Receptor da Interleucina-6 (IL-6R)

Quanto aos polimorfismos do IL-6R, o snp rs2228145, mostrou que o genótipo CC possui concentrações maiores do IL-6R no soro (512,96±364,30 pg/mL) do que aqueles com o genótipo CA (388,60 ± 32,68pg/mL) e AA (312,91±411,35 pg/mL) (p=0,0002) (Figura 48). IL-2 rs2069762 C o n ce n tra çõ e s Sé ri ca s (p g /mL ) CC CA AA

Figura 48: Correlação entre as dosagens da IL-6R e o genótipo rs2228145 em CDT.

O mesmo aconteceu com o rs4845622, no qual os pacientes que apresentaram o genótipo GG possuíam concentrações maiores do IL-6R no soro (541,84±570,03 pg/mL) do que aqueles com o genótipo TG (383,48 ± 36,58pg/mL) e TT (298,59±194,05 pg/mL) (p=0,0043) (Figura 49).

Figura 49: Correlação entre as dosagens da IL-6R e o genótipo rs4845622 em CDT.

C o n ce n tra çõ e s Sé ri ca s (p g /mL ) CC CA AA IL-6R rs2228145 IL-6R rs4845622 C o n ce n tra çõ e s Sé ri ca s (p g /mL ) GG GT TT

Por fim o rs668439 demostrou correlação, no qual os pacientes que apresentaram o genótipo AA tinham concentrações maiores do IL-6R no soro (482,01±318,74 pg/mL) do que aqueles com o genótipo GA (403,50±41,60pg/mL) e GG (300,86±198,74 pg/mL) (p=0,0169) (Figura 50).

Figura 50: Correlação entre as dosagens da IL-6R e o genótipo rs6684439 em CDT.

C o n ce n tra çõ e s Sé ri ca s (p g /mL ) IL-6R rs6684439 GG GA AA

5. DISCUSSÃO

Neste estudo, pudemos observar que os dados das concentrações séricas da IL-2, IL-2R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10 e IL-12 podem ser usados no diagnóstico de malignidade e em parâmetros de agressividade, somente a IL-4 não demonstrou nenhuma associação significativa. Quanto aos resultados dos genes estudados os polimorfismos não estão envolvidos com a patogenicidade e risco para CDT, no entanto os polimorfismos IL-2 rs2069762, IL-6R rs2228145, IL-6R rs4845622 e IL-6R rs6684439, estão relacionados ao aumento da produção das interleucinas séricas respectivas.

IL-2. Há pouco estudo das concentrações séricas da IL-2 com o valor de diagnóstico e prognóstico para CDT e os relatos na literatura, desta interleucina em outros cânceres, ainda são poucos e contraditórios.

Em nossos resultados as altas concentrações séricas da IL-2 distinguiram os pacientes com doença ativa dos pacientes sem doença ativa. Forones et al. (138) observaram que em pacientes com câncer gástrico avançado, as concentrações séricas da IL-2, estavam aumentadas consideravelmente em comparação aos pacientes com câncer gástrico precoce.

Também demonstramos que a concentração sérica da IL-2 nos pacientes com nódulos malignos era significativamente maior em comparação aos pacientes com nódulos benignos, diferente do que observamos em um trabalho com câncer de mama (139), os autores notaram um aumento da concentração no grupo controle em comparação com o grupo com câncer de mama.

Nosso estudo relatou uma relação das altas concentrações desta Interleucina com características de agressividade, estando esta aumentada em pacientes que apresentavam multifocalidade e nos que não apresentavam tiroidite. No entanto, não há trabalhos que mostram correlações desta IL com estas características clínicas, somente trabalhos correlacionando suas baixas concentrações com o estádio avançado da doença em câncer de pulmão (140)

Nosso grupo, neste trabalho, demonstrou que a distribuição genotípica de IL-2 rs2069762 não pode diferenciar o grupo de pacientes portadores de câncer diferenciado de tiroide do grupo controle, semelhante ao encontrado em trabalhos com câncer gástrico (141, 142).

Ao analisarmos a distribuição alélica deste polimorfismo, observamos que o alelo C, considerado polimórfico pela literatura, se mostrou diferente entre os

pacientes com CDT e grupo controle, no entanto, diferentemente dos nossos resultados, em outro trabalho com câncer gástrico (141), não conseguiu demonstrar diferença, da distribuição alélica deste snp entre o grupo de casos e controles.

O polimorfismo do gene IL-2 estudado por nós, não demonstrou nenhuma relação deste com o risco para CDT. Wu et al. (142), demonstram que os indivíduos com a genótipos alterados para IL-2 tem um risco diminuído de desenvolver câncer gástrico. Por outro lado Song et al. (144) demonstraram que o genótipo homozigoto polimórfico deste snp gera um risco para linfoma em um estudo com crianças. Sendo assim, os resultados destes autores não se assemelham aos nossos e há muita controvérsia sobre este snp em estudos com diferentes tipos de câncer.

Quanto à correlação do polimorfismo com as concentrações séricas, a literatura nos mostra que o snp rs2069762 está em uma região promotora do gene, a qual parece interferir na produção normal da IL-2, de forma a aumentar sua concentração sérica (55).

Nossos resultados foram diferentes do demostrado por estes autores, pois as altas concentrações desta IL se encontravam nos indivíduos que apresentavam o genótipo AA, apontado pela literatura como o homozigoto selvagem. Hoffmann et al. (56) demostraram que a alta produção desta interleucina se deve ao genótipo CC deste polimorfismo, alelo considerado polimórfico, resultado este também diferente do encontrado por nós.

IL-2R. Relatamos neste trabalho que a alta concentração do IL-2R

diferenciou o nosso grupo controle do grupo com CDT. Estudos mostraram que a concentração do IL-2R estava alterada no soro de pacientes com tumores sólidos malignos, e pacientes com melanoma (145, 146).

Em nossos casos o IL-2R elevado se correlacionou com pacientes sem metástase ao diagnóstico, uma característica de agressividade, resultado diferente dos estudos com pacientes de câncer colorretal e de mama, pois as concentrações elevadas do IL-2R no soro indicam progressão da doença e presença de metástases à distância. (52).

A literatura também demonstrou que pacientes com câncer gástrico e que possuíam metástase linfonodal possuíam altas concentrações de IL-2R (147), achado semelhante aos nossos dados.

IL-4. Existem poucos estudos referentes a IL-4 e IL-4R no câncer de tiroide e, na sua grande maioria, tratam-se de estudos que avaliam concentrações séricas. Não existem ainda trabalhos com os polimorfismos de IL-4 e IL-4R em CDT.

Em nosso estudo não foi possível fazer uma associação das concentrações séricas desta interleucina com a malignidade no CDT. A literatura tem demonstrado que células tiroidianas cancerígenas de todas as variantes histopatológicas produzem quantidades séricas consideráveis de IL-4 séricas, principalmente durante a transformação neoplásica. No entanto, não conseguimos reproduzir este resultado. (62, 63).

A literatura demonstrou concentrações elevadas desta IL em pacientes com câncer de mama em comparação com o grupo controle (casos benignos e indivíduos saudáveis) (148). Essa relação não parece se aplicar ao CDT, visto que não foi observada diferença significativa nas concentrações séricas principalmente entre casos e controles ou entre os subgrupos analisados.

Nossos resultados mostraram que as altas concentrações da IL-4 estavam presentes em pacientes sem metástase à distância. Corroborando nossos achados, estudos mostram que a IL-4 tem um efeito inibitório sobre o crescimento de melanomas humanos, carcinomas de células renais e células gástricas (59).

Quanto ao nosso dado em relação às altas concentrações da IL-4 em pacientes com tiroidite, este pode ser explicado pelo fato de que a IL-4 é uma citocina que pode estimular a proliferação de células B e induzir a diferenciação celular de T helper (149).

Autores sugerem que a função do alelo C para T do polimorfismo localizado na região promotora -590 do gene da IL-4 rs2243250 é conhecido por afetar a sua transcrição, sendo que uma "elevada expressão" do alelo T confere um aumento das concentrações séricas da IL-4 (150). Porém, na população estudada, não pudemos observar tal correlação.

IL-6. Nosso estudo evidenciou que uma das maiores concentrações da IL- 6 foi encontrada no grupo controle. De fato foi relatado que células foliculares normais da tiroide produzem altas concentrações de IL-6 séricas (126).

Observamos que pacientes com CDT demonstraram uma maior concentração de IL-6 comparado com o grupo benigno. Estudo com câncer de pulmão eles também evidenciaram que a IL-6 elevada diferenciou o grupo maligno

do benigno (151). Já em um estudo com câncer colorretal, esta citocina distingue controles de malignos (152), diferente do observado por nós.

Nossos resultados demonstraram que a IL-6 não se correlacionou com nenhum parâmetro clinico-patológico. No entanto, na literatura há fortes associações positivas entre as concentrações séricas da interleucina-6 e o tamanho do tumor, estágio, e/ou progressão da doença, em pacientes com câncer gástrico, câncer colorretal, sarcoma ósseo, câncer de mama, câncer hepatocelular, câncer de nasofaringe, câncer de células renais, câncer de pulmão e melanoma (72-79).

Não conseguimos demonstrar uma associação do snp com a concentração sérica, mas a literatura evidencia que a grande maioria dos snps desta IL se encontra na região promotora do gene, do qual foram demonstrados atuando na produção da proteína (86, 153).

IL-6R. Embora, sob condições patológicas, concentrações elevadas do IL- 6R tenham sido descritos, ainda há pouca compreensão sobre a regulação da liberação do IL-6R (154).

Em nossos casos as concentrações do IL-6R eram maiores em pacientes que apresentavam metástase ao diagnóstico e naqueles com doença ativa dos sem doença ativa, podendo supor uma relação com a progressão da doença, assim como a concentração da IL-6 e do IL-6R têm sido associadas com a progressão em pacientes com câncer de ovário, embora seu mecanismo não tenha sido demonstrado (155, 156), suas altas concentrações também têm sido associadas com o prognóstico clínico de mieloma múltiplo (157).

No presente estudo relatamos que há uma relação deste receptor com metástase e suas altas concentrações apareceram nos pacientes com lesões não capsuladas e em pacientes acima de 45 anos. A relação entre câncer e controle também não apareceu. Diferente do encontrado por nós, Yeh et al. (158) não conseguiram correlacionar as concentrações séricas do IL-6R, com idade, sexo, metástase e TNM em indivíduos com câncer colorretal, mas suas concentrações diferenciaram indivíduos com câncer dos indivíduos controle.

O receptor da interleucina-6 possui 4 SNPs associados com um risco aumentado de melanoma. Sendo o rs4845622 A/C, rs6684439 e o 4845618 no

íntron, e o rs2228145 [Asp358Ala] no éxon 9 (89). No entanto, não foi observadao um risco para a doença em nosso trabalho.

Para o snp do gene IL-6R rs2228145 pudemos observar que os pacientes que possuíam o genótipo CC deste polimorfismo tinham altas concentrações do IL- 6R, e este alelo foi evidenciado pela literatura como sendo o homozigoto polimórfico. Trabalhos mostraram que este snp realmente influencia em uma elevada concentração desta IL (159, 160), confirmando assim o que encontramos em CDT.

Os snps rs4845822 e rs6684439, também se correlacionaram com elevadas concentrações do IL-6R, na presença do alelo homozigoto polimórfico. No entanto, não há relatos na literatura sobre o envolvimento destes snps com as concentrações séricas, e isso pode ser explicado pelo fato de estarem em uma região intronica e esta região ainda estar em estudos.

IL-8. Tem sido sugerido que células tumorais produzem IL-8 como um fator que promove o crescimento do tumor, invasão de tecidos e disseminação metastática (91), nesse estudo com CDT não foi possível achar uma associação destes parâmetros com esta IL .

Este estudo mostrou que as altas concentrações da IL-8 em CDT encontravam-se nos pacientes sem doença ativa, comparado aos com doença ativa, diferente dos relatos da literatura, onde soro de pacientes com câncer pancreático revelou concentrações elevadas da IL-8, mostrando uma sobrevida relativamente inferior dos pacientes em comparação com aqueles que possuíam concentrações séricas baixas. Também mostraram que a taxa de crescimento de tumores foi significativamente correlacionada à concentração sérica da IL-8. Quanto maior a concentração da IL-8, mais rápido o crescimento tumoral, indicando um fenótipo mais agressivo e um pior prognóstico dos pacientes (97). Não conseguimos correlacionar oas concentrações da IL-8 com o tamanho do tumor em CDT.

Kobawala et al. (161) avaliaram a IL-8 em doenças tiroidianas, e obtiveram resultados significativamente mais elevados desta citocina em todos os pacientes em comparação com indivíduos saudáveis, semelhante ao nosso, observamos uma maior concentração em nódulos malignos do que nos nódulos benignos e controles.

O snp do gene IL-8 estudado por nós, não pode diferenciar os grupos (caso e controle) atraves da distribuição genotipica e nem se correlacionar com o risco para CDT, no entanto, evidenciamos que a frequencia alélica pode distinguir o grupo de caso dos controles. Hull et al. (97) relataram este mesmo snp no gene IL-8 na posição -251 A/T (rs4073), como associado ao aumento da produção da IL, e também a um risco aumentado de desenvolvimento de câncer pancreatico.

Em um estudo com câncer gástrico a freqüência deste genótipo foi maior nos casos do que nos controles, assim como a frequencia alelica (162). O mesmo foi encontrado em câncer de mama quanto ao genótipo (163). Como descrito acima somente à distribuição alélica foi significativa nos nossos casos com CDT semelhante aos estudos à cima.

Para câncer de pulmão, um estudo não conseguiu encontrar uma associação entre o polimorfismo IL8 -251 para sexo, histologia, e idade (164), o mesmo aconteceu para câncer oral (165), e assim também foi demonstrado em nosso estudo com CDT.

Diferente do encontrado por nós, um trabalho com carcinoma de nasofaringe sugere que este polimorfismo no gene IL-8 está associado ao aumento do risco deste câncer, especialmente no sexo masculino, bem como, com a evolução da doença (166), dado não reproduzido por nós.

Quanto à correlação deste snp com a concentração sérica, não foi possível achar uma significância em nossa casuística, no entanto, Hull et al. (98) relataram que este snp (rs4037), estava associado com o aumento da produção de IL-8 em seu trabalho.

IL-10. Concentrações circulantes de IL-10 foram investigadas em diferentes tipos de câncer e foram associados com o estágio da doença ou com um prognóstico ruim em sarcoma ósseo, linfoma de células B difuso, câncer gástrico, câncer de cólon, linfoma de Hodgkin, câncer hepatocelular, melanoma, câncer de células renal e câncer de pâncreas (101-104). Nossos resultados demonstraram não haver associação de qualquer interleucina, com o prognóstico.

Nosso estudo demonstrou que a maior concentração desta IL esta nos pacientes com doença ativa. Todaro et al. (63), mostraram que a produção da IL-10

por células malignas tiroidianas é fundamental para a sobrevivência e crescimento do tumor, se assemelhando ao encontrado por nós.

As altas concentrações de IL-10 diferenciaram os pacientes com nódulos malignos dos benignos em nossos dados, Yu et al.,(130) demonstraram que a concentração da IL-10 foi significativamente maior em pacientes com CPT associado com bócio, do que em pacientes com bócio sozinho, o que reforçou que esta IL se encontra principalmente em nódulos malignos, como o relatado também em nosso trabalho.

Altas concentrações da IL-10 em nosso estudo se correlacionaram com os pacientes que apresentavam multifocalidade, diferente do trabalho de Chan et al., com carcinoma hepatocelular (167).

Um estudo com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, demonstrou que não houve diferença significativa nas concentrações da IL-10, ao comparar pacientes e controles (168), semelhante ao proposto por nós.

Não houve correlação dos snps com as dosagens séricas, diferente do relatado pela literatura, sendo que alguns polimorfismos se correlacionam com a produção sérica da IL-10 (105).

IL-12. Quanto a Interleucina -12 há poucos relatos na literatura em CDT. Nossos resultados mostraram maior diferença da concentração da IL-12 em controles, que nos nódulos malignos, diferente do trabalho de Tao et al., (104) que observaram uma maior concentração nos pacientes com câncer de esôfago do que nos controle.

Em um trabalho com câncer de mama os autores não conseguiram usar as concentrações da IL-12 para diferenciar o grupo controle dos pacientes e nem as características de agressividade (169). Diferente do que foi encontrado por nós em CDT, que distinguimos o grupo controle do maligno, além dos pacientes sem doença ativa dos com doença ativa, e também encontramos uma diferença da concentração em pacientes com multifocalidade e com invasão.

Quanto aos snps estudados não obtivemos nenhuma significância quanto a diferença entre caso e controle e quanto ao risco para CDT, diferente de Wang et

al. (170) que mostraram que o genótipo de rs568408 foi associado com o risco de desenvolvimento para osteossarcoma.

No trabalho de Tao et al. (171) não foram encontradas associações significativas entre os diferentes genótipos do gene IL-12A rs568408, em relação a localização do tumor, tipo histopatológico e estádios em pacientes com câncer de esôfago, semelhante ao encontrado por nós em CDT.

No entanto, em um trabalho com carcinoma nasofaríngeo, este snp pode diferenciar casos com CDT de controles, além do seu genótipo alterado estar associado com o estádio da doença e com a presença de extensão do tumor (172), diferente do reproduzido por nosso grupo, onde não encontramos estas associações.

Este estudo não associou os snps estudados com as concentrações desta Interleucina. No entanto, Wang et al. (170) com demostrou que o snp rs3212227 foi significativamente associado com a diminuição da concentração sérica da IL-12p40 em pacientes com osteossarcoma.

De todos os trabalhos na literatura apenas dois se assemelham com que foi proposto por nós em CDT para avaliar as concentrações séricas. Em nosso trabalho avaliamos oito Interleucinas (IL-2, IL-2R, IL-4, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10 e IL-12), todas de forma unitária e através de kits de ELISA de alta sensibilidade, utilizando 200 pacientes com CDT, 60 benignos e 100 controles. Diferente do nosso estudo, demonstramos que estas Interleucinas diferenciaram os grupos analisados (controle, benigno, pacientes com e sem doença ativa e maligno), com exceção da IL-4, um trabalho de 2008 (127), utilizando a técnica de multiplex, avaliou 19 citocinas entre elas a IL-2, 4, 6, 8, 10 e a 12, mesmas ILs estudadas por nosso grupo. Eles utilizaram 23 pacientes com CT, 24 pacientes com nódulos benignos e 23 sujeitos saudáveis, um grupo amostral bem menor que o estudado por nós. Usando testes univariados estes autores, puderam demonstrar uma significância somente da IL-8 entre o grupo maligno e controle. Esta diferença com nossos dados pode ter ocorrido pelo nÚmero amostral estudado e também por estarmos utilizando uma técnica bem mais sensível e eficaz do que a utilizada por eles para a detecção das ILs.

O segundo trabalho, este mais recente Provatopoulou et al., (173) avaliaram as concentrações séricas das Interleucinas (IL-1B, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 10, IL-12 e IL-13) em 20 pacientes com CT, 38 pacientes com nódulos benignos e

50 controles saudáveis também por multiplex. Concentrações significativamente mais elevadas de IL-6 e IL-10, bem como, as concentrações significativamente mais baixas de IL-8 foram observadas no grupo com nódulos benignos e nódulos malignos, em comparação aos controles. Em nosso estudo encontramos resultados opostos, onde a IL-6 e a IL-10 não diferenciaram o grupo benigno e maligno dos controles, mas se assemelham na alta concentração no grupo maligno e a IL-8 teve uma maior concentração no grupo maligno do que no grupo controle, dado também diferente do proposto pelos autores. Este fato também pode ser explicado pela técnica mais sensível que utilizamos e pelo número de casos que avaliamos.

Sendo assim nosso estudo demostrou uma nova visão e novos dados ao utilizar uma metodologia e casuística diferente da já relatada pela literatura.

6. CONCLUSÃO

O presente estudo sugere que os dados das concentrações séricas da IL- 2, IL-2R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10, IL-12, mas não da IL-4, podem auxiliar no diagnóstico de malignidade e em parâmetros de agressividade, mas não podem ser usadas como marcadores de seguimento para pacientes com CDT.

Entre os polimorfismos estudados (IL-2-rs2069762, IL-6R-rs2228145 e rs4845622, IL-8-rs4073, e IL-12-rs568408), as distribuições genotípicas destes SNPs não puderam diferenciar o grupo com CDT e controle. No entanto, a distribuição alélica do rs2069762 da IL-2 e rs4073 da IL-8 diferenciaram os grupos estudados, embora nenhum dos polimorfismos estudados tenham se associado ao risco para CDT ou ás suas características clinico-patológico.

Além disso, os SNPs IL-2 rs2069762, IL-6R rs2228145, IL-6R rs4845622 e IL-6R rs6684439 se associaram a diferenças nas concentrações das respectivas interleucinas.