Natal/RN
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Efeito de padrões de escoamento sobre o particionamento de
biomoléculas (proteína e ampicilina) em sistemas aquosos
bifásicos (SABs) empregando microsistemas
Marcelo da Silva Pedro
Orientador: Prof. Dr. Domingos Fabiano de Santana Souza
Coorientador: Dr. Carlos Eduardo de Araújo Padilha
Natal/RN
Fevereiro/2020
Marcelo da Silva Pedro
Efeito de padrões de escoamento sobre o particionamento de
biomoléculas (proteína e ampicilina) em sistemas aquosos bifásicos
(SABs) empregando microsistemas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de Mestre, sob a orientação do Prof. Dr. Domingos Fabiano de Santana Souza e coorientação do Dr. Carlos Eduardo de Araújo Padilha.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Pedro, Marcelo da Silva.
Efeito de padrões de escoamento sobre o particionamento de biomoléculas (proteína e ampicilina) em sistemas aquosos bifásicos (SABs) empregando microsistemas / Marcelo da Silva Pedro. - 2020.
83f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química, Natal, 2020.
Orientador: Dr. Domingos Fabiano de Santana Souza. Coorientador: Dr. Carlos Eduardo de Araújo Padilha.
1. BSA - Dissertação. 2. Extração líquido-líquido - Dissertação. 3. Padrão de fluxo - Dissertação. 4. Microdispositivo -
Dissertação. I. Souza, Domingos Fabiano de Santana. II. Padilha, Carlos Eduardo de Araújo. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 66.0
PEDRO, Marcelo da Silva – Efeito de padrões de escoamento sobre o particionamento de biomoléculas (proteína e ampicilina) em sistemas aquosos bifásicos (SABs) empregando microsistemas. Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Área de Concentração: Engenharia Química. Linha de pesquisa: Simulação, Otimização e Controle de Processos. Natal/RN, 2020, Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Domingos Fabiano de Santana Souza Coorientador: Dr. Carlos Eduardo de Araújo Padilha
RESUMO: A separação de proteínas é um processo complexo que envolve uma sequência dispendiosa de etapas. Nesse trabalho, um microsistema foi construído para separar proteína modelo utilizando a técnica de extração líquido-líquido através de sistema aquoso bifásico (SAB) de polímero e sal. O SAB foi formado pela mistura do polímero polietilenoglicol-PEG (25% m/m), fosfato de potássio (10% m/m) e água destilada (65% m/m). Os canais do microsistema apresentam diâmetros de 0,51 mm, 1,14 mm e 1,8 mm. A faixa de vazões total foi de 20 a 700 μL/min. Inicialmente, os padrões de fluxo foram determinados usando SAB composto por PEG/fosfato com diferentes massas moleculares de polímero (PEG 1500, PEG 4000 e PEG 6000) e minicanais de silicone com geometria circular disposto na forma senoidal e diâmetro de 1,8 mm. Conforme esperado, um aumento gradativo de vazão de líquido possibilitou alcançar, em sequência, os seguintes padrões de fluxo: fluxo slug, gotículas e paralelo. Para os sistemas formados por PEG 4000/fostato e PEG 6000/fostato, a elavada viscosidade impediu a ocorrência do padrão de fluxo paralelo. Em seguida, foi estudado o efeito dos padrões de fluxo sobre a recuperação da proteína albumina do soro bovino (do inglês bovine serum albumin-BSA) e ampicilina para os três padrões de fluxo obtido no sistema PEG-1500/fosfato de potássio dibásico nos tempos de residência de 3, 5 e 10 min no minicanal de 1,8 mm. Nessa condição, as maiores eficiências de recuperação de BSA foram obtidas em tempo de residência de 10 min, sendo o regime de gotículas o que proporcionou maior pecentual de recuperação. Entretanto, na recuperação de uma molécula menor (ampicilina), cuja massa molar é 349 g/mol, não foi possível observar diferenças significativas entre os padrões de fluxo para o mesmo tempo de residência. Ensaios de recuperação para a proteína modelo BSA foram também realizados utilizando um minicanal de 1,14 mm e microcanal de 0,510 mm, padrão de fluxo de gotículas e tempos de residência de 3, 5 e 10 min, respectivamente. A redução do diâmetro dos canais e o aumento dos tempos de residência apresentaram um efeito positivo na
eficiência de extração, onde o valor máximo de eficiência obtido foi 69% para o microcanal 0,510 mm e tempo de residência de 10 min. Além disso, o padrão de fluxo e a redução de escala tiveram efeito positivo para o coeficiente volumétrico de transferência de massa (𝐾𝐿𝑎), com valores máximos sendo obtidos para o regime de gotículas e microcanal 0,510 mm.
MARCELO DA SILVA PEDRO
EFEITO DE PADRÕES DE ESCOAMENTO SOBRE O
PARTICIONAMENTO DE BIOMOLÉCULAS (PROTEÍNA E
AMPICILINA) EM SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS (SABs)
EMPREGANDO MICROSISTEMAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química, sob a orientação do Prof. Dr. Domingos Fabiano de Santana Souza e coorientação do Dr. Carlos Eduardo de Araújo Padilha.
Aprovado (a) em: 20 de fevereiro de 2020.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Domingos Fabiano de Santana Souza Orientador - UFRN
Dr. Carlos Eduardo de Araújo Padilha Coorientador - UFRN
Prof.a Dr.a Liana Franco Padilha
Membro Interno - UFRN Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Membro Interno - UFRN
Prof. Dr. Juan Alberto Chavez Ruiz Membro Externo - CTGAS
PEDRO, Marcelo da Silva – Effect of flow patterns on the partitioning of biomolecules (protein
and ampicillin) in aqueous two-phase systems (ATPS) using microsystems. Post-graduation Program of Chemical Engineering, Federal University of Rio Grande do Norte. Area of Concentration: Chemical Engineering. Line of Research: Process Simulation, Optimization and Control. Natal/RN, 2020, Brazil.
Supervisor: Prof. Dr. Domingos Fabiano de Santana Souza Co-Supervisor: Dr. Carlos Eduardo de Araújo Padilha
ABSTRACT: Protein separation is a complex process which involves an expensive sequence of steps. In this work, a microsystem was built to separate standard proteins using the liquid-liquid extraction technique through an aqueous two-phase system (ATPS) of salt and polymer. The ATPS was formed by the mixture of the polymer polyethyleneglycol – PEG (25% w/w), potassium phosphate (10% w/w), and distilled water (65% w/w). The microsystem channels present diameters of 0.51mm, 1.14 mm and 1.8 mm. The total flow range was from 20 to 700 μL/min. Initially, flow patterns were determined using ATPS composed of PEG/phosphate with different polymer molecular masses (PEG 1500, PEG 4000 and PEG 6000) and silicone minichannels with circular geometry positioned in a senoidal form and with a 1.8 mm diameter. As expected, the gradual increase of the liquid flow allowed to reach the following flow patterns in sequence: slug flow, droplet flow and parallel flow. For the systems formed by PEG 4000/phosphate and PEG 6000/phosphate, the elevated viscosity prevented the occurence of the parallel flow. Next, was studied the effect of the flow patterns over the recovery of albumin from the bovine serum – BSA and ampicillin – for the three flow patterns was obtained in the PEG 1500/dibasic potassium phosphate at the residence times of 3, 5 and 10 min in the 1.8 mm minichannel. In this condition, the highest BSA recovery efficiencies were obtained in 10 min of residence time, with the droplet regime providing the greatest recovery rate. However, in the recovery of a smaller molecule (ampicillin), whose molar mass is 349 g/mol, it was not possible to observe significant differences between the flow patterns for the same residence time. Experiments of recovery of BSA were also done using a 1.14 mm minichannel and a 0.510 mm microchannel employing a droplet flow pattern and residence times of 3, 5 and 10 min, respectively. The reduction in the channel diameter and the increase of residence times had positive effect in the extraction efficiency and the maximum efficiency value obtained was 69% for the 0.510 mm microchannel and 10 min residence time. Furthermore, the flow pattern and scale reduction had a positive effect on the volumetric mass transfer coefficient (𝐾𝐿𝑎), with
maximum values being obtained for the droplet pattern and 0.510 mm microchannel.
Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível. Charles Chaplin
AGRADECIMENTOS
• Ao senhor Deus pelo dom da vida.
• Aos meus pais, pelos ensinamentos, carinho, incentivo e compreensão.
• A minha noiva Sabrinna Sanily, pela paciência, amor e compreensão quando preciso me ausentar para focar nos estudos.
• Ao Professor Jackson Araújo de Oliveira, pela proposta do projeto, orientação, paciência e por acreditar que eu seria capaz de desenvolver esse trabalho.
• Ao Dr. Carlos Eduardo de Araújo Padilha, por todo o suporte na realização dos experimentos, paciência e conhecimento transmitido durante o desenvolvimento desse trabalho.
• Ao Professor Domingos Fabiano de Santana Souza, pelas discussões, contribuições e também orientação durante o desenvolvimento desse trabalho.
• Ao bolsista de iniciação científica, Luiz, por toda a ajuda na montagem do sistema e realização dos experimentos iniciais.
• A todos os integrantes do LEAFT pela colaboração e por proporcionarem vários momentos divertidos.
• Ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química-PPGEQ/UFRN pela infraestrutura e apoio técnico.
• Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pelo apoio financeiro.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 17 2. OBJETIVOS ... 21 2.1 -OBJETIVO GERAL ... 21 2.2 -OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 21 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 233.1-FUNDAMENTOS DA EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO APLICADO A SEPERAÇÃO DE PROTEÍNAS ... 23
3.2- SISTEMA AQUOSO BIFÁSICO E SUA APLICAÇÃO NA SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS ... 24
3.3 -USO DE MICROSISTEMAS PARA SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS ... 30
3.4-PADRÕES DE ESCOAMENTO NA EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO EM MICROSISTEMAS ... 32
3.5 - COEFICIENTES DE TRANSFERÊNCIA DE MASSA NA EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO EM MICROSISTEMAS ... 36
4. METODOLOGIA ... 42
4.1-REAGENTES E EQUIPAMENTOS ... 42
4.2-SISTEMA AQUOSO BIFÁSICO (SAB) ... 43
4.2.1 – Obtenção das curvas binodais ... 43
4.2.2 - Formação das fases do SAB ... 44
4.2.3 - Caracterização das fases ... 45
4.3 -MICROSISTEMA PROPOSTO ... 45
4.4 -COEFICIENTE VOLUMÉTRICO DE TRANSFERÊNCIA DE MASSA (KLA) ... 48
4.5 -ANÁLISE ESTATÍSTICA... 51
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 53
5.1-CURVAS BINODAIS OBTIDAS E CARACTERIZAÇÃO DO SAB ... 53
5.2-MAPEAMENTO DOS PADRÕES DE ESCOAMENTO ... 55
5.3-EFEITO DO PADRÃO DE FLUXO E TEMPO DE RESIDÊNCIA NA RECUPERAÇÃO DA PROTEÍNA BSA ... 58
5.4 - EFEITO DO PADRÃO DE FLUXO E TEMPO DE RESIDÊNCIA NO PARTICIONAMENTO DO ANTIBIÓTICO AMPICILINA ... 61
PROTEÍNA BSA ... 62
5.6-DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE VOLUMÉTRICO DE TRANSFERÊNCIA DE MASSA (KLA) 64 6. CONCLUSÕES ... 67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 69
APÊNDICE A ... 80
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 3.1 - Ilustração esquemática da separação de fases em SABs do tipo polímero/sal. ... 26 Figura 3.2 - Diagrama de fases típico de sistemas aquosos bifásicos formados pela mistura PEG e sal, apresentado em coordenadas retagulares. ... 27 Figura 3.3 – Influência da massa molar no diagrama de fase dos SABs formados de PEG 1500/fosfato de potássio e PEG 4000/fosfato de potássio. ... 29 Figura 3.4 - Diferentes padrões de fluxo bifásico líquido-líquido. a) – Fluxo slug, b) – Fluxo slug e gotículas, c) – Fluxo de gotículas e d) – Fluxo paralelo. ... 35 Figura 4.1 – Procedimento de formação do sistema aquoso bifásico utilizado. ... 44 Figura 4.2 - Esquema do aparato experimental utilizado nos estudos de particionamento da proteína BSA e ampicilina em microsistema. ... 45 Figura 4.3 - Esquema dos padrões de escoamentos registrados no microdispositivo e considerações realizadas para calcular o coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa) da proteína ... 51 Figura 5.1 – Curva binodal obtida experimentalmemte do sistema composto por PEG 1500 e K2HPO4 em termos de percentual mássico e o modelo de Merchuk a T= 25 ± 3 ºC . ... 53 Figura 5.2 – Curva binodal obtida experimentalmemte do sistema composto por PEG 4000 e K2HPO4 em termos de percentual mássico e o modelo de Merchuk a T= 25 ± 3 ºC . ... 54 Figura 5.3 – Curva binodal obtida experimentalmemte do sistema composto por PEG 6000 e K2HPO4 em termos de percentual mássico e o modelo de Merchuk a T= 25 ± 3 ºC . ... 54
Figura 5.4 - Mapeamento de padrões de escoamento de sistemas aquosos bifásicos PEG/sal usando microcanais circulares de 1,8 mm de diâmetro interno disposto na forma senoidal. A razão de volume de fases foi mantida em 1:1. ... 56 Figura 5.5 - Padrões de escoamento explorados no microdispositivo proposto a) Fluxo slug, b) Fluxo de gotículas e c) Fluxo paralelo. ... 57 Figura 5.6 - Eficiência de recuperação da proteína BSA para os padrões de fluxo slug, gotículas e paralelo nos tempos de residências 3, 5 e 10 min em microcanais de 1,8 mm. Vazão volumétrica total de 111,88, 337,78 e 563,68 µL/min para os regimes slug, gotículas e paralelo, respectivamente ... 59 Figura 5.7 - Coeficiente de partição (K) da proteína BSA para os três padrões de fluxo nos tempos de residências 3, 5 e 10 min em microcanais de 1,8 mm. Vazão volumétrica total de
111,88, 337,78 e 563,68 µL/min para os regimes slug, gotículas e paralelo, respetivamente . 61 Figura 5.8 - Eficiência de recuperação da ampicilina para os padrões de fluxo slug, gotículas e paralelo nos tempos de residências 3, 5 e 10 min em microcanais de 1,8 mm. Vazão volumétrica total de 111,88, 337,78 e 563,68 µL/min para os regimes slug, gotículas e paralelo, respectivamente ... 62 Figura 5.9 - Padrão de escoamento de gotículas em microcanais com diâmetro 0,510 mm determinado com uso de microscópio para vazão volumétrica total de 21,7 µL/min. ... 63 Figura 5.10 - Eficiência de recuperação da proteína BSA em microcanais de 0,510, 1,14 e 1,8 mm e tempos de residências 3, 5 e 10 min empregando o padrão de fluxo de gotículas. Vazão volumétrica total de 21,7, 100,91 e 337,78 µL/min para os diâmetros 0,510, 1,14 e 1,8 mm, respectivamente ... 64
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 3.1 - Principais sistemas aquosos bifásicos e suas características. ... 25 Tabela 3.2 - Estudos reportados na literatura sobre padrãoes de fluxo bifásicos em microsistemas. ... 36 Tabela 3.3 - Estudos reportados na literatura abordando a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (𝐾𝐿𝑎) em microsistemas. ... 39 Tabela 4.1 - Equipamentos utilizados na construção do aparato experimental e no método analítico. ... 42 Tabela 4.2 – Condições operacionais dos experimentos no microsistema com canais de 1,8 mm para BSA e ampicilina. ... 46 Tabela 4.3 – Condições operacionais dos experimentos no microsistema com canais de 1,14 e 0,510 mm para BSA. ... 47 Tabela 5.1 - Coeficiente de transferência de massa para os três padrões de fluxo em minicanais com diâmetro 1,8 mm. ... 65 Tabela 5.2 - Coeficiente de transferência de massa para o padrão de fluxo de gotículas e minicanais com diâmetros 0,510, 1,14 e 1,8 mm. ... 65
NOMENCLATURA
Siglas
SAB – Sistema Aquoso Bifásico PEG – Polietilenoglicol
BSA – Albumina do soro bovino (“Bovine Serum Albumin”)
LEAFT – Laboratório de Energias Renováveis e Fenômenos de Transporte
Símbolos
Letras Gregas
φ Fração da fase dispersa [-]
a Área interfacial específica [m-1]
τ Tempo de residência [min]
CA,1 Concentração de BSA na fase 1 [µg/L]
CA,2 Concentração de BSA na fase 2 [µg/L]
Aint Área de contato entre as fases [m2]
Vmc Volume do microcanal [m3]
V1 Volume da fase dispersa [m3]
Cb Comprimento total da bolha [m]
Lb Comprimento da região cilíndrica da bolha [m]
∆b Distância entre as bolhas [m]
𝐾𝐿𝑎 Coeficiente volumétrico de transferência de massa [s-1]
v Volume da região esférica da bolha [m3]
Nb Número de bolhas [-]
Lt Comprimento total do microcanal [m]
R Raio da bolha [m]
Subscritos 1 Fase 1 [-] mc Microcanal [-] int Interfacial [-] b Bolha [-] t Total [-] Superscritos * Equilíbrio [-] ent Entrada [-] sai Saída [-]
Capítulo 1
Introdução
Capítulo 1 – Introdução 17
1. Introdução
O processo de separação e purificação de proteínas normalmente envolve várias etapas e técnicas de separação com elevados custos de operação, como por exemplo a cromatografia (RODRÍGUEZ-RUIZ et al., 2018). Segundo Diamond & Hsu (1992), os custos para obtenção de produtos de interesse biotecnológicos, como as proteínas, podem representar cerca de 50 a 90 % dos custos totais e estão relacionados, principalmente, com a estratégia de purificação adotada.
Uma alternativa aos processsos convencionais para separação de proteínas é a técnica de extração líquido-líquido usando sistemas aquosas bifásicos (SABs). Os SABs vêm sendo utilizados como uma ferramenta poderosa para extração líquido-líquido de biomoléculas desde a década de 1980 (HATTI-KAUL, 2000). O SAB é formado por duas soluções aquosas, podendo ser de polímero/polímero, polímero/sal, álcoois de baixo massa molecular, acetonitrila/açúcares (PHONG et al., 2018). Os componentes PEG/sal são geralmente os mais usados por apresentar menor tensão interfacial, rápida separação de fases comparado ao par polímero/polímero, além de ter um baixo custo. Esses sistemas oferecem um ambiente biocompatível devido à presença de alto teor de água nas duas fases, preserva as características da biomolécula e reduz etapas de processamento (RAJA et al., 2011; RUIZ-RUIZ et al., 2012; PHONG et al., 2018). Apesar do reconhecimento da importância dos processos SABs para a recuperação primária de produtos biológicos, sua aplicação generalizada tem enfrentado limitações. A transição gradual da operação SAB em batelada para contínua, a dificuldade de processar grandes volumes e a falta de regras práticas para uma implementação efetiva, são gargalos para sua aplicação em grande escala (ESPITIA-SALOMA et al., 2014).
Nesse contexto, os microsistemas aparecem com grandes vantagens em relação às tecnologias usuais para extração líquido-líquido, oferecendo condições precisamente controladas, redução de tempo e de custos (TSUKAMOTO et al., 2009; HUH et al., 2011; HARDT & HAHN, 2012). Esses sistemas apresentam menores dimensões e uma relação superfície/volume elevada, assim, intensificam os fenômenos de transferência de massa (LI et
al., 2018).
Diversos pesquisadores avaliaram o desempenho de miscrosistemas na recuperação de proteínas empregando extração líquido-líquido usando SAB (MEAGHER et al., 2008, HUH et
Capítulo 1 – Introdução 18
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
al., 2010; HU et al., 2011). Os resultados obtidos com esses estudos evidenciam o potencial dos
processos em microescala para separação de proteínas e, além disso, pressupõem que o desempenho da separação nos microsistemas depende da área interfacial específica disponível que, por sua vez, depende das características dos canais, modo de distribuição e do padrão de escoamento (DAREKAR et al., 2017).
Vários trabalhos avaliaram o efeito do padrão de escoamento sob diferentes sistemas líquido-líquido, diâmetros e geometrias (ZHAO et al., 2006; KASHID & AGAR , 2007; SALIM et al., 2008; CHERLO et al., 2009; SARKAR et al., 2012; FU et al., 2015; DAREKAR
et al., 2017; LÓPEZ-GUAJARDO et al., 2018; WU et al., 2019). Esses estudos foram
direcionados basicamente para o mapeamento dos padrões de escoamento e os fatores que o influenciavam. Alguns pesquisadores deram um passo relevante no sentido de quantificar a influência desses padrões de fluxo na transferência de massa em sistemas líquido-líquido, buscando promover aumento da área disponível para transferência de massa e ajustar as condições operacionais (DESSIMOZ et al., 2008; KASHID et al., 2011; DAREKAR et al., 2014; LI et al., 2018; DAREKAR et al., 2018; XIAN-WEI et al., 2018; KUMAR et al., 2019). Todavia, estudos direcionados a compreensão da influência dos padrões de escoamento na transferência de massa e na maximização da recuperação de biomoléculas usando SAB formado de polímero/sal ainda não foi reportado.
Neste sentido, o presente estudo investigou o efeito de padrões de escoamento na recuperação da proteína BSA usando SAB formado de polietilenoglicol (PEG)/fosfato de potássio dibásico aplicado a microsistemas. Os efeitos do tamanho da cadeia do PEG, dimensões dos microcanais e tempo de residência foram avaliados sobre a eficiência de extração e coeficiente de partição. A influência do padrão de escoamento também foi investigada sobre o particionamento de molécula de baixa massa molecular usando o antibiótico ampicilina como soluto. Além disso, um balanço de massa global foi utilizado para calcular o coeficiente volumétrico de transferência de massa (𝐾𝐿𝑎) para a proteína BSA. Esse é o primeiro trabalho desenvolvido pelo grupo de pesquisa com esse tema.
Essa dissertação está dividida em 7 capítulos. No capítulo 1 é apresentado a introdução do estudo e o capítulo 2 é destinado aos objetivos geral e específicos. A revisão bibliográfica contendo os fundamentos norteadores do trabalho é mostrada no capítulo 3. O capítulo posterior
Capítulo 1 – Introdução 19
aborda a metodologia e os materias utilizados na concretização dos objetivos estabelecidos. No capítulo 5, são apresentados os resultados obtidos, além das discussões oriundas dos resultados. Por último, as conclusões do estudo são apresentadas no capítulo 6 e as referências bibliográficas utilizadas são apresentadas no capítulo 7.
Capítulo 2
Objetivos
Capítulo 2 – Objetivos 21
2. Objetivos
2.1 - Objetivo Geral
O presente trabalho tem como objetivo geral a extração de proteína modelo em um microsistema utilizando a técnica de sistema aquoso bifásico formado por polietilenoglicol e fosfato de potássio. Os dados experimentais de recuperação serão utilizados para determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (𝐾𝐿𝑎) da proteína.
2.2 - Objetivos Específicos
Os objetivos específicos do trabalho consistem em:
▪ Efetuar a montagem do sistema de microextração;
▪ Realizar o mapeamento dos padrões de fluxos para os três sistemas PEG/fosfato;
▪ Avaliar o efeito dos padrões de fluxo sobre a eficiência de recuperação de biomoléculas em ambiente modelo usando a proteína BSA e antibiótico ampicilina;
▪ Avaliar o efeito do diâmetro dos microcanais sobre a partição de proteínas BSA;
Capítulo 3
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 23
3. Revisão Bibliográfica
O presente capítulo traz os aspectos teóricos do processo de extração líquido-líquido, extração líquido-líquido usando sistemas aquosos bifásicos e microsistemas para extração líquido-líquido aplicado ao processo de separação de proteínas, levando em consideração os padrões de fluxos empregados e o efeito destes sobre o processo de transferência de massa.
3.1 - Fundamentos da extração líquido-líquido aplicado a seperação de proteínas
A extração líquido-líquido, também conhecida por extração por solvente, consiste em uma técnica de separação onde um soluto é particionado nas duas fases líquidas tendo por base sua afinidade por ambas as fases (GITIRANA, 2007; LEMOS et al., 2018; PADILHA, 2018). O processo de extração líquido-líquido convencional, isto é, que utiliza uma fase orgânica e outra aquosa, não pode ser utlizado para obtenção de compostos com importância biotecnológica, podendo provocar desnaturação e perda de atividade (SILVA & LOH, 2006; PADILHA et al., 2017; PHONG et al., 2018). Nesse sentindo, os processos de separação de proteínas são conduzidos empregando sistemas aquosos bifásicos (SABs) por apresentarem um ambiente amigável para recuperação de biomoléculas.
O processo de transferência de massa de proteínas entre as fases do sistema aquoso bifásico é avaliado por algumas teorias. A teoria do filme considera que na vizinhança da interface existe uma fina camada de líquido responsável pela resistência ao processo de transferência de massa. Essa camada estaria estagnada e a transferência de massa aconteceria por difusão. Porém, essa teoria não encontra suporte experimental e nem teórico em virtude da grande simplificação. Um novo modelo denominado de modelo da superfície renovada, fundamentado na transferência de massa em sistemas gás-líquido, foi estendido para sistemas líquido-líquido. Esse modelo considera que a interface é constantemente renovada e, desta forma, há um aumento na transferência de massa entre as fases (ROGERS & EITEMAN, 1995; DANCKWERTS, 1951).
Alguns parâmetros do sistema aquoso bifásico podem afetar a partição das proteínas. Dentre esses parâmetros, pode-se destacar os tipos de polímeros, massa molecular média dos polímeros, composição e tipos de íons que compõem o sistema (ASENJO & ANDREWS,
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 24
2012). Em termos de projeto de equipamentos de extração, tais como microseparadores, os fatores que podem influenciar a eficiência do processo são a área interfacial especifífica (a) e o coeficiente volumétrico de transferência de massa (𝐾𝐿𝑎).
3.2 - Sistema aquoso bifásico e sua aplicação na separação de proteínas
Sistemas aquosos bifásicos (SABs) tiveram início no final do século XIX. Em 1896, Beijerinck notou que a mistura de soluções aquosas de gelatina e agar ou gelatina e amido solúvel, formava duas fases líquidas (BEIJERINCK, 1896). Mais de 50 anos depois, Dobry e Boyer-Kawenoki analisaram a formação dos SBAs. Os pesquisadores testaram diferentes polímeros e observaram a geração de duas fases em quase todos (DOBRY & BOYER‐ KAWENOKI, 1947). Entretanto, só a partir da década de 50, com as contribuições científicas do bioquímico sueco, Albertsson, que foi constatado o enorme potencial dos SABs na recuperação/purificação de biomoléculas (TISELIUS et al., 1963; ALBERTSSON, 1986). Desde então, essa técnica de extração líquido-líquido tornou-se uma poderosa ferramenta de biosseparação e tem sido amplamente utilizada para processar uma variedade de materiais biotecnológicos, como proteínas, enzimas, fitoquímicos, ácidos nucléicos e pigmentos (PLATIS & LABROU, 2009; RAJA et al., 2011; PHONG et al., 2018).
Tradicionalmente, os SABs mais utilizados são aqueles formados por polímero-polímero e polímero-polímero-sal. As fases do SAB são formadas quando as concentrações críticas dos componentes são excedidas (PASSOS et al., 2013). A formação e separação das fases do SAB são governadas, principalmente, pelas diferenças de força iônica entre as fases; efeitos de exclusão estérica e interação hidrofóbica (ASENJO & ANDREWS, 2011).
Embora os SABs sejam empregados desde o final do século XIX para separação de biomoléculas, seus aspectos teóricos são pouco elucidados. Nesse sentido, essa técnica é puramente empírica. Porém, com base nos dados experimentais, foi possível realizar algumas observações. No caso de sistemas formados por polímero/sal, a formação das fases pode ser dependente da interação da ligação de oxigênio de éter do PEG com o cátion do sal ser superior a interação do cátion com a água (OLIVEIRA FILHO; 2018).
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 25
Um dos polímeros comumente utilizado na formação das fases do SAB é o polietilenoglicol (PEG), por apresentar um baixo custo e formar duas fases com vários polímeros e sais. Devido ao alto custo e alta viscosidade do sistema polímero/polímero, os SABs de polímero/sal são preferidos (RAJA et al., 2011). Além desse fato, os sistemas polímero/sal também apresentam maiores diferenças de densidade, maior seletividade, rápida separação e menor viscosidade (CUNHA & AZNAR, 2009). A Tabela 3.1 mostra as principais caraterísticas dos SABs formados por polímero-polímero e polímero-sal.
Tabela 3.1 - Principais sistemas aquosos bifásicos e suas características.
Grupo do
SAB Características Exemplo de Constituintes
Polímero - Polímero
• Sistemas baseados em polímeros e eletrólitos ou polímeros e solutos de baixo peso molecular. • Recuperação de proteínas, ácidos nucleicos,
células e organelas.
• Ambiente favorável para proteínas e biomoléculas sensíveis à força iônica.
PEG – Dextrana PEG – PVA
PEG – Poliácido acrílico
Polímero - Sal
• Sistema formado pela adição de sal em soluções certos polímeros.
• Recuperação de proteínas, ácidos nucleicos, nanopartículas e componentes de baixo peso molecular.
• São sistemas de baixo custo.
• Altas concentrações de sal promovem elevadas força iônicas. PEG-Fosfato de Potássio PEG-Sulfato de Magnésio PEG-Tartarato de Sódio Fonte: VELOSO (2019).
No caso do SAB formado pela mistura de polímero/sal e água, a divisão das fases resulta em uma fase superior enriquecida com polímero e uma fase inferior enriquecida com sal, sendo a água o componente principal de ambas as fases (FREIRE et al., 2012). O soluto fica particionado nas fases, sendo a fase rica em soluto aquela que apresentar maior afinidade com o mesmo. A Figura 3.1, mostra o processo típico de formação de fases de um SAB.
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 26
Figura 3.1 - Ilustração esquemática da separação de fases em SABs do tipo polímero/sal. Fonte: PADILHA (2018).
O princípio de formação das fases dos SABs e o particionamento do soluto nas fases são governados pelo equilíbrio termodinâmico do sistema. A natureza química dos componentes do SAB afeta o equilíbrio termodinâmico. Nesse sentido, é necessário conhecer o diagrama de fases do SAB de interesse antes de realizar aplicação no processo de extração. O diagrama de fases fornece várias informações como, por exemplo, a composição necessária para formação das fases (ASENJO & ANDREWS, 2011; VELOSO, 2019). A Figura 3.2 mostra um diagrama de fases genérico para o sistema PEG-sal.
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 27
Figura 3.2 - Diagrama de fases típico de sistemas aquosos bifásicos formados pela mistura PEG e sal, apresentado em coordenadas retagulares.
Fonte: O autor (2020).
No diagrama acima, a curva binodal (linha vermelha) separa o sistema em duas regiões: rigião bifásica (acima da curva) e monofásica (na curva ou abaixo dela). Os segmentos T1-F1, T2-F2 e T3-F3 são as linhas de amarração (tie line) e representam a composição completa de três diferentes sistemas polímero e sal. A interseção da linha de amarração com a curva binodal marca nas extremidades a composição de polímero e sal na fase superior e na fase inferior após a separação das fases. Por exemplo, um sistema de composição dada pelo ponto A se separará em duas fases da composição T1 (fase superior) e F1 (fase inferior), logo após o sistema ficar em repouso. A medida que as concentrações de polímero e sal são reduzidas as linhas de amarração ficam mais curtas até o sistema chegar ao ponto PC (ponto crítico). Nese ponto, as concentrações de polímero e sal na fase superior e inferior são idênticas, e uma única fase é observada. Perto do ponto crítico, os sistemas bifásicos são muito sensíveis a alterações (ASENJO & ANDREWS, 2011; PADILHA, 2018).
O comprimento da linha de amarração (TLL) aponta a diferença de composição das fases de topo e fundo do SAB. Geralmente é observado maior partição do soluto nas fases quando TLL aumenta. O TLL do SAB genérico formado de PEG e sal, conforme mostra a Figura 3.2, é determinado pela Equação 3.1.
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 28
𝑇𝐿𝐿 = √(𝐶𝑃𝐸𝐺𝑇− 𝐶𝑃𝐸𝐺𝐹)2+ (𝐶𝑆𝑎𝑙𝑇 − 𝐶𝑆𝑎𝑙𝐹)2 (3.1)
onde 𝐶𝑃𝐸𝐺𝑇 e 𝐶𝑃𝐸𝐺𝐹 (% m/m) são as concentrações de PEG na fase de topo e fundo, respectivamente, e 𝐶𝑆𝑎𝑙𝑇 e 𝐶𝑆𝑎𝑙𝐹 (% m/m) são as concentrações de sal na fase de topo e fundo,
respectivamente.
O particionamento do soluto nas fases de topo e fundo do SAB é dado pelo coeficiente de partição (𝐾). A Equação 3.2 é empregada para determinação desse coeficiente.
𝐾 = 𝐶𝑆𝑇
𝐶𝑆𝐹 (3.2)
Onde 𝐶𝑆𝑇 e 𝐶𝑆𝐹 são as concentrações do soluto na fase de topo e fundo, respectivamente.
Estudos experimentais direcionados na obtenção de dados de equilíbrio dos SABs são reportados na literatura. Carvalho et al. (2008) e Asenjo et al. (2002) determinaram experimentalmente as curvas binodais para os SABs formados de PEG 1500/fosfato de potássio e PEG 4000/fosfato de potássio, respectivamente. A Figura 3.3 mostra os dados experimentais obtidos e as curvas binodais teóricas. A curva binodal do sistema formado por PEG 1500/fosfato de potássio corresponde a primeira curva no sentido da seta e os dados experimentais são representados pelos quadrados não prenchidos. A segunda curva é referente ao sistema com PEG 4000 e os dados experimentais correspondentes são expostos através de quadrados prenchidos.
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 29
Figura 3.3 – Influência da massa molar no diagrama de fase dos SABs formados de PEG 1500/fosfato de potássio (□) e PEG 4000/fosfato de potássio (■).
Fonte: CARVALHO et al. (2008) e ASENJO et al. (2002).
Na Figura 3.3 é possível identificar a influência da massa molar do PEG no perfil da curva binodal e, sendo assim, a medida que a massa molar do polímero aumenta a curva binodal é deslocada no sentido da interseção dos eixos coordenados, promovendo um aumento significativo da região bifásica.
Os SABs apresentam excelente aplicabilidade na separação de proteínas de detritos celulares ou para purificar proteínas de uma mistura de proteínas. No caso da utilização de SAB formado de PEG-sal, a fase inferior (rica em sal) acomodará os contaminantes, enquanto as proteínas irão ficar na parte superior (rica em PEG), menos polar e mais hidrofóbica. A partição das proteínas é influenciada por alguns fatores, tais como massa molar do polímero, concentração do polímero, força iônica do sal, pH e adição de sal como NaCl que aumenta a resolução hidrofóbica do sistema (ASENJO & ANDREWS, 2011; ASENJO & ANDREWS, 2012).
Um elevado número de estudos abordando a separação de proteínas empregando SAB são encontrados na literatura. Cascone et al. (1991) investigaram a partição da proteína
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 30
taumatina em SABs formados de PEG/dextrana e PEG/fosfato. O efeito da massa molar do PEG, do sal e da concentração de proteína na partição foram examinados. A redução da massa molar do PEG apresentou efeito positivo na partição da proteína obtendo valores elevados (até K=18). Maiores valores de partição foram obtidos quando foi adicionado cloreto de sódio (NaCl) ao sistema PEG 6000/fosfato, com coeficiente de partição saindo de K=0,36 para K=33. A concentração de proteína não apresentou influência no coeficiente de partição.
Schmidt et al. (1994) estudaram a partição da α-amilase em três diferentes SABs formados por PEG/dextrana, PEG/fosfato e PEG/sulfato. Foi investigado o efeito da massa molar e composição do PEG, pH, concentração da α-amilase e adição de NaCl no coeficiente de partição da enzima. A concentração da α-amilase não afetou a partição. Adição de NaCl ao sistema PEG 4000/fosfato proporcionou aumento de K=1,3 para K=100. No sistema PEG 4000/fosfato o aumento do pH (de 5,3 para 9,4) favoreceu a partição (de 0,7 para 20), enquanto o aumento da massa molar do PEG teve efeito negativo na partição.
Além de avaliar a partição de proteínas em SABs, alguns estudos também investigaram a recuperação dessas biomoléculas. Resultados promissores de recuperação de proteínas são reportados na literatura. Rito-Palomares et al. (2000) utilizaram um sistema formado de PEG/fosfato para separação da proteína BSA do sangue de animais, obtendo 62% de recuperação. Em outro estudo, Rito-PalomareS & Middelberg (2002) investigaram a recuperação de uma proteína de revestimento viral (HPV16 L1), também usando o sistema PEG/fosfato e alcançaram recuperação de 54,4%. No trabalho de Pereira et al. (2016), é relatado uma recuperação de 65% da ovalbumina da clara do ovo em uma única etapa empregando um sistema PEG/fosfato.
Contudo, Espitia-Saloma et al.(2014) destacam que a implementação de SAB em batelada para recuperação de biomoléculas apresenta algumas limitações, tais como, a dificuldade de processar grandes volumes e a falta de regras práticas para uma aplicação mais abrangente.
3.3 - Uso de microsistemas para separação de proteínas
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 31
e manufatura de fármacos com ação específica (LEE et al., 2016). Os microsistemas são estruturas com dimensões de dezenas a centenas de micrômetros. As principais características dos microsistemas são: menor consumo de reagentes; tempos de reação curtos; baixos custos de fabricação; relação superfície/volume alta; altas taxas de transferência de calor e massa (TONOMURA et al., 2002; DESSIMOZ et al., 2008; SANTANA et al., 2019). As aplicações microfluídicas compreendem sistemas biológicos, microssensores e microrreatores (KOLB, 2013; HO et al., 2015; JIWANURUK et al., 2015; BALBINO et al., 2016).
Os microsistemas podem ser considerados como alternativas viáveis em relação às tecnologias usuais para separação de biomoléculas, oferecendo condições precisamente controladas, maior seletividade e rendimento e redução de tempo e custos (HUH et al., 2011; HARDT & HAHN, 2012; NOVAK et al., 2012). Essa técnica de separação surgiu como uma ferramenta promissora para acelerar os bioprocessos de maneira econômica a partir da década de 1990 (CHOVÁN & GUTTMAN, 2002) porém, o uso mais amplo dessa tecnologia só ocorreu no início dos anos 2000 (FERNANDES et al., 2011). Apesar disso, Novak et al. (2012), destacam que as aplicações de microsistemas para processos de separação são menos abundantes, sobretudo se comparado aos processos envolvendos reações químicas.
Diversos estudos investigaram o desempenho de microsistemas na recuperação de proteínas usando SAB. Um aspecto importante a destacar é que os SABs possuem uma baixa tensão interfacial (DE OLIVEIRA et al., 2012) e, como consequencia, são retratados em microsistemas como um escoamento bifásico estável, sem a necessidade de surfactantes ou tratamentos especiais para manter a interface e a área de contato bem definida (ASAMI et al., 2004).
Meagher et al. (2008) estudaram a extração líquido-líquido de proteínas recombinantes em microsistemas empregando SAB formado de PEG e fosfato de potássio. O microsistema utilizado apresentava geometria retangular com 80 µm de largura, 50 µm de altura e comprimento de 320 mm. Marcadores genéticos foram adicionados as proteínas para obtenção de maiores coeficientes de partição. A adição desse marcador teve efeito positivo na recuperação da proteína, saindo de quase zero para a enzima sem marcação, até 40% com marcação genética.
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 32
Huh et al. (2010) implementaram um sistema de separação microfluídica usando SAB para a extração da proteína bacteriorodopsina e obtiveram uma recuperação da proteína superior a 90%. Hu et al. (2011) avaliaram a recuperação de proteína da membrana celular empregando também extração microfluídica contínua usando SAB formado de PEG/detergente. Os resultados obtidos revelaram um aumento significativo da eficiência de extração em comparação com o método convencional de agitação descontínua. A máxima recuperação alcançada foi de aproximadamente 90%.
3.4 - Padrões de escoamento na extração líquido-líquido em microsistemas
Os principais padrões de fluxo bifásicos líquido-líquido geralmente observados em microssistemas são classificados em: fluxo slug, fluxo de gotícula e fluxo paralelo. O padrão de fluxo slug é observado em baixas vazões para ambas as fases. A tensão de cisalhamento é pouco relevante e a quebra da fase dispersa gerando o regime slug é governada pelo gradiente de pressão e tensão interfacial. A bolha ocupa quase toda a seção transversal do microcanal com uma camada muito fina da fase contínua entre a bolha e a parede do microcanal. O padrão de fluxo de gotícula é caracterizado por gotas com diâmetros menores que o diâmetro do microcanal. Esse padrão de fluxo ocorre normalmente quando a vazão da fase contínua é relativamente superior a vazão da dispersa. Por fim, o padrão de fluxo paralelo ocorre quando as vazões de ambas as fases são elevadas. Neste caso a força inercial prevalece sobre a força de tensão interfacial e as duas fases escoam sem ocorrer mistura (ZHAO et al., 2006; DAREKAR
et al., 2017).
O conhecimento sobre os padrões de escoamento e fatores que o afetam é crucial para o desempenho dos microsistemas. Estudos sobre o mapeamento de padrões de fluxo bifásico líquido-líquido em microcanais e a compreensão dos principais efeitos e parâmetros adimensionais que afetam os padrões foram reportados por Darekar et al. (2017). Esses parâmetros adimensionais são representados pelas propriedades físicas dos líquidos (tensão interfacial, molhabilidade da parede), diâmetro do microcanal e parâmetros operacionais (vazões das fases). Para os autores, a vazão das fases e a razão dessas vazões são variáveis relevantes na formação dos padrões de escoamento.
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 33
formação dos padrões de fluxo. Todavia, em microsistemas o efeito proporcionado pela tensão interfacial é intensificado permitindo que este supere as forças gravitacionais (ZHAO et al., 2006). A razão dessas variáveis corresponde ao número de Bond (Bo), conforme a Equação 3.3. 𝐵𝑜 = 𝐹𝑜𝑟ç𝑎 𝑔𝑟𝑎𝑣𝑖𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑙 𝑇𝑒𝑛𝑠ã𝑜 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑓𝑎𝑐𝑖𝑎𝑙 = 𝜌. 𝑔. (𝐷𝐻)2 𝜎 (3.3)
Sendo 𝜌 é a massa específica, 𝑔 a aceleração da gravidade, 𝐷𝐻 o diâmetro hidraúlico e 𝜎 a
tensão interfacial.
Segundo Zhao et al. (2006), a tensão interfacial e a força inercial são tensões concorrentes que podem distorcer a interface no escoamento bifásico. A tensão interfacial pode atuar reduzindo a área interfacial, enquanto a força de inércia tende a estender e arrastar a interface ao longo do escoamento. A relação entre essas variáveis é determinada pelo número de Weber (We), de acordo com a Equação 3.4.
𝑊𝑒 = 𝐹𝑜𝑟ç𝑎 𝑖𝑛𝑒𝑟𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑇𝑒𝑛𝑠ã𝑜 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑓𝑎𝑐𝑖𝑎𝑙= 𝜌. 𝑈2. 𝐷 𝐻 𝜎 (3.4)
Onde 𝑈 é a velocidade superficial das fases.
Zhao et al. (2006) estudaram experimentalmente os padrões de fluxo bifásico líquido-líquido em microcanais retangulares com junção do tipo T e diâmetro hidráulico de 400 µm. O sistema bifásico utilizado era formado por água e querosene. Foram calculados números de Weber da água e querosene (com base na Equação 3.4) e utilizados para prever a transição dos padrões de fluxo e obtenção do mapa de padrões de escoamento. Foram observados os seguintes padrões de fluxo: fluxo slug, fluxo de gotículas monodispersas, fluxo de gotículas formada no centro do microcanal, fluxos paralelos com interface suave, fluxos paralelos com interface ondulada e fluxo caótico.
Dessimoz et al. (2008) estudaram padrões de fluxo bifásico líquido-líquido em microcanais, sendo registrado fluxo slug e fluxo paralelo em microcanais retangulares de junção T e junção Y, respectivamente. Os mapas desses padrões de fluxo foram apresentados em
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 34
termos do número de capilaridade (Ca) e número de Reynolds (Re), conforme as Equações (3.5) e (3.6), respectivamente. 𝐶𝑎 = 𝐹𝑜𝑟ç𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑠𝑐𝑜𝑠𝑎𝑠 𝑇𝑒𝑛𝑠ã𝑜 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑓𝑎𝑐𝑖𝑎𝑙= 𝜇.𝑢 𝜎 (3.5) 𝑅𝑒 = 𝐹𝑜𝑟ç𝑎 𝑖𝑛𝑒𝑟𝑐𝑖𝑎𝑙 𝐹𝑜𝑟ç𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑠𝑐𝑜𝑠𝑎𝑠= 𝜌.𝑢.𝐷𝐻 𝜇 (3.6)
Sendo 𝑢 a velocidade linear ou superficial das fases, 𝜌 a densidade e 𝜇 a viscosidade.
Pesquisadores também realizaram estudos de padrões de escoamentos em sistemas bifásicos líquido-líquido e plotaram os mapas de padrões de fluxo encontrados em função da velocidades superficial ou taxas de fluxo (SALIM et al., 2008; KASHID et al., 2011; SARKAR
et al., 2012). No presente estudo, os padrões de escoamento foram plotados em função da
vazões das respectivas fases.
Darekar et al. (2017) realizaram um estudo bastante esclarecedor sobre padrões de escoamentos e fatores que os influenciam. Foram avaliados os efeitos: diâmetro do microcanal, taxa de fluxo, tensão interfacial dos líquidos e hidrofobicidade da parede do canal sobre os padrões de fluxo bifásicos. Três sistemas recomendados pela Federação Européia de Engenharia Química (EFCE) para estudos de extração líquido-líquido foram usados como padrões nos ensaios. Padrões de fluxo slug, fluxo slug e gotículas, fluxo de gotículas e fluxo paralelo foram observados, conforme a Figura 3.4.
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 35
Figura 3.4 - Diferentes padrões de fluxo bifásico líquido-líquido. a) – Fluxo slug, b) – Fluxo
slug e gotículas, c) – Fluxo de gotículas e d) – Fluxo paralelo.
Fonte: DAREKAR et al. (2017).
Segundo Darekar et al. (2017), a transição dos padrões de escoamento podem ocorrer em vazões mais baixas, sobretudo em microcanais de diâmetros menores (260 μm). Por sua vez, mantendo-se a vazão da fase dispersa constante e aumentando vazão da fase contínua, foi observado a transição do padrão de fluxo slug para o regime slug e gotículas e, subsequentemente para o regime de gotículas. No sistema com maior tensão interfacial o padrão predominante foi o slug. O padrão de fluxo paralelo foi pouco observado para sistemas com tensões interfaciais elevadas.
A Tabela 3.2 mostra alguns estudos citados na literatura relacionados ao avaliação dos padrões de escoamentos bifásicos líquido-líquido em microsistemas. Algumas características dos microsistemas usados, como tipos de sistemas bifásicos, vazões, diâmetros dos microcanais e padrões de fluxo, são apresentados.
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 36
Tabela 3.2 - Estudos reportados na literatura sobre padrãoes de fluxo bifásicos em microsistemas. Autores Vazão (µL.min-1 ) Sistema bifásico Geometria Diâmentro (mm) Junção Padrão de fluxo Zhao et al. (2006) 6,98-13948 Água/ querosene Retangular 0,4 T Slug, gotícula, paralelo e anular. Salim et
al. (2008) 209-11853 Óleo/água Circular
0,677 e 0,793 T Slug, gotícula, paralelo e anular. Darekar et al. (2017) 1000-10000 Água/ butanol-água/ tolueno-água/ acetato de butila Circular 0,260 e 0,760 Y Slug, slug+ gotícula, gotícula e paralelo López-Guajardo et al. (2018) 1000-20000 Óleo/água -biodiesel/ glicerol-óleo de girassol/ metanol Circular 3 T Slug e paralelo Fonte: O autor (2020)
.
3.5 - Coeficientes de transferência de massa na extração líquido-líquido em microsistemas
Alguns pesquisadores estudaram, além dos padrões de fluxo, o efeito destes sobre o processo de transferência de massa em sistemas líquido-líquido aplicado a microsistemas. Segundo Darekar et al. (2018), a variedade de padrões de fluxo gerado na junção do microcanal proporciona maior ou menor área interfacial específica disponível, afetando diretamente a taxa de transferência de massa.
Nesse contexto, estudos sobre a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (𝐾𝐿𝑎) em microsistemas com escoamento bifásico líquido-líquido foram reportados por Dessimoz et al. (2008) que estudaram, além dos padrões de escoamento bifásico líquido-líquido, a transferência de massa. Eles utilizaram em seus experimentos sistemas bifásicos formados de hexano/água e tolueno/água. O sistema hexano/água por apresentar maior tensão interfacial proporcionou a formação de um padrão de fluxo slug estável, sendo então,
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 37
selecionado para avaliação da transferência de massa. O soluto utilizado foi o ácido tricloroacético, sendo este adicionado na fase orgânica. Na fase aquosa foi adicionado hidróxido de sódio (NaOH) para neutralizar o ácido. Os estudos mostraram que o padrão de fluxo não teve influência no (𝐾𝐿𝑎), obtido na faixa de 0,2-0,5 s-1, sendo assim, um resultado discutível.
Kashid et al. (2011) realizaram ensaios para investigar os regimes de fluxo e o desempenho da transferência de massa de cinco diferentes microsistemas. O sistemas bifásico utilizado era formado por água/tolueno e o composto a ser extraído foi acetona. Foram observados seis regimes de fluxo diferentes (slug, slug-gotícula, interface deformada, fluxo paralelo/anular, slug-disperso e disperso). O coeficiente de transferência de massa obtido apresentou uma dependência com os regimes de fluxo, velocidade e geometria de contato entre as fases. Além disso, os resultados mostraram que o coeficiente de transferência de massa aumenta à medida que a velocidade do fluxo aumenta, até certo ponto, posteriormente, a taxa de transferência diminui. Esse comportamento foi explicado pela mudança dos padrões de fluxos obtidos com o aumento da velocidade.
Plouffe et al. (2016) avaliaram os efeito das propriedades físicas na transferência de massa em microsistemas. Os padrões de fluxo slug, fluxo paralelo e fluxo de gotículas foram registrados em seus experimentos. Os resultados indicam que um sistema bifásico com menor tensão interfacial proporciona menor tamanho de gota, consequentemente, maior área interfacial e maior transferência de massa. O valor máximo para o 𝐾𝐿𝑎 foi obtido para o padrão
de fluxo de gotículas e para o sistema com menor tensão interfacial.
Kumar et al. (2019) realizaram um estudo exploratório com os vários padrões de fluxo líquido-líquido e sua relação com a transferência de massa. Os experimentos foram implementados em microsistemas de 0,15 mm e 0,25 mm dispostos de três diferentes maneiras, canal reto, canal helicoidal e fazendo curva de 90 graus. O sistema bifásico era formado por tolueno e água. Foi observado que a redução de diâmetro dos microcanais desempenha um papel fundamental no controle das taxas de transferência de massa devido, principalmente, à alta relação superfície/volume. No caso, o microsistema com menor diâmetro possibilitou uma maior área interfacial disponível para o contato entre as fases, o que elevou os valores do coeficiente de transferência de massa .
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 38
Destaca-se que algumas correlações para o cálculo do coeficiente de transferência de massa para sistemas bifásicos líquido-líquido aplicados a microsistemas foram determinadas. Por exemplo, Kashid et al. (2010) investigaram a transferência de massa em sistemas líquido-líquido para regime de escoamento do tipo slug em um único micronal e seis micronanais em paralelo. Eles desenvolveram uma correlação para determinação do 𝐾𝐿𝑎 em função do número de capilaridade (Ca) e no número de Reynolds (Re), para um só micronal e seis microcanais, conforme as Equações (3.7) e (3.8), respectivamente.
𝐾𝐿𝑎 ∙ 𝜏 = 𝐶𝑎−0,09𝑅𝑒−0,09( 𝐷 𝐿) −0,1 (3.7) 𝐾𝐿𝑎 ∙ 𝜏 = 0,88𝐶𝑎−0,09𝑅𝑒−0,09(𝐷 𝐿) −0,1 (3.8)
Sendo 𝜏 o tempo de residência, 𝐷 o diâmetro e 𝐿 o comprimento do microcanal.
Tang et al. (2013) investigaram a eficiência de extração do ácido succínico do n-butanol para água empregando um microsistema. Eles desenvolveram uma correlação empírica para prever o 𝐾𝐿𝑎 do sistema estudado. Nessa correlação foi levado em consideração a razão da taxa de fluxo das fases (𝑞), velocidade (𝑈𝑡) e diâmetro do microcanal (𝐷).
𝐾𝐿𝑎 = 2,12 × 10−6. 𝑞−0,34. 𝑈
𝑡0,53. 𝐷−1,99 (3.9)
Bai et al. (2016) desenvolveram uma correlação para avaliar a transferência de massa em um sistema composto por água e líquido iônico. Duas correlações foram propostas levando em consideração a razão entre as vazões das respectivas fases (𝑞) e o número Reynolds (𝑅𝑒). Para microcanais com junção em T a correlação é dada pela Equação (3.10) e em microcanais com junção em formato de cruz a correlação ficou conforme a Equação (3.11).
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 39 𝐾𝐿𝑎 = 0,03 (1 +1 𝑞) 2,3 𝑅𝑒1,4 (3.10) 𝐾𝐿𝑎 = 0,006 (1 +1 𝑞) 2,3 𝑅𝑒1,1 (3.11)
Na Tabela 3.3, estão sumarizados al trabalhos que estimaram os valores do coeficiente de transferência de massa. De modo geral, foi possível notar que 𝐾𝐿𝑎 é dependente de propriedades físicas e condições operacionais. Nesse sentido, cada microsistema desenvolvido tem suas peculiaridades e os valores dos coeficientes obtidos podem apresentar uma certa discrepância.
Tabela 3.3 - Estudos reportados na literatura abordando a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (𝐾𝐿𝑎) em microsistemas.
Autores Sistema bifásico Soluto Padrão de
fluxo 𝑲𝑳𝒂 (s -1 ) Dessimoz et al. (2008) Água/hexano Ácido
tricloroacético Slug e paralelo 0,2 – 0,5 Zhao et al. (2010) Água/n-butanol Ácido succínico Slug, gotículas e paralelo 0,19 - 11,96 Tang et al. (2013) Água/n-butanol Ácido succínico Gotículas e paralelo 0,012-0,082 Kumar et al.
(2019) Água/tolueno Ácido acético
Slug, slug+anular
e slug+disperso 0,0053 - 0,7952
Fonte: O autor (2020)
.
No presente estudo, o coeficiente volumétrico de transferência de massa, 𝐾𝐿𝑎, foi determinado com base no balanço de massa na interface do sistema bifásico. A expressão final leva em consideração o gradiente entre as fases, tempo de residência e fração da fase dispersa (𝜑), dada pela Equação (4.12).
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica 40
𝑘𝐿𝑎 =
𝜑 𝜏 𝑙𝑛 (
𝐶𝐴∗− 𝐶𝐴𝑒𝑛𝑡
𝐶𝐴∗− 𝐶𝐴𝑠𝑎𝑖) (3.12)
Sendo 𝐶𝐴𝑒𝑛𝑡 e 𝐶𝐴𝑠𝑎𝑖 são as concentrações do componente de interesse da fase desejada na entrada e saída dos microcanais, respectivamente, e 𝐶𝐴∗ é a concentração de equilíbrio.
Como o fenômeno de transferência de massa em sistemas bifásicos líquido-líquido aplicado a microsistemas ainda é bastante discutível, faz-se necessário maiores investigações para elucidar a influência dos padrões de escoamento e parâmetros de projeto na transferência de massa. Outrossim, expandir os estudos sobre a influência desses padrões de fluxo na transferência de massa em microsistemas para recuperação de biomoléculas pode proporcionar um avanço significativo para os processos biotecnológicos, reduzindo custos e tempo de processamento.
Capítulo 4
Metodologia
Capítulo 4 – Metodologia 42
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
4. Metodologia
Neste capítulo são apresentados os materias, equipamentos, procedimentos e métodos utilizados no desenvolvimento da etapa experimental e no cálculo do coeficiente volumétrico de transferência de massa (𝐾𝐿𝑎).
4.1- Reagentes e equipamentos
Polietilenoglicol (PEG) com massas moleculares de 1500, 4000 e 6000 g/mol, fosfato de potássio dibásico (K2HPO4), Etanol 95% e ácido fosfórico foram obtidos pela Synth
(Diadema, São Paulo/Brazil), enquanto albumina do soro bovino (BSA) e ampicilina foram adquiridos pela Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). O azul de coomassie G-250 utilizado foi adquirido pela Merck (Darmstadt, Alemanha).
Na Tabela 4.1, são apresentados os equipamentospados utilizados na construção do sistema de microextração para separação da proteína BSA e também equipamentos analiticos.
Tabela 4.1 - Equipamentos utilizados na construção do aparato experimental e no método analítico.
Equipamentos Modelo Marca
Agitador magnético 752 Fisatom
Balança analítica digital - Tecnal
Bomba de vácuo - Exipump
Espectrofotômetro Genesys ThermoSpectronic
Seringas - SR
Densímetro digital DDM 2910 Rudolph Research
Viscosímetro DV-II+ Pro Brookfield
pHmetro 210B Cap-Lab
Microcanais de silicone - Cole-Parmer
Motor de passo AK34/100F8FN1.8 Akiyama
Computador Ultra thin U45L CCE
Capítulo 4 – Metodologia 43
4.2 - Sistema aquoso bifásico (SAB)
4.2.1 – Obtenção das curvas binodais
Inicialmente, as soluções estoques com composição 50% (m/m) de PEG 1500, PEG 4000, PEG 6000 e fosfato de potássio dibásico 30% (m/m) foram preparadas com água destilada. As curvas binodais para os três sistemas estudados foram construídas com base na metodologia relatada por Padilha et al. (2018). Essa metodologia é conhecida como método de titulação por ponto de nuvem. Na construção das curvas, 2 g de PEG foram colocados em um tubo de ensaio de volume 15 mL e adicionado gota a gota a solução de fosfato até observa-se a turvação da solução, sendo medida a massa da solução de fosfato adicionada. Em seguida, 0,2 g de água foi adicionado à solução e esta voltou a condição inicial (monofásica) e o processo foi repetido até a obtenção de pontos suficientes para plotar as curvas binodais.
Uma correlação empírica proposta por Merchuk et al. (1998) foi ajustada aos dados experimentais obtidos. Os parâmetros da equação de MERCHUK foram estimados usando o
software STATISTICA através do Algoritmo de Levenberg–Marquardt. A equação formulada
por MERCHUK é dada pela Equação (4.1).
𝑌 = 𝐴. exp (𝐵. 𝑋0,5 − 𝐶. 𝑋3)
(4.1)
Sendo A, B e C os parâmetros de Merchuk, Y e X as concentrações de PEG e fosfato de potássio, respectivamente.
A partir da equação de Merchuk e usando o princípio da regra da alavanca, foi formulado o sistema de Equações de (4.2) a (4.6). O comprimento da linha de amarração (TLL) dos três sistemas estudados foi obtido resvolvendo simultaneamente essas equações usando o solver do
software Excel, conforme metodologia vista em Oliveira Filho (2018).
𝑌𝑇 = 𝐴. exp (𝐵. 𝑋𝑇0,5− 𝐶. 𝑋𝑇3) (4.2)
𝑌𝐵 = 𝐴. exp (𝐵. 𝑋𝐵0,5− 𝐶. 𝑋𝐵3)
Capítulo 4 – Metodologia 44
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
𝑌𝑇 = (𝑌𝑀 𝛼) − ( 1 − 𝛼 𝛼 ) 𝑌𝐵 (4.4) 𝑋𝑇 = ( 𝑋𝑀 𝛼 ) − ( 1 − 𝛼 𝛼 ) 𝑋𝐵 (4.5) 𝑇𝐿𝐿 = √(𝑋𝑇− 𝑋𝐵)2+ (𝑌 𝑇− 𝑌𝐵)2 (4.6)
Sendo α a razão entre a massa da fase de topo e a massa total e os subscritos M, T e B representam a mistura inicial, a fase superior e a fase inferior, respectivamente.
4.2.2 - Formação das fases do SAB
Os sistemas aquosas bifásicos (SABs) foram preparados misturando-se PEG 1500, PEG 4000, PE 6000 e K2HPO4 com água destilada para se obter concentração final de 25% e 10% (w/w),
respectivamente. Os componentes do SAB foram misturados em agitador magnético até a completa dissolução deles. A mistura foi transferida para um funil de separação e, após 12 h, as fases superior (rica em PEG) e inferior (rica em K2HPO4) foram coletadas para realizar os experimentos de
extração em SAB. A Figura 4.1 mostras as etapas do processo de formação das fases do SAB.
Figura 4.1 – Procedimento de formação do sistema aquoso bifásico utilizado. Fonte: O autor (2020).
Capítulo 4 – Metodologia 45
4.2.3 - Caracterização das fases
As fases dos três SABs foram caracterizadas quanto ao pH, densidade, viscosidade e tensão interfacial. O pH foi medido utilizando um pHmetro de bancada modelo 210B produzido pela Cap-Lab. Medidas de densidade foram obtidas através de um densímetro digital modelo DDM 2910 da marca Rudolph Research. A viscosidade foi determinada usando um viscosímetro modelo DV-II+ Pro da Brookfield.
4.3 - Microsistema proposto
O microsistema (Figura 4.2) dispõe de junção em Y de resina, minicanais de silicone (0,510-1,8 mm de diâmetro interno e 13-2250 mm de comprimento) e uma bomba de seringa acionada por motor de passo. O controle da injeção foi realizado através de programa computacional instalado ao motor de passo. O microcanal é disposto horizontalmente na forma senoidal e uma câmera de alta velocidade e um microscópio Olympus BX51 (Japão) são colocados em cima dele. As imagens são capturadas e armazenadas no computador para serem analisadas. Os líquidos de ambas as fases se encontram na junção Y e o padrão de fluxo é gerado.
Figura 4.2 - Esquema do aparato experimental utilizado nos estudos de particionamento da proteína BSA e ampicilina em microsistema.
Fonte: O autor (2020).
Inicialmente os experimentos no microsistema foram realizados em canais de 1,8 mm para a determinação dos padrões de fluxo. A vazão volumétrica foi alterada no programa de computador e os padrões de escoamento foram monitorados usando câmeras. A proporção das
Capítulo 4 – Metodologia 46
Marcelo da Silva Pedro Dissertação de mestrado PPGEQ/UFRN
vazões das fases foi de 1:1. Os padrões de fluxo nos microcanais de 0,510 e 1,14 mm foramregistrados usando um microscópio óptico.
Após a determinação dos padrões de fluxo para canais de 1,8 mm, ensaios em triplicada foram realizados para avaliar o particionamento das biomoléculas. Nos experimentos de extração de BSA, 20 mg de proteína foram dissolvidas na fase inferior usando agitador magnético, o que resulta na concentração final 330 µg/L. Os experimentos foram conduzidos sob três padrões de escoamento e nos tempos de residência de 3, 5 e 10 min, conforme a Tabela 4.2. Procedimento experimental igual ao anterior foi reproduzido para avaliar o particionamento do antibiótico ampicilina.
Tabela 4.2 – Condições operacionais dos experimentos no microsistema com canais de 1,8 mm para BSA e ampicilina.
Diâmetro (mm) Vazão (µL/min) Comprimento (cm) Padrão de fluxo Tempo de Residência (min) 1,8 111,88 13,19 Slug 3 1,8 111,88 21,98 5 1,8 111,88 43,97 10 1,8 337,78 39,82 Gotículas 3 1,8 337,78 66,37 5 1,8 337,78 132,74 10 1,8 563,68 66,45 Paralelo 3 1,8 563,68 110,76 5 1,8 563,68 221,51 10 Fonte: O autor (2020).
Ao final dessa etapa experimental, foi possível definir o padrão de fluxo com maior desempenho, sendo essa caracterítica observada para o fluxo de gotículas. Na sequência, experimentos de particionamento de BSA foram reproduzidos em canais 0,510 e 1,14 mm empregando o padrão de fluxo de gotículas. A Tabela 4.3 mostra as condições operacionais dos experimentos no microsistema usando canais com diâmetros 0,510 e 1,14 mm.
