QFL1313_ 202001_Cassiana_Eletroforese capilar

QFL 1313 - Química Analítica III

Eletroforese Capilar

Cassiana Seimi Nomura

0.5 1.0 1.5

Espectros de absorção de diferentes substâncias

Métodos para Análise Química

Requer separação de analitos dos interferentes

Pouco específico

Pode ser feita por

• Métodos Clássicos: precipitação, destilação e extração

• Métodos instrumentais: Cromatografia e Eletroforese

capilar

Análise de especiação

As

As

+

Método de Separação

Souza JM, et al, Quim. Nova, Vol. 38, No. 1, 118-127, 2015

Método de detecção

(concentração total)

Detecta (quantifica) cada

uma das espécies

Qual o princípio da eletroforese?

É uma técnica de separação baseada na migração

diferencial de compostos iônicos ou ionizáveis

sob ação de um campo elétrico.

A velocidade de migração de uma espécie depende de sua carga e

tamanho. Separações são baseadas nas diferenças das relações

carga-tamanho dos vários analitos em uma amostra

J. W. Jorgenson, K.D. Lukacs, Analytical Chemistry, 53 (1981) 1298.

v

1

v

2

v

3

v

4

1

2

Tipos de eletroforese?

Eletroforese em escala macro

(Arne Tiselius – 1930)



separações de proteínas do

soro sanguíneo eram feitas

em papel ou gel.

(Nobel de 1948)

Eletroforese em escala micro

ou nano

(J.W. Jorgenson – 1981)



Separações em tubo capilar

J. W. Jorgenson, K.D. Lukacs, Analytical Chemistry, 53 (1981) 1298.

Eletroforese Capilar

Princípio da Separação:

Solutos (analitos) diferentes possuem mobilidades

diferentes frente ao campo elétrico formado e, portanto,

migram através de um capilar com velocidades diferentes.

Espécies que podem ser separadas:



Cátions



Ânions



Espécies neutras: eletrocromatografia capilar

Componentes de um equipamento de Eletroforese Capilar

-+

Fonte de Tensão 5-30 kV Detector Coluna Capilar (~40-100 cm ) Eletrólito Eletrólito Sílica Fundida ~330 m Revestimento de poliimida ~15 m Cavidade Interna 10-100 m Fluxo Campo Elétrico 30 kV/0,5 m = 60 kV/m Direção do Fluxo Catodo Anodo

Eletroforese Capilar

Componentes principais:



Fonte de alta tensão (5 – 30 kV) ou corrente constante

(0 - 200 A) é usada para estabelecer um campo elétrico

ao longo do capilar



Catodo – pólo negativo (atração de espécies positivas)



Anodo – pólo positivo (atração de espécies negativas)



Capilar (sílica fundida)



Eletrodos (geralmente platina)



Detector (vários tipos)

Detectores



Espectrométricos



Ultravioleta



Raman



Fluorescência



Quimioluminescência



Lentes térmicas



Espectrometria de massas



Eletroquímicos



Condutividade



Potenciometria



Amperometria

Coluna Capilar

Sílica fundida – dióxido de silício (alta pureza)

✓permite dimensões precisas

✓alta constante dielétrica

✓baixa condutividade elétrica

✓alta condutividade térmica

✓boa resistência mecânica

✓maleabilidade

✓boa resistência química

✓alta transmitância óptica (190-900 nm)

Vidro

Teflon

*Capilar de sílica é importante por gerar o fluxo eletroosmótico

7

8

Princípio da Separação Eletroforética

Mobilidade Eletroforética

-+

Força elétrica Carga do íon Campo elétrico Força de atrito Viscosidade do meio Raio iônico efetivo Força de retardamento

Esfera iônica possui carga oposta ao do íon

Força de relaxação Tendência da esfera iônica em se redistribuir simetricamente ao redor do íon

 = µ

e

E

Velocidade de

migração

(cm s

-1

₎

Mobilidade

eletroforética

(cm

2

_V

-1

_s

-1

₎

Campo elétrico

(V cm

-1

₎

 carga iônica

 1 / fator de atraso

por atrito

Força de atraso por atrito:

-Tamanho do íon

-Viscosidade do meio

Mobilidade Eletroforética

É proporcional à carga do íon (+) ou (-)

Moléculas de mesmo tamanho a mobilidade aumenta com a carga

(considerando mesmo solvente e mesma temperatura)

Mobilidade Eletroforética

É inversamente proporcional ao coeficiente de atrito (

ƒ)

HO2C CO2 -CO2H -O2C CO2 -CO2H -O2C CO2 -CO2 -ef= 2,54x10-8m2/V.s ef= 4,69x10-8m2/V.s ef= 5,95x10-8m2/V.s r  = viscosidade ƒ = 6r Equação de Stokes



eletro

= q/ ƒ

1 – K+ 2 - Ba2+ 3 – Ca2+ 4 – Na+ 5 – Mg2+ 6 – Li+ Solução 10 M

Eletroferograma de Cátions

Íons Mobilidade (m2_/s.V) K+ _{7,62 x 10}-8 Ba2+ _{6,59 x 10}-8 Ca2+ _{6,12 x 10}-8 Na+ _{5,19 x 10}-8 Li+ _{4,01 x 10}-8

Mobilidade de alguns íons em H

2

O (25

o

C)

Íons Mobilidade (m2_{/s.V) Íons Mobilidade (m}2_/s.V)

H+ _{36,30 x 10}-8 _OH- _{20,50 x 10}-8 Rb+ _{7,92 x 10}-8 _Fe(CN) 64- 11,45 x 10-8 K+ _{7,62 x 10}-8 _Fe(CN) 63- 10,47 x 10-8 NH4+ 7,61 x 10-8 SO42- 8,27 x 10-8 La3+ _{7,21 x 10}-8 _Br- _{8,13 x 10}-8 Ba2+ _{6,59 x 10}-8 _I- _{7,96 x 10}-8 Ag+ _{6,42 x 10}-8 _Cl- _{7,91 x 10}-8 Ca2+ _{6,12 x 10}-8 _NO 3- 7,40 x 10-8 Cu2+ _{5,56 x 10}-8 _ClO 4- 7,05 x 10-8 Na+ _{5,19 x 10}-8 _F- _{5,70 x 10}-8 Li+ _{4,01 x 10}-8 _HCO 3- 4,61 x 10-8 CH3CO2- 4,24 x 10-8



O que é o fluxo eletroosmótico?

Fluxo Eletroosmótico



Qual é a causa do fluxo eletroosmótico?



grupos silanóis desprotonados leva a formação

de uma dupla camada elétrica que se desenvolve na

interface sílica/solução



Quais espécies formam a dupla camada elétrica?



água, cátions livres e cátions solvatados do tampão



quando uma alta voltagem é aplicada nas extremidades

do capilar de sílica, preenchido com uma solução

tampão, um fluxo de solução é produzido, causando

uma migração do solvente (tampão de corrida) em

direção ao catodo ou anodo

13

14

Representação da estrutura

química da superfície do capilar

de sílica fundida

Fluxo eletroosmótico

_{Modelo para a interface capilar/solução}

Seio da Solução cátions = ânions Parte difusa da dupla camada (rica em cátions) Cátions ligados aos grupos silanóis (pH > 3)

Parede da Sílica Fundida

Fluxo na direção do catodo Catodo Anodo

Fluxo Eletroosmótico

É possível controlar o fluxo eletroosmótico variando-se o pH. Aplicação do E: íons transportam moléculas de água, induzindo um fluxo de

solução como um todo (fluxo eletroosmótico)

Perfil do fluxo eletroosmótico observado na eletroforese capilar

Perfil da velocidade eletroosmótica (Fluxo eletroosmótico)

Anodo Catodo

Perfil da velocidade hidrodinâmica (Fluxo laminar) pressão

maior

pressão menor



A eletroosmose leva a um fluxo líquido da solução com perfil plano

através do tubo capilar devido a formação do fluxo nas paredes.

Eletroforese

Cromatografia

H



A + B/u

x

+ Cu

x

Mobilidade Eletroosmótica

v

eo

=



eo

E

A mobilidade eletroosmótica (eo) é a constante de proporcionalidade entre

a velocidade eletroosmótica (veo) e a intensidade do campo elétrico aplicado

(E).

Como a velocidade eletroosmótica (veo) pode ser estimada?

distância entre o injetor e o detector

tempo de migração de uma molécula neutra

v

eo

=



Exemplo:



Solução tampão 50 mmol/L (pH = 8,0)



Coluna Capilar = 50 cm



Potencial aplicado = 25 kV



Fluxo Eletroosmótico = 5 cm/min

Velocidade Eletroosmótico

J. D. Olechno, J.M.Y. Tso, J. Thayer, A. Wainright, Amer. Lab., 22 (1990) 51.

19

20

Mobilidade Eletroosmótica

Diretamente proporcional à densidade de carga na superfície da sílica

pH < 7 (a eletroosmose diminui)

Si-O- _{Si-OH (diminuição da densidade de carga superficial)}

pH = 9 (tampão borato) o fluxo eletroosmótico é ~2 mm/s

pH = 3 (tampão citrato) o fluxo eletroosmótico é ~0.2 mm/s

Inversamente proporcional à força iônica do meio

Força iônica alta (a eletroosmose diminui) espessura da camada difusa ~ 10 nm ( = 1 mM)

~ 0,3 nm ( = 1 M)

Mobilidade Eletroosmótica

O fluxo eletroosmótico uniforme contribui para a alta resolução da eletroforese capilar

Fluxo de íons no capilar causa aquecimento Joule que causa mudança na uniformidade e consequente dispersão

Lei de Ohm: I = E/R Potência: P = E.I = I2_.R

*Em condições normais o canal central do capilar está 0,02 a 0,3 K mais quente do que a parede

*Viscosidade menor na região mais quente

*Perturbação do fluxo eletroosmótico

☺Capilar fino (diâmetro 50 m) maior dissipação do calor Maior diâmetro do capilar maior gradiente de temperatura

Mobilidade Aparente



_ap

= 

eletro

+ 

eo

A mobilidade aparente (ap) de um íon é a soma da mobilidade

eletroforética e da mobilidade eletroosmótica da solução.

Cátion do analito movendo-se na mesma direção do fluxo eletroosmótico (eletro

e eo) tem o mesmo sinal, portanto ap eletro

Ânion do analito movendo-se na direção oposta ao fluxo eletroosmótico (eletroe

eo) tem sinais opostos

✓pH  7 a eletroosmose transporta os ânions para o catodo (eletro eo)

✓pH  7 a eletroosmose é menos intensa e os ânions podem não alcançar o detector (eletro eo)

Velocidades na presença do fluxo eletroosmótico

++ +

-

--v

eo

v

eletro ++ +

-

--v

total

= v

eletro

+ v

eo

Mobilidade Aparente

v

eletro

= 

eletro

E

v

eo

= 

eo

E



eletro

= v

eletro

/E



eo

= v

eo

/E



ap

= v

eletro

/E + v

eo

/E



ap

= v

total

/E



ap

= 

eletro

+ 

eo

Cálculo das Mobilidades

distância entre o injetor e o detector tempo de migração

v

_total

=

=

Ld

t

potencial elétrico aplicado tamanho do total da coluna capilar

E =

=

V Lt

L

d

/t

V / L

t

=



ap

=

vtotal

E

L

d

/t

neutro

V / L

t

=



eo

=

veo(neutro)

E



_eletro

= 

ap

- 

eo Detector Ld

25

26

27

28

Injeção de Amostra

Injeção hidrodinâmica

✓frasco de amostra é pressurizado na entrada do capilar ou faz-se um vácuo na saída (P conhecido)

✓frasco de amostra é elevado em relação ao outro (sifonagem) P =  g h

✓o cálculo do volume injetado é dado por:

P = diferença de pressão entre as extremidades do capilar

d = diâmetro interno do capilar

t = tempo de injeção  = viscosidade da amostra Lt= comprimento do capilar Pd4_t 128Lt V =

Injeção de Amostra

Injeção hidrodinâmica

✓frasco de amostra é pressurizado na entrada do capilar ou faz-se um vácuo na saída (P conhecido)

✓frasco de amostra é elevado em relação ao outro (sifonagem) P =  g h

✓o cálculo do volume injetado é dado por:

P = diferença de pressão entre as extremidades do capilar

d = diâmetro interno do capilar

t = tempo de injeção  = viscosidade da amostra Lt= comprimento do capilar Pd4_t 128Lt V =

Injeção de Amostra

Injeção eletrocinética

✓usa-se um campo elétrico para direcionar a amostra para o capilar ✓o cálculo do número de mols de cada íon em t segundos é dado por:

ap = mobilidade aparente (ap= eletro+ eo ) E = campo elétrico aplicado (V/m)

r = raio do capilar

C = concentração da amostra (mol/l) t = tempo de injeção

t/a= razão entre as condutividades do tampão e amostra

Problemas associados ✓mobilidade diferentes dos analitos

✓amostra injetada não tem a mesma composição da amostra original Mais indicada para eletroforese capilar em gel (alta viscosidade)

t

a

n = apE tr2C

Erros de amostragem devido à diferença na µ

Volume de analito

(V

a

)

µ

5 V

a

4 V

a

8 V

a

µ

V

a

0,5V

_a

0,2 V

_a

Padrão interno:

Correção de erros de amostragem

Volume de analito

(V

_a

)

Volume de PI

(V

PI

)

Razão

(Va / V

PI

)

µ

5 V

a

4 V

_a

8 V

a

5 V

PI

4 V

Pi

8 V

PI

µ

V

a

0,5V

a

0,2 V

a

V

PI

0,5 V

Pi

0,2 V

PI

V

a

/ V

PI

V

_a

/ V

_PI

V

a

/ V

PI

V

a

/ V

PI

V

a

/ V

PI

V

a

/ V

PI

Padrão Interno



É uma estratégia utilizada para calibração instrumental



Objetivo: melhorar precisão e a exatidão dos resultados

amostras RAZ Ã O SA /SPI CONCENTRAÇÃO soluções analíticas de referência

Adição do padrão interno

Sinal

ANALITO

Sinal

PI

31

32

Curvas de Calibração de K

0 20 40 60 80 100 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 S ina l A na lí ti co Conc. K+ (µmol/L) 0 20 40 60 80 100 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 S ina l A na lí ti co /S ina l P ad rão I nterno Conc. K+ (µmol/L)

Na ausência de Li como PI Na presença de Li como PI

Sinais analíticos K Sinais analíticos PI Sinal Corrigido 0,026 0,015 1,73 0,032 0,018 1,77 0,038 0,022 1,73

0,032±0,006 0,018±0,004 1,74±0,02 CV = 19% CV = 22% CV = 1,1%

Condições para escolha do padrão interno:



Estar presente na amostra em concentração não

detectável (< Limite de Detecção)



Ter mobilidade próxima a dos analitos



Ter comportamento semelhante ao dos analitos frente a



variação instrumental



concomitantes da amostra



sistema de detecção

Equação de van Deenter

H



A + B/u

x

+ Cu

x

ux= vazão (velocidade da fase móvel) A = Caminhos múltiplos B/ux= Difusão longitudinal Cux= Equilíbrios

Cromatografia com coluna empacotada A B C  0

Cromatografia com coluna capilar A = 0 Eletroforese Capilar A C = 0

Resolução EC x HPLC

R es po st a do d et ec to r 4100 pratos 92000 pratos Eletroforese Capilar Cromatografia Líquida de Alta Resolução Tempo (min)

Eletroforese Capilar

Vantagens da eletroforese capilar sobre outros métodos de

separação:



Não existe fase estacionária



Alta resolução



Pequenos volumes de amostra (1 a 10 nL)



Automação com possibilidade de injeção e detecção em fluxo



Compatível com muitos sistemas de detecção

Cromatografia Eletrocinética Micelar

Equilíbrio das moléculas neutras com a solução livre e

interior da micela Anodo Catodo Fluxo Eletrosmótico Fluxo Eletroforético

Separa espécies neutras e íons

Surfactante dodecil sulfato de sódio

(n-C12H25OSO3-Na+)

✓Atinge a concentração micelar crítica

37

38

Cromatografia Eletrocinética Micelar

Ausência de micelas, todas as moléculas neutras alcançam o detector no

mesmo tempo to

As micelas injetadas com a amostra alcançam o detector no tempo tmc

As moléculas neutras atingem o detector em um tempo entre toe tmc

Quanto maior o tempo em que uma molécula neutra permanecer no

interior de uma micela, menor será o seu tempo de migração.

Cátions e ânions interagem eletrostaticamente com as micelas, portanto o

tempo de migração também será afetado

Cromatografia Eletrocinética Micelar

Micelas são consideradas uma fase pseudo-estacionária

ux= vazão

A = Caminhos múltiplos

B/ux= Difusão longitudinal

Cux= Equilíbrios

Transferência de massa para dentro das micelas é rápido

Alargamento de bandas não é significativo

H





A + B/u

x

+ Cu

x

Cromatografia Eletrocinética Micelar

Tipos de surfactantes

Solventes orgânicos aumentam a solubilidade dos analitos

orgânicos e mudam os coeficiente de partição entre as soluções e as micelas (acetonitrila e N-metilformamida)

Bibliografia:

1. Princípios da Análise Instrumental, D. A. Skoog (ref 1) 2. Análise Química Quantitativa, D. C. Harris (ref 2) 3. M. F. M. Tavares, Química Nova, 19(2), 173-181, 1996. 4. M. F. M. Tavares, Química Nova, 20(2), 493-511, 1997. 5. E. M. Richter, D. P. de Jesus, R. A. A. Muñoz, C. L. do Lago, L. Angnes,

Journal of the Brazilian Chemical Society, 16(6A) 1134-1139, 2005. 6. J. A. F. Silva, C. L. do Lago, Analytical Chemistry, 70, 4339-4343, 1998.

Água Mineral

1 – Cs

+

2 – K

+

3 – Ca

2+

4 – Na

+

5 – Mg

2+

Íon Raio iônico, pm

Cs+ ₁₆₇ K+ ₁₃₈ Ca2+ ₁₀₀ Na+ ₁₁₈ Mg2+ ₇₂ Li+ ₅₇ Íon Mobilidade (m2_/s.V) K+ _{7,62 x 10}-8 Ca2+ _{6,12 x 10}-8 Na+ _{5,19 x 10}-8

43

44

45

46

Padrão Interno

R

2

_{= 0,76012}

R

2

_{= 0,99117}

Tipo de injeção

Ânions

1 – Cl -2 – NO3 -3 – SO4

-Pratos Teóricos

H





A + B/u

x

+ Cu



x

 = 2Dt

v

total

= L

d

/t

t = L

d

/ 

ap

E

E = V/L

t



ap

V L

d

2D L

t

N =

Pratos Teóricos

Cálculo dos pratos teóricos? ✓ap= 2 x 10-8m2/V.s

✓tempo de migração (t) = 10 min ✓coluna capilar Ld= 50 cm e Lt= 60 cm

✓E = 25 kV

Calculando o número de pratos teóricos para K+_{e soro albumina}

✓D (K+_{) = 2,0 x 10}-9_m2_{/s (H} 2O, 25oC) ✓D (soro albumina) = 0,059 x 10-9_m2_{/s (H} 2O, 20oC)



ap

V L

d

2D L

t

N =

N (K+_{) = 1,0 x 10}5_pratos

N (soro alb.) = 3,5 x 106_pratos

49

50