MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Obtenção, caracterização e avaliação da atividade antidepressiva de extrato rico em flavonoides na forma livre e de nanopartículas poliméricas elaborados
a partir das folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa (maracujá-amarelo)
JOVELINA SAMARA FERREIRA ALVES
Natal-RN 2019
JOVELINA SAMARA FERREIRA ALVES
Obtenção, caracterização e avaliação da atividade antidepressiva de extrato rico em flavonoides na forma livre e de nanopartículas poliméricas elaborados
a partir das folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa (maracujá-amarelo)
Orientadora: Profª. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner Co-orientadores: Prof. Dr. Arnóbio Antonio da Silva Júnior Prof. Dr. Leandro De Santis Ferreira
Natal-RN 2019
ii
Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de doutorado.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS Alves, Jovelina Samara Ferreira.
Obtenção, caracterização e avaliação da atividade
antidepressiva de extrato rico em flavonoides na forma livre e de nanopartículas poliméricas elaborados a partir das folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa (maracujá-amarelo) / Jovelina Samara Ferreira Alves. - 2019.
109f.: il.
Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2019.
Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner. Coorientador: Arnóbio Antonio da Silva Júnior. Coorientador: Leandro De Santis Ferreira.
1. Passifloraceae - Tese. 2. Fitoterápico - Tese. 3. Marcador - Tese. 4. Nanotecnologia - Tese. 5. Depressão - Tese. I.
Langassner, Silvana Maria Zucolotto. II. Silva Júnior, Arnóbio Antonio da. III. Ferreira, Leandro De Santis. IV. Título. RN/UF/BS-CCS CDU 582.681.41
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde: Profa. Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
JOVELINA SAMARA FERREIRA ALVES
Obtenção, caracterização e avaliação da atividade antidepressiva de extrato rico em flavonoides na forma livre e de nanopartículas poliméricas elaborados
a partir das folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa (maracujá-amarelo)
Banca Examinadora
Presidente da Banca:
Profª. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner (UFRN)
Membros da Banca:
Prof. Dr. Ádley Antonini Neves de Lima Prof. Dr. Eduardo Pereira Azevedo Prof. Dr. Geison Modesti Costa
Profa. Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti
“Meditai se só as nações fortes podem fazer ciência, ou se é a ciência que as fazem fortes”
Oswaldo Cruz vi
Dedico este trabalho:
À minha avó Dona Carmita (In Memorian), que tanto acreditou em mim, sempre me incentivou, elogiando a minha letra quando aprendia a escrever, as primeiras receitas quando aprendia a cozinhar, as minhas conquistas acadêmicas e materiais. Sei que estás muito orgulhosa de mim Carmita. “Tem gente que tem cheiro de passarinho quando canta. De flor quando sorri.” (Ana Jácomo)
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Silvana Maria Zucolotto, por ter me recebido em seu laboratório e me apoiado ao longo desses quase 7 anos! Não foi fácil a trajetória científica até aqui, devido à minha inexperiência científica inicial, mas hoje posso dizer que valeu a pena ter trilhado esse caminho!!! Realizar mestrado e doutorado no Laboratório de Farmacognosia da UFRN permitiu que eu ampliasse minha visão em relação à pesquisa farmacêutica. Sempre lembrarei de duas características suas como pesquisadora: honestidade e ousadia. E, como pessoa: a sua humanidade com seus orientandos. Muito obrigada Profa. Silvana!
Ao meu co-orientador Prof. Leandro de Santis Ferreira, por todo auxílio científico nos experimentos de farmacocinética, toxicidade e validação de metodologias cromatográficas. Seu apoio foi fundamental para conclusão desse projeto; obrigada pela paciência e boa vontade de contribuir sempre. Sua colaboração tem um valor muito grande para o meu doutorado! Muito obrigada!
Ao meu co-orientador Prof. Arnóbio Silva-Júnior, pelo entusiasmo aceitando o desafio de unir a nanotecnologia à farmacognosia. Essa tese é um reflexo do que o senhor planta no seu grupo de pesquisa. Muito obrigada! Obrigada em especial a Dra. Alaine, pelo auxílio nos experimentos de nanopartículas de extrato e fração.
Ao Prof. Norberto Peporine Lopes por ter me recebido em seu Laboratório de Produtos Naturais na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP-Ribeirão Preto, em dois estágios do doutorado, durante 6 meses. O seu laboratório, a forma como administra tudo, priorizando as relações interpessoais e o padrão de excelência científica é um exemplo que levarei para vida. É incrível e saber que existe no Brasil um laboratório de produtos naturais que não fica atrás dos mais renomados no exterior! Em especial agradeço aos técnicos Tomaz, Jaque e Cris, aos colaboradores Dr. Rodrigo Moreira e Dr. Daniel Demarque por todo auxílio científico nos estágios.
À profa. Elaine, por ter contribuído nos experimentos de comportamento, e disponibilizado as duas alunas de iniciação científica Laise e Pamela. A colaboração de vocês foi muito importante!
Ao Prof. Josean Fechine Tavares pela realização de um estágio no Laboratório de Produtos Naturais da UFPB. Em especial ao doutorando Lucas Abreu, pela colaboração finalizando isolamento da vicenina-2.
Ao agrônomo Edson por ter disponibilizado a Fazenda Gurjaú em Coronel Ezequiel-RN para coleta das folhas do maracujá-amarelo. Obrigada pela confiança e amizade!
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq pelo suporte de bolsa de doutorado concedido. É preciso preservar a pesquisa brasileira! Agradeço a UFRN, por ter me aturado por quase 7 anos! Brincadeiras à parte, obrigada pela oportunidade de realizar o mestrado e doutorado nessa instituição, que é tão enriquecedora. A todos que me ajudaram, secretários, técnicos, bibliotecários, ao pessoal do restaurante universitário... Obrigada a todos!
Agradeço aos laboratórios da UFRN envolvidos com essa pesquisa, e em especial aos servidores presentes nesses locais. Agradeço ao técnico Luiz Ricardo pela ajuda nos materiais e a todos os colegas do Laboratório de Farmacognosia. Agradeço as técnicas Nilma e Tereza do Laboratório de Controle de Qualidade pelo auxílio. Ao pessoal do Lasid, na pessoa do Prof. Sócrates por ter contribuído com equipamentos de DLS e CLAE. Ao técnico Flávio da Farmacologia, ao técnico Ednaldo pelo auxílio nas análises de infravermelho. Um agradecimento especial ao Ivan e Anderson no estudo farmacocinético. Ao pessoal do Departamento de Física pela contribuição com nitrogênio líquido. À Engenharia de Materiais pelas análises de microscopia. Aos Biotérios CCS e DBF da UFRN, em especial à Dona Ana e a veterinária Tamires pelo suporte na experimentação animal.
Muito obrigada a todos os amigos que conquistei durante o período de pós-graduação na UFRN. A amizade de vocês nos dão suporte para enfrentar muitas dificuldades científicas, sempre um ajudando o outro! Obrigada em especial a Ivan, Bárbara, Ariane, Manoel e Jordan. Obrigada a Fernando pelo suporte no fim da escrita da tese.
Aos meus irmãos, Soraia, Gutemberg e Júnior, agradeço por todo incentivo de sempre. Pelo exemplo. Pela irmandade. Eu tenho os melhores irmãos!
Aos meus pais Antônia e Severino, pelo apoio, por terem investido em mim. O orgulho de vocês me faz ir cada vez mais longe. Espero poder recompensá-los. Muito obrigada!
E ao fim de um doutorado, apesar de não ser recomendado misturar ciência com religião, eu agradeço a Deus! Por tudo!
RESUMO
Espécies do gênero Passiflora sp. têm capacidade de produzir uma variedade de flavonoides neuroativos e antioxidantes, que podem prevenir os danos cerebrais causados por transtornos depressivos. No entanto, devido à baixa biodisponibilidade, a aplicação clínica desses ativos ainda é um desafio para a tecnologia farmacêutica. Dentro desse contexto, destaca-se a espécie Passiflora edulis fo. flavicarpa (Passifloraceae), conhecida popularmente como maracujá-amarelo. Assim, os objetivos deste trabalho são: i. desenvolver um método de obtenção de um extrato rico em flavonoides (FRE) a partir das folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa; ii. purificar e caracterizar flavonoides do extrato FRE; iii. desenvolver um sistema nanopartículas carregado de extrato FRE; iv. avaliar a biocompatibilidade e atividade antidepressiva do extrato FRE nas formas livre e nanoparticulada. As folhas utilizadas no estudo foram coletadas em local de cultivo e secas para uso em otimização da extração por metodologia de superfície resposta. O extrato FRE foi utilizado para isolamento das substâncias majoritárias por CLAE-UV-DAD-Prep. Posteriormente, foi elaborado um sistema de nanopartículas catiônicas carregadas do extrato FRE, produzidas com polímero polimetilmetacrilato (PMMA), que foi caracterizado por mensuração de tamanho, potencial zeta, eficiência de encapsulação, ATR-FTIR e microscopia por AFM. Adicionalmente, foi avaliada a biocompatibilidade (através do modelo de toxicidade oral aguda) e efeito tipo antidepressivo (usando os modelos de natação forçada e campo aberto) após administração oral de extrato FRE nas formas livre e nanoparticulada e da substância isoorientina, em modelos in vivo. A análises quantitativas mostraram que o extrato FRE possui conteúdo total de flavonoides de 11,42 mg/g e teor de 5,21 mg/g de isoorientina. Foram identificados 13 flavonoides glicosilados derivados de luteolina, crisina e apigenina, através de análise por CLAE-ESI-IT-MS/MS. Posteriormente, foi avaliado o teor dos flavonoides vicenina-2 (5,20 mg/g), orientina (0,59 mg/g), vitexina (0,20 mg/g) e isovitexina (0,96 mg/g) no extrato FRE, através de análise por sistema CLAE-QqQ-MS/MS. As análises físico-quimicas mostraram que as nanopartículas carregadas de extrato FRE são esféricas com carga superficial positiva, tamanho de 65,6 nm, potencial zeta positivo e alta eficiência de encapsulação de isoorientina (EE = 100%) e estáveis ao longo de seis meses. As análises histopatológicas e bioquímicas de tecidos e soro dos animais mostraram a biocompatibilidade das nanopartículas em branco, do extrato FRE livre (2 g/kg kg; p.o.) e nanoparticulado (5 mg/kg; p.o.). O efeito tipo antidepressivo após administração aguda via oral do extrato FRE livre (50 e 100 mg/kg; P <0,01 e P <0,001) e nanoparticulado (5 mg/kg; P <0,01) e da isoorientina (1-10 mg/kg, P <0,001) foi investigado no teste de natação forçada, e semelhante ao antidepressivo nortriptilina, promoveram redução de tempo de imobilidade dos animais. Assim, a otimização do método de extração aumentou em 10 vezes o potencial antidepressivo e. a encapsulação promoveu a manutenção da atividade antidepressiva com aa redução da dose de extrato em 10 vezes. Além disso, este trabalho foi o primeiro a demonstrar o efeito antidepressivo da substância isoorientina, sugerindo um marcador. Os experimentos confirmam que insumos farmacêuticos ativos nas formas livre e de nanopartículas de folhas de P. edulis são uma estratégia promissora para produção de fitoterápico com ação antidepressiva.
Palavras-chave: Passifloraceae, fitoterápico, marcador, nanotecnologia, depressão x
ABSTRACT
Passiflora species are recognized for synthesizing various flavonoid derivatives with
neuroactive and antioxidant properties, which can prevent brain damage caused by depressive disorders. However, due to the low bioavailability, its clinical application is a challenge for pharmaceutical technology. In this context, Passiflora edulis fo.
flavicarpa O. Degener (Passifloraceae) species, popularly known as yellow passion
fruit has been researched. Thus, the aims of this work are: i. to develop a method for obtaining a flavonoid enriched extract (FRE) from Passiflora edulis fo. flavicarpa leaves; ii. purify and characterize flavonoids from FRE extract; iii. develop a FRE extract-loaded nanoparticle system; iv. evaluate the biocompatibility and antidepressant-like effect of FRE extract and loaded-nanoparticles. Raw material (leaves) were collected in a cultivation and dried to obtain a flavonoid rich extract by optimization of extraction through surface response methodology. FRE was used for isolation of major compounds by HPLC-UV-DAD-Prep. After, a FRE extract-loaded nanoparticle system produced with poly (methyl methacrylate) (PMMA) polymer was developed and characterized by size measurement, zeta potential, encapsulation efficiency, infrared and atomic force microscopy. Furthermore, biocompatibility (through acute oral toxicity model) and antidepressant-like effect (using forced swimming and open field models) were evaluated after oral administration of FRE extract and loaded nanoparticles and isoorientin in in vivo models. Quantitative analysis showed that the FRE has a total flavonoid content of 11.42 mg/g and a isoorientin content of 5.21 mg/g. Thirteen glycosylated flavonoids derived from luteolin, chrysin and apigenin were identified by HPLC-ESI-IT-MS/MS analysis. After, the content of flavonoids vicenin-2 (5.20 mg/g), orientin (0.59 mg/g), vitexin (0.20 m /g) and isovitexin (0.96 mg/g) were evaluated. Physicochemical analysis showed that extract-loaded nanoparticles are spherical, with a zeta potential size of 65.6 nm, high isoorientin encapsulation efficiency (EE = 100%) and that the system remained stable throughout the six months. Histopathological and biochemical analyzes of animals serum and tissues showed the biocompatibility of blank nanoparticles, extract (2 g/kg kg; p.o.) and extract-loaded nanoparticles 5 mg/kg; p.o.). The antidepressant-like effect after acute oral administration of FRE (50 and 100 mg/kg; P <0.01 and P <0.001) and extract-loaded nanoparticles (5 mg/kg; P <0.01) and isoorientin (1 -10 mg / kg, P <0.001) was investigated in the forced swimming test. The results were similar to the nortriptyline antidepressant drug, that showed a reduction of animals immobility time. Thus, the optimization of the extraction method increased the antidepressant potential 10-fold when compared with previous results in the literature. The encapsulation of FRE in PMMA nanoparticles promoted a decrease of 10-fold of dose to maintain the same antidepressant-like effect of free extract. Ultimately, this work described to the first time the antidepressant-like effect of isoorientin, suggesting it as a possible active marker for P. edulis. Our results confirm that extract and extract-loaded nanoparticle obtained from P. edulis leaves are a promising raw material that can be used in the development of an antidepressant herbal medicine.
Keywords: Passifloraceae, herbal medicine, marker, nanotechnology, depression
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Passiflora edulis fo. flavicarpa 18
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Planejamento fatorial da otimização da extração de flavonas
C-glicosiladas a partir das folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa.
31
SUMÁRIO 1
INTRODUÇÃO
17 2JUSTIFICATIVA
23 3OBJETIVOS
25 3.1 OBJETIVO GERAL 25 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 25 4MÉTODOS
274.1 COLETA DE MATERIAL VEGETAL 27
4.2 DETERMINAÇÃO DE RENDIMENTO PERCENTUAL DE
EXTRATO VEGETAL
27
4.3 DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE FLAVONOIDES TOTAIS
EM EXTRATO VEGETAL
27
4.4 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA
QUANTIFICAÇÃO DE ISOORIENTINA POR CLUE-UV-DAD
28
4.5 TRIAGEM E METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE RESPOSTA
APLICADA A OTIMIZAÇÃO DE EXTRAÇÃO DE FLAVONOIDES DE FOLHAS DE Passiflora edulis fo. flavicarpa
30
4.6 ISOLAMENTO DE FLAVONOIDES C-GLICOSILADOS A PARTIR
DE EXTRATOS OBTIDOS DAS FOLHAS DE Passiflora edulis fo.
flavicarpa POR CLAE-UV-DAD-Prep
31
4.7 IDENTIFICAÇÃO DE FLAVONOIDES C-GLICOSILADOS A
PARTIR DE EXTRATOS OBTIDOS DAS FOLHAS DE Passiflora
edulis fo. flavicarpa USANDO CLUE-TOF-MS
32
4.8 ANÁLISE QUALITATIVA POR CLAE-UV-DAD-MS/MS DO
EXTRATO OBTIDO DAS FOLHAS DE Passiflora edulis fo.
flavicarpa
33
4.9 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA
QUANTIFICAÇÃO FLAVONAS C-GLICOSILADAS EM EXTRATO DE FOLHAS DE P. edulis fo. flavicarpa POR CLAE-QqQ-MS/MS
34
4.10 DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE
NANOPARTÍCULAS DE EXTRATO OBTIDO DAS FOLHAS DE
Passiflora edulis fo. flavicarpa
35
4.10.1 Preparo de nanopartículas 35
4.10.2 Tamanho de partícula e potencial zeta 35
4.10.3 Eficiência de encapsulação 35
4.10.4 Microscopia de força atômica 36
4.10.5 Reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de
Fourier (FTIR –ATR) 36
4.10.6 Estabilidade físico-química 36
4.11 CUIDADOS E ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL 37
4.12 ADMINISTRAÇÃO VIA ORAL POR GAVAGEM 37
4.13 ESTUDO DE BIOCOMPATIBILIDADE DE EXTRATOS LIVRE E
NANOPARTICULADO OBTIDOS DAS FOLHAS DE Passiflora
edulis fo. flavicarpa
37
4.14 AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA DA
ISOORIENTINA, EXTRATOS LIVRE E NANOPARTICULADO OBTIDOS DAS FOLHAS DE Passiflora edulis fo. flavicarpa
39
4.14.1 Teste de Natação Forçada (FST) 39
4.14.2 Teste de Campo Aberto 39
4.15 ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL 39
5
PRODUÇÃO CIENTÍFICA
426
CONCLUSÃO
105REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1061 INTRODUÇÃO
A depressão é um transtorno mental que afeta 4,4% da população mundial (1). O estresse funciona como um fator de risco que contribui para o desenvolvimento do transtorno depressivo maior (2). Os sintomas associados à depressão, frequentemente, prejudicam o desempenho e a qualidade de vida das pessoas afetadas (3). Os fármacos utilizados no tratamento da depressão geralmente agem aumentando a concentração de monoaminas na fenda sináptica, incluindo inibidores seletivos da recaptação da serotonina, antidepressivos tricíclicos, inibidores de monoamina oxidase e inibidores da recaptação de serotonina e norepinefrina (2,4,5). Os dados sobre o uso de antidepressivos no mundo, explanados em uma pesquisa realizada pela OECD (Organisation for Economic Co-operation and
Development) revelou que o consumo dobrou entre 2000 e 2015 (1). No entanto, a
terapia clássica possui um baixo percentual de eficácia (6), fato que limita a adesão, conjuntamente com a presença de efeitos colaterais recorrentes, como: impotência sexual, náusea, vômito, constipação e xerostomia (6). Assim, há uma clara necessidade de desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento da depressão maior (3,7).
Neste contexto, são inseridos os fitoterápicos, que podem ser utilizados como coadjuvantes no tratamento da depressão ou como tratamento de escolha, dependendo da condição clínica do paciente (3,6,7). O consumo de fitoterápicos vem aumentando nos últimos anos, visto que, há uma tendência da população em buscar produtos ditos “naturais”, devido a menor incidência de efeitos colaterais (8). A planta medicinal objeto de estudo deste trabalho, Passiflora edulis fo. edulis (Passifloraceae), pertence ao gênero Passiflora. As espécies desse gênero reconhecidas por seu potencial calmante e sedativo (9,10). Os medicamentos produzidos com extratos das folhas dessas espécies estão entre os 10 fitoterápicos mais vendidos no Brasil (11). Inserida nesse gênero está a espécie P. edulis fo. flavicarpa, conhecida popularmente como “maracujá-amarelo” ou “maracujá azedo”, apresenta grande interesse no mercado agronômico, sendo extensivamente cultivada em regiões tropicais para produção de suco (10,12,13).
Devido às diferenças genéticas, morfológicas e fitoquímicas, a espécie P.
edulis apresenta duas formas: P. edulis fo. flavicarpa O. Degener (maraujá amarelo)
espécie com frutos de coloração amarela é nativa da flora brasileira, sendo o Brasil o maior produtor mundial desse fruto na atualidade (15).
Atualmente, consta o registro ativo de apenas 1 produto elaborado com uma espécie de Passiflora sp. nativa da flora brasileira no país, segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), para o qual são utilizadas folhas de
Passiflora alata (maracujá doce) (16). Entretanto, para fitoterápicos produzidos com
extratos das folhas de Passiflora incarnata, espécie nativa da América do Norte, consta 17 produtos com registro ativo no Brasil (16). Apesar de Passiflora edulis fo.
flavicarpa ser uma espécie nativa brasileira amplamente cultivada, ainda não há
fitoterápico registrado que contenha o extrato dessa espécie como Insumo Farmacêutico Ativo Vegetal (IFAV) no país. Desse modo, o emprego das folhas dessa espécie limita-se ao uso medicinal na forma de chás das folhas preparados por infusão e/ou decocção (10,17,18).
Figura 1- Passiflora edulis fo. flavicarpa (o autor) (14).
Estudos realizados com extratos obtidos das folhas de P. edulis fo. flavicarpa demonstram seu potencial farmacológico (13,19–21). Esses trabalhos comprovaram que o extrato aquoso da espécie possui efeito antioxidante (22), anti-inflamatório (23,24), ansiolítico (13,18,20), antidepressivo (18,25) e anti-hipertensivo (26).
Curiosamente, em 2013, Wang et al. mostraram que o extrato preparado com acetona 70%, a partir dos caules e folhas de P. edulis fo. flavicarpa possui efeito antidepressivo em camundongos na dose de 2 g/kg (25). Recentemente, nosso grupo de pesquisa realizou um estudo in vivo comparando o efeito de extratos aquosos das
duas formas de P. edulis, demonstrando que os extratos de P. edulis fo. flavicarpa e
P. edulis fo. edulis, apresentaram atividade antidepressiva nas doses de 1 g/kg e 300
mg/kg, respectivamente (18). Em um segundo momento, constatou-se por meio de estudo de fracionamento biomonitorado do extrato aquoso de folhas de P. edulis fo.
edulis que frações acetato de etila e n-butanólica, enriquecidas em flavonoides,
apresentaram efeito antidepressivo na dose oral de 50 mg/Kg, resultado que sugere que o efeito pode estar relacionado a presença de flavonoides, visto que houve uma redução da dose em 6 vezes, quando comparado a dose ativa do extrato (300 mg/Kg) (19).
As informações presentes nos trabalhos citados são importantes para dar continuidade a investigação dos compostos bioativos dessa espécie, visto que para registrar um fitoterápico no Brasil é necessário determinar o marcador ativo ou analítico do extrato vegetal, para que esse possa ser utilizado como IFAV. A ANVISA instituiu na Resolução de Nº 26/2014 os requisitos para registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos. De acordo essa resolução, o perfil cromatográfico e quantificação de marcador na droga vegetal devem ser estabelecidos, no produto fitoterápico intermediário (extrato) e no produto acabado. Preferencialmente, os compostos marcadores escolhidos para monitoramento nesses produtos devem ser do tipo ativo, os quais são substâncias ou classe de substâncias que tenham correlação com efeito terapêutico (27).
Em relação a composição fitoquímica das folhas de P. edulis fo. flavicarpa, são descritos flavonoides, terpenos, saponinas e glicosídeos cianogênicos (23,25,28); com destaque para os flavonoides, especificamente a sub-classe flavonas C-glicosiladas, que são considerados marcadores analíticos do gênero Passiflora sp., principalmente as substâncias vitexina, isovitexina, orientina e isoorientina (9,28,29).
Com base nos estudos in vivo que avaliaram a atividade antidepressiva de extratos e frações obtidos de folhas de P. edulis é possível sugerir que as flavonas C-glicosiladas sejam compostos ativos mediadores desse efeito (18,19,25). Normalmente, os flavonoides encontrados nas plantas são conjugados com carboidratos através de ligação O-glicosídica. No entanto, as flavonas C-glicosiladas são um grupo especial, que requerem uma ligação do tipo C-C na porção glicosídica na posição 6 e/ou na posição 8 da aglicona do flavonoide (13,30). As flavonas possuem funções específicas nas plantas como: pigmentação de flores e caules, proteção contra raios UVB e insetos e fungos (31).
Flavonoides, em geral, possuem biodisponibilidade menor que 1%, flavonoides glicosilados podem ser absorvidos na forma íntegra ou como produtos de reações de metabolismo. A biodisponibilidade das moléculas de flavonoides O-glicosilados é maior que as suas formas C-glicosiladas, visto que os que possuem ligação do tipo
O-C entre o flavonoide e o carboidrato podem hidrolisados no pH ácido do estômago,
sendo mais facilmente absorvidas no trato gastrointestinal na sua forma de aglicona (32).
Os flavonoides C-glicosilados, prováveis compostos bioativos antidepressivos de P. edulis (33–36), tem menor biodisponibilidade que a forma O-glicosídeo (32,37,38), pois devido as características químicas uma pequena fração é absorvida na forma íntegra e a outra parte precisa ser metabolizados pela microbiota intestinal para ser absorvido na forma de sulfato ou glicuronideo, o que contribui para a alta taxa de eliminação dessas moléculas naturais (32). Esses fatores associados à fraca solubilidade em água, meia-vida curta e rápida excreção in vivo limitam a aplicação clínica desses compostos (39,40).
Por essas razões, o desenvolvimento de um fitoterápico é desafiador, visto que é necessário que doses elevadas de IFAV sejam acomodadas em cápsulas para manutenção de um tratamento (41). Atualmente os sistemas liberadores de fármaco vem sendo estudados para melhorar a biodisponibilidade de produtos naturais, apresentando resultados de sucesso, conforme estudos farmacológicos e farmacocinéticos descritos na literatura, esses sistemas promovem o aumento da biodisponibilidade e eficácia de flavonoides (42).
Os principais pontos questionáveis do desenvolvimento de nanopartículas carregadas de extrato vegetal são: a estabilidade, a biocompatibilidade e o custo. Essas inovações tecnológicas para serem aceitas pelas agências reguladoras devem se apresentar como biocompatíveis, sendo incapazes de induzir qualquer resposta inflamatória tóxica ou relevante no corpo humano e de preferência com baixo custo. Assim, a escolha de excipientes biocompatíveis para delineamento de uma nanoformulação é um fator determinante capaz de determinar baixa toxicidade (42).
O copolímero de polimetilmetacrilato é uma das macromoléculas que vem sendo estudada no preparo de nanopartículas, não apenas por ser um polímero considerado de baixo custo, mas por apresentar biocompatibilidade, bioadesão, adsorção eficiente e aumento da permeabilidade de fármacos (43,44). Visando o encapsulamento de flavonoides, esse polímero torna-se uma estratégia interessante,
pois nanopartículas de PMMA carregadas de flavonoides foram capazes de diminuir a toxicidade e melhoraram a eficácia de fármacos, conforme estudos anteriores (42). Ainda, as propriedades catiônicas e de intumescimento do copolímero de PMMA permitiram uma alta eficiência de encapsulação dos compostos naturais (42,45,46).
Várias são as vantagens da nanotecnologia para extratos vegetais, pois os sistemas nanotecnológicos são capazes de melhorar a biodisponibilidade, estabilidade e as propriedades físico-químicas de produtos naturais (39,47). Estudos mostram que nanopartículas de tamanho inferior a 100 nm são capazes de atravessar a barreira-hemato-encefálica, direcionando fármacos para o encéfalo com maior eficiência (48,49). Por isso, o delineamento de sistemas poliméricos carregados de extrato obtidos das folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa pode ser uma terapia complementar viável e promissora para direcionamento ao encéfalo (48). Considerando ainda a questão da viabilidade devido a dose de tratamento, sistemas nanoparticulados podem permitir a administração de uma dose menor, por manter uma liberação prolongada e aumentar a biodisponibilidade. Ainda, um IFAV na forma nanoparticulada pode ser utilizado como ativo para composições fitoterápicas nas formas líquidas ou sólidas, com capacidade de melhorar a estabilidade físico-quimica e bioatividade de um extrato vegetal (39,42,49).
Como a depressão é considerada um grave problema de saúde pública em ascensão na atualidade, relacionado a casos de suicídio e baixa eficácia terapêutica dos medicamentos que estão no mercado (50,51), é importante investir em pesquisas de desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos e insumos ativos vegetais com atividade antidepressiva, e neste contexto, o extrato das folhas de Passiflora edulis fo.
2 JUSTIFICATIVA
A crescente busca por novos extratos ou substâncias oriundas de produtos naturais com atividade antidepressiva tem impulsionado pesquisas ao redor do mundo, visto que os medicamentos sintéticos atualmente utilizados para tratar a depressão possuem elevado percentual de ineficácia e causam vários efeitos colaterais, que somados promovem a baixa adesão aos tratamentos clássicos (6,8,41). A atividade ansiolítica demonstrada por fitoterápicos à base do extrato das folhas de Passiflora sp. é conhecida pelo efeito moderado e estudos recentes vêm mostrando o potencial desse extrato para tratar a depressão (18,20).
Passiflora edulis fo. flavicarpa é a espécie de Passiflora mais produzida no
Brasil, que é considerado o maior produtor mundial de maracujá amarelo, utilizado principalmente para a produção de suco e outros produtos alimentares (18,21,55). Em 2006, foi publicada a Política e o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF), que impulsionou a elaboração da Relação de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (RENISUS) em 2009, disponibilizando uma relação de 71 plantas medicinais que apresentam potencial para gerar produtos de interesse ao Sistema Único de Saúde, dentre as quais foram incluídas três espécies de Passiflora (P. alata; P. edulis e P. incarnata) (56).
Faz-se necessário destacar que uma das metas da PNPMF é promover o fortalecimento de toda cadeia de produção de fitoterápicos, visando o desenvolvimento de comunidades locais de cultivo vegetal, passando pelas indústrias de produção de IFAV e de fitoterápicos, assim como a comercialização do produto acabado (57,58). Além disso, é importante considerar a necessidade de impulsionar o desenvolvimento de um fitoterápico com uma espécie de Passiflora nativa do Brasil, visto que os fitoterápicos elaborados a base de extratos das folhas da espécie P.
incarnata estão entre 10 medicamentos fitoterápicos mais comercializados nesse país
(11). No entanto, não há registro de fitoterápico com espécies nativas, apesar do amplo cultivo da espécie produtora de maracujá amarelo no país (16).
Em função do exposto, faz-se necessário promover os estudos de desenvolvimento de novas tecnologias farmacêuticas aplicadas à elaboração de produtos à base de extratos de folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa, assim como explorar o potencial farmacológico das folhas dessa espécie nativa.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver um método para obtenção e incorporação de um extrato rico em flavonoides das folhas de P. edulis fo. flavicarpa O. Degener em sistema de nanopartículas para avaliar o efeito antidepressivo do extrato e/ou substâncias isoladas nas formas livre ou nanoparticulada.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolver um método extração para as folhas de P. edulis usando análise de superfície-resposta e técnicas eco-sustentáveis;
Desenvolver metodologia de purificação rápida dos flavonoides majoritários do extrato de P. edulis por CLAE-UV-DAD-Prep e identificar por CLUE-Q-Tof;
Desenvolver sistema de nanopartículas carreadoras de extrato rico em flavonoides obtido das folhas de P. edulis, usando um polímero da classe dos polimetilacrilatos, afim de melhorar a estabilidade e bioatividade do extrato;
Determinar as propriedades físico-químicas e a estabilidade das nanoparticulas carregadas de extrato rico em flavonoides obtido das folhas de P. edulis, por meio do tamanho, potencial zeta, eficiência de encapsulação e análise microscópica das partículas;
Avaliar a biocompatibilidade in vivo de extrato obtidos das folhas de P. edulis nas formas livre e nanoparticulada, através do modelo de Toxicidade Oral Aguda em camundongos;
Avaliar o efeito tipo antidepressivo de extrato e/ou moléculas obtidos das folhas de P. edulis na forma livre e de nanopartículas, através dos modelos de natação forçada e campo aberto em camundongos.
4 MÉTODOS
4.1 COLETA DE MATERIAL VEGETAL
As folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa O. Degener foram coletadas na fazenda Gurjaú, na cidade de Coronel Ezequiel-RN (6º23 '44.2 ”S 36º75' 10 '23.7” W) em 17 de maio de 2017. O espécime do material vegetal foi depositado no Herbário do Universidade Federal Rural do Rio Grande do Norte (UFERSA) sob o número 13751.6. O projeto tem autorização para coleta (SISBIO 5524549) e registro de acesso à biodiversidade brasileira para fins de pesquisa (SISGEN A618873). O material vegetal coletado foi seco em estufa de ar circulante a 45 ºC por 72 horas e armazenado para realização de estudos da presente pesquisa.
4.2 DETERMINAÇÃO DE RENDIMENTO PERCENTUAL DE EXTRATO VEGETAL
O rendimento percentual de amostra do extrato foi calculado usando o peso dos extratos liofilizados (a) e o peso das folhas secas usadas na extração (b), de acordo com a fórmula:
Rendimento (%) = a/b × 100; no qual a determinação final foi realizada pela média ± desvio-padrão (DP) de 3 amostras.
4.3 DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE FLAVONOIDES TOTAIS EM EXTRATO VEGETAL
O conteúdo total de flavonoides (CTF) foi determinado pelo ensaio colorimétrico de cloreto de alumínio (59) usando espectrofotometria de ultravioleta (UV). Soluções com concentrações definidas do padrão isoorientina nas concentrações 5, 10, 50, 100, 250 e 500 µg/mL foram solubilizadas em etanol a 60%, para preparo de uma curva de calibração. O preparo de amostras do método consistiu em adicionar 200 µL de solução de cloreto de alumínio 10% em alíquotas (200 µL) de solução de extrato (5 mg/mL) ou do padrão isoorientina, previamente adicionados em balão volumétrico de 5 mL. Posteriormente o balão foi preenchido com 4,6 mL de etanol a 60%, até a linha de gravação em branco. A mistura foi incubada durante 40 min à temperatura ambiente e protegida da luz. A solução em branco para amostras de extratos foi composta por alíquotas (200 µL) de extratos (5 mg/mL) misturada com 4,8 mL de etanol 60% em balão volumétrico com 5 mL de capacidade. A solução em branco
para amostras de padrão isoorientina (preparadas conforme cada concentração da curva de calibração) foi composta por alíquotas (200 µL) da respectiva solução padrão de isoorientina misturadas com 4,8 mL de etanol 60% em balão volumétrico (5 mL). A absorbância das soluções das amostras teste e branco foram medidas no comprimento de onda de 415 nm (espectrofotómetro Instrutherm UV-2000A, EUA), no qual o valor de cada amostra teste foi subtraído do branco correspondente. O CTF foi expresso em mg Equivalentes de isoorientina (EI) por g de extrato vegetal. Para cada amostra de extrato a determinação final foi realizada pela média ± DP de 3 amostras.
4.4 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA QUANTIFICAÇÃO DE ISOORIENTINA POR CLUE-UV-DAD
As análises por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada ao detector arranjo fotodiodos UV (CLUE-UV-DAD) foram realizadas num sistema Shimadzu UFLC-XR ™ (Shimadzu, Kyoto, Japão) equipado com duas unidades de fornecimento de solvente LC 20-ADXR, amostrador automático (SIL-20ACXR), unidade de desgaseificação (DGU-20A3), detector arranjo fotodiodos UV (SPD-M20A) e forno (CTO-20 AC) com uma coluna Shim-pack XR-ODS (tamanho de partícula 75 mm x 4,6 mm, tamanho de poro 2,2 µm; Shimadzu™).
Os solventes da fase móvel A (0,1% HCOOH) e B (MeCN: MeOH; 6: 4; v/v) foram acidificados com ácido fórmico para alcançar o pH 3,0 e filtrados em membrana de (fluoreto de polivinilideno) PVDF de 0,45 µm. Foi utilizado o seguinte gradiente de fase móvel: iniciando com 5% de B até 3 min no modo isocrático, entre 3-8 min em modo gradiente até 15% B e de 8 a 33 min até 30% B, utilizando um fluxo constante de 0,25 mL/min, em temperatura controlada de 30 °C. O volume de injeção de todas as amostras foi de 1 µL e os cromatogramas foram adquiridos no comprimento de 350 nm.
As análises das amostras do padrão de referência e de extratos foram analisadas em triplicata. Os procedimentos de validação foram realizados de acordo com a Resolução Nº 166/2017 da ANVISA (60). Os parâmetros de validação avaliados foram especificidade, linearidade, exatidão e precisão (intra e inter-dia). Inicialmente foi preparado uma solução do extrato isenta de isoorientina (solução target-knockout) (61). Para obtenção desse material vegetal sem isoorientina, as folhas secas foram submetidas a 6 extrações por ultrassom com EtOH 60% na proporção 0,5: 10 (p:v)
por 20 min para cada extração. A constatação da ausência de isoorientina com presença de outros compostos da matriz vegetal foi visualizada no cromatograma do solução resultante da sexta extração, extraído por meio de análise por CLUE-UV-DAD no comprimento de 350 nm. A sexta solução foi utilizada para preparo das soluções da curva de calibração, ensaios de precisão e recuperação.
A linearidade do método foi verificada por meio da construção da curva de calibração, usando resultados de análise (em triplicata) de 6 soluções de isoorientina, com concentrações previamente definidas (10, 40, 50, 200, 15 e 400 μg/mL), preparadas em triplicata usando solução target-knockout e filtradas por filtro de seringa de PVDF de 0,45 µm. Os valores médios da área do pico correspondente a isoorientina foram plotados em oposição à concentração correspondente para elaboração de uma equação de regressão, com determinação do coeficiente de correlação (r2).
A especificidade e a seletividade do método foram confirmadas por meio de comparação do cromatograma da isoorientina com o cromatograma de uma amostra contendo a mistura do par de isômeros orientina e isoorientina, visto que os extratos têm ambas as formas isômeras. O objetivo deste teste foi controlar a ausência interferência de isômeros no pico da isoorientina nas análises de amostras de extrato. Varreduras espectrais foram obtidas na faixa de 200-400 nm pelo detector de arranjo de diodos para obter busca completa de metabólitos. O espectro de UV do pico da isoorientina no extrato foi observado e a pureza espectral foi medida. Foi considerada ideal pureza acima de 95%.
O Limite de Detecção (LDD) e Limite de Quantificação (LDQ) foram definidos como as concentrações mais baixas do analito que mostraram relações sinal-ruído de 3:1 e 10:1, respectivamente, analisados em triplicata. A precisão do método foi estimada por repetitividade (precisão intra-dia) e precisão intermediária (precisão inter-dia).
A precisão intra-dia foi determinada como desvio-padrão relativo (DPR) calculado a partir da análise de nove soluções padrão individualmente preparadas, no mesmo dia, da isoorientina em concentrações identificadas (50, 200 e 400 μg/mL). O mesmo teste foi repetido no dia seguinte por outro analista para avaliar a precisão em dias diferentes. A precisão foi considerada adequada quando os valores do DPR foi inferior a 5%.
A exatidão foi verificada a partir da recuperação de nove determinações da substância isoorientina solubilizadas solução target-knockout, preparadas em triplicata, considerando-se como faixa linear do método analítico três concentrações: baixa, média e alta (50, 200 e 400 μg/mL). O resultado de recuperações médias, obtidas com análise de 3 soluções de cada uma das 3 concentrações definidas, foram calculados pela relação entre a concentração experimental e a concentração teórica expressa em percentagem Recuperação=(Cexperimental/Cteórica)×100), sendo considerada adequada uma variação de 10% em relação ao valor teórico.
4.5 TRIAGEM E METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE RESPOSTA APLICADA A OTIMIZAÇÃO DE EXTRAÇÃO DE FLAVONOIDES DE FOLHAS DE Passiflora edulis fo. flavicarpa
A seleção do método de extração foi realizada após triagem para comparação entre os métodos de maceração e turbo-extração, seguindo para o experimento de planejamento fatorial por Metodologia de Superfície Resposta (MSR). Foi selecionado o método que apresentou melhores resultados de rendimento percentual para as seguintes condições extrativas: 5 extratos macerados preparados por 24, 48, 72, 6 e 120 horas de extração e 3 turbo-extratos preparados nos tempos de extração de 5, 10 e 15 min, na temperatura de 25 ºC, na qual para cada extrato foi utilizada a razão de 7,5 g de folhas secas de P. edulis para 100 mL de etanol 50%. Posteriormente, para determinação do ponto central do experimento de MSR foi realizada uma triagem da melhor proporção de etanol a ser utilizada através de preparo de extratos, em triplicata, com etanol 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% como líquido extrator e foi avaliado o teor de flavonoides de cada condição de extração.
Em seguida, 9 condições extrativas foram utilizadas na MSR (Tabela 1), no qual os fatores variáveis independentes para o design foram a razão solvente:matéria-prima (0,5: 10, 0,75: 10 e 1:10; p:v) e o líquido extrator (EtOH 30%, 70% e 90%; v/v). O desenho de superfície resposta foi realizado para identificar os parâmetros ótimos para as condições de razão material vegetal:líquido extrator conforme os melhores parâmetros obtidos de Rendimento % de extração, conteúdo total de flavonoides e isoorientina. Todos os extratos do experimento de triagem MSR foram preparados em triplicata e cada determinação final foi realizada pelo valor obtido da média ± DP de 3 amostras.
Table 1-Planejamento fatorial da otimização da extração de flavonas C-glicosiladas a partir das folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa.
Código de Valores Níveis
Rendimento (g/g) CFT (mg/g) isoorientin (mg/g) Razão (g/mL) EtOH % Razão (g/mL) EtOH% 1 -1.0 -1.0 0.5:10 30 10.65 (0.17) 9.87 (0.07) 3.27 (0.01) 2 -1.0 0.0 0.5:10 60 7.15 (0.30) 11.37 (0.07) 4.48 (0.02) 3 -1.0 1.0 0.5:10 90 4.23 (0.11) 4.80 (0.07) 4.02 (0.01) 4 0.0 -1.0 0.75:10 30 12.52 (0.13) 11.16 (0.07) 3.65 (0.02) 5 0.0 0.0 0.75:10 60 8.88 (0.03) 10.51 (0.07) 5.21(0.03) 6 0.0 1,0 0.75:10 90 4.93 (0.13) 5.32 (0.11) 3.12 (0.02) 7 1.0 -1.0 1.0:10 30 13.17 (0.23) 7.78 (0.11) 2.57(0.24) 8 1.0 0.0 1.0:10 60 12.35 (0.15) 9.23 (0.07) 3.67 (0.00) 9 1,0 1.0 1.0:10 90 5.53 (0.22) 4.99 (0.11) 4.10 (0.01) 10 0.0 0.0 0.75:10 60 8.73 (0.11) 11.25 (0.11) 5.03 (0.01) 11 0.0 0.0 0.75:10 60 8.55 (0.11) 10.56 (0.04) 4.93(0.03)
A análise estatística foi realizada para determinar a significância dos coeficientes e efeitos padronizados pelo teste t de Student e teste F de Fischer, respectivamente. A equação final foi realizada para traçar as superfícies de resposta e avaliar o comportamento das variáveis dependentes. Os cálculos foram realizados usando o software Statistica 7.0 (Statsoft Inc., EUA).
4.6 ISOLAMENTO DE FLAVONOIDES C-GLICOSILADOS A PARTIR DE EXTRATOS OBTIDOS DAS FOLHAS DE Passiflora edulis fo. flavicarpa POR CLAE-UV-DAD-Prep
Para o isolamento dos flavonoides, o extrato foi produzido com as condições otimizadas no estudo de MSR a partir de folhas secas de P. edulis (turbo-extração: 5 min; 60% etanol; 0,75: 1,0; p/v). Posteriormente, o extrato foi filtrado e submetido a extração líquido-líquido com solventes de polaridade crescente: n-hexano (HE) (3 x 300 mL), CH2Cl2 (3 x 300 mL), AcOEt (3 x 300 mL) e n-BuOH (3 x 300 mL). As frações obtidas foram evaporadas sob pressão reduzida (temperatura abaixo de 45 ºC) e o rendimento em gramas, foi determinado após completa secagem.
Uma triagem fitoquímica do extrato e das frações foi realizada por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) utilizando cromatoplacas de alumínio, revestidas com gel de sílica F254 como absorvente e AcOEt: CH3COCH3: CH3COOH:
H2O (4,0: 1,0: 0,5: 0,25; v/v/v/v) (Sistema I). Os cromatogramas foram analisados sob luz UV nos comprimentos de 254 e 365 nm e depois pulverizados com agente cromogênico específico: i. ácido sulfúrico de vanilina (4%) e ii. Reagente NP (0,5%). Os fatores de retenção (Rf), cor e características das manchas foram comparados com a amostra do padrão de referência isoorientina e orientina na concentração de 1 mg/mL (Sigma-Aldrich ™).
A fração EtOAc (4,85 g) foi solubilizada em 10 mL de EtOH: MeOH (1:1, v/v), devido a polaridade da fase móvel inicial utilizada para eluição (CH2Cl2: EtOH; 50:50; v/v). Essa amostra foi submetida a uma coluna de gel de exclusão molecular (C1: 28 x 6 cm; 150 g; Sephadex® LH-20) com 200 mL de CH2Cl2: EtOH (50:50; v/v). A eluição foi realizada com fluxo de 2,5 mL/min e 400 mL de CH2Cl2: EtOH (50:50; v/v) como fase móvel inicial, seguido por 400 mL de 100% EtOH, 400 mL de EtOH: MeOH (50:50; v/v) e 400 mL de 100% de MeOH. As frações foram coletadas em 160 tubos com capacidade de 10 mL e reunidas de acordo com o perfil de similaridade por CCD em 9 frações (C1: 1-9) (Sistema I, pulverizadas com 0,5% de reagente NP e observadas em luz 365 nm UV). Esse experimento foi realizado em duplicata.
Em seguida, a subfração C1:4 (983 mg) foi submetida a uma coluna de gel de sílica (C2: 49 x 2,5 cm; Macherey NagelTM 70-130 mesh), eluída com 700 mL de CH2Cl2: EtOH: H2O (4: 4: 0,5; v/v; 2,5 mL / min) e 100 mL de MeOH. As frações foram coletadas em 80 tubos de 10 mL. As amostras foram analisadas por CCD (Sistema I, pulverizado com 0,5% de Reagente Natural A; observação em luz UV 365 nm) e reunidas em 10 frações (C2: 1-10). Posteriormente, a fração C2-9 (150 mg) foi solubilizada em 3 mL de MeOH (50 mg/mL) e filtrada por filtro de seringa de PVDF de 0,45. Alíquotas de 500 µl foram injetadas em cromatógrafo preparativo (CLAE-UV-DAD-Prep) Shimadzu™ LC10A usando uma coluna Shimadzu ™ Shimpack ODS (H) (200 mm x 20 mm, 5 µm) em eluição isocrática: 19% MeCN (B) e H2O:THF:TFA (98,05:1:0,05; v/v/v) (A), com fluxo de 10 mL/min, e monitoramento por comprimento de onda de UV 340 nm. Foram coletadas frações correspondente ao composto isoorientina (tR 13,44 min) e orientina (tR 14,96 min). A pureza destes compostos foi
analisada por CLUE-UV-DAD (condições cromatográficas na Seção 4.4).
4.7. IDENTIFICAÇÃO DE FLAVONOIDES C-GLICOSILADOS A PARTIR DE EXTRATOS OBTIDOS DAS FOLHAS DE Passiflora edulis fo. flavicarpa POR CLUE-TOF-MS
A identificação dos compostos purificados foi realizada com base no tempo de retenção e no valor m/z dos compostos em comparação com os dados obtidos para as soluções dos padrões de referência isoorientina (1 mg/mL) e orientina (1 mg/mL). As análises foram realizadas em um sistema de LC Agilent 1260 Infinity acoplado a um sistema de CLAE/EM Agilent 6230 (TOF) da Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), automatizado com auto-amostrador e bomba de solvente quaternário. As amostras foram solubilizadas em MeOH: H2O (1:1; v/v) na concentração de 1 mg/mL e filtrada através de um filtro de seringa PVDF 0,45 µm. A separação dos compostos foi realizada a 25 ºC usando uma coluna Agilent ™ Zorbax Extend C18 (2,1 mm × 50 mm; tamanho de partícula: 1,6 µm). A fase móvel utilizada foi composta de A (0,1% de HCOOH) e B (0,1% de HCOOH em MeCN). A taxa de fluxo utilizada foi de 0,3 mL/min, conforme o a eluição em modo gradiente: 0-10% B, 0-4 min; 10-10% de B, 4 a 10 min; 10–100% B, 10–11 min, 100–8% B, 11–12 min e 8–8% B, 12–16 min.
4.8 ANÁLISE QUALITATIVA POR CLAE-UV-DAD-MS/MS DO EXTRATO OBTIDO DAS FOLHAS DE Passiflora edulis fo. flavicarpa
O extrato rico em flavonoides obtido a partir de folhas de P. edulis fo. flavicarpa foi preparado através das seguintes condições: turbo-extração por 5 min; EtOH 60%; 0,75: 1,0) e analisado usando um sistema de CLAE Shimadzu™ (Kyoto, Japão) acoplada a uma armadilha de íons “ion trap” amaZonSL (IT) Bruker Daltonics™ (Billerica, EUA). O equipamento consiste de uma unidade de bomba de solvente LC-20AD, um desgaseificador on-line DGU-20A3, um forno de coluna CTO-20A, um degaseificador online DGU-20A3, um controlador de sistema CBM-20A e um detector de arranjo de diodos UV SPD-M20A (200 a 400nm). As injeções foram realizadas automaticamente (20 µL) e a amostra de extrato foi solubilizada em MeOH:H2O (1:1; v/v) na concentração de 1 mg/mL e filtrada através de um filtro de seringa de PVDF. A separação dos compostos foi realizada na temperatura de 25 ºC utilizando uma coluna Spherisorb ODS-2 (5 µm, 250 mm × 4,60 mm; Sigma-Aldrich™). A fase móvel utilizada foi composta de A e B, MeCN e H2O, respectivamente, ambos com adição de 0,1% de HCOOH (v/v). O fluxo utilizado para análise foi de 1 mL/min, conforme o gradiente de eluição: 5-15% B, 5-45 min; 15-30% de B, 45-60 min; 30 a 100% B, 60 a 70 min.
4.9 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA QUANTIFICAÇÃO FLAVONAS C-GLICOSILADAS EM EXTRATO DE FOLHAS DE P. edulis fo. flavicarpa POR CLAE-QqQ-MS/MS
A quantificação dos flavonoides vicenina-2, orientina, isoorientina, vitexina e isovitexina foi realizada utilizando um sistema de Cromatografia Líquida Preminence (Shimadzu, Kyoto, Japão) equipado com um desgaseificador online DGU-20A3R, uma bomba de solvente LC -20AD, um amostrador automático SIL-20ACHT, um forno para coluna CTO-20AC e um controlador CBM-20A, acoplado a um espectrômetro de massas triplo quadrupolo Applied Biosystems/Sciex API 3200 (AB Sciex, Concord, Canadá) (LC-MS/MS). A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna Ascentis Express C18 de 100 mm x 4,6 mm, 2,7 µm (Supelco, Bellefone, EUA) e pré-coluna com fase equivalente (5 mm, Phenomenex, Estados Unidos), mantida a 40 °C, o sistema de fase móvel foi composto por ácido fórmico 0,1% (A) e metanol (B) eluído num modo gradiente, com fluxo de 1,0 mL/min. Uma solução estoque com os cinco padrões de referência misturados foi solubilizada para atingir as concentrações de 5, 10, 50, 60, 75, 100 e 500 ng/mL e o volume de injeção utilizado nas análises foi de 5 µL. O espectrômetro de massas foi operado no modo negativo e monitorização de múltiplas reações (MMR) para as transições 593 → 353 (vicenina-2), 447 → 327 (orientina e isoorientina), 431 → 311 (vitexina e isovitexina) e 285 → 133. As amostras de solução padrão e extrato (60 µg.mL-1) foram preparadas em MeOH:H2O (v/v) e filtradas através de uma membrana de politetrafluoretileno com poro de tamanho de 0,22 µm.
A validação dos método analítico foi realizada de acordo com as determinações das diretrizes da International Conference on Harmonisation (ICH), cujas análises foram realizadas em triplicata para cada nível de concentração das etapas de validação realizadas (62,63). A linearidade foi verificada com a construção de equações de regressão linear, que com r2 > 0,999 apresenta-se conforme o
especificado. O LDD foi definido como relação sinal-ruído de 3: 1, e o LDQ usando a razão de 10: 1. A precisão foi executada por dois analistas, para avaliar a repetibilidade e precisão intermediária para todos os compostos separados. Para essa etapa, nove amostras foram preparadas e avaliadas em cada dia de análise e os DPR inferiores a 5% indicam repetibilidade e confiabilidade do método. A precisão foi considerada satisfatória quando estava dentro do intervalo de ± 10% do erro padrão
relativo (EPR%), medido para três soluções de padrão referência, preparadas em triplicata.
4.10 DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE EXTRATO OBTIDO DAS FOLHAS DE Passiflora edulis fo. flavicarpa
4.10.1 Preparo de nanopartículas
As nanopartículas foram preparadas pelo método de nanoprecipitação (43), no qual a fase orgânica (6 mL) contendo o polímero PMMA foi injetada na fase aquosa (14 mL), composta de tensoativo polimérico PVA (Poli(álcool polivinílico)) sob agitação magnética a 720 rpm, a 25 ºC (43,44). Para nanopartículas em branco (NPB), a solução de 0,75% p/v PMMA em EtOH 90% v/v foi injetada na solução aquosa de 0,25% p/v solução de PVA em água usando a bureta a 1,0 mL/min sob agitação magnética a 720 rpm. A etapa de evaporação do solvente ocorreu a 30 °C evaporador rotatório (Buchi; Suíça). Para as nanopartículas carregadas com extrato (NPEP), proporções distintas extrato/copolímero nas razões de 1:10, 1:5 e 2:5 foram testadas, conforme padronização do laboratório para estudos com fármaco para otimização de tempo e custo, com inclusão do extrato na fase orgânica juntamente com PMMA. As amostras foram armazenadas em frascos de vidro hermeticamente fechados a 25 ºC por 24 h, antes das medições. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os dados expressos como média ± DP.
4.10.2 Tamanho de partícula e potencial zeta
O tamanho médio das partículas e índice de polidispersão (PdI) de amostras de NPB e NPEP foram medidos por espectroscopia de correlação de fótons, a 659 nm, com um ângulo de detecção de 90◦ (Nano ZS Zetasizer, Malvern Instruments Corp., Reino Unido) a 25 ºC em cubetas de poliestireno com espessura de 10 mm. O potencial zeta foi determinado por anemometria Doppler a laser também usando o Nano ZS Zetasizer. Foram realizadas as medições com pelo menos dez determinações para cada amostra diluída a 1:100 (v/v) em água purificada, previamente preparadas em triplicata e os dados foram expressos como média ± DP.
4.10.3 Eficiência de encapsulação
A eficiência de encapsulação (EE) foi calculada a partir da quantidade total de isoorientina no extrato livre (Ptotal) subtraindo a quantidade de isoorientina livre presente suspensão de nanopartículas de extrato (Plivre). Para obtenção da solução contendo a isoorientina livre presente na suspensão de nanopartículas de extrato, 20
mL de suspensão de nanopartículas foram submetidos à ultracentrifugação a 9.000 g por 5 min em microcentrífuga (NT805 Nova Técnica, Piracicaba, SP, Brasil) (48). O sobrenadante foi então coletado e reduzido a 0,9 mL em um evaporador rotatório, diluído com 0,9 mL de MeOH, filtrado em seringa com filtro PVDF de 0,22 µm. A concentração de isoorientina foi determinada por metodologia previamente validada após inclusão da análise de 3 amostras de NPB para observação da conservação do parâmetro de seletividade do método. Uma amostra de extrato livre (10 mg/mL) solubilizada em MeOH: H2O (1:1) foi analisada CLUE-UV-DAD para avaliação do conteúdo de isoorientina. As análises foram realizadas em duplicata.
A eficiência de encapsulação foi calculada pela fórmula: Eficiência de encapsulação = Ptotal – Plivre x 100% Ptotal
4.10.4 Microscopia de força atômica (AFM)
A forma e a superfície do NPB e do NPEP foram observadas usando imagens de AFM. As suspenções foram diluídas com água purificada na proporção 1:25 (v/v) e colocadas em uma lamínula, secas sob dessecador durante 24 h e então analisadas em um AFM, SPM-9700, Shimadzu (Tóquio, Japão), com varredura em cantilever sem contato, de 1Hz.
4.10.5 Reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR)
Nesse método as interações extrato-copolímero nas nanopartículas foram avaliadas por ATR-FTIR [34]. A suspensão coloidal de nanopartículas foi concentrada usando o concentrador a vácuo (Labconco Centrivap) por 7 horas. Os espectros foram registrados em 20 varreduras, com uma resolução de 4 cm-1 entre 4000 e 500 cm-1 para excipientes da nanoformulação (FRE, PMMA, PVA), NPB e NPEP em um espectrofotômetro ATR-FTIR SHIMADZU IR Prestige 21 (Tóquio, Japão).
4.10.6 Estabilidade físico-química
Para avaliação da estabilidade, as nanopartículas de extrato foram armazenadas nos frascos hermeticamente fechados a 5 °C, durante 6 meses. Nos intervalos de sete e quinze dias, as amostras foram coletadas e foram determinados o tamanho e o potencial zeta das partículas. As análises foram realizadas a 25 °C usando os parâmetros descritos na seção 4.10.2. Todas as análises foram realizadas em triplicata e os dados expressos como média ± DP.
4.11 CUIDADOS E ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL
Os camundongos da linhagem Swiss machos e fêmeas foram criados em biotério da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Natal, Brasil), em gaiolas (41 x 34 x 16 cm, 10 camundongos/gaiola), cobertas com cama de maravalha sob condições padrão (22 ± 2 °C, ciclo de luz de 12 h, luzes acesas às 6:00 da manhã) e separados conforme o sexo; com disposição de água e comida ad libitum. Todos os animais foram utilizados apenas uma vez para um único experimento. Os estudos foram autorizados pelo Comitê de Ética em Uso Animal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Licença nº 027-2017), diretrizes de ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) (64) e a Lei Brasileira no. 11.794/2008, que dispõe sobre o Cuidado e Uso de Animais Experimentais. Experimentos comportamentais foram realizados com camundongos machos (12 a 15 semanas de idade, 40 ± 10g) e o ensaio de biocompatibilidade foi realizado com camundongos fêmeas (8 semanas de idade, 35 ± 5 g), conforme padronização do laboratório de estudos de comportamento e os guia utilizado para avaliação de toxicidade oral aguda.
4.12 ADMINISTRAÇÃO VIA ORAL POR GAVAGEM
Todos os ativos administrados (isoorientina, extrato livre e nanoparticulado obtidos das folhas de Passiflora edulis fo. de flavicarpa, nanopartícula em branco e nortriptilina foram solubilizados em NaCl 0,9% (solução salina) e administrados oralmente (v.o.) em um volume de 10 ml/kg 90 min antes de experimentos comportamentais e 5 min antes do início de experimento de biocompatibilidade, conforme protocolos estabelecidos. O grupo controle negativo foi tratado com o mesmo volume, via de administração e utilizando o mesmo veículo (solução salina) empregado nos grupos tratados. O fármaco controle positivo nortriptilina adquirido possui fabricante Novartis Biociências S.A., São Paulo, Brasil.
4.13 ESTUDO DE BIOCOMPATIBILIDADE DE EXTRATOS LIVRE E NANOPARTICULADO OBTIDOS DAS FOLHAS DE Passiflora edulis fo. flavicarpa
Para o desenvolvimento desse experimento, realizado em 2 etapas, foram utilizados 22 animais distribuídos em gaiolas de acordo com a similaridade de peso de cada animal. Esse estudo foi realizado de acordo com as Diretrizes da OECD para Testes Químicos (Teste Número 423). Desse modo, na Etapa I, 4 fêmeas receberam
5 e 50 mg/kg de extrato livre, 5 mg/kg de extrato nanoparticulado e nanopartículas em branco por gavagem, individualmente. Após, os animais foram observados por 4 horas para detecção de sinais tóxicos: alteração da cor dos olhos, pele, excreção, fezes, mucosas e secreções, micção, defecação, atividades autonômicas, alteração na postura, marcha, convulsões, agressividade e comportamento estranho. Cada animal foi monitorado durante as próximas 48 horas para observação de sua sobrevivência e sinais de toxicidade. Assim, continuou-se a Etapa I, com os animais que não mostraram quaisquer sinais de toxicidade e sobreviveram durante mais de 48 horas, na sequência, receberam as doses mais elevadas de 300 e 2000 mg/kg e essas fêmeas foram monitoradas como anteriormente por 48h, para verificação dos sinais de toxicidade e sobrevivência, para conclusão da Etapa I.
Na Etapa II, que consiste na principal avaliação do modelo, foi realizado com 5 fêmeas para cada grupo. No grupo que foi administrado extrato livre, a dose mais alta de FRE em que os animais não demonstraram sinais de toxicidade na Etapa I seguiu para Etapa II. Os grupos extrato nanoparticulado e nanopartículas em branco continuaram a receber as doses menores (ativas) e um grupo controle com administração de veículo (salina) também foi incluído no estudo. Após a gavagem, os animais sobreviventes foram observados pelo menos uma vez ao dia por 14 dias. Ao final deste período, os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de quetamina e xilazina, o sangue (800 µL) foi coletado por punção cardíaca e os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e necropsia foi realizada. Os animais foram dissecados e os órgãos (rins, coração, fígado) foram removidos, pesados e fixados em formalina tamponada neutra 10%, desidratados e mergulhados em parafina. Cortes de tecidos na espessura de 5 μm foram levados para coloração com hematoxilina-eosina (H & E) e examinados por microscopia de luz (40 ×, Nikon E200 LED). Três cortes de cada órgão (5 animais por grupo) foram analisadas qualitativamente por dois patologistas. Medições bioquímicas foram realizadas com aproximadamente 400 µL de soro obtido a partir de sangue após centrifugação (3000 rpm; 30 min) usando Labmax-240. Os parâmetros bioquímicos analisados foram: albumina, aminotransferase, aspartato aminotransferase, uréia e creatinina.
4.14 AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA DA ISOORIENTINA, EXTRATOS LIVRE E NANOPARTICULADO OBTIDOS DAS FOLHAS DE Passiflora
Para o desenvolvimento desse experimento foram utilizados 91 animais distribuídos aleatoriamente em 8 grupos (veículo, nortriptilina, FRE 50 e 100mg/kg, isoorientina 1 e 10 mg/kg, NPB e NPEP 5mg/kg) e as séries foram realizadas em 3 dias diferentes, utilizando 3-4 animais/grupo/dia, devido à variabilidade do comportamento animal para proporcionar maior confiabilidade aos dados. Os procedimentos foram realizados entre as 9:00 e as 12:00 horas. Ao final de cada experimento os animais foram anestesiados com tiopental 90 mg/kg solubilizado em solução salina 0,9% pela via intraperitoneal. A eutanásia dos animais foi por deslocamento cervical.
4.14.1 Teste de Natação Forçada (FST)
O modelo experimental foi realizado de acordo com Porsolt et al. (1977) em que os camundongos foram inseridos por 6 min em um cilindro de vidro transparente (24 cm de altura/18 cm de diâmetro) contendo 18 cm de altura preenchidos com água a 24 ± 1°C (65).O tempo de imobilidade (isto é, tempo gasto na água sem fazer quaisquer tentativas de fuga) foi registado por um observador experiente durante os últimos 4 min de uma única sessão experimental para cada animal. Após a avaliação do comportamento, cada animal foi mantido aquecidos usando uma cama de aquecimento até a secagem completa e, em seguida, eram levados para as gaiolas. Os experimentos foram gravados por um sistema de câmera de vídeo computadorizado para gravação.
4.14.2 Teste de Campo Aberto
A atividade locomotora espontânea dos camundongos foi medida usando o aparelho de campo aberto (40 × 40 × 40 cm), com piso e paredes pretos, no qual cada camundongo foi colocado no centro do campo aberto e a distância percorrida (em metros) foi registrada durante 30 min, através de uma câmera de vídeo interligada a um sistema automatizado de monitoramento de atividades (Anymaze, Stoelting Co., Wood Dale, EUA). O aparato foi higienizado com solução de etanol a 10% após a avaliação comportamental de cada animal.
4.15 ANÁLISE ESTATÍSTICA DE EXPERIMENTOS COM ANIMAIS
Valores experimentais foram expressos como média ± DP. O teste t de Student foi usado para comparações pareadas dos dados analíticos. Análise univariada de
variância (one-way ANOVA) foi aplicada para comparações múltiplas pelos testes de
Newman Keuls e Donnutt’s, Valores de p <0,05 foram considerados estatisticamente
5 PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Produções relacionadas ao tema da Tese:
ALVES, J. S. F., Marques, José, Demarque, D. P., Costa, L. R. F., Amaral, J., Lopes, N. P., Soares, L., Silva-Junior, A. A., Gavioli, E. C., Ferreira, L. S., Zucolotto, S. M. Involvement of isoorientin in the antidepressant activity of a flavonoid-rich extract from
Passiflora edulis f. flavicarpa. Brazilian Journal of Pharmacognosy, 2019. O referido artigo foi aceito para publicação na Brazilian Journal of Pharmacognosy, que possui fator de impacto 1.754, com Revision (em revisão para publicação final- novembro de 2019).
ALVES, J. S. F., Santos-Silva, A. M., Silva, M. R., Tiago, P. M. F., Carvalho, T. G., Araújo-Júnior, R. M., Lopes, N. P., Gavioli, E. C., Ferreira, L. S., Silva-Junior, A. A., Zucolotto, S. M. In vivo antidepressant effect of natural compound from Passiflora edulis fo. flavicarpa encapsulated in cationic nanoparticles. O referido artigo foi submetido no periódico Pharmaceutics, que possui fator de impacto 4.773.
Chagas, M. B.; Ferreira, E. J.; ALVES, J. S. F.; Paiva, A. S.; Pontes, D. L.; Zucolotto, S. M.; Ferreira, S. L. Bioinspired oxidation in the CYP of isomers orientin and isoorientin using Salen complexes. O referido artigo foi submetido no periódico Rapid Communications in Mass Spectrometry, que possui fator de impacto 2.045. Nesse trabalho contribuí realizando experimentos de análise fitoquímica, fracionamento de extratos por cromatografia clássica e purificação de flavonoides orientina e isoorientina por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao Detector de Ultravioleta-Preparativo, para serem utilizados em experimentos de farmacocinética in vitro realizados pela primeira autora.
Ayres, A. S.F.S.J., Santos, W. B., Junqueira-Ayres, D. D., Costa, G. M., Ramos, F. A.; Castellanos, L., ALVES, J. S.F., ASTH, L., Medeiros, I. U., Zucolotto, S. M.; Gavioli, E. C. Monoaminergic neurotransmission is mediating the antidepressant-like effects of
Passiflora edulis sims fo. edulis. Neuroscience Letters 2017, 660:79-85. O referido
artigo foi publicado no periódico Neuroscience letters, que possui fator de impacto 2.173. Nesse trabalho contribuí realizando experimentos de análise do perfil fitoquímico do extrato e frações de P. edulis simns fo. edulis obtidos por infusão e extração líquido-líquido, por análise em CLAE-UV-DAD.
