PATRÍCIA GUERRA PEIXE
ANÁLISE DE CÉLULAS DENDRÍTICAS,
MASTÓCITOS E VASCULARIZAÇÃO NA DOENÇA
PERIODONTAL BIOFILME INDUZIDA EM IDOSOS
NATAL – RN
2020
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
PATRÍCIA GUERRA PEIXE
ANÁLISE DE CÉLULAS DENDRÍTICAS, MASTÓCITOS E VASCULARIZAÇÃO NA DOENÇA PERIODONTAL BIOFILME INDUZIDA EM IDOSOS
NATAL 2020
PATRÍCIA GUERRA PEIXE
ANÁLISE DE CÉLULAS DENDRÍTICAS, MASTÓCITOS E VASCULARIZAÇÃO NA DOENÇA PERIODONTAL BIOFILME INDUZIDA EM IDOSOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Patologia Oral.
Orientador: Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel.
NATAL 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento de Odontologia
Peixe, Patrícia Guerra.
Análise de células dendríticas, mastócitos e vascularização na doença periodontal biofilme induzida em idosos / Patrícia Guerra Peixe. - Natal, 2020.
51 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel. Tese (Doutorado em Patologia Oral) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Natal, 2020.
1. Doenças periodontais - Tese. 2. Triptases - Tese. 3. Células dendríticas - Tese. 4. Antígenos CD34 - Tese. 5. Idosos - Tese. 6. Imuno-histoquímica - Tese. I. Gurgel, Bruno César de Vasconcelos. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D64
Dedico este trabalho aos meus pais, Roberto e
Deise; Luiza e Luiz Roberto, à minha querida irmã Roberta, e à minha amada filha Raphaela, por todo
AGRADECIMENTOS
Deus, agradeço a ti por esta experiência, única, em minha vida. Retornar à área
acadêmica após um longo tempo clínico, fez-me renascer. Tudo nesta vida tem um propósito.
Aos meus queridos pais Deise e Roberto, que me criaram de uma maneira a ver o mundo pelas suas óticas, ofereço todo o meu carinho, e agradeço todo o amor e ensinamentos compartilhados comigo, respeitando seus limites de força e tempo nesta vida. Amarei para sempre vocês.
Aos queridos sogros Luiza e Luiz Roberto, que me adotaram, e têm me ofertado amparo e amor, agradeço todos os ensinamentos passados e por considerarem-me como filha. Guardo vocês no coração.
À minha irmã Roberta, com sua candura e amor, agradeço por todas as palavras de incentivo, amor e vivência. Não importa onde estaremos, sempre encontramos uma maneira de encurtar as distâncias e viver este amor fraternal.
Ao meu cunhado Gabriel, com olhar doce e palavras certeiras, obrigada pelo apoio e incentivo.
À minha joia rara Raphaela, que possui um amor puro e uma empatia com o mundo, agradeço por estar sempre ao meu lado, compartilhando momentos mágicos de nossas vivências. Tenha certeza de que meu amor será eterno e de que estarei ao seu lado sempre, desejando muita paz, luz e harmonia. Obrigada margarida do meu jardim.
Aos colegas de mestrado e doutorado no programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, agradeço a Deus por tê-los em meu caminho nestes anos. Desejo sucesso na vida acadêmica.
Em especial, deixo um agradecimento especial para minhas amigas do coração
Carolina Menezes e Laudenice Lucena. Deus as ilumine sempre. Vocês estarão para sempre
no meu coração.
Aos meus amigos do departamento de odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, agradeço pelos maravilhosos momentos de conversa, descontração e ajuda. Presto um agradecimento especial à Gracinha, Lurdinha, Hévio, Ricardo, Bete e Sandrinha, todos da Patologia; à Patrícia e Joana, da clínica de Estomatologia; à Cecília, Hadassa,
Mônica e Ossian, da biblioteca; à Claudinha, da Radiologia. Eu os amo e sentirei muita
falta. Espero que nossas vidas possam se aproximar novamente.
Aos meus mestres do departamento de odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, agradeço pelos ensinamentos de vida e profissão. Tenham certeza de que os levarei em meu coração e mente, e, seguindo seus exemplos, buscarei aprimorar meus conhecimentos e, da mesma forma, compartilhá-los com os alunos que por mim passarem. Deixo meus agradecimentos em especial à Dra. Ana Myriam Costa de Medeiros, ao Dr.
Ângelo Giuseppe Roncalli da Costa Oliveira, ao Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, ao Dr. Carlos Augusto Galvão Barbosa, à Dra. Erika Janine Dantas da Silveira, à Dra. Erika Oliveira de Almeida, à Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, ao Dr. Leão Pereira Pinto, à Dra. Lélia Batista de Souza, à Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, ao Dr. Kênio Costa de Lima, à Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, à Dra. Patrícia dos Santos Calderon, à Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira, ao Dr. Pedro Paulo de Andrade Santos, à Dra. Roseana de Almeida Freitas e à Dra. Ruthinéia Diogenes Alves Uchoa Lins.
Ao querido mestre e orientador Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel, agradeço pelos ensinamentos acadêmicos e de vida que você pôde compartilhar comigo ao longo do mestrado e doutorado. Para mim você é um exemplo de humanidade, empatia, competência, organização, conhecimento e inteligência. Tenha certeza de que levo estas experiências adquiridas e as utilizo quando exerço à docência, e de que nunca esqueço suas palavras. Sei que continuarei aprendendo contigo ao longo da vida. Desejo-lhe muita luz, prosperidade e harmonia.
Aos irmãos espirituais que me acompanham, agradeço pelas intuições e proteção. Muita luz e caridade em nosso caminho. Vamos seguir os ensinamentos do mestre Jesus Cristo.
“Caridade ensinada melhora os ouvidos. Caridade praticada aprimora os corações.”
(Emmanuel por Francisco Cândido Xavier)
RESUMO
A microbiota e o sistema imune do idoso apresentam algumas alterações, favorecendo ao aparecimento de infecções e doenças inflamatórias. A doença periodontal é um exemplo, permeando entre fase imediata e tardia, pode ter alterações em sua evolução com o envelhecimento humano. Compreender a doença periodontal e sua relação com o ciclo da vida é importante para a prevenção, tratamento e cura. Este estudo tem como objetivo avaliar a quantidade de mastócitos (triptase), células dendríticas imaturas (CD1a), células dendríticas maduras (CD83) e vasos sanguíneos (CD34) em 154 tecidos periodontais saudáveis e doentes (27 idosos e 127 adultos). Foi utilizada a técnica de imunoistoquímica através da imunomarcação do CD1a, CD83, triptase e CD34, sendo contabilizados em 5 campos de maior número de células positivas, no aumento de 1000x. Para o CD34, ainda foram calculadas a área e o perímetro microvascular para todos os vasos sanguíneos presentes, e dos vasos com presença do endotélio vascular alto. Não houve diferença na imunomarcação das células dendríticas, dos mastócitos e na quantidade de vasos sanguíneos nos tecidos gengivais, entre os casos de gengiva clinicamente saudável, gengivite induzida por biofilme e periodontite estágios II, III e IV, avaliando isoladamente os grupos etários: adultos e idosos. As células dendríticas imaturas são mais numerosas no idoso com o quadro clínico de gengivite e periodontite. Os adultos com gengivite induzida por biofilme possuem maior quantidade de vasos sanguíneos que o grupo idoso. A área microvascular e o perímetro microvascular dos vasos sanguíneos com o endotélio vascular alto apresentaram maiores nos idosos nos casos de gengivite. Este estudo concluiu que nesta amostra não houve diferença na quantidade de células dendríticas imaturas e maduras, mastócitos na doença periodontal dentro dos grupos etário, porém as células dendríticas imaturas estão mais presentes no idoso podendo estar relacionado a algum decréscimo funcional. Em relação aos vasos sanguíneos, há presença de HEVs em adultos e idosos, não havendo diferença entre os diagnósticos. Nos idosos com gengivite há um aumento da área microvascular e perímetro microvascular, necessitando de estudos que justifiquem esta diferença.
ABSTRACT
The elderly's microbiota and immune system show some changes, favoring the onset of infections and inflammatory diseases. Periodontal disease is an example, permeating between immediate and adaptative stages, it can have changes in its evolution with human aging. Understanding periodontal disease and its relationship with the life cycle is important for prevention, treatment and cure. This study aims to assess the amount of mast cells (tryptase), immature dendritic cells (CD1a), mature dendritic cells (CD83) and blood vessels (CD34) in 154 healthy and sick periodontal tissues (27 elderly and 127 adults). The immunohistochemistry technique was used through the immunostaining of CD1a, CD83, tryptase and CD34, being counted in 5 fields with a greater number of positive cells, in the 1000x increase. For CD34, the microvascular area and perimeter were also calculated for all blood vessels present, and for vessels with the presence of high vascular endothelium. There was no difference in the immunostaining of dendritic cells, mast cells and the amount of blood vessels in the gingival tissues, between cases of clinically healthy gingiva, biofilm-induced gingivitis and stages II, III and IV periodontitis, evaluating the age groups: adults and elderly. Immature dendritic cells are more numerous in the elderly with the clinical picture of gingivitis and periodontitis. Adults with biofilm-induced gingivitis have a greater amount of blood vessels than the elderly group. The microvascular area and the microvascular perimeter of the blood vessels with the high vascular endothelium were larger in the elderly in cases of gingivitis. This study concluded that in this sample there was no difference in the amount of immature and mature dendritic cells, mast cells in periodontal disease within the age groups, however, immature dendritic cells are more present in the elderly and may be related to some functional decrease. Regarding blood vessels, there are HEVs in adults and the elderly, with no difference between diagnoses. In the elderly with gingivitis there is an increase in the microvascular area and microvascular perimeter, requiring studies that justify this difference.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Origem dos mastócitos. 20
Figura 2 - Processo de maturação das células dendríticas na presença de antígenos. 23 Figura 3 - Interação das células dendríticas com microbiota comensal e patogênica. 24 Figura 4 - Disposição das células dendríticas em mucosa oral. 25 Quadro 1 - Anticorpos, diluição, tempo de incubação, clono, sistema de visualização e
recuperação antigênica utilizados no estudo
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Quadro 2 - Variáveis do estudo de acordo com o tipo de variável, classificação e medida.
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Figura 5 - Imunopositividade para os imunomarcadores CD1a, CD83, triptase e CD34.
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 - Média da idade, mínimo, máximo, desvio padrão relacionados ao diagnóstico clínico e o grupo etário.
35
Tabela 2 - Relação da quantificação dos mastócitos com o diagnóstico clínico do tecido gengival e grupo etário.
36
Tabela 3 - Quantificação das células dendríticas imaturas e maduras de acordo com o diagnóstico clínico do tecido gengival e grupo etário.
37
Tabela 4 - Relação da quantificação dos vasos sanguíneos totais e dos com endotélio vascular alto com o diagnóstico clínico do tecido gengival e grupo etário.
38
Tabela 5 - Relação da média da quantidade de células dendríticas imaturas (CD1a) e maduras (CD83), mastócitos (Triptase) e presença de vasos sanguíneos (CD34) com o diagnóstico clínico do tecido periodontal, dentro de cada grupo etário.
LISTA DE ABREVIATURAS
AA Aggregatibacter actinomycetemcomitans
AMV Área microvascular ANG Angiopoietina
CCR7 Receptor de quimiocina 7
CD1a Do inglês cluster of differentiation 1a, traduzido para grupo de diferenciação 1ª
CD11c+ Do inglês cluster of differentiation 11c, traduzido para grupo de diferenciação 11c
CD14 Do inglês cluster of differentiation 14, traduzido para grupo de diferenciação 14
CD31 Do inglês cluster of differentiation 34, traduzido para grupo de diferenciação 31
CD34 Do inglês cluster of differentiation 34, traduzido para grupo de diferenciação 34
CD83 Do inglês cluster of differentiation 83, traduzido para grupo de diferenciação 83
CD105 Do inglês cluster of differentiation 105, traduzido para grupo de diferenciação 105
CD123 Do inglês cluster of differentiation 123, traduzido para grupo de diferenciação 123
CEP/UFRN Comitê de Ética em Pesquisa de Seres Humanos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
CMV Contagem microvascular EUA Estados Unidos da América
FGF-2 Do inglês fibroblast growth fator-2, traduzido como fator de crescimento fibroblástico-2
FN Fusobacterium nucleatum
ICAM1 Do Inglês intercellular adhesion molecule-1, traduzido como molécula de adesão intercelular-1
ICC Do inglês, intraclass correlation coeficiente traduzido como coeficiente de
correlação interclasse
IG Imunoglobulina
IMAJEJ Do inglês Image Processing and Analisis in Java, traduzido como análise e processamento de imagem em Java
INF- γ Interferon gama IL Interleucina
JAM-3 Do inglês juntional adhesion molecule-3, traduzido como molécula de adesão juncional-3
LPS Lipopolissacarídeo
MHC Do inglês major histocompatibility complex, traduzido como complexo de histocompatibilidade
MMP Metaloproteinase da matriz
PDGFB Do inglês platelet-derived growth fator-B, traduzido como fator de crescimento plaquetário-B
PG Porphyromonas gingivalis
PI Prevotella intermedia
PMV Perímetro microvascular PS Profundidade de sondagem
SPSS Do inglês Statistical Package for the Social Sciences, traduzido para pacote estatístico para as ciências sociais
TD Treponema denticola
TF Tannerella forsythia
TLR Do inglês Toll-like receptors, traduzido como receptores tipo Toll
TNF-α Do inglês tumor necrosis factor alpha, traduzido como fator de necrose
UFRN Universidade Federal do Rio grande do Norte
VCAM Do inglês vascular cell adhesion molecule, traduzido como molécula de adesão vascular
VEGF Do inglês vascular endotelial growth factor, traduzido como fator de crescimento endotelial vascular
VEGFR2 Do inglês receptor 2 vascular endotelial growth factor, traduzido como receptor do fator de crescimento endotelial vascular-2
µm Micrômetro.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 15
2 REVISÃO DE LITERATURA... 17
2.1 A relação entre o envelhecimento e as doenças... 17
2.2 A doença periodontal e o envelhecimento... 17
2.2.1 Doença periodontal... 17
2.2.2 Doença periodontal e células do sistema imune inato no idoso... 19
2.2.2.1 Células dendríticas no tecido periodontal... 19
2.2.2.2 Mastócitos no tecido periodontal... 21
2.2.3 Presença de vasos sanguíneos na doença periodontal... 25
3 OBJETIVOS... 27 3.1 Objetivo geral... 27 3.2 Objetivos específicos... 27 4 MATERIAIS E METODOS... 28 4.1 Implicações éticas... 28 4.2 Tipo de estudo... 28 4.3 População... 28 4.4 Amostra... 28
4.4.1 Critérios para seleção de amostra... 29
4.4.1.1 Critérios de inclusão... 29
4.4.1.2 Critérios de exclusão... 30
4.5 Estudo morfológico... 30
4.7 Análise do perfil imunoistoquímico... 31 4.8 Variáveis... 32 4.9 Análise estatística... 34 5 RESULTADOS... 35 5.1 Caracterização do estudo... 35 5.2 Resultados morfológicos... 35 5.2 Resultados imunoistoquímicos... 36 6 DISCUSSÃO... 41 7 CONCLUSÃO... 45 REFERÊNCIAS... 46
ANEXO 1 - APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA 50
ANEXO 2 – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO
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1 INTRODUÇÃO
De acordo com as Nações Unidas, a estimativa de pessoas com mais de 65 anos no mundo será de 1,5 bilhão, em 2050. No Brasil, a estimativa será superior a 30 milhões de pessoas idosas em 2030. O aumento da expectativa de vida advém de melhores condições de vida e cuidados com a saúde (UNITED NATIONS, 2019).
Porém, o envelhecimento é caracterizado por declínios funcionais, levando ao aumento da morbidade e à mortalidade nestes indivíduos. Dentre as doenças mais prevalentes em idosos podem ser citados o câncer, doença cardiovascular, doenças respiratórias, doenças metabólicas e desordens no sistema imunológico (REYNOLDS, 2014; SHET et al. 2015).
A doença periodontal induzida pelo biofilme dentário é uma doença de caráter imune inflamatório crônico, de alta prevalência na população adulta e idosa, caracterizada por ser de origem multifatorial com etiologia associada a uma disbiose da microbiota que coloniza o sulco gengival em um hospedeiro susceptível. Dessa forma a microbiota suscita uma resposta imunológica caracterizada por processos inflamatórios que afetam o tecido de proteção e suporte ao elemento dentário, podendo ter alterações em sua evolução com o envelhecimento humano (BRASIL, 2012; MARJANOVIC et al., 2016; WU et al.,2016).
Células do sistema imunológico inato estão presentes no tecido gengival e são responsáveis por fagocitar e ativar resposta imune adaptativa, atuando como sentinelas no local da injúria. Os mastócitos são importantes na resposta imune inata, na doença inflamatória, na cicatrização e nas reações alérgicas. Possui como função a estimulação de células inflamatórias e atuação direta em vasos sanguíneos locais, através da secreção de mediadores químicos presentes em seus grânulos (CAUGHEY, 2007; HUANG et al., 2014).
Na doença periodontal em adultos, os mastócitos estão em um número elevado no local da injúria e podem estar relacionados com a severidade da doença em adultos (LAGDIVE et
al., 2013). Em relação aos vasos sanguíneos, há alteração do calibre e aumento do número de
vasos nos casos de periodontite relação aos casos de gengiva saudável, estimulados pela liberação de mediadores químicos e fatores de crescimento (ARTESE et al., 2010; SMITH et
al., 2015).
As células dendríticas imaturas possuem alto poder fagocitário via MHC de classe II, e, em contato com o antígeno, sofrem maturação e passam a ter a principal função de apresentadora de antígeno e consequente ativação de linfócitos T nos nódulos linfáticos (HUANG; GIBSON, 2014). Na doença periodontal, as células dendríticas podem estar em maior quantidade do que as células T (BODINEAU et al., 2007; BODINEAU et al., 2009),
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tendendo a um perfil mais imaturo em pacientes idosos, podendo estar relacionado a gravidade da doença nesta população (CURY et al., 2013) pela redução da função de reconhecimento dos antígenos, diminuindo a ativação via MHC de classe II(AGRAWAL et al., 2007; AGRAWAL; GUPTA, 2011).
Alterações no reconhecimento de antígenos por células fagocitárias, como macrófagos e células dendríticas; na resposta celular adquirida, através de linfócitos T e B; deficiência na tolerância imunológica; e a estimulação e liberação continuada de mediadores químicos facilitam a presença de doenças infecciosas e inflamatórias nos idosos (HAIJSHENGALLIS, 2010; AGRAWAL; GUPTA, 2011; WORDSWORTH; DUNN-WALTERS, 2011; SHET et al., 2015; WU et al., 2016; LIRA-JUNIOR et al., 2018).
Compreender a doença periodontal e sua relação com o ciclo da vida é importante para na prevenção, tratamento e cura. Desta forma, este estudo tem como objetivo avaliar na doença periodontal a imunorreação de mastócitos, células dendríticas imaturas e maduras e vasos sanguíneos em tecidos periodontais de indivíduos adultos e idosos.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A relação entre o envelhecimento e as doenças
O envelhecimento está relacionado à perda parcial na competência do sistema imune, aumento de processos inflamatórios e autoimunidade, levando ao aparecimento de doenças como o câncer, doenças cardiovasculares, doenças respiratórias, diabetes e infecções orais (AGRAWAL, GUPTA, 2011; REYNOLDS, 2014).
Mudanças no sistema imune são identificadas em indivíduos idosos. As deficiências no sistema imune na população idosa estão relacionadas à identificação do patógeno, fagocitose, apresentação de antígenos, quimiotaxia e secreção de citocinas (SHET et al., 2015). Além disso, há causa um aumento de secreção de citocinas inflamatórias, normalmente pela presença de radicais livres e alterações funcionais em células, que ainda podem diminuir a secreção de citocinas anti-inflamatórias, perpetuando os processos inflamatórios. A compreensão deste fato é importante, pois há um risco maior de infecção nestes indivíduos após procedimentos invasivos, necessitando de um cuidado minucioso com a saúde (HAJISHENGALLIS, 2010).
Dentre as doenças inflamatórias na cavidade bucal que estão relacionadas a agravamentos na saúde do idoso, encontra-se a doença periodontal, sendo importante compreender na patogênese da doença e a sua relação com o envelhecimento por ser uma doença de alta prevalência nesta população (BRASIL, 2012; MARJANOVIC et al., 2016; WU
et al., 2016).
2.2 A doença periodontal e o envelhecimento
2.2.1 Doença periodontal
A doença periodontal induzida por biofilme dentário é um somatório de presença de patógenos periodontais e respostas inflamatórias crônicas, com destruição de tecido moles e duros, levando a perda dentária em alguns casos (EBERSOLE et al., 2008; HOLZHAUSEN et al., 2011). As bactérias comumente relacionadas à doença periodontal são das espécies
Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf), Treponema denticola (Td), Fusobacterium nucleatum (Fn) e Prevotella intermedia (Pi), apesar de serem microrganismos presentes na cavidade oral, em um quadro de
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disbiose, são destruição dos tecidos de suporte dentário e a ativação de células de defesa presentes no local da agressão (EBERSOLE et al., 2013; WU et al., 2016).
Por acometer frequentemente os idosos, a doença periodontal é estudada a respeito da sua etiopatogenia e na relação com doenças sistêmicas nesta população. É considerada uma doença multifatorial, que acomete o tecido gengival, cemento, ligamento periodontal e tecido ósseo (HUANG; GIBSON, 2014).
O perfil microbiano salivar apresenta mudanças entre os pacientes adultos e idosos. Os idosos (indivíduos com idade superior a 64 anos), segundo do estudo de Lira-Junior et al. (2018), apresentam mais espécies microbianas que os adultos (indivíduos com idade menor ou igual a 64 anos). As principais espécies encontradas no estudo, no grupo dos idosos, incluem as bactérias Aa, Pg, Td e Tf. Além disso, neste grupo foi encontrado um aumento de biomarcadores inflamatórios na saliva, como as metatoproteinases (MMP) 8, 9 e prostaglandina E2, que estão relacionadas com a atividade da doença.
A classificação das doenças periodontais auxilia no diagnóstico e tratamento. São utilizados parâmetros clínicos como perda de inserção, profundidade de sondagem, sangramento à sondagem, e perda óssea para a identificação, controle da doença periodontal. As condições e doenças periodontais são divididas em gengiva clinicamente saudável; condições e doenças gengivais; periodontite; e outras condições que afetam o periodonto. Em relação à presença de biofilme, é importante a observação dos sinais clínicos da inflamação no exame dos tecidos periodontais (CATON et al., 2018).
É considerada gengiva clinicamente saudável quando não há perda de inserção, a profundidade de sondagem (PS) é de até 3,0 mm, o sangramento à sondagem está presente em menos de 10% dos sítios e não há perda óssea avaliada radiograficamente. No quadro de gengivite induzida pelo biofilme, também não apresenta perda de inserção e perda óssea radiográfica em relação ao grupo anterior, mas apresenta sangramento à sondagem em 10% ou mais sítios (CHAPPLE et al., 2018; TROMBELLI et al., 2018).
Na periodontite, é observada perda de inserção em dois ou mais sítios, com 3mm ou mais; e perda óssea horizontal, sendo classificada em estágio I (1,0 - 2,0 mm ou perda óssea coronária, com PS de até 4,0 mm), estágio II (3,0 - 4,0 mm ou perda óssea coronária, com PS de até 5,0 mm), estágio III ( ≥ 5,0 mm ou perda óssea em terço médio a terço apical da raiz, PS de ≥ 6,0 mm, e perda dentária de até 4 dentes por periodontite), e estágio IV (PI de ≥ 5,0 mm ou perda óssea em terço médio a terço apical da raiz, neste caso o paciente teria perda dentária de ≥ 5 dentes por periodontite) (PAPAPANOU et al., 2018; TONETTI; GREENWELL; KORNMAN, 2018).
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A doença periodontal, apesar de ter um componente imune-inflamatório importante, pode ser controlada através da terapia de manutenção que está relacionada ao risco do paciente e fatores envolvidos a cada caso, diminuindo a recidiva em comparação aos que não possuem estes cuidados, o que pode aumentar a perda tecidual, levando à perda dos elementos dentários envolvidos (CHAPPLE et al., 2018).
2.2.2 Doença periodontal e células do sistema imune inato no idoso
O acúmulo de biofilme dentário é rapidamente monitorado por células do sistema inato, a primeira linha de defesa contra a invasão de microrganismos. Elas são compostas, dentre outras por macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e mastócitos, que não possuem especificidade para patógenos periodontais, sendo necessária a ativação do sistema imune adaptativo (composto por linfócitos B e T) na perpetuação da infecção (EBERSOLE et al., 2013; WILENK et al., 2014).
Nos idosos, além das alterações na qualidade da microbiota e o aumento de patógenos periodontais, é observado um declínio no sistema imune do hospedeiro, favorecendo o estabelecimento da infecção e perpetuação do processo inflamatório através das alterações moleculares pró-inflamatórias, pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio, presente em indivíduos com ou sem doença periodontal e pela produção exacerbada de citocinas pró-inflamatórias pelas células envolvidas no processo de doença (CHUNG et al., 2011; SHET et
al., 2015).
2.2.2.1 Mastócitos no tecido periodontal
Os mastócitos são células residentes no tecido saudável, tendo uma função importante na resposta imune imune-inflamatória, na cicatrização e nas reações alérgicas. São originárias da medula óssea e têm sua migração para os tecidos, sem haver ativação neste processo. Nos tecidos, estas células ficam localizadas próximas aos vasos sanguíneos, aos nervos e às superfícies mucosas que, normalmente, estão em contato com o meio externo (Figura 1) (CAUGHEY, 2007).
Caracterizadas por ter um núcleo arredondado e um citoplasma com até 300 grânulos, têm degranulação destes através de um estímulo externo, provocando a liberação de mediadores inflamatórios. Por gerar um grande número de substâncias biologicamente ativas, os mastócitos possuem capacidade de estimular células no microambiente (granulócitos,
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monócitos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B e células natural killer) bem como alterar a estrutura dos vasos sanguíneos locais (LAGDIVE et al.; 2013; HUANG et al., 2014).
Figura 1 - Origem dos mastócitos.
Fonte: LAGTIVE et al. (2013, p.65).
Os grânulos são compostos por mediadores químicos responsáveis por agir em processos alérgicos e inflamatórios, tais como leucotrienos, fator ativador de plaquetas,
TNF-α, triptase, quimase, carboxipeptidade A, catepsina G, histamina, heparina, serotonina, hidrolase ácida e interleucina (IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10, IL13 e IL16), fator estimulador de colônias de granulócito e macrófagos, fator de ativação plaquetária, RANTES e proteína inflamatória macrofágica 1a (LAGDIVE et al., 2013; HUANG et al., 2014). Mais especificamente, a triptase é um componente dos grânulos, amplamente encontrada nas mucosas, no tecido gengival e conjuntivo. Tem a função de servir de fator quimiotático para neutrófilos, linfócitos e eosinófilos, além de sua atividade proteolítica, sendo relacionada a perda de inserção e perda óssea pelo aumento dos níveis nos tecidos periodontais doentes. Por estar presente em todos os mastócitos humanos, é considerada um ótimo inumomarcador (CAUGHEY, 2007; HOLZHAUZEN et al., 2011; LAGDIVE et al., 2013; WILENK et al., 2014).
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Pesquisando a presença de mastócitos em tecidos periodontais saudáveis e com doença, Popovici et al. (2014) observaram que houve um aumento do número dessas células nos casos de periodontite em comparação aos casos de gengiva clinicamente saudável, associado à intensa degranulação nos casos de periodontite.
Marjanovic et al. (2016) quantificaram os mastócitos (histoquímica com azul de toluidina) presentes nos casos de gengiva clinicamente saudável, gengivite, periodontite moderada e severa em indivíduos de 13 a 68 anos e verificaram um aumento do número de mastócitos na periodontite em comparação com os casos de gengivite e gengiva clinicamente saudável, sugerindo um papel importante dos mastócitos no desenvolvimento do processo inflamatório dos tecidos periodontais.
Huang et al. (2014) quantificaram através de imunomarcador duplo a triptase e a imunoglobulina de célula T com domínio mucinoso 3 presentes em mastócitos em 83 espécimes de tecido gengival com o diagnóstico clínico de gengiva clinicamente saudável, periodontite moderada e crônica. Observou-se um aumento da imunomarcação de ambas as proteínas relacionado com a severidade da doença.
No estudo de Lagdive et al. (2013) foram quantificados através de imunomarcadores para os mastócitos em 10 espécimes de tecido gengival clinicamente saudável, 10 espécimes com gengivite, e 10 espécimes com periodontite crônica, sem dados sobre a idade dos indivíduos. Um aumento do número de mastócitos foi detectado nos casos mais severos, sugerindo uma relação da presença destas células com a perda tecidual local, provavelmente pela liberação de citocinas.
2.2.2.2 Células dendríticas no tecido periodontal
As células dendríticas (DCs) são células de defesa responsáveis por identificar, fagocitar e apresentar antígenos para ativação de outros tipos celulares. Quando identificam um patógeno, passam por um processo de maturação, e migram para os nódulos linfáticos para regular a diferenciação de células T CD4+. Elas são uma ponte entre o sistema inato e o sistema imune adaptativo, iniciando e regulando a resposta adaptativa (EBERSOLE et al., 2013; WILENK et
al., 2014; WU et al., 2016).
Uma população celular heterogênea, as DCs são encontradas e divididas segundo sua origem. As de origem mieloide compreendem as DCs convencionais do sangue; as DCs intersticiais dos tecidos; as células de Langerhans da pele; e DCs derivadas de monócitos. As de origem linfoide são representadas pelas DCs plasmocitoides (CUTLER; JOTWANI, 2006;
22
AGRAWAL; GUPTA, 2011). As células dendríticas mieloides estão presentes no sangue e nos tecidos periféricos, com expressão das proteínas CD11c+, CD123, CD14-, e CD1a+ (CURY et
al., 2013).
O CD1a é uma proteína expressa em células dendríticas e timócitos corticais. É utilizada para a identificação de células dendríticas imaturas, pois ajuda a diferenciar de outras células apresentadoras de antígenos com prolongamentos citoplasmáticos (CUTLER; JOTWANI, 2006; CURY et al., 2013).
Um estudo avaliando a expressão das DCs em amostra de tecido gengival humano com diagnóstico clínico de gengiva saudável e de periodontite, demonstrou um aumento da imunomarcação do CD1a na periodontite em comparação ao tecido gengival saudável, evidenciando a presença de células dendríticas imaturas no local da agressão (ARUN et al., 2010).
Na periferia, as DCs mieloides estão no estado imaturo, com alta capacidade fagocitária, sendo considerada sentinela contra patógenos. Quando entram em contato com os invasores, sofrem um processo de maturação (WILENK et al., 2014). As DCs maduras expressam um receptor de quimiocina 7 (CCR7) que irá mediar a sua migração para o linfonodo e supraregula moléculas do complexo histocompatibilidade (MHC) de classe II e moléculas co-estimulatórias, que vão permitir a ativação de linfócitos T CD4+ (Figura 1). Esta capacidade de apresentar um antígeno via MHC de classe II (além da apresentação de MHC de classe I a células T CD8+) concedeu às células dendríticas a denominação de apresentadora de antígenos (figura 2) (HANCOCK et al., 2012; EBERSOLE et al., 2013; CURY et al., 2013; WILENK et
al., 2014).
Expressando receptores TRL 1, 3, 4 e 8, as DCs mieloides possuem a capacidade de reconhecimento de antígenos específicos para posterior ativação de mecanismos de sinalização celular, que induzem a produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12, IFN-γ), quimiocinas, moléculas de adesão (ICAM-1), moléculas co-estimuladoras, MHC, bem como moléculas efetoras (peptídeos antimicrobianos e espécies reativas de oxigénio). Através desta ligação há a maturação da célula e mudança na função, passando de uma célula fagocitária para uma célula apresentadora de antígeno (AGRAWAL; GUPTA, 2011; HUANG; GIBSON, 2014).
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Figura 2 - Processo de maturação das células dendríticas na presença de antígenos.
Fonte: WILENK et al. (2014, p.120).
Quando maduras, as células dendríticas podem secretar diferentes citocinas inflamatórias (a depender do antígeno) para atuar na ativação e diferenciação de células T (Figura 3) (EBERSOLE et al., 2013; WILENSKY et al., 2014).
Para a identificação das DCs maduras pode ser utilizado o CD 83, que é uma proteína transmembrana do tipo I, sendo considerado um imunomarcador específico (CUTLER; JOTWANI, 2006; HEILINGLOH et al., 2017).
O processo de envelhecimento humano provoca diminuição no reconhecimento de antígenos em células dendríticas mieloides e plasmocitoides, pela redução de receptores TRL, incapacitando de apresentá-los nos órgãos linfoides periféricos e pela a diminuição na produção de citocinas com fatores quimiotáteis (AGRAWAL et al., 2007; AGRAWAL; GUPTA, 2011). A presença de DCs no tecido periodontal não é homogênea. Normalmente as células dendríticas não estão distribuídas igualmente no epitélio gengival, sendo encontradas no epitélio sulcular e raramente no epitélio juncional (Figura 4) (CURY et al., 2013; WILENK et
al., 2014).
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Fonte: EBERSOLE et al. (2013, p.57).
Figura 4 - Distrubuição das células dendríticas em tecido gengival.
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Huang et al. (2011) pesquisaram células dendríticas do tecido periodontal in vitro, frente a uma infecção polimicrobiana. Observaram que as células dendríticas imaturas secretaram IL-6 em contato com bactérias Gram-negativas, e as DCs maduras produziram TNF-α e IL-IL-6 em contato com as bactérias Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum e
Porphyromonas intermedia, evidenciando o produto secretório destas células frente a
periodontopatógenos.
No estudo de Cury et al. (2013), ao investigarem os efeitos das bactérias na maturação e a função das células dendríticas maduras em indivíduos com gengivite e periodontite, observaram que células de indivíduos com periodontite tinham um fenótipo mais imaturo e com um perfil de citocinas com ação pró-inflamatória do que as de indivíduos com gengivite.
Visando estudar indivíduos idosos, pesquisadores avaliaram a imunomarcação de proteínas relacionadas a células dendríticas imaturas e maduras, e linfócitos T CD4+ em tecido gengival de indivíduos acima de 60 anos. Evidenciaram que há um aumento de DCs imaturas e maduras, e um decréscimo das células T CD4+, e concluíram que pode haver uma capacidade diminuída das DCs maduras como apresentadora de antígenos (BODINEAU et al., 2007; BODINEAU et al., 2009).
2.2.3 Presença de vasos sanguíneos na doença periodontal
Os microrganismos envolvidos na doença periodontal, incluindo Porphyromonas
gingivalis, induzem respostas pró-inflamatórias através de receptores tipo Toll 2,4 pelo
lipopolissacarídeo (LPS) e outros fatores de virulência, levando à destruição dos tecidos periodontais. A liberação de mediadores pró-inflamatórios promove ação, dentre outras células, nas células endoteliais e macrófagos. A ação nas células endoteliais pode alterar o calibre vascular ou estimular a formação de novos vasos (angiogênese) (ZHOU; AMAR, 2007).
A angiogênese é estimulada por citocinas e fatores de crescimento que são liberados durante o processo inflamatório, sendo frequentemente encontrada nos locais da inflamação a IL-1β, IL-8, MMP 2 e 9, TNF-α, fatores de crescimento do endotélio vascular (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C E VEGF-D), fator de crescimento fibroblástico (FGF-2), angiopoietinas (ANG 1) e fator de crescimento plaquetário B (PDGFB) (ADAMS; ALITALO, 2007; KASPRZAK et al., 2012, KASPRZAK et al., 2013, SMITH et al., 2015; VLADAU et al., 2016).
As células endoteliais expressam diversas moléculas de adesão como: neuropilina, molécula de adesão intercelular (ICAM), molécula de adesão celular vascular (VCAM-1),
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moléculas de adesão juncional 3 (JAM-3), E-selectina, CD105, CD31 e CD34 (ADAMS; ALITALO, 2007; UEKI et al., 2008; KASPRZAK et al., 2013). Dentre estas, o CD34 é utilizado como imunomarcador de células do endotélio vascular, o CD 34 é uma glicoproteína transmembrana, agrupada na família CD34 e na subfamília das sialomucinas. Encontra-se expressa em células-tronco hematopoiéticas, no endotélio vascular de pequenos vasos, em algumas linhagens de células neoplásicas. Sua função é facilitar a diapedese dos leucócitos através da sua ligação com a L-selectina (KASPRZAK et al., 2013).
Na doença periodontal são observadas alterações no endotélio vascular sanguíneo em relação a diâmetro e à angiogênese a partir de capilares pré-existentes, através da adição de precursores de células endoteliais advindas da medula óssea e pala transdiferenciação de monócitos em células endoteliais (SMITH et al., 2015).
Artese et al. (2010) pesquisaram a angiogênese através da expressão do VEGF e da densidade microvascular, óxido nítrico sintase e Ki-67 em tecidos gengivais saudáveis, com periodontite crônica e agressiva. Uma maior imunomarcação destes marcadores foi observada na periodontite agressiva, seguido dos casos de periodontite crônica, em comparação ao tecido saudável.
Já estudo de Gonçalves, Lourenço e Gurgel (2019), avaliou em 90 espécimes de tecido gengival com o diagnóstico clínico de gengiva clinicamente saudável, gengivite e periodontite, a microdensidade vascular de vasos. Um menor número de vasos sanguíneos foi observado nos casos de periodontite em relação ao tecido gengival com gengivite.
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3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a imunomarcação de mastócitos, células dendríticas imaturas e maduras e vasos sanguíneos de acordo com o diagnóstico clínico de gengivite induzida por biofilme e periodontite estágios II, III, IV em indivíduos adultos e idosos.
3.2 Objetivos específicos
• Verificar a quantificação da imunomarcação de mastócitos, células dendríticas imaturas e maduras e vasos sanguíneos no tecido gengival de acordo com o diagnóstico clínico de gengiva clinicamente saudável, gengivite induzida por biofilme e periodontite, de amostras obtidas de indivíduos adultos e idosos.
• Analisar a diferença da imunomarcação de mastócitos, células dendríticas imaturas e maduras e vasos sanguíneos em tecidos gengivais diagnosticados como gengiva clinicamente saudável, gengivite induzida por biofilme e periodontite, de acordo com a idade.
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4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Implicações éticas
O projeto de pesquisa referente a este trabalho foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa de Seres Humanos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN), recebendo a devida aprovação conforme parecer no 3.082.347 (Anexo 1). O termo de consentimento livre esclarecido foi aplicado nesta pesquisa (Anexo 2).
4.2 Tipo de estudo
A presente pesquisa consistiu em uma análise transversal caracterizada por uma avaliação descritiva, comparativa e retrospectiva, constituída pela observação, análise e registro das expressões imunoistoquímicas do CD1a, CD83, Triptase e CD34 em tecido gengival.
4.3 População
Nesta pesquisa, a população foi constituída pelos casos com o diagnóstico clínico de gengiva clinicamente saudável, gengivite e periodontite, arquivados no setor de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), entre os anos de 1970 até 2019. Adicionalmente, foi constituída de amostras de tecido gengival coletadas em pacientes atendidos nas clínicas do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte de 2018 a 2019.
4.4 Amostra
A amostra foi intencional e por conveniência, composta por 154 espécimes de tecidos gengivais, divididos em grupos etários segundo a OMS (2015), sendo 27 casos de idosos (≥ 60 anos) e 127 casos de adultos (18-59 anos) de acordo com parâmetros clínicos de profundidade de sondagem, perda de inserção e o diagnóstico clínico na região que foi extraída a amostra. Foi classificado como gengiva clinicamente saudável quando não houve perda de inserção no
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elemento dentário, a profundidade de sondagem fosse de até 3mm, e ausência sangramento à sondagem e perda óssea local. A gengivite induzida pelo biofilme foi diagnosticada quando não houve perda de inserção no elemento dentário, a profundidade de sondagem fosse de até 3mm, presença de sangramento à sondagem e sem perda óssea. No caso de periodontite estágios II, III e IV, presença de perda de inserção no elemento dentário, com 3mm ou mais de perda óssea horizontal, profundidade de sondagem de 3,0 mm ou mais, seguindo os critérios de diagnóstico da Academia Americana de Periodontia e Federação Europeia de Periodontia, nos casos coletados de pacientes atendidos nas clínicas do Departamento de Odontologia da UFRN (Adaptado de CHAPPLE et al., 2018; TROMBELLI et al., 2018; PAPAPANOU et al., 2018; TONETTI; GREENWELL; KORNMAN, 2018). Os fragmentos de tecido gengival foram oriundos de procedimentos cirúrgicos no tecido periodontal pelas seguintes razões: aumento de coroa clínica, gengivectomia, exodontia por finalidade protética e exodontia por doença periodontal.
Os casos arquivados no setor de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) foram reclassificados de acordo com a nova classificação descrita acima, levando em consideração o diagnóstico clínico periodontal, dados clínicos de profundidade de sondagem e perda de inserção, havendo mudanças somente nos casos denominados periodontite agressiva e crônica, sendo incluídos na categoria periodontite e seus estágios (CHAPPLE et al., 2018; FINE; PATIL; LOOS, 2018).
4.4.1 Critérios para a seleção da amostra
4.4.1.1 Critérios de inclusão
Foram incluídas as amostras de casos de pacientes previamente recrutados de projetos aprovados por comitê de ética e publicados com os mesmos critérios de inclusão e exclusão deste estudo.
Os pacientes com o diagnóstico clínico de gengiva clinicamente saudável, gengivite induzida por biofilme e periodontite, maiores que 18 anos, com os dados completos na ficha cadastral e com material biológico suficiente nos blocos de parafina para o desenvolvimento da pesquisa, foram incluídos.
30
4.4.1.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos os pacientes menores de 18 anos, portadores de gengivites associadas a outros fatores que não sejam ao biofilme dentário e doença periodontal necrozante.
4.5 Estudo morfológico
O estudo morfológico foi realizado em microscopia de luz, a partir de cortes histológicos de 5 μm de espessura, corados pela técnica da hematoxilina e eosina. Foi avaliada a qualidade e as características anatomopatológicas da amostra, de acordo com os critérios abaixo:
• Tecido epitelial:
➢ Tipo de ceratinização: não ceratinizado, paraceratinizado, ortoceratinizado.
➢ Alterações no epitélio: hiperparaceratinizado, hiperortoceratinizado, acantose, hiperplasia, atrofia, espongiose, exocitose, degeneração hidrópica, duplicação da camada basal.
• Tecido conjuntivo:
➢ Densidade do tecido conjuntivo (denso, variado ou frouxo). ➢ Intensidade do infiltrado inflamatório (leve, moderado e intenso). ➢ Tipo de infiltrado inflamatório (linfoplasmocitário, linfocitário e misto). • Vasos sanguíneos:
➢ Vasos sanguíneos com endotélio delgado, com células achatadas compatível com o endotélio capilar.
➢ Vasos sanguíneos com endotélio vascular alto.
4.6 Estudo imunoistoquímico
As amostras selecionadas, fixadas em formol a 10%, incluídas em parafina, foram submetidas a cortes histológicos de 3 µm de espessura, estendidas em lâminas de vidro devidamente preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxy-silano (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA).
Os cortes foram submetidos às etapas de desparafinização, reidratação e recuperação antigênica com panela pascal (Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA). Posteriormente, o material foi submetido ao bloqueio de peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 10 volumes, lavagem em água corrente, e posteriormente, incubada em proteína
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block (Thermo Scientific, Runcorn, UK) para bloquear ligações inespecíficas. Em seguida,
realizou-se lavagens com tris-hidroximetil-aminometano (TRIS, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) (pH 7,4).
A incubação dos anticorpos primários foi realizada de acordo com a diluição e sistema de visualização a seguir (Quadro 1): CD1a (ScyTec Laboratories, Utah, USA), diluição 1:100, por 60 minutos no sistema de visualização Envision (Dako North America Inc., CA, USA); CD 83 (BioRad Laboratories, California, USA), diluição 1:100, por 60 minutos no sistema de visualização Envision + Link Mouse (Dako North America Inc., CA, USA); CD34 (Cell-Marque, CA, USA), diluição 1:200, por 60 min no sistema de visualização HiDef (HiDef DectectionTM, HRP Polymer System, Cell-Marque, CA, USA); e Triptase (Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), diluição 1:2500, por 30 minutos no sistema de visualização HiDef (HiDef DectectionTM, HRP Polymer System, Cell-Marque, CA, USA). Após esta incubação, foi realizada a revelação com a di-aminobenzida (DAB, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) por 5 minutos, lavagem com solução tampão pH 7,4 e contra coloração com Hematoxilina de Mayer por 10 minutos. O processo foi finalizado com desidratação, diafanização e montagem da lâmina.
Quadro 1 - Anticorpos, diluição, tempo de incubação, clono, sistema de visualização e recuperação antigênica utilizados no estudo.
Anticorpo Diluição Tempo de
Incubação Clone Sistema
Recuperação Antigênica
CD1a 1:100 60 minutos 010 Envision Pascal
CD83 1:200 60 minutos HB15e Envision Pascal
CD34 1:100 60 minutos Qbend/10 HiDef Pascal
Triptase 1:2500 30 minutos AA1 HiDef Pascal
Fonte: Elaborada pelo autor (2020).
4.7 Análise do perfil imunoistoquímico
As análises das imunomarcações das proteínas citadas foram estabelecidas baseadas na positividade de marcação, sendo consideradas positivas as células que apresentam marcação de cor acastanhada. Todas as lâminas foram avaliadas em microscopia de luz, sendo selecionadas 5 áreas com maior representatividade de células. Esta avaliação foi realizada para todos os marcadores, havendo calibração prévia do operador (CD1a: ICC=0,968) (SOUTO et al., 2014; POPOVICI et al., 2014). As imagens das áreas foram capturadas por meio de fotomicroscopia para análise pelo programa ImageJ.
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Os imunomarcadores CD1a, CD83 e a Triptase foram avaliados através da densidade de marcação, onde foi quantificado o número de células positivas em cada área selecionada e, posteriormente, calculada a média de células marcadas nos 5 campos observados. A localização da célula no tecido também foi avaliada no tecido epitelial e tecido conjuntivo (SOUTO et al., 2014; POPOVICI et al., 2014).
O CD 34 foi avaliado através da contagem microvascular, do perímetro microvascular e da área microvascular de todos os vasos sanguíneos presentes e dos vasos sanguíneos que apresentavam o alto endotélio vascular (HEVs). Para a avaliação da contagem microvascular foram selecionadas cinco áreas aleatórias significativas com maior imunomarcação de vasos, sob o aumento de 400x. Em seguida, no aumento de 1000x, foram quantificados manualmente com o auxílio do programa ImageJ (Image Processing and Analisis in Java), com o objetivo de evitar a recontagem de estruturas. O resultado foi expresso pelo número médio de vasos por espécime. Durante o procedimento, qualquer célula ou grupo celular endotelial imunomarcado positivamente separado dos microvasos adjacentes e de outros constituintes do tecido conjuntivo, assim como os vasos contendo lúmen, foram considerados como um vaso unitário. Foram contados como vasos, ainda, estruturas ramificadas e com descontinuidade na sua conformação (LIMA et al., 2011; AGARVAL et al., 2014; GONÇALVES, LOURENÇO e GURGEL, 2019).
Para a medição da área microvascular e do perímetro microvascular foram utilizados os 5 campos selecionados para a contagem microvascular, utilizando o programa ImageJ para demarcar a região. O resultado foi expresso pela média da área microvascular e pela média do perímetro microvascular, respectivamente (AGARVAL et al., 2014; GONÇALVES, LOURENÇO e GURGEL, 2019).
4.8 Variáveis
As variáveis quantitativas e qualitativas deste estudo estão descritas abaixo no Quadro 2.
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Quadro 2 - Variáveis do estudo de acordo com o tipo de variável, classificação e medida.
Fonte: Elaborado pelo autor (2020).
Legenda:*, categórica nominal mutualmente exclusiva.
Variável Tipo Classificação Medida
Idade Independente Quantitativa Anos
Idade categorizada Independente Categórica* 18 e 59 anos ou ≥ 60 anos Sexo Independente Categórica* Feminino e masculino
Diagnóstico clínico Independente Categórica*
Gengiva clinicamente saudável, gengivite induzida por biofilme e
periodontite estágio II, III e IV Densidade do tecido conjuntivo Dependente Categórica* Denso, variado ou frouxo Intensidade do infiltrado inflamatório Dependente Categórica* Leve, moderado ou intenso
Quantidade de células dendríticas
imaturas Dependente Quantitativa
Média da quantificação celular em 5 campos
Quantidade das células dendríticas
maduras no epitélio Dependente Quantitativa
Média da quantificação celular em 5 campos
Quantidade de células dendríticas
maduras no conjuntivo Dependente Quantitativa
Média da quantificação celular em 5 campos
Quantidade de mastócitos no tecido
conjuntivo Dependente Quantitativa
Média da quantificação celular em 5 campos
Quantidade de mastócitos
degranulados no conjuntivo Dependente Quantitativa
Média da quantificação celular em 5 campos
Contagem microvascular de vasos
sanguíneos Dependente Quantitativa
Média da quantificação vascular em 5 campos
Área microvascular de vasos
sanguíneos Dependente Quantitativa
Média da área vascular medida em 5 campos
Perímetro microvascular de vasos
sanguíneos Dependente Quantitativa
Média do perímetro vascular medido em 5 campos Presença de vasos sanguíneos com
endotélio vascular alto (HEV) Dependente Categórica* Sim ou Não Contagem microvascular dos vasos
sanguíneos com endotélio vascular alto (HEV)
Dependente Quantitativa Média da quantificação vascular em 5 campos
Área microvascular dos vasos sanguíneos com endotélio vascular
alto (HEV)
Dependente Quantitativa Média da área vascular medida em 5 campos
Perímetro microvascular dos vasos sanguíneos com endotélio vascular
alto (HEV)
Dependente Quantitativa Média do perímetro vascular medido em 5 campos
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4.9 Análise estatística
Os dados clínicos, morfológicos e imunoistoquímicos foram tabulados em tabelas do programa Microsoft Excel® 2013 e posteriormente exportados para o programa estatístico SPSS® versão 22.0, no qual foram submetidos a uma análise descritiva e inferencial.
Assumindo a não normalidade e a independência da amostra, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney para buscar diferenças significativas. Para o teste de Kruscal-Wallis foram comparadas as variáveis diagnóstico clínico (gengiva clinicamente saudável, gengivite e periodontite) com médias de células positivas imunomarcadas por campo: CD1a, CD83 no tecido epitelial, CD83 no tecido conjuntivo, triptase, contagem microvascular (CMV) de vasos sanguíneos, CMV de vasos sanguíneos com o epitélio vascular alto (HEV), área microvascular (AMV) de vasos sanguíneos, AMV de vasos sanguíneos com o HEV, perímetro microvascular (PMV) de vasos sanguíneos, PMV de vasos com o HEV , dentro de cada grupo etário.
No teste de Mann-Whitney, foram comparadas os grupos etários com os as variáveis CD1a, CD83 no tecido epitelial, CD83 no tecido conjuntivo, triptase, contagem microvascular (CMV) de vasos sanguíneos, CMV de vasos sanguíneos com o epitélio vascular alto (HEV), área microvascular (AMV) de vasos sanguíneos, AMV de vasos sanguíneos com o HEV, perímetro microvascular (PMV) de vasos sanguíneos, PMV de vasos com o HEV , dentro de cada grupo de diagnóstico clínico.
A correlação de Spearman foi usada para relacionar as variáveis dos imunomarcadores entre si (CD1a; CD83 no tecido epitelial; CD83 no tecido conjuntivo; triptase; mastócitos degranulados; CMV, AMV e PMV de vasos sanguíneos; e CMV, AMV e PMV de vasos sanguíneos com HEV.
O teste do Qui-quadrado foi realizado para as associações significativas entre diagnóstico clínico com sexo, idade categorizada, tipo de infiltrado e intensidade de infiltrado inflamatório.
Para todos os testes estatísticos utilizados neste estudo, o nível de significância estabelecido foi de 5% (p<0,05).
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5 RESULTADOS
5.1 Caracterização do estudo
No presente estudo foram utilizadas 154 amostras de tecido gengival de 103 mulheres (66,9%) e 51 homens (33,1%). O sítio de coleta do material de tecido gengival foi identificado em 112 casos, sendo em 73 casos (65,2%) oriundos da região da maxila seguido da região de mandíbula com 39 casos (34,8%).
A variável idade foi dividida em dois grupos etários segundo os critérios da OMS (2015): indivíduos adultos, com idade entre 18 e 59 anos, e indivíduos idosos, com idade maior ou igual a 60 anos, com o objetivo de avaliar as marcações entre as faixas etárias.
A amostra foi dividida de acordo com a classificação da doença periodontal de Caton et
al. (2018), levando em consideração os dados clínicos de profundidade de sondagem e perda
de inserção, e de acordo com diagnóstico clínico presente no cadastro dos espécimes arquivados (Tabela 1), ambos relacionados com o grupo etário.
Tabela 1 – Média da idade, mínimo, máximo, desvio padrão relacionados ao diagnóstico clínico e o grupo etário.
Diagnóstico Clínico Grupos Etários n Mínimo Máximo Média Desvio Padrão Gengiva clinicamente saudável Adultos 42 18 57 40,0 9,99
Idosos 6 62 72 66,3 3,83
Gengivite induzida por biofilme Adultos 36 18 57 34,4 11,38
Idosos 10 60 90 68,0 9,14
Periodontite estágios II, III e IV Adultos 49 18 59 38,2 10,76
Idosos 11 62 74 66,6 4,00
Fonte: Elaborado pelo autor (2020). Legenda: n, número de casos.
5.2 Resultados morfológicos
Os espécimes passaram por avaliação das características morfológicas. A cerca do epitélio de revestimento gengival, todos os casos apresentavam epitélio de mucosa oral, 22 casos (14,3%) apresentavam epitélio crevicular, e 4 casos (2,6%), epitélio sulcular. Os epitélios orais eram em sua maioria paraceratinizados (92,9%), ainda apresentando casos com ortoceratina (7,1%), e nenhum caso era do tipo não ceratinizado.
As alterações encontradas no tecido epitelial e nas células presentes foram: degeneração hidrópica (93,5%), acantose (85,1%), espongiose (69,5%), hiperplasia (51,9%), exocitose
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(51,3%), duplicação da camada basal (16,9%), hiperparaceratinização (3,9%), atrofia (1,9%), e ulceração (1,3%).
O tecido conjuntivo mostrou-se predominantemente denso em 116 casos (75,3%), apresentando infiltrado inflamatório crônico predominantemente mononuclear em 147 casos (95,5%).
5.3 Resultados imunoistoquímicos
Na análise imunoistoquímica para identificar os mastócitos, foi utilizada a triptase (Figura 5A). Em relação à presença de mastócitos, a imunomarcação da triptase nos mastócitos não foi diferente entre os grupos etários dentro de cada grupo de diagnóstico clínico. Contudo, foi observado que nos casos de gengivite em idosos, há maior número de células degranuladas (p=0,001) (Tabela 2).
Tabela 2 – Relação da quantificação dos mastócitos com o diagnóstico clínico do tecido gengival e grupo etário.
Imunomarcadores Diagnóstico Clínico
Grupo
Etário n Mediana Q25-Q75 Ranks p
Triptase Saudável* Adultos 41 5,0 4,2 – 7,6 24,34 0,655 Idosos 6 4,1 2,6 – 10,9 21,67 Gengivite Adultos 36 6,2 5,0 – 7,9 23,60 0,926 Idosos 10 6,4 3,9 – 9,2 23,15 Periodontite Adultos 48 5,0 4,0 – 6,4 29,76 0,823 Idosos 11 5,4 3,6 – 9,1 31,05 Mastócitos Degranulados Saudável* Adultos 41 0,3 0,0 – 1,1 23,70 0,681 Idosos 6 0,6 0,0 – 3,2 26,08 Gengivite Adultos 36 0,2 0,0 – 1,0 20,11 0,001 Idosos 10 1,6 0,9 – 2,8 35,70 Periodontite Adultos 47 0,2 0,0 – 0,8 29,55 0,959 Idosos 11 0,0 0,0 – 2,2 29,27
Fonte: Elaborado pelo autor (2020).
Legendas: n, número de casos avaliados; p, Teste estatístico de Mann-Whitney; Saudável*, gengiva clinicamente saudável.
Na marcação das células dendríticas, foram utilizados os anticorpos CD1a para localização das células dendríticas imaturas (marcação citoplasmática). As células dendríticas (DCs) imaturas foram localizadas somente no tecido epitelial, nas camadas basal e granulosa (Figura 5 B).
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As células dendríticas maduras foram positivas para o anticorpo CD83 em tecido gengival, com marcação celular citoplasmática, sendo localizadas no tecido epitelial e lâmina própria (Figura 5 C e D). Setenta e quatro casos (48%) de DCs maduras, localizadas no epitélio, tiveram a distribuição na camada basal e na camada granulosa. No tecido conjuntivo, as DC maduras foram identificadas em 80 casos (51,9%), encontrando-se subepitelial e dispersa na lâmina própria.
Ao comparar dentro de cada diagnóstico clínico, a positividade observada das DCs imaturas no tecido gengival é maior na gengivite (p=0,009) e na periodontite (p=0,014) nos idosos. Entretanto, a média da imunomarcação das DCs maduras no tecido epitelial e conjuntivo, foram semelhantes entre os grupos etários (Tabela 3).
Tabela 3 – Quantificação das células dendríticas imaturas e maduras de acordo com o diagnóstico clínico do tecido gengival e grupo etário.
Imunomarcadores Diagnóstico
Clínico Grupo Etário n Mediana Q25-Q75 Ranks p
CD1a Saudável* Adultos 42 3,6 1,9 – 5,0 23,52 0,201 Idosos 6 5,8 2,0 – 5,0 31,33 Gengivite Adultos 36 3,5 2,4 – 4,5 20,76 0,009 Idosos 10 6,4 3,5 – 10,4 33,35 Periodontite Adultos 49 3,4 2,1 – 4,6 27,52 0,014 Idosos 10 5,2 3,3 – 8,8 42,15 CD83ep Saudável* Adultos 38 0,0 0,0 – 0,8 21,39 0,120 Idosos 6 0,6 0,0 – 1,0 29,50 Gengivite Adultos 35 0,2 0,0 – 0,6 22,57 0,671 Idosos 10 0,2 0,0 – 0,6 24,50 Periodontite Adultos 42 0,0 0,0 – 0,4 25,25 0,082 Idosos 11 0,2 0,0 – 0,4 33,64 CD83conj Saudável* Adultos 38 0,2 0,0 – 0,8 21,75 0,308 Idosos 6 0,6 0,0 – 1,6 27,25 Gengivite Adultos 35 0,2 0,0 – 0,8 23,03 0,978 Idosos 10 0,3 0,0 – 0,6 22,90 Periodontite Adultos 42 0,0 0,0 – 0,4 26,55 0,065 Idosos 11 0,2 0,0 – 1,5 28,73
Fonte: Elaborado pelo autor (2020).
Legendas: CD83ep, média do CD83 no tecido epitelial; CD83conj, média do CD83 no tecido conjuntivo; n, número de casos avaliados; p, Teste estatístico de Mann-Whitney; Saudável*, gengiva clinicamente saudável.
A tabela 4 mostra a relação entre os imunomarcadores e o diagnóstico clínico dentro de cada grupo etário, não havendo diferença na imunomarcação das células dendríticas, dos
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mastócitos e na quantidade de vasos sanguíneos nos tecidos gengivais, entre os casos de gengiva clinicamente saudável, gengivite induzida por biofilme e periodontite estágio II, III e IV, avaliando isoladamente os grupos etários adulto e idoso.
A correlação entre a quantidade de células CD83 positivas no epitélio e conjuntivo é fraca, porém positiva, demonstrando que quando há um aumento das células dendríticas maduras no epitélio, aumenta o número destas células no conjuntivo (r=0,207, p 0,013).
Ao comparar a positividade do CD1a e o CD83 no epitélio, foi observado que há correlação positiva, porém, também fraca, demonstrando que quando há um aumento das células dendríticas imaturas, aumenta as células dendríticas maduras (r=0,254, p=0,002). Tabela 4: Relação da média da quantidade de células dendríticas imaturas (CD1a) e maduras (CD83), mastócitos (Triptase) e presença de vasos sanguíneos (CD34) com o diagnóstico clínico do tecido periodontal, dentro de cada grupo etário.
Grupo Diagnóstico Clínico n Mediana Q25-Q75 Rank p
CD1a Adulto Saudável* 42 3,6 1,9 – 5,0 66,26 0,887 Gengivite 36 3,5 2,4 – 4,5 63,13 Periodontite 49 3,4 2,1 – 4,6 62,70 Idoso Saudável* 6 5,8 2,0 – 7,0 11,42 0,554 Gengivite 10 6,4 3,5 – 10,4 15,45 Periodontite 10 5,2 3,3 – 8,8 12,80 CD83ep Adulto Saudável* 38 0,0 0,0 – 0,8 58,41 0,288 Gengivite 35 0,2 0,0 – 0,6 63,83 Periodontite 42 0,0 0,0 – 0,4 52,77 Idoso Saudável* 6 0,6 0,3 – 1,0 18,25 0,316 Gengivite 10 0,2 0,0 – 0,6 12,55 Periodontite 11 0,2 0,0 – 0,6 13,00 CD83conj Adulto Saudável* 38 0,2 0,0 – 0,8 58,46 0,325 Gengivite 35 0,2 0,0 – 0,8 63,69 Periodontite 42 0,0 0,0 – 0,4 52,85 Idoso Saudável* 6 0,6 0,0 – 1,6 16,08 0,729 Gengivite 10 0,3 0,0 – 0,6 13,85 Periodontite 11 0,2 0,0 – 1,4 13,00
39 Triptase Adulto Saudável* 41 5,0 4,2 – 7,6 60,39 0,183 Gengivite 36 6,2 5,0 – 7,9 72,28 Periodontite 48 5,0 4,0 – 7,3 58,27 Idoso Saudável* 6 4,1 2,6 – 10,9 12,58 0,783 Gengivite 10 6,4 3,9 – 9,2 15,30 Periodontite 11 5,4 3,5 – 8,4 13,59 CD34 Adulto Saudável* 42 7,0 5,4 – 8,0 64,49 0,195 Gengivite 36 7,5 5,8 – 8,6 72,15 Periodontite 49 6,2 5,4 – 7,3 57,59 Idoso Saudável* 6 5,5 4,4 – 7,3 11,67 0,421 Gengivite 10 5,9 5,1 – 6,6 12,80 Periodontite 11 6,6 5,6 – 7,0 16,36 Fonte: Elaborado pelo autor (2020).
Legendas: CD83ep, média do CD83 no tecido epitelial; CD83conj, média do CD83 no tecido conjuntivo; n, número de casos avaliados; p, Teste estatístico de Kruskal-Wallis; Saudável*, gengiva clinicamente saudável.
O CD34 foi positivo para células endoteliais em 100% dos casos, apresentando ainda marcação do endotélio vascular alto em 101 casos (65,6%) (Figura 5 E e F). Os valores da contagem microvascular (CMV) nos vasos sanguíneos foram relacionados com o diagnóstico clínico da doença periodontal dentro de cada grupo etário, sendo maior nos adultos com gengivite induzida por biofilme (p=0,040) (Tabela 5). A AMV e PMV dos vasos sanguíneos com o endotélio vascular alto apresentaram-se maiores em idosos na gengivite (AMV p=0,028; PMV p=0,043).
Tabela 5 – Relação da quantificação dos vasos sanguíneos totais e vasos sanguíneos com endotélio vascular alto com o diagnóstico clínico do tecido gengival e grupo etário.
Diagnóstico Clínico
Grupo
Etário n Mediana Q25-Q75 Ranks P
CMV Saudável* Adultos 42 7,0 5,4 – 8,0 25,60 0,151 Idosos 6 5,5 4,4 – 7,3 16,83 Gengivite Adultos 36 7,5 5,8 – 8,6 25,64 0,040 Idosos 10 5,9 5,1 – 6,6 15,80 Periodontite Adultos 49 6,2 5,5 – 7,0 30,24 0,811 Idosos 11 6,6 5,4 – 6,9 31,64
