Universidade Federal Fluminense Instituto Biomédico
Curso de Graduação em Biomedicina Habilitação em Análises Clínicas
Lincoln Bastos Farias Junior
Morfologia do espermatozoide: uma revisão atualizada de
técnicas no diagnóstico de análises clínicas
Orientador: D’Angelo Carlo Magliano
Co-Orientadora: Paula Fontoura Coelho de Souza
Niterói 2018
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Morfologia do espermatozoide: uma revisão atualizada de técnicas no diagnóstico de análises clínicas
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de bacharel em Biomedicina. Habilitação: Análises Clínicas.
Orientador: Prof. Dr. D’Angelo Carlo Magliano
Co-orientadora: Dra. Paula Fontoura Coelho de Souza
Niterói 2018
Ficha catalográfica automática - SDC/BIB Gerada com informações fornecidas pelo autor
Bibliotecária responsável: Vanja Nadja Ribeiro Bastos - CRB7/2522
F224m Farias Junior, Lincoln Bastos
Morfologia do espermatozoide: uma revisão atualizada de técnicas no diagnóstico de análises clínicas : / Lincoln Bastos Farias Junior ; D?Angelo Carlo Magliano, orientador ; Paula Fontoura Coelho de Souza, coorientadora. Niterói, 2018. 42 f. : il.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Biomedicina)-Universidade Federal Fluminense, Instituto Biomédico, Niterói, 2018.
1. Infertilidade Masculina. 2. Morfologia. 3. Produção intelectual. I. Magliano, D?Angelo Carlo, orientador. II. Fontoura Coelho de Souza, Paula, coorientadora. III. Universidade Federal Fluminense. Instituto Biomédico. IV. Título.
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Morfologia do espermatozoide: uma revisão atualizada de técnicas no diagnóstico de análises clínicas
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de bacharel em Biomedicina. Habilitação: Análises Clínicas.
Apresentado em ____ de ___________________ de 2018.
BANCA EXAMINADORA
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Prof. Dr. D’Angelo Carlo Magliano – UFF (Titular – Presidente)
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Profa. Dra. Carla Ferreira Farias Lancetta– UFF (Titular)
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MSc. Mariana Duque de Mello – Fiocruz (Titular)
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AGRADECIMENTOS
A meus pais, Vera e Lincoln, e minha irmã, Ticiane, por estarem sempre presentes em todas as etapas da minha vida e me apoiarem em tudo. Sem vocês não teria chegado até aqui.
Aos amigos que estão comigo desde a época da escola, pela fidelidade, apoio, amor e compreensão durante toda a vida e principalmente durante esses anos de faculdade.
Aos amigos que conquistei na UFF, pelo companheirismo, compreensão, ajuda, paciência e momentos de diversão nesse misto de caos e paz que a UFF nos proporcionou nos últimos quatro anos.
A meu orientador, D’Angelo, por toda ajuda oferecida durante a graduação e por todo aprendizado na área profissional e pessoal. Você é um modelo a se seguir. A Paula e Mariana, por me ajudarem a encontrar minha área e por me aceitarem de braços abertos em seu laboratório. Obrigado por todos os ensinamentos que vou levar pra sempre.
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Pois nada vive na terra que seja tão vil que não tenha algum bem em especial para lhe doar; e nada é tão bom que não possa ser mal-empregado e, contrário a sua própria origem, chegar às raias do abuso. SHAKESPEARE, William. Romeu e Julieta
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RESUMO
A infertilidade é considerada uma doença pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Estima-se que essa doença afete em média 9% dos casais ao redor do mundo. Sendo o fator masculino responsável por 20-40% dos casos. Para o diagnóstico primário da infertilidade masculina é realizado o espermograma. Nele, são avaliados vários parâmetros macro e microscópicos, como motilidade, morfologia e concentração de espermatozoides, além de volume, pH e aspecto do sêmen. Por muito tempo a motilidade dos espermatozoides foi considerado o aspecto mais importante desse exame, porém diversos estudos mostram a importância da análise da morfologia espermática como indicador da saúde reprodutiva masculina. Essa análise tem evoluído muito com o tempo, tendo sido melhoradas não só as técnicas e equipamentos como o critério de avaliação de um espermatozoide normal e anormal. A morfologia é medida pela leitura em microscópio óptico, na objetiva de 100 vezes em óleo de imersão, de esfregaços de sêmen corados. Mesmo havendo uma tentativa de padronização pela OMS, ainda existe muita discrepância entre resultados encontrados por diferentes laboratórios. Isso acontece porque ainda existem muitas variantes nessa análise, como o critério utilizado para classificação, a coloração utilizada, os métodos de preparação da lâmina e o uso de sistemas automatizados. O objetivo desse trabalho é comparar os diferentes métodos de análise de morfologia espermática, além de relatar os avanços da técnica nos últimos dez anos. A avaliação da morfologia fornece dados relevantes sobre a fertilidade do paciente. Sendo assim, o questionamento dos métodos utilizados para esse exame é muito importante.
Palavras chave: morfologia, espermatozoide, infertilidade masculina, espermograma.
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ABSTRACT
Infertility is considered a disease by the World Health Organization (WHO). It is estimated that this disease affects on average 9% of the couples all around the world. Being the male factor responsible for 20-40% of the cases. The spermogram is made for the primary diagnosis of male infertility. In this exam, macroscopic and microscopic parameters, such as motility, morphology, sperm cell concentration, volume, pH and aspect of the semen, are analyzed. For a long time, the motility of the sperm cell was considered the most important aspect of this exam, however a lot of studies show the importance of the analyses of sperm cell morphology as an indicator of male reproductive health. This analysis has evolved a lot with time, not only the techniques and equipments have been improved but also the evaluation criteria of a normal and abnormal sperm cell. The morphology is measured by reading slides with stained smears of semen on the optic microscope, under a 1,000 magnification. Even though there is an attempt of standardization by the WHO, there are still a lot of disparities between the results found by different laboratories. This happens because there are still a lot of variants in this analysis, such as the criteria used for the classification, the methods used to prepare the slides, the staining method, and the use of computer-assisted morphology analyzers. The objective of this study is to compare the different methods of sperm morphology analysis and discuss the advances in the techniques in the last ten years. The evaluation of morphology provides relevant data about the patient’s fertility. Therefore the questioning of the methods used in this exam is really important.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Esquema da espermiogênese e do espermatozoide ... 18
Tabela 1 – Pontos de corte dos parâmetros seminais ... 21
Figura 2 – Esquema de um esfregaço de sêmen ... 22
Figura 3 – Espermatozoides com morfologia da cabeça normal ... 24
Figura 4 – Espermatozoides com globozoospermia ... 25
Figura 5 – Espermatozoides alterados e sem cabeça ... 26
Figura 6 – Espermatozoides com peça intermediaria normal e alterada ... 27
Figura 7 – Espermatozoides com cauda normal ... 28
9 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 10 2. OBJETIVOS ... 14 3. METODOLOGIA ... 15 4. DESENVOLVIMENTO ... 16 4.1 INFERTILIDADE MASCULINA ... 16 4.2 ESPERMATOGÊNESE E MATURAÇÃO ... 17 4.3 ESPERMOGRAMA ... 20 4.4 MORFOLOGIA ESPERMÁTICA ... 23 4.4.1 CABEÇA ... 23 4.4.2 PEÇA INTERMEDIÁRIA ... 26 4.4.3 CAUDA ... 27 4.5 COLORAÇÃO ... 29 4.6 CRITÉRIOS DE CLASSIFICAÇÃO ... 30 4.7 AUTOMAÇÃO ... 31 5. DISCUSSÃO ... 33 6. CONCLUSÃO ... 35 7. REFERÊNCIAS ... 36
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1. INTRODUÇÃO
A infertilidade é considerada uma doença do sistema genital pela Organização Mundial da Saúde (OMS) (DUPREE, 2016). Ela é definida pela não obtenção de uma gestação clínica após 12 meses ou mais de relações sexuais regulares sem uso de contraceptivos (LINDSAY; VITRIKAS, 2015). Estima-se que a prevalência mundial de casais com essa condição seja em média de 9% (BOIVIN et al., 2007). Porém, esse número pode chegar a 30% da população em alguns países em desenvolvimento (OMBELET et al., 2008). Quando um casal é considerado infértil esse diagnóstico pode ser causado pelo fator feminino, fator masculino ou uma combinação de ambos. O fator masculino é responsável por 20-40% dos diagnósticos de infertilidade (SOHRABVAND et al., 2015).
O espermatozoide é uma célula muito especializada que passa por diversas etapas para ser formada. A espermatogênese é um processo que leva de 6 a 9 semanas para ser finalizado e envolve diversas divisões meióticas e mitóticas (SCHLATT; EHMCKE, 2014). As espermatogônias, derivadas das células germinativas primordiais, passam por diferenciações celulares formando os espermatócitos primários que, por sua vez, passam por uma divisão meiótica reducional para formar os espermatócitos secundários. Essas células passam por uma divisão meiótica equacional formando, assim, as espermátides (CHOCU et al., 2012).As espermátides passam por um processo chamado espermiogênese, em que sofrerão diversas mudanças para, assim, formar os espermatozoides, constituídos de cauda, cabeça e peça intermediária (GADELLA; LUNA, 2014). Porém, esse processo pode não ser realizado perfeitamente, resultando em espermatozoides anormais.
O espermograma é a primeira ferramenta utilizada na investigação da produção de espermatozoides e do funcionamento adequado do eixo hipotálâmico-hipofisário masculino (FATHI NAJAFI et al., 2015). É um exame muito importante, porque nele são observados fatores que estão estritamente relacionados com o funcionamento dos órgãos genitais masculinos.
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Segundo a OMS, devem ser analisados, durante um espermograma, parâmetros macro e microscópicos. Os parâmetros macroscópicos são: tempo de liquefação, viscosidade, turgidez, cor, volume e pH. Os parâmetros microscópicos são: concentração, motilidade, presença de outros tipos celulares no sêmen, vitalidade e morfologia (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010).
A avaliação da morfologia espermática é muito importante não só para avaliação do funcionamento do testículo, mas também como indicador de estresse causado pelo meio. Essas alterações da morfologia dos espermatozoides são um reflexo de estresse negativo que atuam no corpo sem afetar a saúde como um todo (MENKVELD, R.; HOLLEBOOM; RHEMREV, 2011).
Para definir a morfologia de um espermatozoide normal foi analisada a morfologia dessas células encontradas na secreção cervical na parte superior do canal endocervical pós-coito (MENKVELD, R. et al., 1990). Com esse experimento em que foi retirando essa secreção de mulheres horas depois da relação sexual, foi possível observar que os espermatozoides nesse material tinham uma morfologia mais homogênea, ou seja, os espermatozoides eram mais parecidos entre si. O que sugere que antes mesmo da fecundação, ocorra uma seleção dos espermatozoides que serão capazes de fecundar um ovócito. Sendo assim, os espermatozoides com esse tipo de morfologia teriam mais chance de chegar à tuba uterina (FREDRICSSON; BJORK, 1977).
A tentativa de padronizar a análise da morfologia é grande, porém ainda existe uma disparidade entre os laboratórios. Um estudo realizado na França comparando os métodos das clínicas do país mostrou que fatores como preparação da amostra antes do esfregaço, método de coloração, número de espermatozoides contados, classificação, entre outros parâmetros, variam muito (GATIMEL; MANSOUX; et al., 2017). Os critérios de avaliação da morfologia têm sido modificados com o passar dos anos. Eles têm se tornado mais estritos devido ao avanço dos métodos de coloração e estudos na área. A OMS disponibiliza um manual de análise seminal desde 1980 para tentar diminuir as diferenças neste exame. O ponto de corte de normalidade na primeira edição desse manual era de 80,5% de espermatozoides morfologicamente normais no sêmen, muito diferente da quinta edição, publicada em 2010, em que o ponto de corte é de 4% (GATIMEL;
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MOREAU; et al., 2017). Estes dados da literatura corroboram para a ideia de que, nos últimos 30 anos, esta avaliação apresentou grande evolução.
Os principais critérios para avaliação morfológica dos espermatozoides são: o liberal, que era aceito pela OMS até 1999; e o estrito, que é o método recomendado pelo manual da OMS de 2010. O critério liberal considerava como anormais apenas espermatozoides com alterações claras e bem definidas, enquanto o critério estrito de Tygerberg desenvolvido por Menkveld e Kruger tem uma definição mais precisa da morfologia normal (GATIMEL; MOREAU; et al., 2017). De acordo com o manual da OMS de 2010, um espermatozoide normal deve ter a cabeça regularmente contornada e oval, a região acrossômica deve ocupar 40 a 70% da cabeça e não deve apresentar mais de dois vacúolos pequenos. A peça intermediária deve ser delgada, regular e aproximadamente do mesmo comprimento da cabeça. E a cauda deve ser uniforme e mais fina que a peça intermediária, sendo considerados anormais todos os espermatozoides que fujam dessa definição. Resíduos de citoplasma são considerados anormais apenas quando em excesso (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010).
Além destes métodos adotados pela OMS, outros critérios existem, como o critério modificado de David, muito utilizado na França e outros países francófonos; e o critério de Dusseldorf. No primeiro, a morfologia normal é a mesma do critério estrito, porém tamanhos e formas subnormais são considerados normais (AUGER, 2010). O segundo apresenta uma morfologia normal mais precisa do que o critério liberal, porém espermatozoides com região acrossômica ligeiramente reduzida são considerados normais (HOFMANN et al., 1995).
Outro fator que difere entre os laboratórios é a coloração utilizada. O manual da OMS de 2010 recomenda a utilização de Diff-quick (panotico rápido), Papanicolau ou Shorr. Além desses, existem outros kits que também são usados, como Testsimplets que é um método simples que utiliza uma lâmina pré-corada em que é adicionado o sêmen, não sendo necessária a adição de reagentes (NATALI et al., 2013); e Spermac, que era usada originalmente para análise seminal de animais domésticos, mas tem se mostrado uma boa escolha para o espermograma humano por ser metodologicamente simples e rápido e por marcar detalhes importantes do espermatozoide, como o acrossoma (CHAN et al., 1999).
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A automação é algo comum na análise de diversos fluidos corporais, portanto, a tentativa da implementação desse avanço na análise seminal não é surpresa. O uso de sistema computadorizado apresenta alta precisão e reprodutibilidade, mas pode apresentar erros, como classificar espermatozoides com cabeça extremamente grande ou pequena como normais ou ainda com dupla cabeça como artefatos de coloração, excluindo-os, assim, da contagem (GARRETT; BAKER, 1995). Além disso, a preparação da lâmina pode interferir com o resultado fornecido pela máquina e fatores como qualidade do esfregaço, uniformidade da coloração e iluminação igual em toda a lâmina podem alterar o resultado (LACQUET et al., 1996). Outro empecilho encontrado é o fato do sêmen humano apresentar muitas partículas, debris e restos celulares, o que pode confundir os aparelhos (MORTIMER; VAN DER HORST; MORTIMER, 2015).
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2. OBJETIVOS
Realizar uma revisão de literatura com o objetivo de comparar os diferentes métodos de coloração e análise de morfologia espermática, além de relatar os avanços da técnica nos últimos dez anos.
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3. METODOLOGIA
A presente monografia é um trabalho de revisão da literatura. Para sua elaboração foram utilizados livros e artigos científicos. Os últimos foram localizados através dos seguintes locais de busca:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
http://www.periodicos.capes.gov.br/portugues/index.jsp http://www.scielo.org/php/index.php
A busca dos artigos científicos foi realizada dentro do período de anos de publicação de 2007 a 2018, sendo utilizadas as seguintes palavras-chave: “sperm morfology”, “sperm analysis”, “infertility”, “male infertility”, “spermogram” “sperm morphology computer-assisted”.
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4. DESENVOLVIMENTO
4.1 Infertilidade Masculina
A infertilidade é diagnosticada pela não obtenção de gravidez clínica após um ano de relações sexuais regulares sem o uso de contraceptivos (MCLAREN, 2012). Ela é definida como uma doença do sistema genital pela OMS (ZEGERS-HOCHSCHILD et al., 2009).
Estima-se que, em média, 9% dos casais ao redor do mundo apresentem esse diagnóstico (BOIVIN et al., 2007). O fator masculino é responsável, sozinho ou combinado com o feminino, por 50% dos casos. A porcentagem de diagnósticos gerada apenas pelo fator masculino é de 20 a 30% dos casos e apenas pelo fator feminino é de 50% dos casos (AGARWAL et al., 2015). Existe ainda a infertilidade sem causa aparente, em que nem o fator feminino nem o masculino são identificados, porém o casal não consegue ter filhos. Esse quadro representa de 8 a 28% dos casos (GELBAYA et al., 2014).
O exame que avalia os parâmetros seminais é o espermograma. Parâmetros anormais são encontrados em 50% dos homens que realizam avaliação de infertilidade, sendo a alteração mais comum a oligoastenoteratozoospermia (HU et al., 2013). Oligoastenoteratozoospermia é a combinação de anormalidade em três parâmetros seminais: oligozooespermia, astenozooespermia e teratozooespermia (WEI et al., 2013). Oligozooespermia é a baixa concentração de espermatozoides no sêmen, astenozooespermia é a baixa porcentagem de espermatozoides móveis e teratozooespermia é a baixa porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais (JUNGWIRTH et al., 2012). A qualidade seminal pode ser afetada por várias causas, entre elas: estilo de vida, obesidade, diabetes, trauma na região do testículo, varicocele, infecções, criptorquidia, distúrbios hormonais, quimioterapia ou radioterapia, entre outros fatores (PIZZOL; BERTOLDO; FORESTA, 2014).
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4.2 Espermatogênese e Maturação
Os espermatozoides são formados nos túbulos seminíferos dos testículos por um processo chamado espermatogênese (SMITH; WALKER, 2014). Presentes no espaço intertubular, estão as células de Leydig, responsáveis pela secreção de testosterona, hormônio essencial para formação de espermatozoides (ILIADOU et al., 2015). Esse processo ocorre em uma temperatura de 2 a 3 ºC menor que a do corpo, que é temperatura nos testículos (THIJSSEN et al., 2014). Antes da puberdade esses túbulos não apresenta luz e são compostos por células de sustentação e células germinativas primordiais, as espermatogônias-tronco (MOORE, 2016). Na puberdade, essas células de sustentação se diferenciam nas células de Sertoli que são células somáticas muito importantes para espermatogênese, elas fornecem suporte físico e nutricional para células germinativas, além de secretar substâncias necessárias para o processo (ALVES et al., 2013). Nesse período de puberdade a espermatogênese se inicia, quando as espermatogônias-tronco, presentes desde o nascimento, começam a se diferenciar em espermatogônias, devido a estímulos hormonais (GALUPPO, 2015). As espermatogônias se dividem em dois grupos: espermatogônias A escuras, que funciona como reserva regenerativa, e espermatogônias A claras que funcionam como células progenitoras. As espermatogônias A claras podem dar origem a outras espermatogônias A claras, mas também podem dar origem a espermatogônias B, que por sua vez se diferenciam em espermatócitos primários (JUNQUEIRA, 2013). Os espermatócitos primários, células diploides passam, então, pela meiose I, que é reducional, dando origem aos espermatócitos secundários, células haploides. Essas células passam pela meiose II, que é equacional, resultando em espermátides haploides. (NETO et al., 2016).
Durante a espermiogênese, as espermátides sofrem modificações que resultam na formação de espermatozoides. Esse processo pode ser dividido em três etapas: do complexo de Golgi, do acrossoma e de maturação. Na etapa do complexo de Golgi, grânulos pró-acrossômicos se acumulam nessa organela e depois se fundem para formar um único grânulo acrossômico, no interior de uma vesícula chamada vesícula acrossômica. Ainda nessa fase, os centríolos migram para posição oposta da vesícula para formar um axonema (o eixo central do flagelo).
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Na etapa do acrossoma, a vesícula e o grânulo se posicionam na metade anterior do núcleo, formando o capuz acrossômico, que vai originar o acrossoma. Além disso, o flagelo é formado a partir dos centríolos, enquanto mitocôndrias se acumulam na porção proximal dessa estrutura, formando assim, a peça intermediária. O núcleo, nessa etapa, se torna mais condensado e alongado. Na etapa de maturação, grande parte do citoplasma da espermátide é desprendido. Esses corpos residuais são fagocitados pelas células de Sertoli. Após todas essas mudanças, são formados os espermatozoides maduros que são liberados no lúmen dos túbulos seminíferos e levados ao epidídimo (JUNQUEIRA, 2013). Um esquema do processo de espermiogênse e de um espermatozoide após esse processo está representado na Figura 1.
Figura 1. (A)Esquema do processo de espermiogênese. (B)Esquema de um
espermatozoide. Fonte: (JUNQUEIRA, 2013).
Os espermatozoides que chegam ao epidídimo não tem motilidade progressiva e não possuem potencial para fertilização natural. Eles passam por um período entre 1 a 2 semanas de maturação no epidídimo, que possui aproximadamente 6 a 7 metros em humanos (WU et al., 2015). Muitas alterações ocorrem durante essa maturação, um exemplo é o glicocálix presente na membrana espermática que é diferente em espermatozoides maduros e imaturos, a formação de um glicocálix maduro é relacionada com a capacidade de fertilização (FABREGA
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et al., 2012). Além disso, são adicionadas proteínas diversas à membrana espermática com diferentes funções. A adição de proteínas como lactoferrina, clusterina e fosforiletanolamina, junto com a apolipoproteína A1 e glicoproteínas do glicocálix, confere proteção contra aglutinação dos espermatozoides pela cabeça. Outra proteção conferida é a das enzimas como glutationa peroxidase e tiorreduxina, secretadas no fluido epididimal, que podem estar envolvidas na redução das espécies reativas de oxigênio presentes. O mecanismo que leva à obtenção de motilidade ainda não está bem elucidado (DACHEUX; DACHEUX, 2014).
Algumas condições podem afetar o processo da espermatogênese levando a alterações nos parâmetros seminais. O criptorquidismo é uma anomalia congênita que afeta recém-nascidos do sexo masculino, ela se caracteriza pela não migração dos testículos para o escroto, os mesmos permanecendo na cavidade abdominal, canal inguinal ou tecido subcutâneo. Essa condição pode ser resolvida espontaneamente em até um ano do nascimento, mas caso não seja, é recomendada a realização de uma cirurgia para correção. A criptorquidia pode afetar diretamente as células presentes nos túbulos semíferos, já que a temperatura dos testículos nesses casos é maior do que a ideal. A gravidade do dano causado depende de diversos fatores como posição do testículo, se a condição é uni ou bilateral, o tempo até a correção. Sendo assim, indivíduos que apresentaram esse problema na infância podem não apresentar nenhuma alteração seminal em alguns casos e, em outros, podem se tornar inférteis (AGOULNIK; HUANG; FERGUSON, 2012).
Outro problema relacionado ao aumento de temperatura na região dos testículos é a varicocele. Ela é caracterizada pela dilatação das veias do plexo pampiniforme, que drenam os testículos. Esse aumento de calor pode levar a várias alterações como diminuição de motilidade e aparecimento de padrões de estresse morfológicos que são: formas imaturas, células amorfas e formas cônicas. Essas alterações morfológicas não são específicas da varicocele. Além disso, há um aumento nas espécies reativas de oxigênio, podendo levar à fragmentação do DNA espermático. Existe tratamento para essa condição e foi observado que há uma melhora nos parâmetros seminais em alguns pacientes que o realizam (PASTUSZAK; WANG, 2015).
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Desequilíbrios hormonais também podem prejudicar a espermatogênese. A falta do hormônio testosterona leva à parada da meiose, resultando em poucas espermátides e o não acontecimento da espermiogênese. Além disso, ocorre a liberação de formas imaturas, devido ao prejuízo do sistema de adesão entre a espermátide e as células de Sertoli (SMITH; WALKER, 2014).
O diabetes mellitus (DM) é uma doença que pode afetar diversos sistemas do corpo, como o renal e cardiovascular. Entretanto, essa enfermidade também pode afetar o sistema genital (RAMA RAJU et al., 2012). Essa desordem metabólica caracterizada por uma hiperglicemia crônica apresenta dois tipos, o tipo 1 é uma doença autoimune que leva à destruição das células secretoras de insulina; e o tipo 2 é causado pela resistência à insulina. Os dois tipos de DM apresentam prejuízo para a qualidade seminal, principalmente pela formação de espécies reativas de oxigênio, que levam à fragmentação do DNA nuclear e mitocondrial dos espermatozoides. Os pacientes também podem apresentar diminuição da motilidade e modificações epigenéticas que podem ser passadas para os descendentes (DING et al., 2015).
O estilo de vida é um fator que pode ter relação com uma espermatogênese ineficaz. Evidências apontam que a obesidade e sedentarismo têm um efeito negativo nesse processo que só é agravado pela exposição à poluição atmosférica, porém, confirmar essas hipóteses é difícil, devido aos diversos fatores confundidores. Mesmo com essa dificuldade, a diminuição da qualidade seminal entre os homens jovens indica a necessidade de estudos que relacionem o estilo de vida com a espermatogênese (SHARPE, 2010).
4.3 Espermograma
O espermograma é o primeiro exame laboratorial realizado na investigação da infertilidade masculina. É disponibilizado pela OMS um manual que tem o objetivo de padronizar as técnicas utilizadas e os valores de referência. A primeira edição desse manual foi publicada em 1987 (VIEIRA, 2013). A edição mais atual desse manual é a quinta, que foi publicada em 2010. Os parâmetros que devem ser analisados no sêmen, de acordo com o manual, são: volume, cor, liquefação, pH e concentração, motilidade, vitalidade e morfologia dos espermatozoides (WORLD HEALTH
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ORGANIZATION., 2010). Os pontos de corte de todos os manuais da OMS estão ilustrados na tabela 1.
Tabela 1. Ponto de corte de cada parâmetro analisado no espermograma, de acordo com as
cinco edições dos manuais da OMS. Modificado de (ESTEVES, 2014).
Características Seminais OMS 1980 OMS 1987 OMS 1992 OMS 1999 OMS 2010 Volume (mL) -- ≥2 ≥2 ≥2 1,5 Concentração/mL (10⁶/mL) 20-200 ≥20 ≥20 ≥20 ≥15 Concentração Total (10⁶) -- ≥40 ≥40 ≥40 ≥39 Motilidade Total (%) ≥60 ≥50 ≥50 ≥50 ≥40 Motilidade Progressiva (%) ≥2 ≥25 ≥25 (Tipo a) ≥25 (Tipo a) ≥32 (Tipo a+b) Vitalidade (% de vivos) -- ≥50 ≥75 ≥75 ≥58 Morfologia (% de normais) 80,5 ≥50 ≥30 14 ≥4 Contagem de leucócitos <4,7 <1 <1 <1 <1
Para realização desse exame o paciente deve estar com abstinência ejaculatória de 2 a 7 dias (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010). Esse tempo é indicado, pois uma abstinência muito curta pode levar a diminuição do volume e concentração da amostra, por outro lado se esse tempo for muito longo, a motilidade dos espermatozoides pode ser afetada, já que o longo período de armazenamento pode levar ao aumento de espermatozoides mortos no ejaculado (MAYORGA-TORRES et al., 2015). O material deve ser coletado por masturbação, preferencialmente numa sala privada do laboratório em que o exame será realizado. Coletas domiciliares podem ser realizadas e nestes casos, o material deve ser
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analisado pelo laboratório em até 60 minutos após a ejaculação, além disso, o material deve ser mantido próximo ao corpo como uma tentativa de manter a temperatura fisiológica (ESTEVES; MIYAOKA; AGARWAL, 2011).
O exame começa com a avaliação da liquefação e do aspecto seminal. A liquefação normalmente ocorre 15 minutos após a ejaculação, mas pode levar ate 60 minutos. O sêmen liquefeito pode apresentar grânulos gelatinosos que não parecem ter importância clínica (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010).
Na análise do aspecto, deve-se observar a cor e opalescência do material. Uma amostra normal apresenta a cor branca acinzentada e se mostra opalescente. A presença de uma cor diferente ou translucidez da amostra devem ser relatadas no laudo do paciente (BJÖRNDAHL, 2010).
Em seguida, é medido o volume, sendo o ponto de corte mínimo de 1,5 mL. Mesmo não havendo ponto de corte máximo, volumes muito altos podem refletir inflamação das glândulas acessórias (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010). Também é medido o pH seminal cujo valor de referência mínimo é 7,2. O sêmen com pH inferior a 7,2 pode indicar uma obstrução da vesícula seminal (BANJOKO; ADESEOLU, 2013).
Para as análises microscópicas são retirados 10 µL para realização de um esfregaço que será posteriormente corado para leitura de morfologia, a figura 2 mostra um esquema de uma das formas de como deve ser realizado o esfregaço de sêmen.
Figura 2. Esquema representando uma das formas de como dever ser feito o esfregaço de
sêmen. Fonte: (BJÖRNDAHL, 2010).
Para análise da motilidade e concentração são retirados 10 µL para leitura em uma câmara de contagem. O ponto de corte atual para morfologia dos espermatozoides é o mínimo de 4% de formas normais ejaculado. O ponto de corte para concentração por mL é de 15 milhões de espermatozoides e para concentração
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total, ou seja, a concentração por mL multiplicada pelo volume, é de 39 milhões. A motilidade da amostra seminal é considerada normal se sua amostra apresentar 32% ou mais de espermatozoides com motilidade progressiva (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010).
4.4 Morfologia Espermática
A avaliação da morfologia dos espermatozoides é uma das etapas do espermograma de acordo com o manual da OMS de análise seminal (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010). Essa avaliação é muito relevante para a investigação de infertilidade. Estudos indicam que pacientes com menos de 4% de formas normais no ejaculado têm menores taxas de fecundação utilizando as técnicas de reprodução assistida (ESTEVES, 2014).
A morfologia dos espermatozoides está diretamente relacionada com sua função. A dimensão da cabeça, por exemplo, é um fator determinante para seu movimento progressivo (GILLIES et al., 2009). Para essa avaliação, é necessária a preparação de um esfregaço de sêmen em uma lâmina limpa que será posteriormente fixada de acordo com o método de coloração escolhido (BJÖRNDAHL, 2010). Com esse exame, foi possível concluir que as mudanças ocorridas durante a espermiogênese e maturação no epidídimo não são livres de erros, o que resulta em espermatozoides anormais (AUGER, 2010).
Erros na formação dos espermatozoides podem levar à teratozooespermia, ou seja, presença de uma porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais no sêmen menor do que a apresentada pelos valores de referência (COUTTON et al., 2015). Esses erros podem acontecer em diversas partes do espermatozoide, na cauda, na cabeça e na peça intermediária.
4.4.1 Cabeça
A cabeça do espermatozoide contém o seu núcleo com a cromatina muito condensada e o acrossoma que contém enzimas que serão necessárias para o processo de fecundação (GADELLA; LUNA, 2014). Sendo assim, deformidades na cabeça podem levar a impossibilidade de fertilização. Para ser considerada normal,
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a cabeça do espermatozoide deve ser lisa, com um contorno regular, de forma oval e a região acrossomica deve ocupar 40 a 70% de sua área (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010). A cabeça deve ter de 3 a 5 μm de comprimento e 2 a 3 μm de largura (MENKVELD, R. et al., 2011). A figura 3 mostra diferentes imagens que representam uma cabeça normal.
Figura 3. Fotomicrografia de espermatozoides corados que apresentam morfologia da
cabeça normal. Fonte: (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010).
Alterações do acrossoma podem levar à globozoospermia, uma condição que afeta aproximadamente 0,1% dos homens inférteis. Nela, os espermatozoides têm a cabeça arredondada (CHANSEL-DEBORDEAUX et al., 2015). Existem dois tipos de globozoospermia: no tipo I os espermatozoides não possuem o acrossoma, o que impede a penetração no ovócito II; no tipo II, os espermatozoides apresentam apenas resquícios do acrossoma (NERI et al., 2014). A figura 4 mostra espermatozoides de pacientes com essa condição.
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Figura 4. Fotomicrografia de um esfregaço de sêmen corado onde podem ser observados
espermatozoides com a cabeça arredonda de paciente com globozoospermia. Fonte: (CHANSEL-DEBORDEAUX et al., 2015).
A macrocefalia é caracterizada por um aumento anormal da cabeça. Essa condição é diretamente associada a anomalias cromossômicas (GUICHAOUA et al., 2009). Uma mutação que pode estar associada a esse problema é a do gene Aurkc. Pacientes com essa mutação podem apresentar espermatozoides com mais de uma cauda, além da macrocefalia. Esse gene é envolvido na regulação meiótica, sua mutação bloqueia a meiose levando à tetraploidia e ao aparecimento de múltiplas caudas (CHIANESE et al., 2015).
A presença de um vacúolo na cabeça dos espermatozoides ocorre naturalmente durante o processo de condensação do núcleo e, portanto, não deve ser considerada uma anormalidade (TANAKA et al., 2012).
Outra alteração que pode ocorrer na espermiogênese é a formação de espermatozoides sem cabeça. Essa é uma condição considerada rara em humanos e pode estar associada com erros na migração nuclear e posicionamento da cauda (SHA et al., 2017). A figura 5 mostra um esfregaço de sêmen em que podem ser observados espermatozoides sem cabeça, cabeças desacopladas e outras deformidades.
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Figura 5 Fotomicrografia de um esfregaço de sêmen corado onde podem ser observados
espermatozoides sem cabeça (seta preta), cabeças desacopladas (seta verde) e outras alterações (seta vermelha).Fonte: (SHA et al., 2017).
4.4.2 Peça Intermediária
Conectada a cabeça do espermatozoide está a peça intermediária. Durante a espermiogênese, as mitocôndrias desta célula migram para essa região. Estas mitocôndrias vão fornecer energia para o movimento do espermatozoide e desta forma uma alteração nesta região pode gerar problemas de motilidade do espermatozoide (GADELLA; LUNA, 2014). Para a peça intermediária ser considerada normal ela deve ser delgada, uniforme e ter aproximadamente o mesmo tamanho da cabeça (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010). A figura 6 mostra um espermatozoide com a peça intermediaria normal (a) e um espermatozoide com a peça intermediária alterada (b).
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Figura 6. Fotomicrografia de espermatozoides observados em microscópio óptico de alta
magnificação, (a) mostra um espermatozoide com peça intermediária normal e (b) com a peça alterada. Fonte: (UGAJIN et al., 2010).
Uma deformidade que pode afetar a peça intermediária é a displasia da bainha fibrosa (UGAJIN et al., 2010). Essa é uma condição genética e se apresenta pela hipertrofia da bainha fibrosa, que é um componente do axonema (DAVILA GARZA; PATRIZIO, 2013).
A extrusão citoplasmática é um acontecimento muito importante da espermiogênese, em que grande parte do citoplasma é desprendido e fagocitado pelas células de Sertoli. Podem ser formados corpos residuais, chamados gotas citoplasmáticas, na região proximal da peça intermediária, sendo um processo fisiológico e que não causa problemas ao espermatozoide. Além disso, estas gotas são removidas durante a preparação das lâminas quando as mesmas são secas ao ar antes de serem fixadas. Porém, podem também ser formados excessos residuais de citoplasma que, diferente das gotas, podem ocupar toda área da peça intermediária, apresentam grandes quantidades de enzimas citoplasmáticas e não são removidas pela secagem ao ar, permitindo assim sua visualização nas lâminas coradas. Essas enzimas produzem espécies reativas de oxigênio, causando estresse oxidativo no espermatozoide (RENGAN et al., 2012).
4.4.3 Cauda
A cauda do espermatozoide é composta por uma estrutura de nove diplomicrotúbulos em volta de um par central; por toda extensão dos microtúbulos estão presentes complexos proteicos, os braços de dineína internos e externos (COUTTON et al., 2015). Para a cauda do espermatozoide ser considerada normal
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ela deve ter um calibre uniforme, ser mais fina que a peça intermediária e ter o comprimento de 45 μm (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010). A figura 7 mostra espermatozoides com cauda normal.
Figura 7. Fotomicrografia de um esfregaços de sêmen com espermatozoides com cauda
normal e peça intermediária dobrada. Fonte: (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010)
Alterações na organização dos microtúbulos da cauda dos espermatozoides também podem levar a deformidades. A falta dos braços externos de dineína, do par central de microtúbulos ou dos diplomicrotúbulos pode levar à ausência, encurtamento, alterações na grossura ou enrolamento da cauda (MITCHELL et al., 2015). A figura 8 mostra um esfregaço contendo diversos espermatozoides com cauda enrolada.
Figura 8. Fotomicrografia de um esfregaço de sêmen corado onde podem ser observados
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4.5 Coloração
Para avaliação da morfologia dos espermatozoides é necessário que as lâminas com o esfregaço de sêmen sejam coradas. O manual da OMS recomenda o uso de três métodos de coloração: Papanicolau, Shorr e Panótico (ou diff-quick) (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010). Porém, diferentes métodos são utilizados dependendo do laboratório em que é realizada a análise. A coloração ideal seria a que causa o mínimo de alterações na morfologia e morfometria dos espermatozoides e marca claramente as diferentes partes da célula (MAREE et al., 2010). Todas as colorações apresentam vantagens e desvantagens, cabe ao laboratório decidir qual representa o melhor custo benefício.
A coloração de Papanicolau tem sido considerada o padrão ouro para esse exame, porém, é uma técnica que demanda muito tempo e incluiu o uso de 12 soluções químicas, o que leva à procura de um método mais simples e rápido. As colorações Panótico, Giemsa, Spermac e Spermblue são alternativas menos laboriosas para lâminas de morfologia espermática (VAN DER HORST; MAREE, 2009). Além destes métodos, outra opção mais rápida é a Testsimplets, que são lâminas pré-coradas onde é adicionada uma gota do sêmen. Nessa técnica, não é necessária a adição de nenhum reagente, porém como não exige a etapa de secagem ao ar, o número de espermatozoide com gotas citoplasmáticas nessa coloração é muito maior, o que pode levar ao uma superestimação dos espermatozoides anormais (NATALI et al., 2013). A coloração Panótico apresenta sua vantagem na rapidez e praticidade do método, porém pode levar ao inchaço do espermatozoide. A coloração Spermac cora bem o acrossoma humano, o que é muito importante, porém nesse método ocorre coloração de fundo. Na coloração Spermblue, esta coloração de fundo não ocorre, entretanto esta é uma coloração nova que necessita de mais estudos que comprovem sua eficácia (VAN DER HORST; MAREE, 2009).
Com o objetivo de validar o uso das técnicas de coloração, estudos são realizados comparando-as. Um estudo comparando Papanicolau, Shorr e Testsimplets mostrou que não houve diferença significativa entre os resultados obtidos com Papanicolau e Shorr, porém os resultados de Testsimplets
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apresentaram uma média de espermatozoides normais muito menor do que nas outras colorações (HENKEL et al., 2008). Também não foram encontradas diferenças significativas quando comparadas a técnica Papanicolau e Diff-quick. Entretanto, quando o Testsimplets foi comparado com Diff-quick, o resultado obtido foi o mesmo encontrado na comparação com as outras técnicas, o número de espermatozoides normais na contagem feita com Testsimplets foi muito menor (NATALI et al., 2013).
4.6 Critérios de Classificação
O critério de classificação é muito importante na avaliação da morfologia espermática, é necessário um critério que apresente uma definição clara de um espermatozoide normal (MENKVELD, ROELOF, 2013). O primeiro (1980) e segundo (1987) manuais de análise seminal da OMS recomendavam o critério livre para essa avaliação. Esse critério dizia que todo espermatozoide que não apresentasse uma anormalidade bem definida deveria ser considerado normal. Com essa classificação, o ponto de corte para esse parâmetro era de 80,5% de formas normais no sêmen ejaculado. Em 1982, a forma de um espermatozoide normal foi definida pela retirada dessas células do muco cervical, útero e tubas uterinas pós-coito, e observação das mesmas, comparando-as com as encontradas no sêmen ejaculado (GATIMEL; MOREAU; et al., 2017). Com essa definição, foi criado o critério estrito ou de Tygerberg, que define que o espermatozoide é normal se sua cabeça for oval, medindo de 3 a 5 μm de comprimento e 2 a 3 μm de largura, possuindo um acrossoma bem definido, ocupando 40 a 70% da cabeça. Não apresentar defeitos na peça, que deve ter aproximadamente 1,5 do comprimento da cabeça, ou na cauda, que deve ser uniforme, ligeiramente mais fina que a peça intermediária, não estar enrolada e ter aproximadamente 45 μm de comprimento. Os espermatozoides são classificados como normais ou com alteração na cabeça, peça ou cauda. Esse critério foi aceito parcialmente na terceira edição do manual da OMS, publicada em 1992, e se tornou o critério recomendado pela quarta (1999) e quinta (2010) edições do manual (MENKVELD, R. et al., 2011).
Além do critério livre e do estrito, outros critérios são utilizados para esse exame, como o critério de David, criado em 1975 e modificado por Jouannet e colaboradores em 1988, e o critério de Dusseldorf, criado em 1985 (BLANCHARD et
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al., 2011). O critério de Dusseldorf tem a definição de espermatozoide normal muito parecida com a do critério estrito, com a diferença que é considerado normal um espermatozoide com a área do acrossoma ligeiramente reduzida (HENKEL et al., 2008). O critério modificado de David também apresenta a mesma definição de espermatozoide normal, porém aceita como normais espermatozoides com alterações limítrofes. Além disso, neste critério, os espermatozoides são classificados de acordo com a anomalia que possuem, existindo sete tipos de alteração de cabeça (microcefalia, macrocefalia, cônica, múltipla, alongada, região acrossômica anormal e região pós-acrossômica anormal), três alterações de peça intermediária (presença de resíduo citoplasmático, peça fina e peça dobrada), e cinco alterações de cauda (ausência, curta, múltiplas, de calibre irregular e enrolada) (AUGER; JOUANNET; EUSTACHE, 2016).
4.7 Automação
A morfologia espermática tem uma grande relação com a capacidade de fertilização, porém sua avaliação pode ser influenciada por diversos fatores, como interpretação, sistema de classificação e experiência do técnico (WANG et al., 2014). Por isso, diversos sistemas automatizados foram desenvolvidos para tentar diminuir essa discrepância entre os laboratórios e tornar os resultados das análises mais precisos (BLANCHARD et al., 2011). Estes sistemas são muito utilizados na análise seminal de animais, porém o sêmen humano, diferente do animal, possui muitas partículas e debris celulares que podem confundir os aparelhos (MORTIMER et al., 2015).
Um desses sistemas é o Sperm Quality Analyzer (SQA). Ele funciona com o princípio do processamento do sinal óptico em combinação com algoritmos de computador (AGARWAL; SHARMA, 2007). As principais vantagens desse método são a retirada da subjetividade na análise e baixo custo, e a principal desvantagem é que a peça intermediária e a cauda não são avaliadas (SINGH et al., 2011).
Outro sistema automatizado é o Integrated Visual Optical System (IVOS) que utiliza um parâmetro baseado no critério estrito para classificar as células entre normais, anormais ou subnormais. Ele também apresenta as vantagens de rapidez e
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objetividade, entretanto, o aparelho tem sua atenção voltada para cabeça do espermatozoide, não incluindo análise da cauda (BLANCHARD et al., 2011).
O uso de métodos automatizados é valido. Porém, é importante a avaliação de uma lâmina corada para quantificação e determinação dos defeitos encontrados, o que auxilia o médico na decisão pela técnica de reprodução assistida adequada ou tratamento (SINGH et al., 2011).
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5. DISCUSSÃO
A infertilidade tem se tornado uma das doenças mais prevalentes em jovens adultos (FARHI; BEN-HAROUSH, 2011). Por isso é importante que existam exames confiáveis e com bom prognóstico para essa doença. O espermograma é o exame mais utilizado para determinar o potencial de fertilidade masculina. Com ele, é possível obter informações importantes sobre o funcionamento hormonal, dos túbulos seminíferos, epidídimo, glândulas anexas e dos próprios espermatozoides (ESTEVES, 2014). Os espermatozoides dos mamíferos são células altamente especializadas que passam por diversas alterações morfológicas durante a espermiogênese (AUGER, 2010). A morfologia do espermatozoide é um ótimo biomarcador para sua função e ajuda na escolha do tratamento do paciente (FRANKEN, 2015).
Mesmo existindo estudos que indicam que a porcentagem de espermatozoides normais no ejaculado tem relação com o sucesso ou fracasso de fertilizações in vivo ou in vitro (ABU HASSAN ABU et al., 2012), esse parâmetro apresenta um grande problema, que é a falta de padronização. O manual da OMS de análise seminal recomenda o uso do critério estrito de Tygerberg e de alguns métodos de coloração (WORLD HEALTH ORGANIZATION., 2010), porém esse manual não é seguido por todos os laboratórios, sendo utilizados outros critérios e colorações (GATIMEL; MOREAU; et al., 2017). Colorações diferentes podem causar alterações diferentes nos espermatozoides, sendo assim, o mesmo paciente pode apresentar resultados discordantes com o uso de outras colorações (VAN DER HORST; MAREE, 2009). Além disso, os critérios utilizados apresentam certas diferenças na classificação do que é um espermatozoide anormal, podendo um espermatozoide ser considerado normal por um técnico que utiliza um critério e anormal por um que utilize outro (GATIMEL; MOREAU; et al., 2017). Essa falta de padronização leva à diferença de resultados entre os laboratórios (FILIMBERTI et al., 2013), o que impede a comparação de dados para uma confirmação mais específica da relevância desse parâmetro (MENKVELD, R. et al., 2011). Além disso, por ser uma avaliação subjetiva, podem existir diferenças na análise de técnicos de um mesmo laboratório (WANG et al., 2014), mesmo com o uso de sistemas automatizados, o problema persiste, pois o processo continua dependendo da
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operação de um técnico, resultando nas mesmas disparidades da análise manual (MENKVELD, R. et al., 2011).
Para confirmação da validade da avaliação da morfologia espermática é necessário que sejam realizados mais estudos comparando os diferentes métodos de coloração e classificação, selecionando os mais adequados para o teste. Além disso, os laboratórios que realizam esse exame devem ter um bom controle de qualidade interno e externo, e um treinamento adequado para seus técnicos.
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6. CONCLUSÃO
Atualmente, a procura por exames que ajudem na investigação da infertilidade tem crescido muito. O espermograma é o principal exame utilizado para detecção do funcionamento dos espermatozoides. Todos os parâmetros analisados nesse exame apresentam sua importância para um diagnóstico adequado. A morfologia espermática é um parâmetro que, por muito tempo, foi negligenciado, apesar de ser um bom biomarcador para função espermática. No entanto, a falta de padronização entre os laboratórios, o uso de diferentes colorações e critérios de classificação utilizados, gera discrepância nos resultados. Estudos na área de morfologia espermática são importantes para definição dos melhores métodos a serem utilizados, para que assim, essa análise possa se tornar mais confiável.
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