana coincidiu com a urbanização da doença canina, visto que estes reservatórios acompanharam os indivíduos nas migrações populacionais (BARRETO et al., 2011). Cidades do nordeste brasileiro demonstram altas taxas de soroprevalência canina, tanto em cães errantes, como em cães domiciliados (BARBOSA; CARLOTA; DE ANDRADENETO, 2015; RONDON et al., 2008).. 1.5 Controle da leishmaniose visceral no Brasil. No Brasil, o controle da leishmaniose visceral humana e canina é focado principalmente no combate ao vetor e eliminação de reservatórios, medida indicada pelo Ministério da Saúde. Até o momento, o Brasil é o único país a realizar a retirada sistemática de cães positivos das residências, com posterior eutanásia. No entanto, as taxas de infecção canina crescem continuamente (ROMERO; BOELAERT, 2010). A ocorrência de casos de doença humana reflete na busca ativa de reservatórios infectados na região de domicílio destes casos. No entanto, esta não parece ser uma medida de efetivo controle, pois o que se observa é a lentidão da retirada dos cães infectados da área de transmissão, favorecendo a manutenção do ciclo. Além disso, não se conhece, no Brasil, o papel de humanos sintomáticos e assintomáticos no processo de transmissão do parasita à vetores (QUINNELL; COURTENAY, 2009). Na Índia, no entanto, humanos sintomáticos e assintomáticos desempenham papel importante na manutenção de transmissão da leishmaniose, já que a Leishmania donovani, espécie que causa a leishmaniose nesse país, é frequentemente encontrada no sangue de indivíduos infectados, possibilitando a transmissão ao vetor (DAS et al., 2014). Dessa forma, neste país, o cão não é considerado um reservatório importante na manutenção do ciclo do parasita. Medidas alternativas de controle da doença incluem: vacinação dos reservatórios, tratamento de cães infectados, utilização de inseticidas tópicos, além do uso de coleiras impregnadas com inseticidas (WERNECK, 2014). Os estudos da adoção de vacinas em larga escala são ainda experimentais, e esta medida não é adotada pelo Ministério da Saúde. Uma das dificuldades da implantação. de. vacinas. é. a. distinção. entre. cães. vacinados,. que.

(16) 14. soroconverteram, e cães assintomáticos naturalmente infectados. Desta forma, a busca de reservatórios infectados seria dificultada. Portanto, a implantação desta medida é ainda um desafio, necessitando de maiores evidências de sua eficácia (KAYE; AEBISCHER, 2011). Alguns estudos avaliam a efetividade do tratamento de cães infectados, na tentativa de prolongar a sobrevivência destes. No entanto, é visto que a cura sintomática existe, mas não é comprovada a cura estéril, ou seja, parasitas poderiam. permanecer. no. reservatório,. possivelmente. ocasionando. a. transmissão para vetores (MANNA et al., 2008). Devido à ausência de cura estéril, o tratamento deveria ser periódico e continuado, o que poderia levar ao aumento da taxa de resistência à droga utilizada no esquema terapêutico (WHO, 2010). No Brasil, o tratamento de cães com Miltefosine foi liberado pelo Ministério da Saúde a partir do ano de 2016. Outros trabalhos, no entanto, verificam a eficácia do uso de inseticidas, no intuito de diminuir a taxa vetorial. Tais estudos utilizam tanto a dispersão, impregnação na pele de animais e uso de coleiras impregnadas (DAVID et al., 2001; KILLICK-KENDRICK et al., 1997a; REITHINGER et al., 2004). No passado, o inseticida de escolha inicial foi o DDT (Dicloro Difenil Tricloro Etano), porém este se mostrou ineficiente, devido a não aplicação na estação correta, permitindo que seu efeito residual aja no momento de maior taxa vetorial, bem como na sua ineficácia em alcançar os locais de reprodução do vetor (ALEXANDER; MAROLI, 2003; TEODORO et al., 1998). Com o passar dos anos, as técnicas de uso de inseticidas evoluíram, o que permitiu o surgimento das coleiras impregnadas. Essas passaram a ser utilizadas com drogas mais modernas e menos tóxicas, com os piretróides sintéticos (ROGAN; CHEN, 2005). Em estudo controlado, onde os cães foram expostos a flebotomíneo em tempos determinados, com posterior verificação de fêmeas do inseto alimentadas, foi observado um drástico efeito ‘anti-feeding’, com 100% de redução de repasto sanguíneo após dois meses de uso de coleira (DAVID et al., 2001). Alguns estudos mostram redução da taxa de infecção em áreas com cães encoleirados (REITHINGER et al., 2004), bem como um curso clínico mais brando. Isso poderia acontecer devido ao menor número de inóculos injetados pelo vetor, levando a uma menor carga parasitária no momento do repasto.

(17) 15. sanguíneo (FOGLIA MANZILLO et al., 2006a). Estudos em áreas endêmicas encontram algumas dificuldades, como perda das coleiras, morte dos cães por diversos motivos além da leishmaniose visceral, como também a saída dos cães para outros domicílios, com inserção de novos animais nas residências (FOGLIA MANZILLO et al., 2006a). Observa-se, portanto, que existem grandes limitações no controle da leishmaniose visceral no Brasil, uma vez que não há vigilância continuada da doença, já que esta apenas tem início quando da ocorrência de doença em humanos. A ausência de vigilância permanente favorece o aumento das taxas de infecção em cães, e além disso, existe uma defasagem temporal entre a infecção e a doença canina, que leva a uma lentidão da retirada de reservatórios infectados, favorecendo a manutenção do ciclo da doença. 1.6 Imunologia da leishmaniose visceral. Durante a infecção de células da linhagem fagocítica mononuclear, a Leishmania faz com que uma resposta imunológica seja elicitada, uma vez que estas células fazem parte do grupo de apresentadoras de antígenos. Desta forma, linfócitos T são ativados via receptores TCR, e após ativação, há produção de citocinas características de dois padrões distintos. Indivíduos os quais derivam um perfil de citocinas Th2, com produção de IL-4, são mais susceptíveis ao desenvolvimento de doença, enquanto aqueles que possuem um perfil de citocinas Th1, mais inflamatório, com produção de IL-1 e IL-6, são mais resistentes ao desenvolvimento de sintomas (SACKS; NOBEN-TRAUTH, 2002). As citocinas inflamatórias favorecem a ativação de macrófagos, para que haja liberação de espécies reativas de oxigênio no interior do fagócito, levando à eliminação do parasita, e possível formação de granuloma, uma organização tecidual responsável por conter a infecção e a liberação do parasita no organismo (KAYE; AEBISCHER, 2011). Embora a LV seja caracterizada por hipergamaglobulinemia, e a opsonização do parasita possa favorecer sua fagocitose num primeiro momento da infecção, demonstra-se que a presença de anticorpos pode favorecer a infecção (BUXBAUM, 2013), através da indução da produção de IL-10 por macrófagos (MILES et al., 2005)..

(18) 16. 1.7 Diagnóstico da leishmaniose visceral. O método padrão ouro para o diagnóstico de LV humana é a identificação de amastigotas em tecido ou de promastigotas em cultura de aspirado de medula óssea (ZIJLSTRA, 1992). Apesar de ser um método de alta sensibilidade, é uma medida invasiva, que possui alguns riscos e necessita de profissional especializado para sua realização. Algumas medidas auxiliares de diagnóstico são utilizadas, as quais são menos invasivas e podem ser utilizadas conjuntamente com a clínica do paciente. Dentre estas medidas, inclui-se a investigação de anticorpos antiLeishmania. Para tal, são utilizadas as técnicas de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ou Imunofluorescência indireta, na pesquisa de anticorpos anti-SLA (soluble Leishmania antigen) ou anticorpos que tenham reatividade frente à proteínas recombinantes, como rk39 (BRAZ et al., 2002). O diagnóstico da leishmaniose visceral canina é complexo devido a sintomatologia não específica e a presença de coinfecções. No Brasil, são utilizados testes rápidos de imunocromatografia como forma de triagem, os quais se baseiam na reatividade de anticorpos presentes no soro do cão infectado frente às proteínas recombinante rk28 e rk39. Como teste confirmatório, após teste de triagem positivo, utiliza-se a técnica de ELISA (FRAGA et al., 2016).. 1.8. O vetor da Leishmania infantum. O principal vetor da Leishmania infantum no Brasil é a Lutzomyia longipalpis, popularmente conhecida como mosquito palha ou flebotomíneo. A Lutzomyia cruzi também é um vetor da L. infantum, porém existe apenas no Mato Grosso do Sul. A espécie L. Longipalpis é amplamente distribuída pelo país (BAUZER et al., 2007). São insetos pequenos, medindo de 1 a 3 mm, de cor amarelada e possuem cerdas por todo o corpo. São reconhecidos por seu hábito de não voar alto, locomovendo-se por pequenos saltos e pousando com as asas entreabertas na posição vertical (SOARES; TURCO, 2003). A urbanização da leishmaniose visceral no Brasil coincidiu com a adaptação do vetor, saindo das matas às áreas urbanas, o que favoreceu ainda mais o aparecimento de surtos no final da década de 80 e anos 90. Atualmente,.

(19) 17. os insetos podem ser encontrados tanto em áreas rurais, como no peridomícilio (chiqueiros, galinheiros, canis) e no intradomicílio (HARHAY et al., 2011). Para seu desenvolvimento, especialmente na fase larval, necessitam de matéria orgânica e ambientes com pouca luz. As fêmeas necessitam de sangue para amadurecimento dos ovos. Dessa forma, em áreas urbanas, o ambiente mais favorável ao desenvolvimento do inseto são locais com pouca higiene e com criação de animais, como galinhas e porcos (RANGEL; VILELA, 2008). O flebotomíneo possui hábito crepuscular, logo, durante o dia, permanecem escondidos, protegidos da luz, do vento e de predadores naturais (RANGEL; VILELA, 2008). Relaciona-se o aumento da taxa vetorial ao período pós estação chuvosa, quando ocorre também o aumento do número de casos de LV (XIMENES et al., 2000).. 1.9 A saliva do vetor é um fator influenciador da infecção. No momento do repasto sanguíneo, a probóscida do flebotomíneo provoca uma pequena lesão na pele do hospedeiro. Por não possuir aparelho bucal longo e capaz de canalizar os vasos, os flebotomíneo danificam o tecido, formando uma pequena bolsa de sangue, de onde se alimentam. Neste momento, além de realizar o repasto, o flebotomíneo deposita sua saliva no tecido do hospedeiro. Os componentes presentes na saliva do vetor incluem principalmente peptídeos, pequenos nucleosídeos e ácidos nucléicos (RIBEIRO et al., 1999). Essa lesão é capaz de disparar o sistema de coagulação para que a pequena hemorragia cesse. No entanto, a saliva do flebotomíneo possui fatores anticoagulantes, que impedem o início da cascata, fazendo com que o sangue seja fluido para o repasto (RIBEIRO; FRANCISCHETTI, 2003). Os primeiros estudos demonstraram que a saliva do vetor possuía vasodilatadores, devido a presença de uma apirase, que atua degradando ADP, um agonista da agregação plaquetária. Sendo, portanto, um inibidor da coagulação sanguínea (CHARLAB et al., 1999), e da via clássica do complemento (CAVALCANTE; PEREIRA; GONTIJO, 2003)..

(20) 18. Além de funções hemostáticas, também se relatam atividades imunomodulatórias na saliva do vetor. Primeiramente, descreveu-se a ação inibitória da saliva de L. longipalpis sobre linfócitos T e macrófagos, por meio da indução da produção de citocinas do padrão Th2, e bloqueio da produção de citocinas do padrão Th1, conhecido como um padrão mais inflamatório (HALL; TITUS, 1995). Outros estudos mostraram o mesmo padrão de imunoregulação presente na saliva de Phlebotomus papatasi, observando-se a proliferação de células mononucleares do sangue periférico após estimulação com a saliva do vetor, bem como produção de IL-10 por linfócitos CD8+, sem aumento da produção de IFN-ɣ (ABDELADHIM et al., 2011). São necessários maiores estudos que visem identificar quais as proteínas salivares capazes de inibir ativação de células T e o mecanismo dessa inibição. Fagócitos também podem ter ação inibida na presença da saliva de flebotomíneos, a exemplo das células dendríticas. Foi demonstrado que a saliva de Phlebotomus duboscqi e P. papatasi pode diminuir a capacidade desta célula de apresentar antígenos, em modelo experimental de artrite induzida por colágeno, em que a presença de saliva reduziu as lesões articulares e a liberação de citocinas pró inflamatórias. Isto demonstra um potencial papel terapêutico frente à doenças autoimunes (CARREGARO et al., 2011). Neutrófilos representam a primeira linha de defesa frente a uma infecção, já que rapidamente chegam ao sítio afetado, e também podem ter atividade inibida na presença da saliva de vetores. Foi visto que a saliva de L. longipalpis pode induzir a apoptose de neutrófilos, em um mecanismo mediado por Fas e caspases, em modelo in vitro de neutrófilos peritoneais murinos. Além disso, na presença de L infantum e saliva, foi demonstrada liberação aumentada de prostaglandina 2, bem como diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio, viabilizando a permanência do parasita no interior da célula, levando ao aumento de carga parasitária (PRATES et al., 2011). Diversos estudos, no entanto, vêm demonstrando que a exposição frequente a antígenos da saliva de flebotomíneos pode conferir um efeito protetor ao hospedeiro quando da infecção por Leishmania. As primeiras evidências dessa hipótese surgiram quando foi demonstrado que a exposição prévia a saliva de P. papatasi por imunização, ou a picada do mesmo vetor não infectado, protegeram os animais da infecção grave por L. major, tanto na infecção artificial,.

(21) 19. como na exposição à picadas (BELKAID et al., 1998; KAMHAWI et al., 2000). Esse efeito protetor em relação ao desenvolvimento de doença vem sendo relacionado a neutralização do ‘efeito de exacerbação’, o qual é denominado como sendo o aumento de doença e permanência do parasita nas células, que foi demonstrado em alguns trabalhos (ABDELADHIM et al., 2011; CARREGARO et al., 2011; PRATES et al., 2011); ou ainda, a indução de uma resposta imune celular, caracterizada por formação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH), com predominância do padrão linfocitário Th1, o qual é relacionado à menor carga parasitária e prevenção de doença, e produção de IFN-γ no local da picada. (KAMHAWI et al., 2000). Estes resultados têm implicações importantes para a epidemiologia da leishmaniose e sugerem uma estratégia de vacinação contra esta e possivelmente outras doenças transmitidas por vetores. Mamíferos tem a capacidade de produzir anticorpos anti-saliva de vetores (BARRAL et al., 2000). Desta forma, tais imunoglobulinas podem ser utilizadas como marcadores de exposição ao vetor. A determinação de anticorpos antisaliva era realizada com antígenos obtidos das glândulas salivares dos insetos, com posterior utilização do homogenato de glândulas salivares (SGH). Trabalho este bastante laborioso, levando a não utilização do homogenato em larga escala. Com o advento da genômica e transcriptômica, foi possibilitada a produção de novas proteínas, recombinantes, as quais poderiam ser utilizadas como marcadores de exposição, e produzidas em maior escala. Foi demonstrado que a proteína recombinante LJM17 é reconhecida por humanos, cães e raposas, e LJM11 é reconhecida pelo soro de cães e humanos. Além disso, foi visto que essas duas proteínas são reconhecidas especificamente pelo soro de humanos expostos a L. longipalpis, e não a L. intermedia, diminuindo o risco de reação cruzada, sendo portanto, os melhores marcadores para utilização na América Latina (TEIXEIRA et al., 2010). As medidas de controle da leishmaniose visceral não têm sido efetivas, e atualmente focam na eutanásia de cães infectados. Há de se buscar, então, novas estratégias de controle, as quais levem em conta o ciclo biológico do parasita e utilizem novos marcadores de exposição. Uma dessas alternativas é a utilização de coleiras impregnadas com deltametrina em cães residentes em área endêmica para leishmaniose visceral. Nesse contexto, os anticorpos antisaliva de flebotomíneo podem ser utilizados como marcadores de exposição.

(22) 20. vetorial, para avaliação da efetividade das novas medidas de controle da doença. Portanto, o trabalho tem como finalidade avaliar a presença de marcadores de exposição ao vetor em cães e humanos após adoção de coleiras impregnadas por deltametrina em cães residentes em uma área endêmica para LV..

(23) 21. 2. Objetivos 2.1 Objetivo geral: Avaliar a influência da utilização de coleiras impregnadas com deltametrina na taxa de exposição vetorial de flebotomíneo em humanos e cães residentes em área endêmica. 2.2 Objetivos específicos: 1. Comparar as taxas de positividade para anticorpos anti-SGH e LJM11/LJM17 em humanos; 2. Comparar os níveis de anticorpos anti-SGH em cães no momento da intervenção, após seis meses e após um ano nas áreas de intervenção e controle; 3. Avaliar as taxas de soroconversão para infecção por Leishmania em cães após seis meses e um ano de intervenção; 4. Comparar os níveis de anticorpos anti-SGH e anti-LJM11/LJM17 em homens e mulheres..

(24) 22. 3. Metodologia. 3.1 Área de estudo O estudo ocorreu em dois bairros da Zona Norte da cidade do Natal, escolhidas devido a suas elevadas taxas de LV canina e humana nos anos anteriores. As áreas selecionadas foram os bairros de Nossa Senhora da Apresentação (Loteamento Boa Esperança) e Lagoa Azul (Loteamento Jardim Progresso), localizados na zona norte da cidade do Natal. As duas áreas são contíguas, sendo divididas apenas uma linha férrea urbana (Figura 1).. IControle Jardim Progresso. Intervenção. Boa Esperança. Figura 1: Mapa da área de estudo. 3.2 Desenho de estudo. Este é um estudo aninhado, contido em um estudo longitudinal com um total de 4 amostragens (Coutinho, et al., Manuscrito em preparação). Teve como base a intervenção e foi projetado para analisar a exposição a flebotomíneos após do uso de coleiras (Scalibor®) impregnadas com deltametrina por cães da região selecionada. Para isso, foram determinados os níveis de anticorpos anti-saliva do vetor. Foram incluídos cães e indivíduos residentes em duas áreas endêmicas para leishmaniose visceral, na cidade do Natal. Nos cães domiciliados da área de intervenção (Boa Esperança) foram colocadas coleiras impregnadas com deltametrina no momento do recrutamento, enquanto a área de Jardim.

(25) 23. Progresso foi considerada como controle e os cães domiciliados não receberam o dispositivo. No momento do recrutamento, os cães das duas áreas tiveram sangue coletado para determinar se havia infecção por Leishmania, através de visitas dos agentes de endemias do Centro de Controle de Zoonoses da cidade do Natal. O sangue destes animais foi colhido no momento do recrutamento (Tempo 1: T1) e a cada seis meses, totalizando 3 coletas (Figura 2). A cada nova coleta, as coleiras foram substituídas por novas, devido ao tempo de validade. Para determinação da infecção por Leishmania, foi utilizado teste rápido (DPP), como método de triagem. Dos cães. positivos nesse teste, foi realizado teste. confirmatório para detecção de anticorpos anti-SLA. Os cães com infecção confirmada foram retirados da área e eutanasiados. Do total de cães negativos para a infecção por Leishmania, um subgrupo foi selecionado para realização da sorologia anti-saliva de flebotomíneo (anti-homogenato de glândula salivar: SGH), para cães das duas áreas, em cada uma das coletas. Na área de intervenção foram incluídos 23 cães, seguidos nas 3 coletas, de um total de 1250 encoleirados, enquanto que na área controle foram 58, seguidos nas 3 coletas, de um total de 1536 incluídos no projeto (Figura 3). Na área controle, a coleta de sangue canino teve início 4 meses após a intervenção (Figura 2). Pessoas que residem na área de intervenção e na área controle foram incluídas neste estudo, através de visitas às suas residências. O sangue de indivíduos da área a qual sofreu intervenção foi colhido 3 meses após esta. Enquanto na área controle, foi colhido 5 meses após a intervenção, sendo uma única coleta (Figura 2). No momento do recrutamento humano, um questionário socioeconômico foi aplicado, e foram colhidos 8 ml de sangue. As amostras de soros foram congeladas a -20 ° C até posterior utilização. Todos os voluntários assinaram termo de consentimento livre e esclarecido. Para a determinação da sorologia anti-saliva de flebotomíneo (anti-SGH e anti-LJM11/17) e anti-SLA, um número de 247 do total de 1.127 indivíduos da área de intervenção arrolados no estudo foram incluídos, enquanto na área controle estes foram 251 do total de 447 pessoas incluídas (Figura 4)..

(26) 24. Figura 2: Cronologia do estudo. Figura 3: Fluxograma do desenho de estudo canino.

(27) 25. Figura 4: Fluxograma do desenho de estudo humano. 3.3. Determinação da infecção por L. infantum. A detecção de anticorpos IgG anti-leishmania no soro foi realizada por ELISA, utilizando a fração solúvel de antígenos de promastigotas (SLA) obtido de um isolado de medula óssea de um paciente oriundo de Natal, (Cepa IOC 341), seguindo o protocolo previamente publicado (BRAZ et al., 2002). A densidade óptica foi lida a 405nm (Titerteck Instruments, Inc., Huntsville, AL, EUA), com estabelecimento de um ponto de corte, que corresponde à média das absorbâncias dos soros controles negativos na diluição 1:500 mais três desvios padrões para SLA.. 3.4 Determinação da exposição a antígenos de saliva de flebotomíneo por ELISA. A detecção de anticorpos IgG anti-SGH e anti-LJM11/17, foi realizada por ELISA. Placas Immunlo®4xHB de 96 poços foram sensibilizadas com 50µL do antígeno por poço, diluído a 1µg/mL em tampão com pH 9,6 e.

(28) 26. incubadas overnight a 4ºC. Foi realizado, então, o bloqueio de antígenos inespecíficos, com 200µL TBS/BSA a 4% por 1 hora a temperatura ambiente. Secou-se a placa, e então, foi adicionado o soro diluído a 1:100 em TBS/BSA 4%, e incubado por 1 hora a temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes com TBS 0,05% Tween, e então foram adicionados os anticorpos secundários, conjugados com fosfatase alcalina, diluídos em 1:10000 de TBS/BSA 4%, e incubou-se por 1 hora a temperatura ambiente. Os poços foram novamente lavados com TBS 0,05% Tween em 3 vezes, e adicionou-se 50µL por poço do revelador, p-nytrophenil fosfato (Sigma®). A densidade óptica foi lida a 405 nm. Os antígenos foram caracterizados e cedidos pelo laboratório do Dr Jesus Valenzuela (NIH, USA).. 3.5 Análise estatística. Os gráficos e a análise estatística foram realizados através do programa Graphpad Prism 5®, com utilização de Teste T para comparações de média com distribuições normais e Mann-Whitney para comparações de médias com distribuições não normais.. 3.6 Aprovação ética. O protocolo para os estudos de cães expostos a Leishmania infantum foi revisto e aprovado pela Comissão de Ética para o uso de animais em pesquisa (CEUA N.º 062/2014). O estudo em humanos foi revisto pelo Comitê de ética da Universidade Federal do Rio Grande Norte (CAAE 37529814.1.0000.5537). Todos os indivíduos ou seu responsável legal assinaram os formulários de consentimento..

(29) 27. 4. Resultados. 4.1 Caracterização da área de estudo. 4.1.1 Caracterização ambiental Quanto às características ambientais, as áreas estudadas apresentaram características distintas. A área de intervenção apresentou um menor índice de depósito de lixo à céu aberto (46,1%), em relação à área controle (60,1%) (p<0,001). No que diz respeito à presença de vegetação no imóvel, a área Controle apresentou maior índice em relação à área de intervenção (86.7% versus 60.8%), com p valor < 0,001. A área controle também apresentou maiores índices de árvores frutíferas no imóvel (80.8% versus 40.6%), p<0.001. A área de Intervenção possui maior existência de fossa em seus domicílios, tanto para água da pia (38.6%), como para água do banheiro (77.7%), em relação a área controle (15.4% e 54.6%, respectivamente), p<0.001. Em relação à presença de outros animais, residências da área Controle apresentam maior número de galinhas (35%) do que residências da área de intervenção (22%). Descrição ambiental das populações de estudo. Presença de lixo a céu aberto. Presença de vegetação. Presença de galinhas. Controle. Intervenção. (n = 1563). (n = 1282). 60,1 %. 40,1%. (n = 1549). (n = 1246). 86,7%. 60,8%. (n = 1663). (n = 1282). 35,1%. 22%. Tabela 1: Descrição das condições ambientais das áreas de intervenção e controle. p p<0,001. p<0.001. p<0.001.

(30) 28. 4.1.2 Caracterização da população humana As populações estudadas apresentam características demográficas de idade e sexo semelhantes. A idade média dos indivíduos é 35,9 ± 19,9, e 64% dos entrevistados são do sexo feminino. O mesmo não ocorre com o nível de escolaridade, o qual apresenta diferença significativa, em que a população da área de intervenção possui um maior nível (p < 0,001) (Tabela 1). Níveis de escolaridades nas populações de estudo. Nível de escolaridade. Área Controle Intervenção n = 1542 n = 1263. Não Alfabetizado. 7.9%. 3.9%. 1a a 4a série incompleta. 18.5%. 10.5%. 4a série completa. 5.1%. 5.4%. 33.4%. 26.4%. 3.5%. 8.3%. 9.6%. 12.9%. 18.7%. 26.4%. 0.8%. 2.2%. 1.3%. 2.5%. 5a. a 8a. série incompleta Ensino fundamental completo Ensino médio incompleto Ensino médio completo Ensino superior incompleto Ensino superior completo. Tabela 1: Distribuição de frequências dos níveis de escolaridade das populações de estudo. 4.1.3 Caracterização da população canina Os cães das duas áreas de estudo não apresentam diferença significativa da distribuição de frequências entre machos e fêmeas (p=0.079). Quanto ao comprimento do pelo, cães da área de intervenção apresentam maior frequência de pelo longo (10.1%), em relação a área controle (6.2%), p=0.01. Quanto ao porte, a área de intervenção possui cães com menor porte (30.1%) em relação a área controle (19.7%), p<0.001..

(31) 29. 4.2 Níveis de anticorpos anti-SGH em cães: Área de intervenção. Em relação aos níveis de anticorpos anti-SGH em cães na área de intervenção, não foram observadas diferenças significativas quando comparadas as três coletas (p = 0,15). Durante a primeira coleta canina (Tempo 1), momento em que se iniciou o uso das coleiras impregnadas, cães da área de intervenção demonstraram média dos níveis de anticorpos anti-SGH de 0,048 (Figura 5). No Tempo 1, 47% dos cães da área de intervenção possuíam valores dos níveis de anticorpos anti-SGH acima do cutoff, tendo um resultado qualitativo positivo. No momento da segunda coleta canina (Tempo 2), 6 meses após o uso de coleira impregnada, observa-se um valor médio de densidade óptica de 0,054 (Figura 5). Neste momento, 56% dos cães mostraram valores positivos. Já no momento da terceira coleta canina (Tempo 3), 1 ano após o uso de coleira impregnada, observa-se um valor médio de densidade óptica de 0,098 (Figura 5). Neste momento, 73% dos cães mostraram valores positivos.. Figura 5: Comparação entre os níveis de anticorpos anti-SGH das primeira, segunda e terceira coleta canina na área de intervenção.

(32) 30. 4.3 Níveis de anticorpos anti-SGH em cães: Área Controle. Em relação aos níveis de anticorpos anti-SGH em cães na área controle, não foram observadas diferenças significativas quando comparadas as três coletas (P<0.0001). Durante a primeira coleta canina, cães da área controle demonstraram média dos níveis de anticorpos anti-SGH de 0,2 (Figura 6). No Tempo 1, 43% dos cães da área de intervenção possuíam valores dos níveis de anticorpos anti-SGH acima do cutoff, tendo um resultado qualitativo positivo. No momento da segunda coleta canina (Tempo 2), 6 meses após o uso de coleira impregnada, observa-se um valor médio de densidade óptica de 0,058. (Figura 6). Neste momento, 91% dos cães mostraram valores positivos. Já no momento da terceira coleta canina (Tempo 3), 1 ano após o uso de coleira impregnada, observa-se um valor médio de densidade óptica de 0,092. (Figura 6). Neste momento, 91% dos cães mostraram valores positivos (Figura 6).. Figura 6: Comparação entre os níveis de anticorpos anti-SGH das primeira, segunda e terceira coleta canina na área controle.

(33) 31. 4.4 Soroconversão de anticorpos anti-SLA em cães após 6 meses e 1 ano. Na área controle, para determinação dos níveis de anticorpos antiSGH, foram selecionados cães que fossem negativos para infecção por Leishmania na primeira coleta. Do total de 58 cães da área controle, nenhum deles se tornou positivo para infecção por Leishmania 6 meses após. No entanto, após 1 ano da primeira coleta, na 3ª coleta, 5 cães (8,6%) se tornaram positivos. Já na área de intervenção, dos 23 cães que puderam ser seguidos na segunda coleta, nenhum soroconverteu para infecção por Leishmania após 6 meses.. 4.5 Níveis de anticorpos anti-SGH em humanos quanto a área de estudo, após intervenção. Indivíduos residentes no bairro que sofreu intervenção do uso de coleira canina, demonstraram menores títulos de anticorpos (média=0.075 ± 0,048), quando comparados aos indivíduos do grupo controle (média =0.10 ± 0,079) residentes no bairro o qual não sofreu intervenção (p<0,0001) (Figura 8). Na área que sofreu intervenção, 68,8% dos indivíduos se mostram expostos ao vetor, enquanto na área a qual não sofreu intervenção, estes são 79,2%.. Figura 7: Níveis de anticorpos anti-SGH em humanos quanto a área de estudo.

(34) 32. 4.6 Níveis de anticorpos anti-LJM11/LJM17 em humanos quanto a área de estudo, após intervenção Os indivíduos da área controle se mostraram com maiores títulos de anticorpos anti-LJM11/LJM17 (média = 0,11± 0,079) em relação a área de intervenção (média = 0,093 ± 0,063) (p = 0,0002) (Figura 9). Neste momento, 88,8% dos indivíduos da área controle possuíam títulos de anticorpos antiLJM11/LJM17 acima do cutoff (0,046), sendo portanto, positivos, enquanto na área de intervenção estes eram 76,9%.. Figura 8: Níveis de anticorpos anti-LJM11/LJM17 em humanos quanto a área de estudo.

(35) 33. 4.7 Níveis de anticorpos anti-SGH quanto ao sexo Nas duas áreas estudadas, homens e mulheres se mostraram com títulos de anticorpos anti-SGH semelhantes. Na área de intervenção, obteve-se um p valor de 0,1717 (Figura 10). Já na área sem intervenção, o p valor obtido foi de 0,8071.. Figura 9: Níveis de anticorpos anti-SGH em humanos quanto ao sexo. 4.8 Níveis de anticorpos anti-LJM11/LJM17 quanto ao sexo Nas duas áreas estudadas, homens e mulheres apresentaram valores de títulos de anticorpos anti-LJM11/LJM17 semelhantes. Para a área de intervenção observa-se um p valor de 0,097 (Figura 11), enquanto na área controle observase um p valor de 0,78.. Figura 10: Níveis de anticorpos anti-LJM11/LJM17 em humanos quanto ao sexo.

(36) 34. 4.9 Correlação entre níveis de anticorpos anti-SGH e anti-LJM11/LJM17 em humanos. A correlação entre a exposição ao antígeno recombinante e o SGH em humanos se mostrou positiva e significante (Figura 12), com r = 0,5670 e p < 0,0001.. Figura 11: Correlação entre homogenato de saliva de flebotomíneo e antígeno recombinante em humanos.

(37) 35. 4.10 Níveis de anticorpos anti-SLA em humanos segundo a área de estudo, após intervenção.. Indivíduos residentes na área de intervenção demonstraram menores títulos de anticorpos anti-SLA (média = 0.045 ± 0,022), do que a área controle (média = 0.056 ± 0,034), com um p valor < 0,0001 (Figura 13). Na área de intervenção, 1 dos indivíduos (0,4%) foi caracterizado como assintomático, enquanto na área controle, estes foram 5 (2%).. Figura 12: Níveis de anticorpos anti-SLA em humanos quanto à área de estudo.

(38) 36. 5. Discussão. Nosso estudo foi o primeiro a avaliar a exposição canina e humana a antígenos de L. longipalpis após uso de coleira impregnada com inseticida. A análise dos níveis de anticorpos anti-SGH demonstrou que existe sazonalidade na exposição de cães a flebotomíneos, uma vez que cães residentes da área controle demonstraram variáveis níveis de anticorpos durante diferentes meses do ano. A variação dos níveis de anticorpos ao longo do ano pode ser ocasionada pela sazonalidade da densidade vetorial, visto que as taxas de infestação do vetor variam temporalmente. É relatado que fatores abióticos como: temperatura, velocidade dos ventos e umidade relativa do ar podem influenciar o número populacional de machos e fêmeas de L. longipalpis (XIMENES et al., 2000). As duas áreas de estudo são bastante próximas, sendo divididas por uma ferrovia urbana. Dessa forma, as condições climáticas que afetaram uma área são as mesmas que afetaram a outra área. Na área de intervenção é provável que o número amostral não tenha sido suficiente para demonstrar sazonalidade ao longo do ano. Em um estudo desenvolvido no nordeste brasileiro, no estado do Rio Grande do Norte, em uma área de transmissão da LV, foi realizada a coleta de espécimes de L. longipalpis durantes três anos, com aferição de fatores abióticos. Neste trabalho, foi confirmado que o ciclo cicardiano do vetor é preferencialmente noturno, com pico de atividade ocorrendo as 22h. Nas áreas periurbanas de Natal, os machos começam a picar os mamíferos uma hora antes das fêmeas. Além disso, machos e fêmeas de flebotomíneos apresentam diferentes padrões temporais de atividade no Rio Grande do Norte. Machos de flebotomíneos têm um padrão bimodal, com um pico no mês de maio, quando a chuva e as temperaturas mais baixas predominam, e um segundo pico em novembro, quando a precipitação é leve e as temperaturas são mais elevadas. As fêmeas apresentam apenas um único pico de atividade no mês de maio. Adicionalmente, há correlação positiva entre a densidade de fêmeas e umidade relativa do ar. A taxa de densidade de vetores aumenta na.

(39) 37. estação chuvosa, a qual tende a ser irregular e curta na maioria dos estados do nordeste do Brasil (XIMENES et al., 2000). As coletas caninas na área controle ocorreram nos meses de novembro, quando, segundo a literatura (XIMENES et al., 2000), há uma alta densidade vetorial de flebotomíneos; e no mês de junho, quando há um decréscimo da atividade do vetor em áreas periurbanas da cidade do Natal. Nessa área houve diminuição dos níveis de anticorpos anti-saliva do vetor quando comparadas a primeira e a segunda coleta, existindo também um aumento da exposição na terceira coleta, confirmando o comportamento sazonal. Verifica-se ainda, que os antígenos de interesse no estudo são comuns a machos e fêmeas do vetor, portanto, os picos de atividade nos dois gêneros do inseto podem interferir na produção de anticorpos. Diversos trabalhos (FOGLIA MANZILLO et al., 2006b; KILLICKKENDRICK et al., 1997b; REITHINGER et al., 2004) comprovam a eficácia de coleiras impregnadas com inseticidas na redução da infestação e infecção canina, inclusive por outros insetos e parasitas, através de diversas metodologias. O primeiro estudo que avaliou a eficácia da coleira impregnada utilizou-as com deltametrina e diazino, separadamente, com o objetivo de avaliar a prevenção de pulgas. Os cães foram expostos a 50 pulgas, e após 24h a coleira foi colocada, e a cada dia a infestação foi medida. Viu-se que os maiores níveis de prevenção aconteciam após 14 dias, para os dois inseticidas e se mantinham por até 150 dias naqueles que utilizaram deltametrina, enquanto que os níveis de prevenção do diazino decaíram por volta do dia 91 (FRANC; CADIERGUES, 1998). A efetividade da coleira Scalibor®, a mesma utilizada em nosso estudo, foi verificada, primariamente, em relação à sua ação carrapaticida. Foi realizado estudo controlado, com exposição intencional a duas espécies do artrópode, nos grupos que utilizou a coleira e no grupo controle. Foi verificada uma efetividade de mais de 90% em 6 meses de uso, para as duas espécies de carrapato. Um estudo de campo subsequente em que 82 cães seguiram utilizando a coleira e foram.

(40) 38. monitorizados por infestação indicou que a duração de eficácia era entre 5 e 6 meses (VAN DEN BOS; CURTIS, 2002). O primeiro estudo a sugerir a utilização de coleira impregnada com deltametrina como método de prevenção da infecção por Leishmania ocorreu em 2003, no estado de Minas Gerais. Da mesma forma que em nosso trabalho, este também selecionou duas áreas endêmicas, em que os cães foram encoleirados em uma, e não encoleirados na outra, sendo controles, num período de 5 meses. Foi observada a redução de 50% dos títulos de anticorpos anti-Leishmania nesses cães. A partir disso, foi realizado um modelo matemático, o qual demonstrou que a estratégia de encoleiramento é mais eficiente do que a atual metodologia praticada, de eutanásia. No entanto, essa eficiência é dependente da área de cobertura e da taxa de perda das coleiras. As análises de sensibilidade desse modelo indicam que o impacto de qualquer intervenção não é significativamente afetado pela biologia do vetor, mas sim pela variação da mortalidade e taxas de soroconversão (REITHINGER et al., 2004). Uma grande deficiência da distribuição de coleiras impregnadas se encontra na não cobertura total das áreas. Uma vez que a colocação do dispositivo depende da concordância e presença do proprietário do cão na residência, não foi possível a cobertura da área em sua totalidade, devido à ocorrência de recusas e domicílios fechados. Além disso, registrou-se também a perda das coleiras, devido a possíveis alergias e retirada indiscriminada pelo dono do cão, por associar doenças diversas à presença da coleira. Por fim, a maior deficiência na distribuição se encontra na presença de cães errantes, que vivem em situação de rua, e por falta do registro do domicílio, não receberam o dispositivo. No que concerne a estes cães errantes, um estudo de campo com duração de dois anos avaliou a eficiência de coleiras Scalibor® em cães vadios residentes em um canil público, em uma área altamente endêmica para leishmaniose. Além disso, também foi avaliado o desfecho clínico dos cães doentes. Foi realizada uma coorte com 120 cães, dos quais 50% foram encoleirados. Os cães da coorte foram colocados em convivência com cães infectados no mesmo canil. A taxa de perda de coleira foi 35%, enquanto aproximadamente 50% dos cães foram perdidos devido a morte.

(41) 39. ou mudança para outros locais. A taxa de proteção dos cães encoleirados foi de 72,3%. Nos cães que sofreram soroconversão para anti-SLA, o desfecho clínico dos cães encoleirados foi mais brando, permanecendo a maioria assintomáticos, enquanto que no grupo controle, a maioria apresentou sinais de doença. Uma hipótese para que isso ocorra é o menor número de picadas a que estão expostos os cães encoleirados, resultando numa menor carga parasitária e menor estímulo antigênico (FOGLIA MANZILLO et al., 2006a). Em outros países, a estratégia de encoleiramento também tem sido adotada, a exemplo da França. Os cães do exército do sudeste desse país são altamente expostos à Leishmania, e é realizado acompanhamento clínico e sorológico desde 1993. A partir de 2002, a estratégia de encoleiramento vem sendo utilizada. Considerando o período de 2002 a 2012, o risco de infecção por Leishmania diminuiu 85%, e a taxa de proteção atingiu 93,8%. Isso demonstra que a estratégia de prevenção baseada na coleira impregnada demonstrou ser altamente eficiente, como efetivamente controlou a doença. Sendo um importante fator de interesse para a saúde pública, já que reflete na redução na capacidade canina de ser reservatório (DAVOUST et al., 2013). A utilização da metodologia de análise da sorologia anti-saliva possibilita a avaliação da relação do vetor e do reservatório, não somente quando há infecção por Leishmania, como ocorre atualmente, mas também quando o vetor não está infectado. Avaliar a taxa de exposição ao vetor, e não somente ao parasita, é uma estratégia que permite prevenir futuros surtos. Nosso estudo objetivou também avaliar a exposição a antígenos de Leishmania e de flebotomíneo em indivíduos residentes nas áreas de controle e intervenção. Observaram-se níveis menores de anticorpos antiSGH em humanos da área de intervenção, visto que a coleta humana se deu 3 meses após os cães terem sido encoleirados. Seria esperado o aumento de exposição humana ao vetor após encoleiramento dos cães, pois as fêmeas de flebotomíneos buscariam fontes alternativas ao cão para repasto sanguíneo, podendo realizá-lo nos indivíduos do domicílio. No entanto, nosso estudo mostrou que o uso de coleiras pelos cães da.