MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ATIVIDADE IMUNOESTIMULATÓRIA E ANTICÂNCER DE GALACTANAS SULFATADAS DE Caulerpa cupressoides var. flabellata
JEFFERSON DA SILVA BARBOSA
NATAL/RN
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JEFFERSON DA SILVA BARBOSA
ATIVIDADE IMUNOESTIMULATÓRIA E ANTICÂNCER DE GALACTANAS SULFATADAS DE Caulerpa cupressoides var. flabellata
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha
NATAL/RN
iii
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Barbosa, Jefferson da Silva.
Atividade imunoestimulatória e anticâncer de galactanas sulfatadas de Caulerpa cupressoides var. flabellata / Jefferson da Silva Barbosa. - 2019.
105f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2019.
Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
1. Galactanas sulfatadas - Tese. 2. Imunoestimulação - Tese. 3. Melanoma - Tese. I. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 615.015.14
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde:
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JEFFERSON DA SILVA BARBOSA
ATIVIDADE IMUNOESTIMULATÓRIA E ANTICÂNCER DE GALACTANAS SULFATADAS DE Caulerpa cupressoides var. flabellata
Aprovada em: 24/05/2019
Banca Examinadora:
Presidente da Banca:
Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha – Departamento de Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Membros da Banca:
Prof. Dra Valquíria Pereira de Medeiros (membro externo) - Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora.
Prof. Dr. Daniel Chaves de Lima (membro externo) – Diretoria Acadêmica de Ciências, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte.
Prof. Dra Silvana Maria Zucolotto Lagassner (membro interno) – Departamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Prof. Dr. Marcelo de Sousa da Silva (membro interno) – Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
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Aos meus pais, Irene Benedito e Raimundo Vieira, por todos os ensinamentos e exemplos de honestidade e luta por seus ideais. Minha eterna gratidão!
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, por todo investimento na minha formação acadêmica, incentivo e ensinamentos que me acompanham por toda minha trajetória profissional. E por toda força e motivação que me sustentaram nesses quatro anos de doutorado... Nos momentos de cansaço e desânimo em vocês encontrei o caminho para seguir!
Ao meu orientador, Hugo Rocha, pela confiança para realização desse trabalho e pelos conhecimentos compartilhados.
A todos que estiveram no BIOPOL durante esses quatro anos de doutorado. Em especial a:
✓ Dayanne Gomes, pelo acolhimento desde o primeiro dia em que ingressei no laboratório, por ter me acompanhado nas primeiras etapas dessa pesquisa e por todas as contribuições dadas ao trabalho;
✓ Diego de Sabry, ou simplesmente Popó, pelo tempo e trabalho dedicados a purificação e análise estrutural dos polissacarídeos sulfatados;
✓ Jailma Almeida, pelos ensinamentos e por sempre estar disponível para sanar minhas dúvidas;
✓ Karoline Rachel, pelos momentos descontraídos e por toda ajuda nos momentos iniciais do trabalho;
✓ Rony Lucas, pelos momentos divertidos e principalmente por sempre se dispor a ajudar na realização desse trabalho;
✓ Talita Brito, pelo apoio e amizade, e principalmente por saber que poderia contar no que fosse preciso para realização desse trabalho;
✓ Maíra Menezes, pela alegria contagiante e companhia nas várias disciplinas cursadas e nos intermináveis dias de trabalho;
✓ Cynthia Haynara e Adriana Oliveira pela valiosa ajuda nas diferentes etapas de purificação dos PS;
✓ Maria do Socorro, pelo trabalho realizado na extração e fracionamento dos PS;
✓ Luciana Fentanes, pelo auxílio nos experimentos de expressão gênica. A prof. Kátia Scortecci (DBG-UFRN), pela paciência e empenho para realização dos experimentos de análise de expressão gênica.
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Ao prof. Guilherme Sasaki (UFPR), pela permissão do uso do equipamento de RMN.
A prof. Monique Gabriela (DBQ-UFRN), pela disponibilidade para discutir as dúvidas dos ensaios de imunoestimulação.
A prof. Suely Chavante (DBQ-UFRN), por ter aberto as portas do seu laboratório para que parte desse estudo fosse realizado e pela disponibilidade em torná-lo o melhor que pudéssemos fazer.
A Laís Palhares, pela parceria, amizade e comprometimento com a pesquisa. Foram muitas horas que trabalhamos juntos...Seu apoio foi fundamental para realização do trabalho.
Aos professores da banca de qualificação, Vanessa Rachetti e Leandro Costa, pelas correções e sugestões para melhoria do trabalho.
Aos membros da banca de defesa.
Aos técnicos do Departamento de Bioquímica, em especial a Ana Katarina Menezes pelo suporte dado na cultura de células, a Francisco Freire pelas incontáveis análises no citômetro de fluxo e a Eliane por sempre estar disposta a ajudar no que fosse preciso.
Aos técnicos do Instituto de Medicina Tropical, Ingrid e Paulo Ricardo, pelas análises de PCR em tempo real.
Ao Laboratório Multiusuário de Microscopia, do Instituto do Cérebro (UFRN), em especial a técnica Rebecca Diniz e ao professor Marcos Costa, pelas análises no videomicroscópio.
Ao Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (DBG-UFRN), por disponibilizar os equipamentos e a estrutura para realização de parte dos experimentos de expressão gênica.
Ao Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros (LQCPol), Instituto de Química (UFRN), em especial ao prof. Daniel Pontes e a Mayara Jane, pela disponibilidade para as análises de infravermelho.
Aos meus amigos, em especial a Daiane Golbert, pelos conselhos sobre o trabalho e principalmente pelos momentos de alegria e diversão. A Lílian Vieira,
ix
Fábio Duarte, Bruno Maggi e demais amigos do IFRN que mesmo sem estarmos convivendo no cotidiano do trabalho sempre me apoiaram e deram força para conclusão dessa tese.
Ao IFRN, que por meio da sua política de capacitação docente me concedeu o afastamento total para realização do doutorado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq (Edital Universal, n° 408369/2016-7), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, Programa Nacional de Cooperação Acadêmica – PROCAD (CAPES/PROCAD n° 2965/2014) e Programa Ciências do Mar/CAPES (AUXPE-CIMAR-1956/2014), pelo apoio financeiro necessário para realização desse trabalho.
x RESUMO
As algas marinhas são ricas fontes de compostos com propriedades farmacológicas. Dentre esses compostos, os polissacarídeos sulfatados (PS) se destacam por sua diversidade estrutural, pelo alto teor e por apresentarem grande potencial de uso em diversas atividades humanas. Por esses motivos, estudos com PS tem ganhado destaque na pesquisa biomédica. Assim, o objetivo desse trabalho foi caracterizar estruturalmente os PS de Caulerpa cupressoides var. flabellata e avaliar seu potencial imunoestimulatório e anticâncer, in vitro. Para tanto, os PS foram extraídos e caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Além disso, seus efeitos imunoestimulatórios e anticâncer foram avaliados por meio da quantificação de diferentes mediadores inflamatórios em macrófagos murinos RAW 264.7, como também quanto aos seus efeitos inibitórios sobre marcadores de tumorigênese em células de melanoma murino B16-F10, respectivamente. As análises de RMN revelaram que as frações polissacarídicas de C. cupressoides são ricas em galactanas, constituídas por unidades de β-D-galactopiranoses sulfatadas e piruvatadas. Esses PS não apresentaram efeitos citotóxicos sobre nenhuma das linhagens normais testadas. Contudo, promoveram aumentos significativos na produção dos mediadores inflamatórios: óxido nítrico, espécies reativas de oxigênio e das citocinas TNF-α e IL-6. Com relação a atividade anticâncer, os PS inibiram a migração, a produção de melanina e a formação clonogênica em células B16-F10. Em conjunto, os resultados desse estudo mostraram que as galactanas sulfatadas de C. cupressoides podem desempenhar um potente efeito imunoestimulatório e anticâncer, com potenciais uso em novos produtos com aplicações biomédicas e biotecnológicas. Contudo, estudos adicionais devem ser realizados para elucidar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos nas respostas observadas, bem como para verificar esses efeitos em outros modelos de estudo.
Palavras-chaves: Polissacarídeos sulfatados; galactanas sulfatadas; Atividade imunoestimulatória; Mediadores inflamatórios; Melanoma; Migração celular.
xi ABSTRACT
Marine seaweeds are rich sources of compounds with pharmacological properties. Among these compounds, sulfated polysaccharides (SP) are known for their structural diversity, high content and because they present great potential of use in several human activities. For these reasons, studies with SP have gained prominence in biomedical research. Thus, the aim of this work was to characterize structurally the SP from Caulerpa cupressoides var. flabellata and to evaluate its immunostimulatory and anticancer potential, in vitro. For this, the SP were extracted and characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. In addition, its immunostimulatory and anticancer effects were evaluated by quantification of different inflammatory mediators in RAW 264.7 murine macrophages, as well as their inhibitory effects on tumorigenic markers in murine melanoma B16-F10 cells, respectively. NMR analysis revealed that the polysaccharide fractions of C. cupressoides are rich in galactans, consisting of units of sulfated and pyruvated β-D-galactopyranoses. These SP had no cytotoxic effects on cell lines tested. However, they promoted significant increases in the production of inflammatory mediators: nitric oxide, reactive oxygen species and cytokines TNF-α and IL-6. With respect to anticancer activity, PS inhibited migration, melanin production and clonogenic formation in B16-F10 cells. Together, the results of this study showed that C. cupressoides sulfated galactans may play a potent immunostimulatory and anticancer effect, with potential use in new products with biomedical and biotechnological applications. However, additional studies should be performed to elucidate the cellular and molecular mechanisms involved in the observed responses, as well as to verify these effects in other study models.
Keywords: Sulfated polysaccharides; Sulfated galactans; Immunostimulatory activity; Inflammatory mediators; Melanoma; Cell migration.
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg Micrograma
µL Microlitro
ANOVA Análise de Variância
ATCC American Type Culture Collection B16-F10 Linhagem celular de melanoma murino
BIOPOL Laboratório de biotecnologia de polímeros naturais
CCB-F0.3 Fração polissacarídica precipitada com 0,3 volumes de acetona CCB-F0.5 Fração polissacarídica precipitada com 0,5 volumes de acetona CCB-F1.0 Fração polissacarídica precipitada com 1,0 volumes de acetona CCB-F2.0 Fração polissacarídica precipitada com 2,0 volumes de acetona
cDNA DNA complementar
COSY Homonuclear 1H–1H Correlation spectroscopy
COX-2 Enzima ciclooxigenase 2
CTV Cetavlon
DCFH-DA 2’7’ diclorofluoresceína diacetato
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DNA Ácido desoxirribonucleico
ERO Espécies reativas de oxigênio
g Grama
h hora
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy
HSQCed Heteronuclear Single Quantum Coherence edited spectroscopy IL-1β Interleucina 1 beta
IL-6 Interleucina 6
iNOS Enzima óxido nítrico sintase induzível
L Litros L-NAME Nω-nitro-arginina-metil-ester LPS Lipopolissacarídeo bacteriano m Massa M Molar mg Miligrama Min Minutos mL Mililitro
xiii
mM Milimolar
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil- tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NaCl Cloreto de sódio
NO Óxido nítrico
º C Grau Celsius
P.A Para análise
PBS Tampão fosfato salino
PCR Reação em cadeia da polimerase
PDA 1,3 Diaminopropano acetato
pH Potencial de hidrogênio
ppm Partes por milhão
PS Polissacarídeo(s) Sulfatado(s)
RAW 264.7 Linhagem celular de macrófago murino
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RNA Ácido ribonucleico
Rpm Rotações por minuto
SFB Soro Fetal Bovino
SisGen Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
U Unidades
xiv
LISTA DE FIGURAS
xv SUMÁRIO 1.0 INTRODUÇÃO ... 16 2.0 JUSTIFICATIVA ... 21 3.0 OBJETIVOS ... 23 3.1 Geral ... 23 3.2 Específicos: ... 23 4.0 MÉTODOS ... 24 4.1 Coleta da alga ... 24
4.2 Extração e Fracionamento dos PS ... 25
4.3 Eletroforese em gel de agarose em tampão 1,3 diamino propano acetato (PDA) ... 25
4.4 Espectroscopia de Infravermelho ... 25
4.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ... 26
4.6 Linhagens e Cultura Celular ... 26
4.7 Ensaios de viabilidade celular ... 27
4.7.1 Ensaio de redução do Brometo de 3-(4,5-dimetil- tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) ... 27
4.7.2 Ensaio do Azul de Alamar ... 27
4.8 Ensaios para avaliação do potencial imunoestimulatório ... 28
4.8.1 Dosagem de NO ... 28
4.8.2 Produção de espécies reativas de oxigênio intracelulares ... 29
4.8.3 Extração de RNA e expressão de gênica ... 29
4.8.4 Dosagem de citocinas ... 30
4.9 Ensaios para caracterização das atividades anticâncer ... 30
4.9.1 Ensaio de Apoptose (Anexina-V/ Iodedo de Propídeo) ... 30
4.9.2 Análise do Ciclo Celular ... 31
4.9.3 Ensaio de migração Wound healing ... 31
4.9.4 Ensaio de migração com uso de Transwell ... 32
4.9.5 Ensaio Clonogênico Ensaio Clonogênico ... 32
4.9.6 Dosagem de Melanina ... 33
4.10 Análise Estatística ... 33
5.0 ARTIGOS PRODUZIDOS ... 34
6.0 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES ... 97
1.0 INTRODUÇÃO
As algas marinhas apresentam um grande potencial para utilização como aditivos funcionais em produtos alimentícios, farmacêuticos e cosméticos, bem como na extração e isolamento de compostos que podem ser utilizados como novos agentes com propriedades terapêuticas (1). Esses organismos são ricas fontes de minerais, vitaminas e também em substâncias bioativas como lipídeos, proteínas, polifenóis e polissacarídeos sulfatados (PS) (2,3). Os PS são polímeros aniônicos encontrados em muitas espécies de algas e usualmente isolados da parede celular e matriz extracelular (4). Devido ao grande teor encontrado nas algas, diversidade estrutural e propriedades biológicas, esses compostos são promissores candidatos para o desenvolvimento de produtos com aplicações biotecnológicas e biomédicas (5). Essas moléculas podem exibir efeitos terapêuticos em diferentes sistemas patofisiológicos como coagulação sanguínea, trombose, inflamação, infecções microbianas e câncer (6–10).
Os PS apresentam entre outras características, uma baixa toxicidade e são capazes de provocar poucos efeitos colaterais ao organismo (11,12). Diversos autores têm relatado que PS obtidos de fontes naturais são capazes de modificar diversos processos celulares e consequentemente desempenhar uma variedade de bioatividades, entre as quais, a capacidade estimulatória da função imune (13–15). Estudos in vitro e in vivo mostraram que esses compostos podem atuar sobre diferentes tipos celulares do sistema imunológico, levando a produção e secreção de moléculas com efeitos imunoestimulatórios (16–18). Dessa forma, podem apresentar um potencial terapêutico ou adjuvante para condições de imunossupressão, como ocorre no caso de pacientes em tratamento oncológico, bem como no combate de infecções virais e bacterianas (19–21).
Polissacarídeos imunoestimulatórios podem interagir com componentes do sistema imunológico, desencadeando diversos eventos celulares e moleculares, que promovem a ativação da resposta imune (22,23). Os principais alvos celulares descritos e responsivos a essa moléculas são os monócitos, macrófagos e neutrófilos (24). Juntamente com os neutrófilos, os macrófagos
constituem a primeira linha de defesa do organismo (25). A ativação de macrófagos é um evento chave na imunidade inata e adaptativa e essencial para as reações de defesa contra agentes patogênicos (26). Uma vez ativadas, essas células são capazes de fagocitar e matar microrganismos e células tumorais, bem como de produzirem moléculas que recrutam e ativam outras células para o sítio de infecção (27). Quanto ativados, macrófagos aumentam a produção de intermediários reativos de nitrogênio como o óxido nítrico (NO), espécies reativas de oxigênio (ERO) e citocinas proinflamatórias como IL-1β, IL-6 e TNF-α (28– 30). Por meio de sua capacidade apresentadora de antígenos, também exercem um importante papel na imunidade adaptativa (31). Por isso, macrófagos são frequentemente usados para avaliação dos efeitos imunomodulatórios de compostos bioativos provenientes de fontes naturais (32,33).
A descoberta de novos compostos com propriedades antitumorais tem sido um grande desafio para pesquisa biomédica (34,35). Entre os principais fármacos utilizadas atualmente no tratamento do câncer, pelo menos 1/3 é derivado de fontes naturais, incluindo plantas e espécies marinhas (36). Das 175 moléculas aprovadas para o tratamento do câncer nos últimos anos, 49% são oriundas de compostos naturais ou diretamente derivadas delas (37). Nesse sentido, compostos naturais obtidos de diferentes fontes, como os PS, têm demostrado considerável potencial na terapia contra o câncer (38). Muitos agentes antitumorais utilizados atualmente são inespecíficos e causam toxicidade as células normais, e em especial as células do sistema imune (39). Como consequência, eles provocam efeitos colaterais ao organismo, resistência multidrogas do tumor e comprometem a resposta do paciente ao tratamento (40). Por isso, a busca por moléculas com efeitos seletivos sobre as células tumorais é uma promissora estratégia para o desenvolvimento de novos compostos para o tratamento do câncer (41).
Nesse contexto, PS provenientes de organismos marinhos, também têm destaque na pesquisa para o tratamento do câncer (42,43). PS podem exercer um efeito direto sobre as células cancerígenas, promovendo a inibição da proliferação ou induzindo os processos de morte celular por necrose e apoptose (44,45). O efeito direto também pode ocorrer sobre outras etapas do processo de progressão tumoral por meio da inibição da migração, invasão e angiogênese (46,47).
Indiretamente, PS podem promover a morte de células cancerígenas mediada pela estimulação de células do sistema imune, como macrófagos e células natural killers (48,49). Estudos in vitro revelaram que PS de algas podem não apresentar um efeito antiproliferativo direto sobre as células cancerígenas. Contudo, ao serem avaliados em modelos de estudo in vivo, os mesmos PS possuíram efeito antitumoral por meio da estimulação do sistema imune. Esses estudos indicaram que a capacidade antitumoral dos PS ocorreu via a estimulação de macrófagos secretores de moléculas tumoricidas como o NO e TNF-α (49).
Nos estágios avançados do câncer as células tumorais entram na circulação sanguínea e linfática, passam a circular no corpo e invadem órgãos diferentes dos quais se originaram (50). Embora na circulação sanguínea diferentes componentes do sistema imune estejam presentes, nessa etapa, as células cancerígenas podem não ser reconhecidas (51). Assim, para reestabelecer a capacidade de proteção, estímulos externos adicionais podem ser necessários (52). Nesse sentido, PS de fontes naturais podem atuar como agentes imunoestimulantes, de modo a ativar a resposta imune antitumoral e eliminar as células cancerígenas do corpo (53,54).
Entre as fontes de PS estudadas como fontes de compostos com potenciais imunoestimulatórios e antitumorais, as algas verdes têm sido as menos estudadas em comparação com as algas vermelhas e marrons (55). Nesse grupo, os PS são estruturalmente heterogêneos e constituídos por galactose, xilose, arabinose, manose, ácido glucorônico e/ou glicose (56). Nas espécies de Ulva e Enteromorpha, o principal PS é rico em ramnose e denominado de ulvana (57,58). Embora as galactanas sulfatadas sejam comumente encontradas nas algas vermelhas, espécies de algas verdes do gênero Codium também sintetizam significativas quantidades de galactanas sulfatadas. Contudo, nas algas verdes esses compostos tendem a apresentar estruturas mais heterogêneas e complexas (59). No gênero Caulerpa homo e heterogalactanas são os PS mais comuns (60).
A avaliação do efeito imunomodulatório de PS de algas verdes foi realizada por vários autores. Xilogalactanas de Caulerpa lentillifera exibiram potente efeito imunoestimulatório em macrófagos RAW 264.7, por meio dos
aumentos da capacidade de fagocitose, secreção de NO e indução da expressão de genes que codificam citocinas (61). Em outro trabalho, com essa mesma espécie, Sun et al. (62) verificaram que xilogalactomananas promoveram um aumento na proliferação, capacidade fagocitária, secreção de NO e fosfatase alcalina em macrófagos. Galactanas de C. cupressoides var. lycopodium apresentaram efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório in vivo por meio da redução da migração leucocitária para a cavidade peritoneal de ratos (63), enquanto galactanas de Caulerpa mexicana apresentaram efeito antinociceptivo, diminuíram o edema da pata e a atividade da mieloperoxidase em camundongos (64). Ribeiro e colaboradores (9) observaram que os PS de Caulerpa racemosa também apresentaram atividade antinociceptiva e anti-inflamatória em modelo de estudo in vivo com camundongos. Assim, pode-se verificar que PS de algas verdes apresentam diferentes propriedades modulatórias sobre a função imune, alterando diferentes respostas celulares.
Diversos estudos também têm relatado os efeitos inibitórios de PS obtidos de algas marinhas verdes sobre a proliferação de linhagens de células cancerígenas, como também nas diferentes etapas da progressão tumoral (60). PS de C. racemosa inibiram o crescimento de células de leucemia mielóide humana K562 (65). Wang et al. (66) mostraram que o tratamento com os PS de Enteromorpha intestinalis induziu significativamente um aumento na percentual de células apoptóticas na linhagem de hepatoma humano HepG2. Galactanas sulfatadas obtidas de Udotea flabellum inibiram a proliferação, adesão e migração de células de melanoma murino B16-F10 (6). Heteroramnanas sulfatadas de Gayralia oxysperma induziram o bloqueio do ciclo celular e aumento na expressão das proteínas p21 e p53 em células de glioblastoma humano (67). Portanto, esses compostos podem atuar sobre diferentes alvos celulares e moleculares relacionados aos processos de transformação e progressão tumoral.
A macroalga marinha Caulerpa cupressoides var. flabellata sintetiza quatro populações distintas de PS, denominadas por Costa e colaboradores (68) de CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0 e CCB-F2.0. Nesse estudo, algumas característica químicas dessas frações, como a massa molecular e a composição monossacarídica foram avaliadas, e são descritas a seguir: a fração CCB-F0.3 apresenta PS com massa molecular de 155 kDa, constituídos pelos
monossacarídeos galactose, glicose, manose e xilose na razão molar de 1.0: 0.1: 0.2: 0.1; a fração CCB-F0.5 apresenta PS com 130 kDa compostos de galactose, manose e traços de xilose na razão molar de 1.0: 0.1; a fração CCB-F1.0 apresenta PS com 155 kDa, constituídos por galactose, manose, xilose, e traços de glicose e ramnose, na razão molar de 1.0: 0.1: 0.6; a fração CCB-F2.0 é constituída de PS com 170 kDa e compostos dos monossacarídeos galactose, glicose, manose, xilose, ramnose e fucose na proporção de 1.0: 0.6: 1.8: 1.0: 0.5: 1.0. Embora estudos anteriores tenham caracterizado as atividades antiproliferativa, anticoagulante e antioxidantes dos PS de C. cupressoides (59, 60), suas propriedades imunoestimulatórias e anticâncer permanecem desconhecidas. Assim, nesse estudo o potencial imunoestimulatório in vitro dos PS foi caracterizado utilizando como modelo de estudo macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7, bem como as propriedades anticâncer no modelo de melanoma murino B16-F10, um tipo de câncer com elevada agressividade e resistência aos tratamentos convencionais (70).
2.0 JUSTIFICATIVA
Uma possibilidade para a descoberta de novos fármacos para o tratamento de diversas doenças é a busca por metabólitos presentes em diferentes organismos como, animais, plantas, microrganismos e algas. Nos últimos anos, um considerável número de estudos têm relatado que as algas marinhas são promissoras fontes de compostos com potencial uso no tratamento de várias doença, incluindo as doenças imunomediadas e o câncer (71–73).
Estudos in vitro e in vivo demostraram a capacidade de diferentes compostos extraídos de algas em promover efeitos inibitórios sobre as etapas do processo de tumorigênese, como também na modulação da resposta imune (24,74). PS extraídos de algas marinhas tem ganhado destaque nas pesquisas com esses temas, pois apresentam baixo nível de toxicidade para organismo e por isso poucos efeitos adversos a sua utilização. Além disso, tem o potencial para serem empregados em combinação com alguns procedimentos terapêuticos já existentes, como no caso dos tratamentos quimioterápicos contra o câncer, para potencializar as respostas do organismo frente ao quadro da doença (75).
A macroalga verde C. cupressoides é encontrada ao longo do litoral potiguar. Estudos iniciais mostraram que esta alga sintetiza PS com atividade antioxidante e anticoagulante (32). Considerando que esses compostos podem apresentar características multifuncionais, seus efeitos sobre a função imune ainda permanecem desconhecidos. No trabalho de Costa e colaboradores (2010) (69) um estudo prospectivo da atividade antiproliferativa dos PS de C. cupressoides sobre células cancerígenas, identificou uma potencial atividade na linhagem de célula de adenocarcinoma de útero humano. Como um agente anticâncer pode exercer efeitos inibitórios sobre diferentes etapas da formação do tumor e esses efeitos podem variar dependendo do tipo de câncer, estudos adicionais que visem melhor caracterizar os efeitos desses compostos sobre diferentes linhagens de células cancerígenas são necessários. Além disso, no contexto das terapias anticâncer, o funcionamento da função imune passa a ter papel crucial no controle do desenvolvimento tumoral, como também na resposta do paciente a terapia adotada. Assim, a avaliação das propriedades imunoestimulatórias também podem contribuir com a elucidação do efeito
desses compostos sobre a formação e desenvolvimento tumoral, bem como em outras alterações relacionadas a imunidade.
3.0 OBJETIVOS
3.1 Geral:
✓ Caracterizar estruturalmente os polissacarídeos sulfatados da alga Caulerpa cupressoides var. flabellata e avaliar seus efeitos imunoestimulatório e anticâncer.
3.2 Específicos:
✓ Obter da alga Caulerpa cupressoides var. flabellata frações ricas em polissacarídeos sulfatados;
✓ Avaliar o efeito dos polissacarídeos sulfatados sobre a viabilidade celular; ✓ Caracterizar a atividade imunoestimulatória das frações polissacarídicas por meio da dosagem de óxido nítrico, espécies reativas de oxigênio e das citocinas fator de necrose tumoral alfa e interleucina 6, em macrófagos RAW 264.7;
✓ Purificar os polissacarídeos sulfatados que apresentaram atividade imunoestimulatória mais significativa;
✓ Caracterizar os polissacarídeos sulfatados purificados por Ressonância Magnética Nuclear;
✓ Verificar o efeito citotóxico dos polissacarídeos sulfatados sobre células de melanoma murino B16-F10;
✓ Avaliar o efeito inibitório dos polissacarídeos sulfatados sobre a migração de células B16-F10;
✓ Caracterizar o efeito inibitório dos polissacarídeos sulfatados sobre a formação clonogênica de células B16-F10;
✓ Analisar a influência dos polissacarídeos sulfatados sobre a produção de melanina em células B16-F10.
4.0 MÉTODOS
Com a finalidade de sistematizar as etapas desse estudo e identificar as metodologias empregadas em cada etapa, foi elaborado o fluxograma conforme ilustrado a seguir.
Figura 1 – Fluxograma descritivo das etapas do estudo.
4.1 Coleta da alga
A macroalga verde Caulerpa cupressoides var. flabellata foi coletada no município de Nísia Floresta, litoral sul do estado do Rio Grande do Norte, Brasil (S 6°1'8.19" e O 35°6'33.40), no mês de outubro de 2015. Em seguida, foi transportada para o Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais do Departamento de Bioquímica, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para retirada de espécies epífitas, restos de sedimentos, organismos incrustados e posterior extração de seus PS. A coleta do material foi autorizada pelo Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) sob n° A0D4240.
4.2 Extração e Fracionamento dos PS
Para obtenção do extrato rico em PS, a alga foi submetida as etapas de secagem em estufa, trituração, delipidação em etanol P.A, proteólise (NaCl 0,25 M, prozima 15 mg/g de alga seca, pH 8, por 18 h a 60 °C) e precipitação em metanol P.A (2:1 v/v). Após a obtenção do extrato rico em PS, denominado de extrato bruto, os PS foram diluídos em água destilada e realizou-se a etapa de fracionamento por meio da adição de volumes crescentes de acetona P.A gelada, conforme descrito por Costa et al. (69). Com base nos volumes de acetona utilizados no fracionamento, as frações obtidas foram denominadas de CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0 e CCB-F2.0.
4.3 Eletroforese em gel de agarose em tampão 1,3 diamino propano acetato (PDA)
A mobilidade eletroforética dos PS de C. cupressoides foi avaliada pela técnica de eletroforese em gel de agarose em tampão PDA conforme descrito por Dietrich e Dietrich (76). Inicialmente, as lâminas de eletroforese foram revestidas com agarose (BioRad Laboratories, Richmond, CA, EUA) 0,6% (m/v) em tampão PDA (0,05 M, pH 9,0). Em seguida, alíquotas de 5 µl das amostras (10 mg/mL) foram aplicadas e submetidas a eletroforese (100 V, 4º C) por 60 min. Após a migração eletroforética, o gel foi seco e os polissacarídeos precipitados com CETAVLON 0,1% por 2 h, à temperatura ambiente. Para visualização dos PS, o gel foi corado com uma solução de azul de toluidina 0,1% em ácido acético a 1% e etanol a 50% e seu excesso removido por meio da descoloração com uma solução contendo 1% de ácido acético e 49% de etanol.
4.4 Espectroscopia de Infravermelho
Os espectros de infravermelho foram obtidos com o uso de um espectrômetro de infravermelho via transformada de Fourier (8400S spectrometer Shimadzu Corp., Kyoto, Japão) na faixa de 4000 – 400 cm-1. Os PS (~5 mg) foram analisados após secagem em aparelho de Abdenhalden sob a forma de pastilha de brometo de potássio (KBr). Os resultados foram
analisados no software IRsolution 1.20 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japão) e plotados no programa Origin 8.5.(Northampton, MA, EUA).
4.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os espectros bidimensionais de RMN foram obtidos no espectrômetro Bruker 600 MHz (Avance III, Bruker, Billerica, MA, EUA), usando sonda inversa de 5 mm. Foram realizadas as análises 2D-RMN COSY (Homonuclear 1H –1H
Correlation spectroscopy), HSQCed (Heteronuclear Single Quantum Coherence edited spectroscopy) e HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy), a 30 ºC, com amostras solubilizadas em óxido de deutério (D2O). Os deslocamentos químicos dos PS foram expressos em δ (ppm) relativos ao ácido trimetilsilil propiônico. As estruturas das moléculas foram determinadas no software ChemSketch v. 12.0 (ACD/Labs, Toronto, Ont, Canada).
4.6 Linhagens e Cultura Celular
As linhagens celulares de macrófago murino RAW 264.7 (ATCC número TIB-71) e de melanoma murino B16-F10 (ATCC CCL-6475) foram cultivadas em meio de cultura Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (CULTILAB, Campinas, SP, Brasil) suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB) (CULTILAB, Campinas, SP, Brasil) e antibióticos (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) (Gibco, Fort Worth, TX, EUA), e mantidas em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 °C. Para manutenção da cultura celular, o meio de cultivo foi trocado a cada três dias e ao se atingir 80% de confluência as células foram subcultivadas com auxílio de um raspador celular (RAW 264.7) ou por tripsinização (B16-F10).
4.7 Ensaios de viabilidade celular
4.7.1 Ensaio de redução do Brometo de 3-(4,5-dimetil- tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)
A capacidade dos macrófagos RAW 264.7 de reduzirem o MTT foi avaliada segundo Mosmann (77). Para tanto, as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 104 célula/poço. Após o tratamento com as diferentes frações polissacarídicas, nas diferentes concentrações testadas (100-800 µg/mL), por um período de 24 h, o meio de cultura foi retirado e foi adicionado 100 µL de MTT (Sigma, St. Louis, MO, EUA) (1 mg/mL dissolvido em DMEM com 10% de SFB). Posteriormente, as células foram mantidas por 4 h em incubadora contendo 5% de CO2 a 37 °C. Em seguida, os poços foram aspirados e os cristais de formazan solubilizados por meio da adição de 100 µL/poço de etanol P.A. A absorbância foi determinada em espectrofotômetro de microplacas Epoch da Biotek Instruments Inc. (Winooski, VT, EUA) no comprimento de onda de 570 nm. Células mantidas em meio de cultura DMEM contendo 10% de SFB foram utilizadas como controle negativo. A viabilidade celular foi calculada em relação ao controle negativo por meio da fórmula: % de viabilidade = (Ateste/Acontrole) x 100, na qual Ateste corresponde a absorbância do grupo experimental e Acontrole a absorbância do controle negativo.
4.7.2 Ensaio do Azul de Alamar
As células da linhagem B16-F10 foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 104 célula/poço. Após o tratamento com os PS, nas diferentes concentrações testadas (100-1000 µg/mL), por um período de 24 horas, foi adicionado a cada poço 10 µL do alamar blue® (Sigma, St. Louis, MO, EUA) (400 µg/mL em tampão fosfato salino - PBS). Posteriormente, as células foram incubadas por 4 h em estufa com 5% de CO2 a 37°C. Em seguida, a absorbância foi medida a 570 nm e 600 nm em espectrofotômetro de microplacas Epoch da Biotek Instruments Inc. (Winooski, VT, EUA). Células mantidas em meio de cultura DMEM contendo 10% de SFB foram utilizadas como controle negativo. A viabilidade celular foi calculada por meio da fórmula: % de viabilidade = [(A570-teste/A600-teste) / (A570-controle/A600-controle)] x 100, na qual A570-teste e A600-teste
correspondem as absorbâncias do grupo experimental, nos comprimentos de onda de 570 e 600 nm, respectivamente e A570-controle e A600-controle correspondem as absorbâncias do controle negativo nos comprimentos de onde de 570 e 600 nm, respectivamente.
4.8 Ensaios para avaliação do potencial imunoestimulatório
4.8.1 Dosagem de NO
A atividade imunoestimulatória dos PS foi determinada por meio da quantificação dos níveis de nitrito liberado no sobrenadante de culturas celulares de macrófagos RAW 264.7, conforme descrito por Green et al. (78). Inicialmente, as células foram cultivadas (3x105/poço) em placas de 24 poços e exposta as diferentes concentrações dos PS (100-800 µg/mL), por 24 h. Lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) de Escherichia coli 055: B5 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA), na concentração de 2 µg/mL foi utilizado como controle positivo, enquanto que o meio de cultura DMEM contendo 10% de SFB foi utilizado como controle negativo. Após o tempo de tratamento, 100 µL do sobrenadante foi coletado e misturado com 100 µL do Reagente de Greiss (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e incubados por 10 minutos, a temperatura ambiente e protegido da luz. A absorbância foi determinada em espectrofotômetro de microplacas Epoch da Biotek Instruments Inc. (Winooski, VT, EUA) a 540 nm. Os resultados foram expressos em percentual de nitrito produzido em relação ao controle positivo (LPS), conforme a fórmula: % de produção de nitrito = (Ateste/ALPS) x 100, na qual Ateste corresponde a absorbância do grupo experimental e ALPS a absorbância do LPS (controle positivo). Adicionalmente, a possível participação da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) na produção de NO foi avaliada por meio da quantificação dos níveis de NO, conforme descrito acima, na presença do inibidor enzimático Nω-nitro-arginina-metil-ester (L-NAME) (Sigma, St. Louis, MO, EUA) 250 µM.
4.8.2 Produção de espécies reativas de oxigênio intracelulares
Os níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) intracelulares foram avaliados por meio da quantificação da fluorescência emitida pelo 2’7’ diclorofluoresceína, a forma oxidada do 2’7’ diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA). Para tanto, macrófagos RAW 264.7 foram cultivados (3x105/poço) em placas de 24 poços e expostos aos PS, por 24 h. LPS (2 µg/mL) foi utilizado como controle positivo, enquanto o meio de cultura DMEM contendo 10% de SFB foi utilizado como controle negativo. Após o tratamento, o sobrenadante foi retirado, as células foram lavadas com PBS e foi adicionado aos poços o DCFH-DA (Sigma, St. Louis, MO, EUA) a 100 µM em meio DMEM, contendo 1% de SFB e posterior incubação a 37 °C, 5% de CO2, por 2 h. Em seguida, o DCFH foi retirado, as células lavadas duas vezes com PBS e a fluorescência emitida quantificada no citômetro de fluxo (FACSCanto II, BD Biosciences, Eugene, OR, EUA) com o software FACSDiva, version 6.1.2 (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os resultados foram analisados no software FlowJo (FlowJo, Ashland, OR, EUA) e expressos em % de fluorescência emitida em relação as células tratadas com LPS.
4.8.3 Extração de RNA e análise da expressão gênica por qRT-PCR.
A análise da expressão gênica foi realizada em macrófagos RAW 264.7. Para tanto, as células (2,5 x 106) foram cultivadas em garrafas de 25 cm2 e incubadas com os PS a 37º C, 5% de CO2, por 24 h. O RNA total foi extraído por meio do kit ReliaPrep TMRNA Cell Miniprep System da Promega (Madison, WI,
EUA), conforme instruções do fabricante e quantificado no espectrofotômetro NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Após extração do RNA, o RNA total foi tratado com DNAse, utilizando Kit DNase TURBO DNA-free™Kit TURBO™ (Ambion Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, o DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando o kit High Capacity cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), segundo determinações do fabricante. As reações de amplificação foram realizadas utilizando o reagente SYBRGreen (Applied Biosystem, Foster
City, CA, EUA), conforme instruções do fabricante, no equipamento QuantStudio5 (Applied biosystems, Foster City, CA, EUA). Os genes avaliados e as respectivas sequencias nucleotídicas dos primers foram: COX-2 (Ciclooxigenase-2), 5’-CTGGAACATGGACTCACTCAGTTG-3’(Forward), 5-’AGGCCTTTGCCACTGCTTG-3’(Reverse); iNOS (Óxido Nítrico Sintase
induzível), 5’-ACCTTGTTCAGCTCAGCC TTCAAC-3’ (Forward),
5’-GTGCTTGTCACCACCAGCAGTAGT-3’(Reverse) e β-actina,
5’-TCATGAAGTGTGCGTTGACATCCGT-3’(Forward), 5’-CCTAGAAGC
ATTTGCGGTGCACGAG-3’ (Reverse). A expressão gênica foi normalizada com o gene da β-actina. A eficiência da PCR (E) foi calculada com auxílio do software LinRegPCR, conforme Ramakers et al. (79), threshold cycles (Cts) foram normalizados para eficiência igual a 2 [Ct′ = Ct x (log2 E/log2 2)], e a expressão relativa calculada de acordo com o método de Pant et al. (80).
4.8.4 Dosagem de citocinas
O sobrenadante das células que foram expostas aos PS no experimento empregado para a extração de RNA foi utilizado para o ensaio de quantificação das citocinas Interleucina 6 (IL-6) e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α). Nesse caso, as citocinas foram quantificadas por meio do kit BD Cytometric Bread Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit, (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) conforme orientações do fabricante, no citômetro de fluxo (FACSCanto II, BD Biosciences, Eugene, OR, EUA) com o software FACSDiva, version 6.1.2 (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os resultados foram analisados no software FCAP Array, versão 3.0 (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA).
4.9 Ensaios para caracterização das atividades anticâncer
4.9.1 Ensaio de Apoptose (Anexina-V/ Iodedo de Propídeo)
Células da linhagem B16-F10 (2 x 105 células/poço) foram cultivadas em placas de 6 poços e expostas aos PS na concentração de 1000 µg/mL, por 24 h. Após o tempo de exposição, as células foram soltas com tripsina e EDTA, centrifugadas (2500 rpm, 4º C, 5 min) e lavadas duas vezes com PBS gelado.
Em seguida, as células foram marcadas com a Anexina-V conjugada ao Isotiocianato de fluorosceína (FITC) e com o Iodedo de Propídeo, utilizando o Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), conforme especificações do fabricante. Células mantidas em meio de cultura DMEM contendo 10% de SFB foram utilizadas como controle negativo. Os percentuais de células marcadas foram quantificados no citômetro de fluxo (FACSCanto II, BD Biosciences, Eugene, OR, EUA) com o software FACSDiva, version 6.1.2 (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os resultados foram analisados no software FlowJo (FlowJo, Ashland, OR, EUA).
4.9.2 Análise do Ciclo Celular
Para análise do ciclo celular, as células B16-F10 foram expostas aos PS nas mesmas condições descritas para o ensaio de morte celular. Após o tratamento e as etapas de tripsinização e lavagem com PBS, as células foram permeabilizadas com 90 µL de Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO, EUA) 0,1% e tratadas com 10 µL de RNAse (4 mg/mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por 1 h a 37º C. Em seguida, foram marcadas com 5 µL de Iodedo de Propídeo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Células mantidas em meio de cultura DMEM contendo 10% de SFB foram utilizadas como controle negativo. A marcação foi quantificada no citômetro de fluxo (FACSCanto II, BD Biosciences, Eugene, OR, EUA) com o software FACSDiva, version 6.1.2 (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os resultados foram analisados no software FlowJo (FlowJo, Ashland, OR, EUA).
4.9.3 Ensaio de migração Wound healing
Células B16-F10 foram cultivadas em placas de 24 poços (4 x 104 célula/poço) até atingirem aproximadamente 80% de confluência. Em seguida, com auxílio de uma ponteira de micropipeta de 1000 µL, foi feita uma fenda (scratch) no centro do poço. Os poços foram lavados duas vezes com meio de cultura novo para retirada das células soltas. Em seguida, foram adicionados os PS nas concentrações de 100, 400 e 1000 µg/mL. As células foram incubadas
com 5% de CO2, a 37 ºC e monitoradas no microscópio Zeiss Observer z.1 invertido e de campo claro, por 48 h. Células mantidas em meio de cultura DMEM contendo 10% de SFB foram utilizadas como controle negativo. As imagens capturadas foram analisadas no software Image J (81) e a taxa de migração calculada conforme a fórmula: % de migração = [(At0 – At) / At0] x 100, na qual At0 corresponde a scratch área no tempo 0 e At a scratch nos respectivos tempos de tratamento de 24 e 48 h.
4.9.4 Ensaio de migração com uso de Transwell
Inicialmente, os transwell foram hidratados em DMEM suplementado com 10% de SFB e fibronectina (40 µg/mL), (Sigma, St. Louis, MO, EUA) por 1 h. Em seguida, foram lavados com PBS e ao seu interior foram acrescentadas as células (3 x 105/poço). Após o período de adesão de 1 h em incubadora contendo 5% de CO2 a 37º C, foram adicionadas aos poços as soluções contendo os PS nas concentrações de 100, 400 e 1000 µg/mL. Posteriormente, as células foram incubadas por 4 h. Células mantidas na ausência do PS e em DMEM suplementado com 10% de SFB foram utilizadas como controle negativo, enquanto as mantidas em transwell hidratados em meio sem SFB e fibronectina foram utilizadas como controle positivo. As células que não migraram foram retiradas do transwell com auxílio de hastes flexíveis contendo algodão nas extremidades, enquanto as células que migraram foram fixadas com metanol e coradas com cristal violeta 0,2%. As imagens foram capturadas em microscópio óptico e 10 campos foram analisados para cada replicata dos grupos controle e teste. A taxa de migração foi calculada por meio da fórmula: % de migração = (número de células que migraram no grupo teste / número de células que migraram no grupo controle negativo) x 100.
4.9.5 Ensaio Clonogênico
Células da linhagem B16-F10 (100 células/poço) foram cultivadas em placas de 6 poços overnight. No dia seguinte, o meio de cultura foi substituído por um meio de cultura novo contendo os PS nas concentrações de 100, 400 e
1000 µg/mL. As células foram incubadas em estufa com 5% de CO2, a 37º C, por oito dias. O meio de cultura contendo os PS e do grupo controle negativo (DMEM com 10% de SFB) foi trocado a cada três dias. Após o período de tratamento, o meio de cultura foi removido, os poços lavados com PBS, as colônias formadas fixadas com metanol e coradas com cristal violeta 0,2%, por 30 min. Em seguida, os poços foram fotografados e as imagens analisadas no programa Image J (81). Os resultados foram quantificados como a área total de crescimento das colônias e expressos em relação ao crescimento total do controle negativo (100%).
4.9.6 Dosagem de Melanina
Células B16-F10 (5 x 104 célula/poço) foram cultivadas em placas de 6 poços e expostas aos PS nas concentrações de 100, 400 e 1000 µg/mL, por 48 h. Após o período de tratamento, as células foram soltas com tripsina e EDTA, centrifugadas (3000 rpm, 4º C, 5 min) e lavadas com PBS. Em seguida, as células foram lisadas por meio da adição de NaOH 1 M e a absorbância medida a 475 nm em espectrofotômetro de microplacas Epoch da Biotek Instruments Inc. (Winooski, VT, EUA). Células mantidas em meio de cultura DMEM contendo 10% de SFB utilizadas como controle negativo. Os resultados foram expressos como percentual de melanina produzida em relação ao grupo mantido em meio de cultura DMEM durante todo experimento (controle negativo).
4.10 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada com o Prism 5 (GraphPad software, versão 5.00, CA, EUA). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. As diferenças estatísticas entre os grupos foram avaliadas por meio da análise de variância e pelo teste Student Newman-Keuls. Valores de p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos.
5.0 ARTIGOS PRODUZIDOS
Artigo 01 (publicado)
Título: In Vitro Immunostimulating Activity of Sulfated Polysaccharides from Caulerpa cupressoides var. Flabellata
Doi:10.3390/md17020105
Periódico: Marine Drugs
ISSN: 1660-3397
Fator de impacto: 4.379 (2017)
Qualis A2 (2016) na área de medicina II
Artigo 02 (submetido)
Título: Immunostimulatory effect of sulfated galactans from the green seaweed Caulerpa cupressoides var. flabellata
Periódico: International Journal of Biological Macromolecules ISSN: 0141-8130
Fator de impacto: 3.909 (2017)
Artigo 03 (Submetido)
Título: Antimelanome activity of Sulfated Galactans from Caulerpa cupressoides var. flabellata
Periódico: Marine Drugs
ISSN: 1660-3397
Fator de impacto: 4.379 (2017)
5.1 Artigo 01:
Article
In
vitro
immunostimulating
activity
of
sulfated
polysaccharides from Caulerpa cupressoides var.
flabellata
Jefferson da Silva Barbosa 1,2,3, Mariana Santana Santos Pereira Costa 4,
Luciana Fentanes Moura Melo 1, Mayara Jane Campos de Medeiros 5, Daniel de Lima
Pontes 5, Katia Castanho Scortecci 6 and Hugo Alexandre de Oliveira Rocha 1,2,*
1 Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), Departamento de Bioquímica, Centro
de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, Rio Grande do Norte, 59078-970, Brazil; jefferson.barbosa@ifrn.edu.br (J.S.B.); lucianafentanes@gmail.com (L.F.M.M.).
2 Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN), Natal, Rio Grande do Norte, 59012-570, Brazil
3 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte (IFRN), Campus São
Gonçalo do Amarante, Rio Grande do Norte, 59291-727
4 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte (IFRN), Campus João
Câmara, Rio Grande do Norte, 59550-000, Brazil; mariana.costa@ifrn.edu.br (M.S.S.P.C).
5 Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros (LQCPol), Instituto de Química, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, Rio Grande do Norte, 59078-970, Brazil; mayarajane20049@hotmail.com (M.J.C.M); pontesdl@yahoo.com (D.L.P.)
6 Laboratório de Transformação de Plantas e Análise em Microscopia, Departamento de Biologia Celular
e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte 59078-970, Brazil; kacscort@yahoo.com (K.C.S).
* Correspondence: hugo-alexandre@uol.com.br; Tel.: +55-84-3215-3416
Received: 23 January 2019; Accepted: 7 February 2019; Published: 9 February 2019
Abstract: Green seaweeds are rich sources of sulfated polysaccharides (SPs) with potential
biomedical and nutraceutical applications. The aim of this work was to evaluate the immunostimulatory activity of SPs from the seaweed, Caulerpa cupressoides var. flabellata on murine RAW 264.7 macrophages. SPs were evaluated for their ability to modify cell viability and to stimulate the production of inflammatory mediators, such as nitric oxide (NO), intracellular reactive oxygen species (ROS), and cytokines. Additionally, their effect on inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase 2 (COX-2) gene expression was investigated. The results showed that SPs were not cytotoxic and promote the production of NO, ROS and the cytokines, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6). It was also observed that treatment with SPs increased iNOS and COX-2 gene expression. Together, these results indicate that C.
cupressoides var. flabellata SPs have strong immunostimulatory activity, with potential
biomedical applications.
Keywords: sulfated polysaccharides; immunostimulatory activity; macrophages; inflammatory
mediators
1. Introduction
Seaweeds are sources of bioactive compounds with potential biotechnological applications and could potentially be exploited as functional ingredients for human health [1,2]. Among these compounds, sulfated polysaccharides (SPs) are the main components of the cell wall of seaweeds and represent an important structural component of these organisms [3,4]. These SPs exhibit many beneficial biological activities such as anticoagulant, antiviral, antioxidative, anticancer and immunomodulating activities [5]. Therefore, marine algae derived SPs have great
potential for further development as products in nutraceutical, pharmaceutical and cosmeceutical areas [6].
The discovery and evaluation of the biological activities of SPs has emerged as a promising field of research. In the last few decades, several studies have reported that SPs are able to interact with surface receptors of animal cells and involve in several processes like cell recognition, cell adhesion, and the regulation of cellular processes of biomedical interest [7], including those involved in modulating the immune response [8–10]. Molecules with immunostimulatory effects, such as SPs, may become interesting therapeutic agents because they are capable of potentiating natural defenses against immunosuppressive conditions, as in individuals undergoing cancer treatment, as well in fighting against infections caused by microorganisms [11–13].
SPs have, among other characteristics, low toxicity and therefore, cause few adverse effects. These compounds stimulate different types of immune system cells, in vitro and in vivo, to produce and secrete molecules with immunostimulatory effects [4,14,15]. Hence, they have therapeutic potential as adjuvants for the treatment of immunological disorders.
Macrophages are important effector cells of innate immunity, but they also help in the initiation and propagation of the acquired immune response. Therefore, the search for agents that modulate the activity of macrophages is of great interest in biomedical research [16]. Studies of SPs obtained from different natural sources have shown that these molecules stimulate macrophages to increase their cytotoxic and immunomodulatory activities, through the production of nitric oxide (NO), reactive oxygen species (ROS), prostaglandins, and the production and secretion of cytokines [17–19]. Often these inflammatory mediators are studied by quantification in cell culture supernatants or by analyzing their gene expression, such as for the enzymes, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) [20–22].
The seaweed, Caulerpa cupressoides var. flabellata, synthesizes four distinct SPs populations, CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0, and CCB-F2.0 [23]. CCB-F0.3 presents the main polysaccharide with a molecular weight of 155 kDa, consisting of the monosaccharides, galactose, glucose, mannose, and xylose in a molar ratio of 1.0:0.1:0.2:0.1. CCB-F0.5 has polysaccharide of 130 kDa, consisting of galactose and mannose in a molar ratio of 1.0:0.1 and traces of xylose. CCB-F1.0 presents as a 155 kDa polysaccharide with galactose, mannose, and xylose in a molar ratio of 1.0:0.1:0.6 and traces of glucose and rhamnose. CCB-F2.0 presents as a 170 kDa polysaccharide with galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose, and fucose in a molar ratio of 1.0:0.6:1.8:1.0:0.5:1.0. Although previous studies have characterized the antiproliferative, anticoagulant, and antioxidant activities of SPs from C. cupressoides var.
flabellata [23,24], their immunostimulatory properties remain unknown. Therefore, the aim of this
work was to evaluate the immunostimulatory potential of theirs SPs on murine macrophage RAW 264.7 cell line.
2. Results and Discussion
Using the process of extracting C. cupressoides SPs described by Costa et al. [23] and in the Materials and Methods section of this paper, four SPs-rich fractions were obtained that were dominated by CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0, and CCB-F2.0. These fractions were evaluated by gel electrophoresis and infrared spectroscopy to confirm their identity.
2.1. Agarose gel electrophoresis in 1,3-diamino propane acetate buffer (PDA)
C. cupressoides polysaccharides were subjected to agarose gel electrophoresis. As seen in
Figure 1, bands were detected, after toluidine blue staining, that correspond to the predominant SPs population in each of the fractions. In addition, different SPs populations were shown to have different mobilities. The SPs present in CCB-F0.3 and CCB-F0.5 showed similar mobilities, but they were less mobile than the other polysaccharides. CCB-F2.0 SPs had highest mobility, while CCB-F1.0 SPs had an intermediate mobility.
Figure 1. Electrophoretic mobility of the crude extract and polysaccharide fractions from C.
cupressoides in agarose gel. About 5 µL aliquots (50 µg) of each sample were applied in agarose gel prepared in diaminopropane acetate buffer and subjected to electrophoresis, as described in Materials and Methods section.
Generally, in agarose gel electrophoresis systems, the mobility of polysaccharides depends on their charge. For example, those with a more negative charge have greater mobility. However, as suggested by Dietrich and Dietrich [25], the use of 1,3-diaminopropane alters this outcome, such that negatively charged polysaccharides are not necessarily more mobile. At the pH used in this experiment (9.0), SPs assume a conformation in which some sulfate groups are exposed and others not. The exposed sulfate groups react with the diamine, resulting in neutralization of their negative charge. This induces a conformational change in the polysaccharide, exposing new sulfate groups and subsequently, react with the diamine. This process continues until an equilibrium is reached and the conformation of the polysaccharide no longer changes.
However, the polysaccharide, in this conformational equilibrium condition, will still have sulfate groups that have not reacted with the diamine, and these groups will permit mobility of the polysaccharide during agarose electrophoresis. In summary, the polysaccharide molecules that have the same structure will have the same interaction with the diamine and consequently, will have the same electrophoretic mobility. Meanwhile, structurally different polysaccharides will have different electrophoretic mobilities. The SPs in this study were verified to have similar mobilities to those reported by Costa et al. [23].
2.2. Infrared spectroscopy
The infrared spectroscopy technique is quick and easy to execute. It is a useful tool that can be used to identify some chemical characteristics from polysaccharides. Infrared spectroscopy analysis detected signals corresponding to SPs functional groups in the four polysaccharide fractions of C. cupressoides. As can be seen in Figure 2, bands were identified between 3430– 3481 cm-1 and 2922–2934 cm-1, corresponding to the stretching vibrations O-H and C-H,
respectively [16]. Absorption bands in the range of 1641–1655 cm-1, corresponding to bound
water; 1255–1259 cm-1, typical of sulfate groups (S=O); 1030–1075 cm-1, corresponding to
vibrations of the glycosidic bond of the carbonyl group; and signals around 820 cm-1, indicating
the presence of asymmetric C-O-S stretching vibrations associated with the C-O-S03 group, were
also detected [26–28]. The spectra of C. cupressoides fractions obtained here were similar to the spectra of the same fractions reported by Costa et al. [23], confirming the structural similarity of the four polysaccharide fractions obtained in the two studies.
Figure 2. Infrared spectra of sulfated polysaccharide-rich fractions from C. cupressoides.
The fractions, CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0, and CCB-F2.0 and their respective SPs were obtained using the same procedure described by Costa et al. [23]. Furthermore, the fractions obtained here were structurally similar to those reported by these authors, as seen in both gel electrophoresis and infrared spectra results. Therefore, it can be assumed that the polysaccharides obtained here are the same as those obtained by Costa et al. [23]. Therefore, the fractions CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0, and CCB-F2.0 and their SPs were evaluated for their immunostimulatory activities.
2.3. Cell viability
Macrophages are central cellular components of the innate and adaptive immune responses, participating in the production of molecules with microbicidal, tumoricidal, and immunomodulatory functions [29]. Thus, the viability of RAW 264.7 macrophages was evaluated according to 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction ability, after treatment with the crude extract and different polysaccharide fractions of C. cupressoides (100–800 μg/mL) for 24 h. As shown in Figure 3, in most of the conditions tested, there were no significant changes in MTT reduction ability when compared to the negative control. However, the 100, 200, and 400 μg/mL CCB-F2.0 concentrations showed a significant increase in MTT reduction capacity by up to 60% (p < 0.05). These results indicate that C. cupressoides SPs had little effect on the viability of RAW 264.7 macrophages and point to a possible absence of cytotoxicity.
Figure 3. Influence of the crude extract and sulfated polysaccharide-rich fractions from C.
cupressoides on the viability of RAW 264.7 macrophages. The data presented correspond to means ± standard deviations (n = 3). Different letters represent statistically significant differences (p < 0.05) between the different concentrations of crude extract or polysaccharide fractions. Different numbers represent statistically significant differences (p < 0.05) between the same concentration of the crude extract and polysaccharide fractions. * represents samples that presented statistically significant differences (p < 0.05) in relation to the negative control.
2.4. NO production
NO is one of the main molecules produced by activated macrophages, with potent cytotoxic effects on pathogenic microorganisms and tumor cells. It also acts as an intracellular messenger in the regulation of several physiological processes [30]. Therefore, the immunomodulatory activity of SPs extracted from seaweeds has been investigated by several authors, through the evaluation of NO levels produced by macrophages [4,14,31]. Therefore, in this study, NO levels were determined in RAW 264.7 macrophages exposed to different concentrations of the crude extract and polysaccharide fractions of C. cupressoides. As shown in Figure 4, the crude extract and polysaccharide fractions were able to induce statistically significant increases (p < 0.05) in NO production at most concentrations tested, when compared to the negative control. In addition, treatment with 800 μg/mL of CCB-F1.0 and CCB-F2.0 resulted in NO levels that were higher than those produced by LPS-stimulated cells (p < 0.01), indicating that these fractions promoted a strong immunostimulatory activity.
Figure 4. Effect of the crude extract and sulfated polysaccharide-rich fractions from C.
cupressoides on the NO production. The data presented correspond to means ± standard deviations (n = 3). Different letters represent statistically significant differences (p < 0.05) between the different concentrations of crude extract or polysaccharide fractions. Different numbers represent statistically significant differences (p < 0.05) between the same concentration of the crude extract and polysaccharide fractions. * represents the samples that had a statistically significant difference (p < 0.05) in relation to the negative control. # represents statistically significant increases (p < 0.01) in NO production relative to the positive control. LPS— Lipopolysaccharide. NC—negative control.
SPs are described in the literature as molecules capable of inducing an increase in NO production. In a study by Lee et al. [32], a sulfated galactan obtained from Codium fragile was shown to promote an increase in NO production by RAW 264.7 macrophages. Similar immunostimulatory effects are also promoted by SPs from Dictyopteris divaricate [33], Porphyra
haitanensis [14], and Ecklonia cava [34] in RAW 264.7 macrophages. The different
polysaccharides from C. cupressoides induced NO production at different levels. Several studies suggest that the differences in NO production capacity promoted by different SPs types may be related to their chemical characteristics, such as polysaccharide type, molecular weight, monosaccharide composition, conformation and branching of the molecule, and sulfate content [35–37]. In this study, the highest NO production values were observed after treatment with the CCB-1.0 and CCB-F2.0 fractions. Costa et al. [23] reported that the most significant differences in the chemical characteristics between these fractions were in the sulfate/total sugars ratio and the molecular weight. In this study, CCB-F1.0 showed a sulfate/total sugars ratio of 0.23, the lowest among the four fractions studied, while CCB-F2.0 had a ratio of 0.53. The molecular weight of SPs in the CCB-F1.0 fraction was 155 kDa and in the CCB-F2.0 fraction, which had the highest molecular weight among all fractions studied, it was 170 kDa.
Studies have observed different immunostimulatory activities of polysaccharides based on their degree of sulfation. In a study of SPs from Ulva rigida, Leiro et al. [38] found that NO production was proportional to the amount of sulfate, whereas heterofucans obtained from
Sargassum filipendula, with similar sugar/sulfate ratios, showed distinct NO production capacities
[31]. The authors of this paper discuss that the position in which the sulfate groups are distributed in the molecule seems to be a factor more determining for immunostimulatory capacity than the degree of sulfation. Qi and Kim [36] observed that the reduction in molecular weight of Chlorella
ellipsoidea SPs resulted in a decrease in NO production. However, fractions of carrageenans with
lower molecular weight are associated with higher immunostimulatory properties [39]. Nie et al. [40], when evaluating the immunostimulatory capacity of two polysaccharide fractions from stem lettuce, with different sulfate content and molecular weight, observed that macrophages produced
