FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARIANA BONJIORNO MARTINS
ESTUDO DAS INTERLEUCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS (IL-2, IL-2R, IL-6, IL-6R, IL-8 E IL-12) E ANTI-INFLAMATÓRIAS (IL-4, IL-4R E IL-10) NO CARCINOMA
DIFERENCIADO DA TIROIDE.
CAMPINAS 2015
MARIANA BONJIORNO MARTINS
ESTUDO DAS INTERLEUCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS (IL-2, IL-2R, IL-6, IL-6R, IL-8 E IL-12) E ANTI-INFLAMATÓRIAS (IL-4, IL-4R E IL-10) NO CARCINOMA
DIFERENCIADO DA TIROIDE.
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências, Área de Concentração Clínica Médica.
ORIENTADOR: PROFA. DRA. LAURA STERIAN WARD
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MARIANA BONJIORNO MARTINS, E ORIENTADA PELA PROFA.DRA. LAURA STERIAN WARD.
CAMPINAS 2015
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2012/16830-0
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Analysis of pro-inflammatory interleukins (IL-2, IL-2R, IL-6, IL-6R, IL-8 and IL-12) and anti-inflammatory interleukins (IL-4, IL-4R and IL-10) in the differentiated thyroid cancer Palavras-chave em inglês: Thyroid neoplasms Interleukins Diagnosis Prognosis
Área de concentração: Clínica Médica Titulação: Doutora em Ciências
Banca examinadora:
Laura Sterian Ward [Orientador] Rita de Cássia Ferreira
Gláucia Maria Ferreira da Silva Mazeto Natassia Elena Bufalo
Ligia Vera Montali da Assumpção Data de defesa: 11-12-2015
Programa de Pós-Graduação: Clínica Médica Martins, Mariana Bonjiorno, 1985-
M366e Estudo das interleucinas pró-inflamatórias (IL-2, IL-2R, IL-6, IL-6R, IL-8 e IL-12) e Anti-Inflamatórias (IL-4, IL-4R e IL-10) no carcinoma diferenciado da tiroide / Mariana Bonjiorno Martins. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
Orientador: Laura Sterian Ward.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
1. Neoplasias da glândula tireoide. 2. Interleucinas. 3. Diagnóstico. 4. Prognóstico. I. Ward, Laura Sterian,1956-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
MARIANA BONJIORNO MARTINSORIENTADOR: Profa. Dra. Laura Sterian Ward
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. Laura Sterian Ward
2. PROFA. DRA. Rita de Cássia Ferreira
3. PROF. DRA. Gláucia Maria Ferreira da Silva Mazeto
4. PROFA. DRA. Natassia Elena Bufalo
5. PROFA. DRA. Ligia Vera Montali Assumpção A
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esta dissertação:
Aos meus pais, Rogeria e Marcos, por acreditarem em mim. Mãe seu amor e incentivo foi o que me deu esperança para seguir. Pai, sua presença e amor significou segurança de que não estou sozinha nesta caminhada.
AGRADECIMENTOS
Á Deus, qυе permitiu qυе tudo isso acontecesse ао longo de minha vida, е não somente nestes anos de doutorado, mаs em todos os momentos é ele o maior mestre qυе alguém pode conhecer.
À minha orientadora, Dra. Laura Sterian Ward por acreditar em mim, por acreditar no futuro deste projeto e contribuir para o meu crescimento profissional e me mostrar o caminho da ciência. A Senhora é um exemplo de profissional a ser seguido.
Aos meus pais Rogeria B. Martins e Marcos Martins, por acreditarem em meu potencial, pelo incentivo e dedicação não só a minha formação pessoal, mas também profissional.
A minha irmã Bruna B. Martins pelo amor e carinho, por fazer minha vida mais fashion...rsrsrs.
A todos do Laboratório GEMOCA que apoiaram e ajudaram na execução deste trabalho: Angélica, Caroline, Fernando, Jacqueline, Karina, Laís, Lucas, Marjory, Murilo, Natássia e Raquel. Agradeço por toda motivação, pelas conversas e diversão, pelos estudos e trocas de conhecimentos, pelas amizades eternas que levarei, pelo orgulho de fazer parte desta equipe!! Muito obrigado! Um agradecimento especial à Karina e Murilo, pela ajuda técnica neste trabalho, por terem aceitado fazer parte desta realização, sem vocês este trabalho teria sido mais pesado.
Um agradecimento em especial ao Antônio por ter disponibilizado seu tempo para me ensinar e ajudar com os testes de ELISA.
As minhas amigas Thatiane Moura e Daniele Martins que me olham com admiração, vocês são únicas meninas, eu sou muito feliz por fazer parte das suas vidas e vocês da minha. Amo!!
A Talita Cunha e Jacqueline Requena minhas amigas queridas vocês transformaram os meus dias mais dolorosos em um aprendizado e divertimento constante, me fizerem enfrentar o mundo de outra maneira, me fizeram mais forte e
feliz. Jamais esquecerei os momentos que vivi com vocês. Sei que a vida nos unirá novamente!!
E eu não poderia deixar de agradecer eternamente a Marjory e Fernando por serem companheiros de trabalhos е irmãos na amizade, vocês fizeram parte da minha formação profissional e pessoal е vão continuar presentes em minha vida com certeza. Sem vocês esta estrada seria tão difícil, vocês tornaram meu doutorado prazeroso e minha vida muito mais feliz, serei eternamente grata por tudo, pelas broncas, conselhos, risadas e choros. Deus me deu vocês e os tenho como irmãos para sempre!! Amo muito!!
A todos os Pacientes e Voluntários que, doando um pouco de si, tiveram o desprendimento e a generosidade de ajudar não a si mesmos, mas aos outros.
À FAPESP, pelo apoio financeiro na pesquisa e pelo investimento em minha bolsa de doutorado e no projeto, sem este incentivo este trabalho não poderia ter sido desenvolvido e nem contribuído para a ciência no país.
“A menos que modifiquemos a nossa maneira de pensar, não seremos capazes de resolver os problemas causados pela forma como nos acostumamos a ver o mundo”.
(Albert Einstein)
“A persistência é o menor caminho do êxito”.
(Charles Chaplin)
“Descobrir consiste em olhar para o que todo mundo está vendo e pensar uma coisa diferente”.
RESUMO
Representando mais de 2% de todas as neoplasias humanas, o câncer de tiroide tem aumentado continuamente em muitas regiões do mundo nas últimas décadas. Assim, tem se buscado ativamente marcadores que permitam distinguir malignidade nos nódulos tiroidianos e que permitam delinear melhores estratégias de manejo e seguimento. Células tiroidianas neoplásicas estão associadas a um perfil molecular e imunológico de resposta que pode estar relacionado com malignidade e agressividade. O sistema imunológico dispõe de citocinas, dentre as quais se destacam inúmeras Interleucinas (ILs), que participam da indução e de fases efetoras de respostas imunes e inflamatórias. O presente trabalho teve como objetivo verificar se os genes e proteínas da IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10 e IL-12 podem ser utilizados como marcadores de diagnóstico e/ou prognóstico para o Carcinoma Diferenciado de Tiroide (CDT). Foram estudados 300 pacientes com CDT, 60 pacientes com nódulos benignos e 300 indivíduos controle. Foi realizada análise genotípica dos genes das ILs por TaqMan® SNP Genotyping e a dosagem sérica por ELISA. Para os dados séricos, a IL-2 distinguiu pacientes com doença ativa dos sem doença ativa (p=0,0007) e nódulos malignos dos benignos (p<0,0001); a IL-2R diferenciou o grupo maligno do grupo controle (p<0,0001); a IL-4 foi à única que não diferenciou os grupos, mas foi maior nos pacientes que não apresentaram metástase a distância (p=0,0290) e nos que possuíam tiroidite (p=0,0005). A dosagem da IL-6 foi capaz de identificar malignidade (p=0,0053); enquanto concentrações mais elevadas de IL-6R se associaram a presença de doença ativa (p<0,0001), e metástase ao diagnóstico (p=0,0301) e ausência de cápsula (p=0,0310). As concentrações da IL-8 distinguiram os pacientes com doença ativa dos sem doença ativa (p=0,0025), nódulos malignos dos benignos (p<0,0001) e dos controles (p=0,0016). A IL-10 também se mostrou útil na identificação de malignidade (p<0,0001) e multifocalidade (p=0,0019). E, por fim, a IL-12 distinguiu os pacientes com doença ativa dos sem doença ativa (p<0,0001), assim como os nódulos malignos dos controles (p<0,0001).
A distribuição genotípica dos polimorfismos estudados não se correlacionou com o risco para CDT; não diferenciou os grupos estudados e não se correlacionou com características clinico-patológicas dos pacientes.
Os dados de correlação entre os snps estudados e as concentrações séricas, demonstraram que apenas os snps IL-2 rs2069762 e IL-6R rs2228145, IL-6R rs4845622 e IL-6R rs6684439 apresentaram influencia no aumento da concentração sérica das respectivas ILs.
Concluímos assim que, aos dados das concentrações séricas da 2, 2R, 6, IL-6R, IL-8, IL-10 e IL-12 podem auxiliar no diagnóstico de malignidade e em alguns parâmetros de agressividade, mas não podem ser usadas como marcadores de seguimento para pacientes com CDT. Quanto aos genes estudados nenhuns dos polimorfismos estão envolvidos com a patogenicidade no CDT.
Quanto aos polimorfismos estudados, apesar de nenhum deles estar envolvidos na patogenicidade no CDT, os polimorfismos IL-2 rs2069762, IL-6R rs2228145, IL-6R rs4845622 e IL-6R rs6684439, estão relacionados ao aumento da produção das interleucinas séricas.
Palavras-chave: Neoplasias da Glândula Tireoide. Interleucinas. Diagnóstico. Prognóstico.
ABSTRACT
Representing more than 2% of all human cancers, thyroid cancer has been increasing in many regions of the world in the recent decades. So, there has been an active sought for markers that distinguish malignancy in thyroid nodules and enable a better choice of management strategies and monitoring. Thyroid neoplastic cells are associated with a molecular profile and immune response that may be associated with malignancy and aggressiveness. The immune system has anti-inflammatory cytokines, among which are several Interleukins (ILs), that participate in the induction and effector phases of immune and inflammatory responses. This study aimed to determine whether the genes and proteins of 2, 2R, 4, 4R, 6, 6R, IL-8, IL-10 and IL-12 can be used as markers diagnosis and/or prognosis for Differentiated Thyroid Cancer (DTC). We studied a total of 300 DTC, 60 patients with benign nodules and 300 healthy controls. Genotypic analysis was performed of ILs byTaqMan® SNP Genotyping and serum dosage by ELISA. For the serum data, the IL-2 distinguished patients with active disease from without active disease (p=0.0007) benign and malignant (p<0.0001). IL-2R differentiated malignant and control groups (p<0.0001), IL-4 was the only one that did not differentiate the malignant, benign and control groups, but was greater in patients without metastasis to distance (p=0.0290) and those who higher thyroiditis (p=0.0005). The dosage of IL-6 was capable of identifying malignancies (p=0.0053); while higher levels of IL-6R were associated with the presence of active disease (p<0.0001) and metastasis diagnosis (p=0.0301), and no capsule (p=0.0310). IL-8 concentrations distinguished patients with active disease from without the active disease (p=0.0025), malignant from benign patients (p<0.0001) and the control (p=0.0016). IL-10 also proved useful in identifying malignant (p<0.0001) and multifocality (p=0.0019). And, IL-12 differentiated patients with active disease from without active disease (p<0.0001) as well as differentiate the control of malignant disease (p<0.0001).
Genotype distribution of the studied polymorphisms did not correlate with the risk for DTC; did not differentiate the groups and there was no correlation with clinicopathological characteristics.
As for the correlation data between the studied SNPs and serum concentrations, we observed that only SNPs IL-2 rs2069762 and IL-6R rs2228145, IL-6R rs4845622 and
IL-6R rs6684439 showed influences the increased concentration of the respective ILSs.
We conclude that the data in serum concentrations of IL-2, IL-2R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10 and IL-12 can help in the diagnosis of malignancy and aggressiveness parameters, but cannot be used as markers for monitoring patients with DTC.
As for the genes studied none of the polymorphisms are involved in pathogenicity in DTC.
As for the studied polymorphisms, although none of them are involved in pathogenicity in DTC, the polymorphisms IL-2 rs2069762, IL-6R rs2228145, IL-6R rs4845622 and IL-6R rs6684439, are related to increased production of serum interleukins.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Incidência estimada de Câncer da Tiroide em 2014 nos EUA...24 Figura 2: Distribuição dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para
2016/2017 por sexo, exceto pele não melanoma. Adaptado de INCA, 2015...24 Figura 3: Exemplo de resultado observado pelo método de Real time para o gene
2 a curva em destaque indica que o indivíduo apresenta o genótipo homozigoto selvagem. ...43 Figura 4: Exemplo de resultado observado pelo método de Real time para o gene
2 a curva em destaque indica que o indivíduo apresenta o genótipo homozigoto polimórfico...44
Figura 5: Exemplo de resultado observado pelo método de Real time para o gene IL-2 as curvas indicam que o individuo apresenta o genotipo heterozigoto...44
Figura 6: Gráfico exibindo o método de Real time para o gene IL-2, em azul, indica que as amostras são do alelo Y, ou seja, indica que são homozigotos selvagens; em verde, as amostras são heterozigotas, em vermelho, as amostras são homozigotas (polimórficos), o quadrado indica o controle negativo...45 Figura 7: Box plot mostrando os valores de concentrações de Interleucina-2 em soro
de Indivíduos Controles, Nódulos Benignos, Pacientes com e sem doença ativa e Nódulos Malignos...47 Figura 8: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-2 em soro de
Pacientes Sem Doença Ativa e Com Doença Ativa...48 Figura 9: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-2 em soro de
Nódulos Benignos e Nódulos Malignos...48
Figura 10: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da dosagem de IL-2 para pacientes com doença ativa vs sem doença ativa...50
Figura 11: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da dosagem de IL-2 para nódulos malignos vs nódulos benignos...50 Figura 12: Box plot mostrando os valores de concentrações do Receptor da
Interleucina-2 em soro de Indivíduos Controles, Nódulos Benignos, Pacientes Portadores com e sem doença ativa e Nódulos Malignos...51 Figura 13: Box plot mostrando as concentrações do Receptor da Interleucina-2R em
soro de Controle e Nódulos Malignos...52 Figura 14: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da dosagem de IL-2R para controles vs nódulos malignos...53 Figura 15: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-4 em soro de
Indivíduos Controles, Nódulos Benignos, Pacientes com e sem doença ativa e Nódulos Malignos...54 Figura 16: Box plot mostrando os valores de concentrações de Interleucina-6 em
soro de Indivíduos Controles, Nódulos Benignos, Pacientes com e sem doença ativa e Nódulos Malignos...56 Figura 17: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-6 em soro de
Nódulos Benignos e Nódulos Malignos...57 Figura 18: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da
dosagem de IL-6 para pacientes nódulos malignos vs ódulos benigno..58 Figura 19: Box plot mostrando as concentrações do Receptor da Interleucina-6 em
soro de Indivíduos Controles, Nódulos Benignos, Pacientes com e sem doença ativa e Nódulos Malignos...59 Figura 20: Box plot mostrando as concentrações do Receptor da Interleucina-6 em
soro de Pacientes Sem Doença Ativa e Com Doença Ativa...60 Figura 21: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da
dosagem de IL-6R para pacientes sem doença ativa vs com doença ativa...61 Figura 22: Box plot mostrando os valores de concentrações de Interleucina-8 em
soro de Indivíduos Controles, Nódulos Benignos, Pacientes com e sem doença ativa e Nódulos Malignos...62 Figura 23: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-8 em soro de
Pacientes Sem Doença Ativa e Com Doença Ativa...63 Figura 24: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-8 em soro de
Figura 25: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-8 em soro de Controles e Nódulos Malignos...64 Figura 26: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da
dosagem de IL-8 para pacientes sem doença ativa vs com doença ativa...65
Figura 27: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da dosagem de IL-8 para nódulos malignos vs controles...66 Figura 28: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da
dosagem de IL-8 para nódulos malignos vs benignos...67 Figura 29: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-10 em soro de
Indivíduos Controles, Nódulos Benignos, Pacientes portadores com e sem doença ativa e Nódulos Malignos...68 Figura 30: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-10 em soro
Pacientes com Nódulos Benignos e Nódulos Malignos...69 Figura 31: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da
dosagem de IL-10 para nódulos malignos vs nódulos benignos...70 Figura 32: Box plot mostrando os valores de concentrações de Interleucina-12 em
soro de Indivíduos Controles, Nódulos Benignos, Pacientes com e sem doença ativa e Nódulos Malignos...71 Figura 33: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-12 em soro de Sem
Doença Ativa e Com Doença Ativa...72 Figura 34: Box plot mostrando as concentrações da Interleucina-12 em soro de
Controle e Nódulos Malignos...72 Figura 35: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da dosagem de IL-12 para pacientes sem doença ativa vs com doença ativa...73 Figura 36: Curva ROC apresentando os pontos de especificidade e sensibilidade da
dosagem de IL-12 para controle vs nódulos malignos...74 Figura 37: A frequência genotípica do polimorfismo IL-2 rs2069762 nos casos e
controles...75 Figura 38: A frequência alélica do polimorfismo IL-2 rs2069762 nos casos e
Figura 39: A frequência genotípica do polimorfismo IL-6R rs2228145 nos casos e controles...77
Figura 40: A frequência alélica do polimorfismo IL-6R rs2228145 nos casos e controles...77
Figura 41: A frequência genotípica do polimorfismo IL-6R rs4845622 nos casos e controles...78
Figura 42: A frequência alélica do polimorfismo IL-6R rs485622 nos casos e
controles...79
Figura 43: A frequência genotípica do polimorfismo IL-8 rs4073 nos casos e
controles...80
Figura 44: A frequência alélica do polimorfismo IL-8 rs4073 nos casos e
controles...80
Figura 45: A frequência genotípica do polimorfismo IL-12 rs568408 nos casos e controles...81 Figura 46: A frequência alélica do polimorfismo IL-12 rs568408 nos casos em
controles...82 Figura 47: Correlação entre as dosagens da IL-2 e o genótipo rs2069762 em
CDT...84 Figura 48: Correlação entre as dosagens da IL-6R e o genótipo rs2228145 em
CDT...85 Figura 49: Correlação entre as dosagens da IL-6R e o genótipo rs4845622 em
CDT...85 Figura 50: Correlação entre as dosagens da IL-6R e o genótipo rs6684439 em
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Genes estudados e seus respectivos SNPs...41
Tabela 2: Relação entre caso e controle quanto a características de sexo e
idade...43
Tabela 3: Valores das concentrações séricas da Interleucina-2 nos grupos
estudados...47
Tabela 4: Valores das concentrações séricas do Receptor da Interleucina-2 nos grupos estudados...51
Tabela 5: Valores das concentrações séricas da Interleucina-4 nos grupos
estudados...54
Tabela 6: Valores das concentrações séricas da Interleucina-6 nos grupos
estudados...55
Tabela 7: Valores das concentrações séricas do Receptor da Interleucina-6 nos grupos estudados...58
Tabela 8: Valores das concentrações séricas da Interleucina-8 nos grupos
estudados...62
Tabela 9: Valores das concentrações séricas da Interleucina-10 nos grupos
estudados...67
Tabela 10: Valores das concentrações séricas da Interleucina-12 nos grupos estudados...70
Tabela 11: Avaliação da correlação entre os polimorfismos e as dosagens séricas da Interleucinas correspondentes...83
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AF Adenoma Folicular
Ala Alanina
Arg Arginina
Asp Aspartato
ATA American Thyroid Association
BRAF V-Raf – Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B1
CAT Carcinoma Anaplásico da Tiroide
CDT Carcinoma Diferenciado da Tiroide
CFT Carcinoma Folicular da Tiroide
CMT Carcinoma Medular da Tiroide
CPT Carcinoma Papilífero da Tiroide
CPTVF Carcinoma Papilífero da Tiroide de Variante Folicular
CT Carcinoma da Tiroide; Câncer de Tiroide
CTLs Linfócitos T Citotóxicos
Cys Cisteina
DNA Ácido desoxirribonucleico
ELISA Enzime Linked Immunoborbent Asssay
EUA Estados Unidos da América
FCM Faculdade de Ciências Médicas
F Teste Exato de Fisher
GEMOCA Laboratório de Genética Molecular do Câncer
Gln Glutamina
HSV-TK The Human Herpes Simplex Virus Thymedine Kinase Type 1 IFN Ínterferon-γ IFN-γ Interferon- γ Ile Isoleucina ILs Interleucinas IL-2 Interleucina-2
Il-2R Receptor da Interleucina-2
IL-2Ra Receptor alfa da Interleucina-2
IL-4 Interleucina-4
IL-6 Interleucina-6
IL-6R Receptor da Interleucina-6
IL-8 Interleucina-8
IL-10 Interleucina-10
IL-12 Interleucina-12
INCA Instituto Nacional do Câncer
NK Natural Killer
OR Odds Ratio
PAAF Punção aspirativa por agulha fina
PCR Polymerase Chain Reaction
Pro Prolina
ROC Receiver operating characteristic
Rs Número do Snp na base de dados do dbSNP
SAS Statistical Analyses System
Ser Serina
SNP Single Nucleotide Polymorphism
Tg Tireoglobulina
TH1 Linfócitos T-helper1
TH2 Linfócitos T-helper2
TLC Tiroidite Linfocitária Crônica
TNM Tumor Size, Nodes, Metastases
Treg Linfócito T regulatório
TSH Thyroid –Stimulating Hormone
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
US Ultrassonografia
Val Valina
VEGF Vascular Endothelial Growth Fator
VIC/FAM Sondas com alelos específicos para o polimorfismo e primers
VPN Valor Preditivo Negativo
VPP Valor Preditivo Positivo
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 23
1.1 Câncer de Tiroide 23
1.2 Citocinas e Câncer 27
1.3 Citocinas e Câncer de Tiroide 33
2. OBJETIVOS 36 3. MATERIAL E MÉTODOS 37 3.1 Casuística 37 3.2 Pacientes com CDT 37 3.3 Seguimento 38 3.4 Controles 38 3.5 Coleta do Soro 38 3.6 Extração de DNA 39
3.7 Análise das proteínas IL-2, IL-2R, IL-4, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10 e IL-12 por Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
39
3.8 Protocolo de ELISA 39
3.9 Análise dos genes IL-2, IL-4, IL-4R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10 e IL-12 por TaqMan® SNP Genotyping
40
3.10 Análise Estatística 45
4. RESULTADOS 46
4.1 Análise entre Casos e Controles 46
4.2 Análise das proteínas por ELISA 46
4.2.2 Receptor da Interleucina-2 (IL-2R) ELISA 51
4.2.3 Interleucina-4 (IL-4) ELISA 54
4.2.4 Interleucina-6 (IL-6) ELISA 55
4.2.5 Receptor da Interleucina-6 (IL-6R) ELISA 58
4.2.6 Interleucina-8 (IL-8) ELISA 61
4.2.7 Interleucina-10 (IL-10) ELISA 67
4.2.8 Interleucina-12 (IL-12) ELISA 70
4.3 Análise Genotípica e Alélica 74
4.3.1 Interleucina-2 (IL-2) rs2069762 75
4.3.2 Receptor da Interleucina-6 (IL-6R) rs2228145 76
4.3.3 Receptor da Interleucina-6 (IL-6R) rs485622 78
4.3.4 Interleucina-8 (IL-8) rs4073 79
4.3.5 Interleucina-12 (IL-12) rs568408 81
4.4 Análise dos genótipos com as concentrações séricas 82
4.4.1 Interleucina-2 (IL-2) 84
4.4.2 Receptor da Interleucina-6 (IL-6R) 84
5. DISCUSSÃO 87
6. CONCLUSÕES 96
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 97
1. INTRODUÇÃO
1.1 Câncer de Tiroide
A incidência das doenças tiroidianas tem aumentado nos últimos anos e a detecção de nódulos na glândula tem se tornado frequente (1, 2). Estima-se que nódulos sejam detectados em aproximadamente 10% dos indivíduos submetidos a um exame físico (palpação) e 50% da população examinada por ultrassonografia (US) na região do pescoço (3, 4), possua nódulos. Além disso, como os nódulos tiroidianos são mais frequentes ao passar de idade, exames de US detectam essas lesões em cerca de 90% das mulheres acima de 70 anos e cerca de em 80% dos homens acima de 80 anos (5). No entanto, aproximadamente 5% destes nódulos são diagnosticados como malignos (3, 6-8).
O câncer de tiroide (CT) representa mais de 2% de todas as neoplasias malignas humanas (2, 9, 10). E, sua incidência tem aumentado continuamente e praticamente dobrado nos últimos 30 anos em muitas regiões do mundo (11).
Dados da Sociedade Americana de Câncer apontam que o CT foi a 8ª neoplasia maligna mais frequente nos Estados Unidos da América (EUA) no ano de 2015 (Figura 1) (12). Dados recentes do Instituto Nacional do Câncer (INCA) colocam o CT como o câncer mais comum de cabeça e pescoço, projetando esse tumor como o 8º câncer mais frequente entre as mulheres no país e nos deu uma estimativa para o ano de 2016/2017 de 5870 novos casos para o sexo feminino e 1090 novos casos de para o sexo masculino (Figura 2) (13).
Figura 1: Incidência estimada de Câncer da Tiroide em 2014 nos EUA (12).
Figura 2: Distribuição dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2016/2017 por sexo, exceto pele não melanoma. Adaptado de INCA, 2015 (13).
O CT apresenta diferentes tipos histológicos e sua forma mais comum é o Carcinoma Diferenciado da Tiroide (CDT). Os CDTs são derivados das células foliculares e subdivididos em dois grupos: Carcinomas Papilíferos da Tiroide (CPT) e Carcinomas Foliculares da Tiroide (CFT) (14).
Os CPTs representam aproximadamente 85% das malignidades epiteliais da glândula tiroide, sendo caracterizados pela presença de papilas e também por diferenças no núcleo das células, embora algumas variantes não apresentem a característica das papilas, como sua variante mais comum, o Carcinoma Papilífero de Variante Folicular (CPTVF) (15). Outras variantes do CPT são menos frequentes e apresentam irregularidades na forma dos folículos (16). De maneira geral, os CPTs são propensos a invadir espaços linfáticos, podendo levar à metástase nos linfonodos (15). Entre 20% e 90% dos pacientes que apresentam CPT irão possuir metástase linfonodal no momento do diagnóstico e apenas 2% apresentarão metástases a distância, um indicador de pior prognóstico (17, 18).
Já os CFTs são mais agressivos e menos comuns que o CPT, representando aproximadamente 5% das malignidades tiroidianas, sendo que sua incidência vem diminuindo ao redor do mundo (19). Histologicamente, os CFTs se assemelham muito ao CPTVF e ao Adenoma Folicular (AF), diferindo do último apenas pela presença de invasão capsular (16). Estima-se uma sobrevida de 10 anos para 95% dos casos de CPT e de 77% para os casos de CFT (12, 20).
O prognóstico de pacientes com CDT geralmente é bom, uma vez que esses tumores apresentam comportamento indolente, e a maioria deles não tem uma progressão clínica considerável, o que levaria o paciente à morte (21).
Os demais tipos de CT são considerados mais raros e agressivos, sendo que os Indiferenciados ou Anaplásicos (CAT) representam menos de 1% dos CTs, e são altamente letais. Já os Carcinomas Medulares da Tiroide (CMT), que são derivados das células parafoliculares, produtoras de calcitonina, representam apenas 3% dos CTs (14). Estima-se uma sobrevida de 85% em 10 anos para os CMT com linfonodos negativos, porém de apenas 40% para aqueles que apresentam invasão ganglionar (14).
Apesar do crescente número de casos, as razões pelas quais a incidência do CT tem aumentado ainda não são bem estabelecidas e permanecem controversas (22). Diversos autores sugerem que este aumento da incidência está relacionado apenas à melhoria nos métodos diagnósticos e ao acesso da população
aos sistemas de saúde, utilizando como justificativa o fato de que os tumores que mais cresceram em incidência são os tumores pequenos, que antes não podiam ser detectados apenas com o exame da palpação (11, 23, 24). Porém, outros autores já demonstraram que o aumento da incidência não compreende apenas os tumores menores que 1cm, mas compreende também os tumores maiores, o que torna inviável dizer que as mudanças na incidência estariam ocorrendo exclusivamente devido a melhorias no diagnóstico e ao acesso ao sistema de saúde (25).
Desta forma, é possível sugerir que estamos sujeitos a uma crescente exposição a fatores que podem contribuir para este aumento de CTs. Dentre os fatores de risco já bem reconhecidos para o desenvolvimento do CT, é possível listar a exposição prévia a radiação ionizante, a ingesta de iodo, a história familiar de doenças tiroidianas, os fatores hormonais e reprodutivos e as concentrações do Hormônio Estimulante da Tiroide (TSH) alterados. Mais recentemente, o perfil genético e a presença de inflamação na área peritumoral, vêm sendo incluídos na lista de potenciais fatores de risco para o CT (26).
A avaliação diagnóstica de nódulos tiroidianos é feita através da punção aspirativa por agulha fina (PAAF). O exame citológico posterior à PAAF dos nódulos tiroidianos é a ferramenta diagnóstica mais precisa e mais usada atualmente, fornecendo, na maioria das vezes, um diagnóstico definitivo de nódulo maligno ou benigno (3, 27). Apesar das vantagens, tal método diagnóstico apresenta limitações: além de ser invasivo e com gastos para o sistema de saúde, 20 a 30% dos nódulos não podem ser classificados de maneira confiável em benigno ou maligno (3, 27). No entanto, o que acontece às vezes é que a PAA não é capaz de diferenciar as células dos AFs, dos CFTs, e também dos CPTVFs (15). Nos pacientes em que a citologia obtida pela PAAF é considerada suspeita, muitas vezes, estes são encaminhados para a tiroidectomia, para confirmar o diagnóstico histopatológico (28). Aproximadamente 75% dos nódulos decorrentes de cirurgias realizadas, em pacientes com diagnóstico citológico duvidoso, se mostram benignos (29, 30).
O avanço nas pesquisas que buscam marcadores moleculares vem demonstrando outras ferramentas para este diagnóstico. Os guidelines da Associação Americana de Tiroide (ATA) recomendam fazer uma análise molecular nos casos em que a citologia é considerada indeterminada, desde o ano de 2009 (12, 31).
A determinação do prognóstico de pacientes com CDT também é problemática. Embora a maioria dos pacientes apresente boa evolução, 10 a 15% dos casos podem ser agressivos, com metástase ao longo do seguimento, podendo levar à morte pela doença (32). Infelizmente, na prática clínica ainda não há marcadores capazes de prever quem serão os pacientes com boa ou má evolução durante o seguimento (3, 33).
Umas séries de sistemas de classificação baseadas em características clínicas, patológicas e moleculares estão sendo usados para prever o prognóstico e orientar as estratégias de tratamento cirúrgico e clínico. Alguns marcadores moleculares, especialmente a mutação do gene BRAF (V-Raf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B1), parecem muito promissores para indicar progressão tumoral (34). No entanto, no estado atual do conhecimento, esses marcadores ainda não são poderosos o suficiente para prever a necessidade de um tratamento mais agressivo (35).
Novos marcadores moleculares para o diagnóstico são necessários, em particular, no caso das lesões de padrão folicular, que incluem doenças benignas, que poderiam não ser submetidas à cirurgia (como a Hiperplasia e o Adenoma Folicular), e também lesões malignas, como a Variante Folicular do Carcinoma Papilífero e, mais raramente, o Carcinoma Folicular. Já marcadores de prognóstico podem ser úteis no seguimento de pacientes com CDT, podendo servir para dar base a estratégias de tratamentos ou dando indicações da presença de doença em algum momento do seguimento.
1.2 Citocinas e Câncer
A transformação celular maligna é caracterizada por mutações genéticas que causam desregulação na expressão de genes envolvidos na proliferação, diferenciação ou apoptose celular. Assim, ao longo desta transformação uma célula normal pode vir a expressar proteínas em concentrações anormais ou mesmo novas proteínas que não eram expressas anteriormente, perdendo o controle de processos celulares regulatórios vitais (36). A atividade do sistema imune contra infecções ou contra tecidos transplantados permite supor que, uma vez dirigido contra uma neoplasia, o sistema imune possa exercer um importante papel em seu controle ou
mesmo na erradicação das células malignas. Esta erradicação pode ocorrer através da produção de algumas citocinas (37).
As citocinas são produzidas por diferentes células do sistema imune, podendo desempenhar diversas funções, dentre elas: a mediação de respostas imunes e inflamatórias (38). Os efeitos das citocinas na imunidade dependem de vários fatores, incluindo a concentração local de citocinas, o padrão de expressão de seu receptor e a integração de múltiplas vias de sinalização em resposta às células imunes. Assim, o sistema imunológico dispõe de citocinas pró-inflamatórias que podem aumentar a função de outras citocinas e da resposta imune e de citocinas anti-inflamatórias que possuem a função de suprimir essa resposta. Dentre estas citocinas, destacam-se inúmeras Interleucinas (39).
As Interleucinas (ILs) pertencem a uma família de diversas citocinas, e representam pequenas moléculas de proteína de sinalização de células específicas, que regulam o sistema imunológico de um organismo. As ILs são sintetizadas principalmente por células T, monócitos, macrófagos e células endoteliais, tendo como funções: facilitar a comunicação entre as células do sistema imunológico, regular fatores de transcrição, além de controlar a inflamação, adiferenciação, a proliferação e a secreção de anticorpos. (40).
A Interleucina-2 (IL-2) é uma potente citocina imunorreguladora envolvida na mediação de células na resposta imune (41), sendo importante para a proliferação de linfócitos T ativados e assim, para a ativação dos fagócitos para a destruição do material captado (ativação-Th1). A IL-2 também pode aumentar a ativação da indução de morte celular em linfócitos T (42), podendo participar na finalização da resposta dos linfócitos ao induzir a supressão da produção de células T (43).
Por isso, o recombinante humano da IL-2 é utilizado em imunoterapia de câncer renal avançado e em melanoma (44, 45). Assim, é compreensível que vários estudos tenham sido realizados a fim de testar a eficácia da IL-2 em estimular o sistema imune de pacientes com câncer.
A administração de doses elevadas de IL-2 em casos de melanomas e cânceres renais está associada a uma melhoria na sobrevida livre de doença, embora os efeitos adversos de sua administração sejam notavelmente graves para a maioria dos pacientes (46, 47)
A IL-2 e seu receptor solúvel (sIL-2R) foram descobertos em sobrenadantes de células T adultas em linhagens celulares de leucemia/linfoma (48), e, atualmente, a IL-2 tem sido reconhecida como um biomarcador de tumor relacionado a linfomas malignos, incluindo células B-malignas (49, 50).
O Receptor da Interleucina-2 (IL-2R) é constituído por, pelo menos, três subunidades diferentes, α, β e γ, respectivamente (51). Quando há a ativação do receptor alfa da IL-2 (IL-2Ra), a forma solúvel é liberada no soro, sendo possível avaliar a concentração proteíca de IL-2Ra (52).
A regulação da concentração do sIL-2R no sistema IL/sIL-2R é crucial e é geralmente considerado um importante indicador envolvido na ativação do sistema imunitário (48, 53).
Em pacientes com câncer colorretal e de mama, concentrações elevadas de IL-2Ra no soro indicam progressão da doença e presença de metástases à distância (52).
Sendo assim as concentrações de sIL-2R são elevados no soro e em outros fluidos biológicos de pacientes com uma variedade de doenças auto-imunes e em varios tipos de cânceres, onde o sIL-2R têm provado ser um marcador útil de progressão da doença (49, 54).
Na posição -330 do gene IL-2 (4q26-q27) há uma região promotora que desempenha um papel importante na indução da expressão desta citocina e também na sua taxa de produção (55). O SNP (Single Nucleotide Polymorphism) G-330T (rs2069762) foi identificado nesse promotor, que supostamente influencia a produção desta proteína em indivíduos saudáveis (56). Estudos mostraram que linfócitos T de pacientes com o -330 G/G foram capazes de produzir uma maior quantidade da proteína IL-2 do que os que possuiam -330 T/G ou T/T (56).
Trabalhos em câncer de próstata também evidenciaram uma associação de variantes genéticas de IL-2 com o risco de câncer de próstata, revelando uma significativa contribuição da variante do exón 1 do gene IL-2 (rs2069763 G/T) para a suscetibilidade à doença (57).
A Interleucina 4 (IL-4) é produzida principalmente por células T CD4+, mastócitos e basófilos, podendo exibir grande atividade biológica em células do sistema imunológico (58). Estudos mostraram que a IL-4 tem um efeito inibidor sobre o crescimento de melanomas humanos, carcinomas de células renais e de células gástricas (59).
Existem 2 tipos de Receptores da Interleucina-4 (IL-4R). O tipo I que se liga apenas a IL-4 e consiste em 2 cadeias de receptores: IL-4Rα (CD124) e o γc (CD132) e o tipo II, que se liga a 4 e a 13 e é constituído pelo 4Rα e pelo IL-13Rα1 (60).
Em células de linhagens cancerígenas, as variações da atividade da IL-4 e de seus receptores foram mostradas atuando na modulação e proliferação celular. Nas linhagens célulares de câncer colorretal, a IL-4 e seu receptor (IL-4R) estão associados com a modulação e proliferação celular (61).
Há evidencias de resistência das células cancerígenas a apoptose devido a uma elevada expressão das proteínas anti-apoptóticas, associadas à produção autócrina da IL-4 (62, 63). A IL-4 foi relatada previamente, como uma indutora de resistência a apoptose em leucemia linfocítica crônica de células B e por aumentar a expressão de proteínas anti-apoptóticas em linfócitos normais e transformados (64), assim como em linhagens tumorais de próstata, mama e bexiga (65).
Além disso, também foi demonstrado que a IL-4 aumenta a proliferação de células pancreáticas câncerígenas em humano, ao passo que o bloqueio desta citocina sobre estas células tumorais tem um efeito inibidor do crescimento (66).
Um SNP na região promotora IL-4 T-168C (rs2070874) foi descrito por estar associado ao risco para o câncer colorretal (rs2243250) (67).
Um estudo realizado em linfoma revelou relações dos polimorfismos de IL-4R I75V (rs1805010); C431R (rs1805012); S436L (rs1805013); S503P (rs1805015), Q576R (rs1801275) com a sobrevida de pacientes, além de se associar a altas concentrações séricas do IL-4R com uma pior taxa de sobrevida e uma melhor taxa de sobrevida quanto ás concentrações séricas baixas (68).
A Interleucina-6 (IL-6) é uma citocina pleiotrópica que desempenha um papel central na hematopoiese, na diferenciação e no crescimento de inúmeras células de origem histológicas diferentes (69).
Ela é imuno-moduladora, com ação pró-inflamatória e endócrina. O tecido adiposo é a principal fonte da IL-6 circulante nos estados não inflamatórios (70). Concentrações séricas alteradas da IL-6 têm sido associadas com a morbidade e atividade da doença em uma surpreendente variedade de cânceres (71).
Há fortes associações positivas entre as concentrações séricas da IL-6 e o tamanho do tumor, estadio, ou com a progressão da doença em pacientes com câncer gástrico, câncer colorretal, sarcoma ósseo, câncer de mama, câncer
hepatocelular, câncer de nasofaringe, câncer de célula renal, câncer de pulmão, e melanoma (72-79).
A IL-6 atua através da ligação ao seu receptor. O Receptor da Interleucina-6 (IL-6R) é composto de duas subunidades, sendo uma a ligação com o gp80 (CD126) e a outra a da transdução do gp130 (CD130) (80). O IL-6R é expresso principalmente pelos hepatócitos, neutrófilos, monócitos/macrófagos, e alguns linfócitos (81, 82).
Concentrações elevadas do IL-6R, foram reportadas em doenças inflamatórias intestinais, artrite e na infecção pelo HIV (Human Immunodeficiency Virus) (83-85).
Existem vários polimorfismos na região promotora do gene IL-6 que desempenham um papel na expressão da mesma (86). Dentre eles, encontramos o SNP-174G/C (rs1800795), um dos mais estudados (87). Investigadores demonstraram que o alelo G deste snp está relacionado com uma alta concentração da proténa IL-6, do que o alelo C. Vários estudos vêm associando este alelo com um risco aumentado para câncer de mama (88).
O IL-6R possui 4 SNPs associados com um risco aumentado de melanoma. Três deles estão localizados em íntrons (rs6684439 C/T, rs4845618 T/G, e rs4845622 A/C) e um está localizado no éxon 9 (rs2228145 [Asp358Ala]) (89).
A Interleucina-8 (IL-8) foi classificada como um fator quimiotático para leucócitos progressão tumoral e na metástase em uma variedade de cânceres humanos (90). Tem sido sugerido que as células tumorais produzem IL-8 como um fator que promove o crescimento do tumor, invasão de tecidos e disseminação metastática (91).
Ela tem sido apontada como moduladora da proliferação e migração de células tumorais no melanoma (92), câncer de próstata (93), câncer de mama (94) e câncer do cólon (95).
Em câncer de próstata, a concentração circulante da IL-8 se mostrou aumentada nos tumores mais avançados (96). O soro de pacientes com câncer pancreático também revelou concentrações elevadas da IL-8, mostrando uma sobrevida relativamente inferior dos pacientes em comparação com aqueles que apresentavam concentrações séricas baixas. A taxa de crescimento de tumores também foi significativamente correlacionada à concentração sérica da IL-8. Quanto
maior a concentração da IL-8, mais rápido o crescimento tumoral, indicando um fenótipo mais agressivo e um pior prognóstico dos pacientes (97).
Hull et al.,(98) relataram um SNP no gene IL-8 na posição -251 A/T (rs4073), que estava associado com o aumento de sua produção sérica, e com um risco aumentado de desenvolvimento de câncer. O mesmo polimorfismo também foi relatado em câncer de mama (99).
A Interleucina-10 (IL-10) inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias através da inibição dos linfócitos T-helper 1 (Th1) e da estimulação dos linfócitos B e de linfócitos T-helper 2 (Th2) e, portanto, diminui a expressão da resposta inflamatória. Ela é uma potente citocina com capacidade dupla de imunossuprimir ou imunoestimular propriedades anticancerígenas (100).
Concentrações séricas da IL-10 foram avaliadas em diferentes tipos de cânceres, estando associado com o estadio da doença ou com um pior prognóstico em sarcoma ósseo, linfoma células B, câncer gástrico, câncer de cólon, linfoma de Hodgkin, câncer hepatocelular, melanoma, câncer de células renais, e câncer pancreático (101-104).
Existem três SNPs frequentemente investigados no gene IL-10, na posição -1082 A/G, na posição -819 C/T e um próximo à região promotora, na posição -592 A/C. O SNP -1082 é o mais amplamente divulgado, pois seu alelo G foi associado com o aumento da produção da IL-10 (105).
Estudos indicaram que o genótipo AA IL-10 -1082 (rs1800896 A/G) está associado com a diminuição da expressão da IL-10 (106). Já os polimorfismos nas posições -819 (rs1800871 T/C) e -592 (rs1800872 A/C) foram associados a uma menor resposta da IL-10 (56). Baixas concentrações séricas da IL-10 podem desempenhar um papel facilitador no desenvolvimento de câncer de mama (107).
Além disso, o SNP investigado na posição -1082 (A/G) esteve significativamente aumentado em pacientes com câncer de próstata e a sua ação, em conjunto com o VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) e com a IL-8, pode possivelmente influenciar a angiogênese no câncer (108).
Quando correlacionados a alteração das concentrações séricas da IL-10 com o polimorfismo -1082, pôde-se observar que eles influenciavam na suscetibilidade ao câncer por alterações nas respostas inflamatórias (109).
Concentrações elevadas da proteína IL-10 também foram relatadas em pacientes com carcinoma gastrointestinal em comparação com controles saudáveis,
observando concentrações significativamente mais elevadas em pacientes metastáticos do que nos pacientes sem metástase (110).
A Interleucina-12 (IL-12) é produzida principalmente por células apresentadoras de antígeno, como os macrófagos (111). Ela é composta de duas cadeias polipeptídicas (codificadas pelos genes IL-12A e IL-12B, respectivamente), que potentemente induzem a resposta imune de Th1, enquanto promovem a maturação de linfócitos T citotóxicos (CTLs), estimulam as células natural killer (NK) e produzem interferon-γ (IFN-γ) (112).
Ela pode prejudicar a neoangiogênese em tumores através da indução de Interferon- γ (IFN-γ). Devido a estas atividades, a IL-12 é considerada uma das citocinas mais viáveis para ser aplicada em imunoterapia de neoplasias (113).
Há relatos que a IL-12 possua uma resposta imune anticancerígena em vários tipos de cânceres, sendo utilizada como um alvo potencial para o seu tratamento (114). A IL-12 suprime drasticamente o apoio às atividades do tumor, através de macrófagos associados a tumores, que regulam a angiogênese tumoral, bem como, a iniciação e progressão de metástases (115).
O gene que codifica a IL-12A possui um polimorfismo (rs568408 G/A) que está associado a um risco elevado para câncer cervical. Também há relatos de outro polimorfismo (rs2243115 T/G) associado a um risco maior para glioma (116). A IL-12 tem ainda como uma de suas funções, ativar as células efetoras através do seu receptor (IL-12R), que compreende duas subunidades IL-12Rb1 e IL-12Rb2 (117). Estudos têm demonstrado que IL-12Rb2 é essencial para o sinal de transdução da IL-12 (118). Com base nesses resultados, existe a hipótese de que o aumento da concentração da IL-12 nas células de câncer de cólon pode inibir a sobrevivência de células e a iniciação do tumor (118).
Recentemente, foi relatado que um polimorfismo na região 3'- não traduzida (UTR) do gene IL-12B 1188A/C (rs3212227) tem influência na produção da IL-12 ou na expressão da proteína, estando associado com doenças inflamatórias e tumores (119). Em contraste, as concentrações séricas da IL-12 em soro de pacientes com câncer gástrico e colorretal são baixas (120).
1.3 Citocinas e Câncer de Tiroide
Estudos revelam que as citocinas são produzidas principalmente a partir de células imunitárias, mas também são secretados pelas células foliculares da
tiroide, bem como por células inflamatórias. Elas regulam a reação inflamatória através da estimulação de linfócitos T e B, resultando assim na produção de anticorpos e em uma possível lesão tecidual, com um papel crucial principalmente nas doenças autoimunes da tiroide (17, 18)
A IL-2 já foi testada como tratamento de contenção de carcinomas medulares da tiroide, tendo como resultado uma estabilização tumoral nos tumores maiores e uma regressão dos tumores menores além de uma baixa toxicidade sistêmica após aplicação in vivo. Este efeito antitumoral demonstrou ser dependente de atividade de linfócitos T citotóxicos contra o tumor, o que também impediu o crescimento tumoral pós uma nova aplicação de células tumorais, demonstrando o desenvolvimento de uma imunidade antitumoral a longo prazo (121, 122).
Em outro trabalho, foi testado um combinado da IL-2 humana e do gene HSV-TK (The human herpes simplex vírus thymidine kinase type 1) em células de CDT e anaplásico, demonstrando um efeito terapêutico melhor em comparação com a IL-2 por si só (123).
Vitale et al. (124) avaliaram os efeitos da lanreotida, um análogo de somatostatina, em combinação com a IL-2 em uma linhagem celular de CMT, avaliando o seu crescimento e os efeitos da lanreotida sobre a sensibilidade das células humanas alvo para IL-2, e na estimulação de células mononucleares no sangue periférico humano, concluindo que a combinação de uma baixas doses de IL-2 e lanreotida induzem respostas objetivas em pacientes com CMT avançado.
Todaro et al. (63) e Stassi et al. (62) demostraram que as células tiroideias cancerigenas de todas as variantes histológicas produzem quantidades consideráveis de IL-4, produzindo principalmente durante a transformação neoplásica. Em tecido tiroidiano normal, se detecta apenas o IL-4R. Assim, a presença de IL-4 no microambiente do câncer de tiroide contribui para a sobrevivência e proliferações das células cancerígenas, além de resistência á quimioterapia. Estes resultados podem ter importantes implicações para a patogénese e terapia no câncer de tiroide.
Uma variedade de citocinas, como as interleucinas 6, 8, 10 e IL-12, mostraram ser produzidas em células foliculares inflamatórias da tiroide, desempenhando um papel na patogênese das doenças autoimunes, afetando o processo autoimune, através do recrutamento de células inflamatórias, da regulação,
perpetuação de moléculas na resposta inflamatória e da interferência na síntese do hormônio tiroidiano (125).
Células foliculares normais da tiroide produzem altas concentrações de IL-6 e IL-8. A concentração reduzida da IL-IL-6 foi encontrada em linhagens de células anaplásicas da tiroide (126). Tanto em doenças benignas quanto malignas da tiroide o perfil das citocinas no soro está relacionado com desregulação inflamatória (127).
Estudos também apontam que o polimorfismo IL-10-1082A/G ocorre em pacientes com CPT (128). Nosso grupo demonstrou, em estudos prévios, que nem o polimorfismo IL-18-105 A/C nem o IL-10-1082A/G representavam risco para o desenvolvimento do CDT (129).
Yu et al. (130) demonstraram que a concentração da IL-10 foi significativamente maior nos pacientes com CPT e bócio multinodular concomitante, do que somente pacientes com bócio, sugerindo que estes pacientes poderiam ter um tipo específico de Treg (Linfócito T regulatório) que desempenha um papel na supressão de respostas imunes antitumorais locais.
Zhang et al. (131) geraram um adenovírus com duas subunidades do gene IL-12 e mostraram uma atividade anti-tumoral eficaz após a injeção intratumoral do adenovírus em tumores medulares da tiroide em ratos, demonstrando um desenvolvimento da imunidade anti-tumoral também a longo prazo.
Usando o mesmo adenovírus, foi observado em outro trabalho, um efeito terapêutico significativo através da imunidade antitumoral a longo prazo, em uma linhagem celular de CF em ratos. In vivo, a toxicidade demonstrou-se baixa após a aplicação intratumoral ou sistêmica do adenovírus (132).
Assim as citocinas podem influenciar na ativação, crescimento e diferenciação de diversas células-alvo, desempenhando um papel crucial, tanto nas doenças autoimunes da tiroide quanto nas neoplásicas, sendo assim elas parecem ser úteis como biomarcadores em soro de pacientes com CDT (133).
Porém, embora nosso grupo e outros estejam fornecendo evidências de que os perfis inflamatório e imune sejam importantes nos CDTs, não há, atualmente, muitos estudos relacionando tais citocinas a esses tumores (134-136)
2. OBJETIVOS
O objetivo deste estudo foi verificar se as dosagens séricas e/ou polimorfismos das Interleucinas pró e anti-inflamatórias podem ser utilizados como marcadores de diagnóstico e/ou prognóstico para o CDT.
E especificamente este estudo objetivou verificar as concentrações séricas das interleucinas em sangue periférico de pacientes com CDT, benignos e controles sem doença tiroidiana; verificar se o perfil genotípico herdado dos genes e receptores das interleucinas influencia na suscetibilidade ao desenvolvimento do CDT; correlacionar às dosagens séricas e o perfil genotípico dos indivíduos estudados com características clínico-patológicas do CDT e correlacionar o perfil genotípico com as concentrações séricas das interleucinas;
3. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Genética Molecular do Câncer (GEMOCA) da Faculdade de Ciências Médicas (FCM)/Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) em parceria com o Ambulatório de Câncer de Tireoide da Disciplina de Endocrinologia do Hospital de Clínicas da FCM-Unicamp, sob coordenação da Dra. Ligia Assumpção, além do Hemocentro da UNICAMP. O estudo foi aprovado pela Plataforma Brasil -UNICAMP (455.776).
3.1 Casuística
Foram estudados 300 pacientes com Carcinoma Diferenciado da Tiroide (CDT), 60 pacientes com Nódulos Benignos e 300 Indivíduos Controles.
3.2 Pacientes com CDT
Obtivemos sangue periférico, dados clínicos e anatomopatológicos dos 300 pacientes. Todos os pacientes diagnosticados com CDT seguiram um protocolo-padrão implantado há mais de 25 anos no Ambulatório de Tumores da Tiroide da UNICAMP e do Serviço de Medicina Nuclear da UNICAMP, possuindo uma ficha na qual constam, além de dados de identificação, idade ao diagnóstico, sexo, dados clínicos pré-cirúrgicos, exposição a agentes ambientais, dieta, tabagismo, uso de medicamentos e drogas, exames realizados (ultrassom, pesquisa de corpo inteiro com iodo131, biópsia aspirativa), dados referentes à cirurgia e do exame anatomopatológico (medida do tumor, tipo histológico, grau de diferenciação e presença de linfonodos metastáticos). Todos os dados, incluindo o diagnóstico de outras doenças concomitantes, foram confirmados nos prontuários dos pacientes. Os pacientes foram seguidos por um período de 12 a 336 meses (88.51±54 meses).
Os critérios de exclusão para os pacientes foram: histórico de exposição acidental ou médica à radiação ionizante, doença tiroidiana prévia, sinais clínicos e/ou relato de infecções ou inflamações agudas, relato de doença autoimunes,
infecção ou vacina recente (até 15 dias), imunossupressão e aquelas que não aceitaram participar do estudo.
3.3 Seguimento
Os pacientes com câncer foram acompanhados com pesquisa periódica de corpo inteiro com 131I, TSH sérico e medidas de tiroglobulina (Tg) de acordo com o protocolo de seguimento. Essa pesquisa também incluiu Raio-X, ultrassonografia, tomografia computadorizada e outros procedimentos para detectar metástase à distância, de acordo com cada caso. Pacientes com altos valores de Tg (>2ng/dL) e/ou pesquisas de corpo inteiro suspeitas foram submetidos a uma busca por exames de imagens. Os tumores foram definidos como recorrentes e/ou apresentando metástases à longa distância a partir do encontro de lesões nos exames de imagem e da persistência de valores ascendentes de Tg. Foram considerados pacientes assintomáticos e livres de doença aqueles que apresentavam Tg indetectável ou <2ng/dL.
3.4 Controles
Para o grupo controle, foram selecionados 300 indivíduos saudáveis da região de Campinas. Todas as amostras de sangue periférico foram coletadas no Hemocentro da UNICAMP. Os critérios de exclusão utilizados foram: indivíduos com história prévia de doenças tiroidianas, exposição à radiação, sinais clínicos e/ou relato de infecções ou inflamações agudas, relato de doença autoimune, infecção ou vacina recente (até 15 dias), imunossupressão e aquelas que não aceitaram participar do estudo. Tanto os indivíduos do grupo-controle quanto os pacientes com diagnóstico de CDT, foram submetidos a um questionário completo que inclui ocupação, tabagismo, uso de drogas ilícitas e médicas, condições gerais da saúde e informações sobre doenças prévias.
3.5 Coleta do Soro
Após a coleta do sangue periférico em tubo sem anticoagulante, o procedimento para separação do soro iniciou-se ao deixar o sangue em temperatura
ambiente por 1 hora para retração do coágulo; após a retração do coágulo, separou-se o soro com o auxilio da centrífuga; em separou-seguida separou-se transferiu o soro (sobrenadante) para outro frasco estéril e seco e então este é armazenado à -80°C ate seu uso.
3.6 Extração de DNA
As amostras de sangue foram armazenadas em geladeira, até a extração do DNA (Ácido desoxirribonucleico) genômico de leucócitos periféricos por meio de protocolo adaptado pelo nosso laboratório, utilizando-se como base o método do fenol-clorofórmio. Após uma semana da extração, o DNA foi quantificado com auxílio do equipamento espectrofotômetro UV-Visível modelo PICODROP, marca Picodrop Limited (Cambridgeshire, UK) e armazenado em freezer à –20ºC.
3.7 Análise das proteínas IL2, IL-2R, IL-4, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10 e IL-12 por Enzyme Linked ImmunosorbentAssay (ELISA).
Para o estudo das proteínas 2, 2R, 4, 6, 6R, 8, 10 e IL-12, utilizamos a técnica de ELISA, que se baseia na interação anticorpo-antígeno. Esta interação produz uma fluorescência na presença de um substrato, fazendo com que seja possível que a leitora capte a quantidade de coloração emitida e assim, consiga “quantificar” a proteína desejada.
A concentração de IL-2, IL-2R, IL-4, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10 e IL-12 foram determinadas por ELISA colorimétrico, seguindo as especificações correspondentes aos Kits R&D System High Sensitive.
3.8 Protocolo Geral de ELISA
Todos os reagentes necessários para a realização das dosagens foram deixados em temperatura ambiente antes de usá-los.
O protocolo geral do ELISA foi muito similar ao utilizado para todas as proteínas: Foi adicionado 50μL de reagente diluente, por poço, em seguida adicionou-se 200μL da amostra e cubra-o com o adesivo fornecido. Incubou-se por 3 horas em temperatura ambiente. Após essa etapa a placa foi aspirada e lavada. No próximo passo adicionou-se 200μL do conjugado da IL alvo em cada poço, cobriu
com o adesivo e incubou a placa por 2 horas em temperatura ambiente, após isso se repetiu o procedimento de lavagem. Posteriormente, adicionou 50μL da solução de substrato em cada poço, cobriu com o adesivo e incubou-se a placa por 1 hora em temperatura ambiente. Não se repetiu a lavagem e adicionou 50μL da solução de amplificador em cada poço. Cobriu com uma nova tira adesiva. Incubou-se por 30 minutos à temperatura ambiente. Após isso finalizou-se com 50μL stop em cada poço. Por fim, determinou-se a densidade óptica de cada poço usando o leitor da microplaca.
3.9 Análise dos genes IL-2, IL-4, IL-4R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10 e IL-12 por TaqMan® SNP Genotyping
Para a verificação da presença ou ausência dos polimorfismos, utilizou-se o TaqMan® SNP Genotyping (7500 Real Time PCR Systems). Tal técnica tem como base a estabilidade térmica do DNA de dupla fita, que em condições de alta estringência, é suficiente para distinguir entre pares de sonda e DNA-alvo perfeitos e imperfeitos. A hibridização só acontece se ocorrer pareamento perfeito entre sonda e DNA-alvo, podendo assim ser construídas sondas específicas para cada alelo. O ensaio para genotipagem de TaqMan® SNP Genotyping (Applied Biosystems, CA), constitui uma combinação da hibridização e da atividade exonucleásica 5’ da DNA-polimerase, acoplada à detecção de fluorescência (137).
A probe e os primers foram adquiridos pela TaqMan® SNP Genotyping (Applied Biosystems, CA). O número do ensaio utilizado que é determinado pela empresa Applied Biosystems conforme tabela 1.
Gene Identificação do
Ensaio
rs1 Concentração Sonda VIC/FAM2 Fita Região Mudança de
Aminoácido
IL-2 2069762 40X TTGTC[C/A]TAAAA Forward Promotor -
IL-4 2070874 40X AATTG[C/T]CTCAC Reverse – G/A UTR 5 -
IL4 2243250 40X ATTGT[C/T]CCCCA Forward Promotor -
IL-4R 1805010 40X CGTGT[A/G]TCCCT Forward Éxon I [Ile]* ⇒ V [Val]*
IL-4R 1805012 40X AGTCA[C/T]GCCTT Reverse – G/A Éxon C [Cys]* ⇒ R [Arg]*
IL-4R 1805013 40X ACCTT[C/T]GGGAA Reverse – G/A Éxon I [Ile]* ⇒ V [Val]*
IL-4R 1805015 40X GCAAC[C/T]CCCTG Forward Éxon S [Ser]* ⇒ P [Pro]*
IL-4R 1801275 40X CTATC[A/G]GGAGT Forward Éxon Q [Gln]* ⇒ R [Arg]*
IL-6 1800795 40X CTTGC[C/G]ATGCT Forward Promotor -
IL-6R 6684439 40X GAAAT[C/T]ACCTC Reverse – G/A Íntron -
IL-6R 2228145 40X GCAAG[C/A]TTCTT Forward Éxon D [Asp]* ⇒ A [Ala]*
IL-8 4073 40X ATACA[A/T]TTGAT Forward Íntron -
IL-10 1800896 40X TCCCC[T/C]TCCCA Forward Promotor -
IL-10 1800871 40X GAGAT[A/G]TTACA Reverse – T/C Íntron -
IL-10 1800872 40X TACAG[T/G]ACAGG Reverse – A/C Íntron -
IL-12B 2243115 40X CGCCT[G/T]GAGTC Forward Íntron -
IL-12A 568408 40X CACAT[A/G]ATACC Forward UTR 3 -
IL-12B 3212227 40X GCATC[G/T]AACTA Forward UTR 3 -
1rs – numero do Snp na base de dados do dbSNP.
2VIC/FAM – São sondas com os alelos específicos para o polimorfismo e os primers.
O volume final utilizado em cada solução foi de 25μL, contendo 20ng de DNA da amostra, 12,5μL de Taqman universal PCR (Polymerase Chain Reaction) Master Mix (concentração final 1X), 0,625μL do ensaio (sonda e primers) para a concentração de 40x (concentração final de 1x) e 8,875μL de água milli-Q. Os seguintes ciclos foram utilizados na PCR: a fase inicial de desnaturação foi de 10 minutos a 95°C, seguida por 50 ciclos de 92°C por 15 segundos, 60°C por 90 segundos. O software utilizado para a análise foi “Sequence Detection Software”, versão 1.3 (Applied Biosystems, CA). Nas figuras 3, 4, 5 e 6, exemplificamos os resultados observados no Real Time para os genes.
Figura 3: Exemplo de resultado observado pelo método de Real time para o gene IL-2 a curva em destaque indica que o indivíduo apresenta o genótipo homozigoto selvagem.
Figura 4: Exemplo de resultado observado pelo método de Real time para o gene IL-2 a curva em destaque indica que o indivíduo apresenta o genótipo homozigoto polimórfico.
Figura 5: Exemplo de resultado observado pelo método de Real time para o gene IL-2 as curvas indicam que o individuo apresenta o genotipo heterozigoto.
Figura 6: Gráfico exibindo o método de Real time para o gene IL-2, em azul, indica que as amostras são do alelo Y, ou seja, indica que são homozigotos selvagens; em verde, as amostras são heterozigotas, em vermelho, as amostras são homozigotas (polimórficos), o quadrado indica o controle negativo.
3.10 Análise estatística
Para a análise estatística foi utilizado o software SAS (Statistical Analyses System). Testes exatos de qui-quadrado (x2) e o teste exato de Fisher (F) foram usados para examinar a homogeneidade entre os casos e os controles com relação ao sexo, etnia, tabagismo e para os genótipos. Os testes de Mann-Whitney ou Wilcoxon foram usados para comparar a idade entre diferentes grupos genotípicos. O teste de Bonferroni foi utilizado para comprovar a associação entre os parâmetros clínicos. Já para o estabelecimento de valores de corte dos testes comparativos, foi utilizada uma curva ROC (reciver operating characteristics), que mostrou os pontos de sensibilidade/especificidade. O odds ratio (OR) e o coeficiente de intervalo de 95% “confidence interval- CI” foram usados para indicar o risco que um determinado genótipo de um determinado nódulo possui em relação ao grupo controle. Para o estudo dos fatores de risco para o câncer de tireoide foi utilizada a análise de regressão logística univariada e multivariada. O nível de significância adotado para os testes estatísticos foi 5%.
