ANA PAULA GIMENES
Desenvolvimento de um modelo humanizado de
camundongo com traço falciforme e expressão de
hemoglobina fetal persistente
CAMPINAS 2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Médicas
ANA PAULA GIMENES
Desenvolvimento de um modelo humanizado de
camundongo com traço falciforme e expressão de
hemoglobina fetal persistente
Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP para obtenção de título de Mestra em Ciências na área de concentração Clínica Médica.
ORIENTAÇÃO: Prof. Dr. MARCUS ALEXANDRE FINZI CORAT
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR ANA PAULA GIMENES, E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCUS ALEXANDRE FINZI CORAT.
_______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2014
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Gimenes, Ana Paula,
G429d GimDesenvolvimento de um modelo humanizado de camundongo com traço falciforme e expressão de hemoglobina fetal persistente / Ana Paula Gimenes. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
GimOrientador: Marcus Alexandre Finzi Corat.
GimDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Gim1. Modelos animais de doenças. 2. Hemoglobina fetal. 3. Traço falciforme. I. Corat, Marcus Alexandre Finzi. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Development of a humanized mouse model of sickle cell traid with
persistent fetal hemoglobin expression
Palavras-chave em inglês:
Disease models, Animal Fetal hemoglobin Sickle cell traid
Área de concentração: Clínica Médica Titulação: Mestra em Clínica Médica Banca examinadora:
Marcus Alexandre Finzi Corat [Orientador] Luiz Augusto Corrêa Passos
Valdemar Antonio Paffaro Junior
Data de defesa: 23-01-2014
Programa de Pós-Graduação: Clínica Médica
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vi
Dedicatória Ao meu querido avô que tão cedo partiu e Tanta saudade deixou.
AGRADECIMENTOS Agradeço ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Marcus Alexandre Finzi Corat, por sempre me apoiar, e acreditar de forma efetiva no meu potencial para o desenvolvimento desse trabalho, pela sua paciência, e, principalmente pelos ensinamentos que me proporcionou.
Ao programa de pós-graduação em Clínica Médica da Faculdade de Medicina da Unicamp.
Ao Centro Multidisciplinar para Investigação biológica na Área da Ciência de Animais de Laboratório da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB/UNICAMP) pela permissão, apoio técnico e infra-estrutura indispensáveis ao andamento da pesquisa.
Ao Centro de Hematologia e Hematoterapia da Unicamp Hemocentro, mais especificamente o laboratório Dr. Fernando Costa pelo apoio e colaboração para o andamento do trabalho.
Ao Laboratório de Bioquímica do Instituto de Biologia da Unicamp, mais especificamente ao Prof. Dr. Marcelo Lancellotte pelo apoio efetivo na realização de algumas técnicas.
Ao laboratório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Unicamp pelo apoio na realização de diferentes técnicas, mais especificamente à Susan Jorge e Denise.
Às meninas do Hemocentro-Unicamp Carla, Carol, Dani e Dulcinéia, sempre prontas a ajudar. Colaboraram muito na execução desse trabalho.
viii
Aos meus queridos amigos e companheiros do dia a dia do Laboratório de Controle Genético:
Viviane, amiga sempre presente e disposta em ajudar. Sem nosso companheirismo, esses 2 anos seriam muito mais difíceis.
Andréia, pela amizade e também pela firmeza nas orientações em momentos de indecisões.
Luiz Augusto, querido chefinho, e acima de tudo amigo, pelo apoio, compreensão e paciência todo esse tempo.
Rodrigo, pela amizade e também por estar sempre pronto a ajudar.
Jéssica, por toda ajuda no apoio técnico com os animais.
Aos colegas do CEMIB:
Dr. Rovilson Gilioli, nosso diretor, pelo apoio e incentivo na realização deste trabalho.
Dra. Delma Pegolo Alvez e Edivana Aparecida Vespa, pelo apoio e ajuda com os animais.
Robson Pontes, pelo apoio na Quarentena.
Aos amigos da área de Gnotobiologia, Marina, Alex e Rodnei, no apoio e dedicação com os animais.
Ao pessoal do laboratório de Controle Sanitário: Daniele, Sílvio, Josélia, Clarice e Lenira, pela atenção e paciência.
Aos colegas da Manutenção: Armando, Zé, Babu e Roberto, pela ajuda.
Aos colegas da secretaria: Sérgio, Márcio, Marisa, e todos que passaram por lá.
A todos os colegas e amigos do CEMIB que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
Também a todos os que passaram pelo CEMIB e que deixaram saudades.
Ao meu querido e amado esposo que sempre me apoiou no meu interesse pelos estudos e por toda a compreensão e cuidados.
Aos meus familiares e amigos, pela compreensão nos desaparecimento nos encontros familiares.
À minha fiel escudeira e companheira Geralda que ficou literalmente do meu lado durante todas as horas de estudo.
À todos os animais utilizados neste trabalho, os quais desempenharam o papel fundamental, para os quais devo meu maior respeito.
Às pessoas que sofrem da doença de Anemia Falciforme, para quem todos os esforços na pesquisa são dedicados.
Agradeço imensamente a Deus pela minha vida.
x
“Um sonho que se sonha só é só um sonho que se sonha só, um sonho que se sonha junto é realidade.” (Raul Seixas)
SUMÁRIO __________________________________________________________________ PÁG. RESUMO... xviii ABSTRACT... xx 1- INTRODUÇÃO... 22 1.1 Histórico... 23 1.2- Estrutura da Hemoglobina... 24 1.3- A doença falciforme... 25 1.4- Manifestações Clínicas... 26 1.4.1- A vaso Oclusão... 27
1.5- Hemoglobina Fetal x anemia falciforme... 28
1.5.1- Interações da HbS com HbFetal... 29
1.6- Tratamento... 29
1.7- Modelo animal... 31
1.7.1- Importância modelo animal... 32
1.7.2- Modelo para doença Anemia Falciforme... 33
1.8- Justificativa ... 36
2- OBJETIVOS... 39
2.1- Objetivos gerais... 40
xii 3- MATERIAL E MÉTODOS... 41 3.1- Desenho experimental... 42 3.2- Animais utilizados... 42 3.3- Acasalamentos programados... 42 3.4- Análise molecular... 44
3.4.1- Extração de DNA genômico... 44
3.4.2- Reação em cadeia da polimeraze – PCR... 45
3.5- Diferenciação da presença da cadeia β e βS humana... 46
3.5.1- PCR em tempo real... 46
3.5.2- Eletroforese de Hemoglobina... 48
3.5.3- HPLC de Cadeias globínicas... 49
3.5.4- Teste de Solubilidade... 50
3.6- Fisiopatologia... 51
3.6.1- Análise Histológica dos órgãos... 51
3.6.2- Curva de dissociação de Oxigênio... 52
3.6.3- Hemograma... 52
3.7- Análises estatísticas... 53
4- RESULTADOS... 54
4.1 Acasalamentos... 55
4.2 Genotipagem por PCR... 55
4.4- Padronização d teste de solubilidade... 58
4.5- Eletroforese de Hemoglobina... 59
4.6- Caracterização do modelo por HPLC... 60
4.7- Análises bioquímicas... 61
4.7.1- Perfil sanguíneo... 61
4.7.2- Teste funcional da Hemoglobina... 62
4.8- Esfregaço sanguíneo... 63 4.9- Morfologia do Baço... 64 4.10- Histologia de órgãos... 65 5- DISCUSSÃO... 68 6- CONCLUÕES... 74 7- PERSPECTIVAS FUTURAS... 76 8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 78 9- ANEXOS... 87 Anexo 1- Soluções ... 88 Anexo 2- Aprovação Comissão de Ética Animal da Unicamp. 89
xiv
LISTAS DE ABREVEATURAS
AF Anemia Falciforme
Berk-SCM Linhagem transgênica de camundongo para doença de anemia falciforme “sickle cell mouse strain”
B-HPFH Linhagem transgênica de camundongo com a mutação brasileira para persistência hereditária de hemoglobina fetal B-HPFH/SCM Modelo de camundongo resultante das linhagens
Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA-HBBs) e B-HPFH EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNTPs Desoxirribonucleotídeos Fosfatados g/dL Gramas por decilitro
HbA Hemoglobina A
HbF Hemoglobina Fetal
HbS Hemoglobina S
hCG Human corionic Gonadotrofin
HE Hematoxilina e eosina
HPLC High performance liquid cromatograph
HU Hidroxiuréia
MgCl2 Cloreto de magnésio
NaCl Cloreto de sódio
PBS Salina tamponada fosfatada
PCR Reação em cadeia da polimerase
PHHF Persistência hereditária hemoglobina fetal
pH Potencial hidrogênico
PI Ponto isoelétrico
PK Proteinase K
PÓ Pressão de oxigênio
PB Pares de base
RBC “Red blood cell”
RPM Rotações por minutos
SNPs “Single nucleotide polimorfism"
Tg Transgênese
TP10x Tampão 10 vezes
Μl Microlitro
♀ Fêmea
xvi
LISTAS DE TABELAS __________________________________________________________________
PAG. Tabela 1- Sequência e Tamanho dos Fragmentos dos Primers
utilizados nas Reações de PCR... 45
Tabela 2- Primers e sondas utilizados nas reações de SNPs... 48
Tabela 3 - Tempos Utilizados no Processamento Histológico... 51
Tabela 4 - Análise dos Parâmetros RBC, Hb do Hemograma e Porcentagem das Hemoglobinas... 62
LISTAS DE FIGURAS __________________________________________________________________
PAG.
Figura 1- Estrutura da Hemoglobina... 24
Figura 2 - Fisiopatologia da Anemia Falciforme... 26
Figura 3 - Estratégia de Acasalamento... 43
Figura 4 - Esquema da Reação em Tempo Real para Análise de SNPs... 47
Figura 5 - Esfregaço Sanguíneo... 53
Figura 6 - Eletroforese de PCR em Agarose... 56
Figura 7 - Resultado da Técnica de SNPs... 57
Figura 8 - Resultados de Testes de Solubilidade... 58
Figura 9 - Eletroforese de Hemoglobina em Acetato de Celulose... 59
Figura 10 - Cromatografia Líquida de Alta Performance... 61
Figura 11 - Curvas de Desoxigenação e Oxigenação da Hemoglobina 63 Figura 12 - Esfregaço sanguíneo - Morfologia e Características dos Eritrócitos... 64
Figura 13 - Gráfico representativo do peso relativo do Baço/Corpo(g) 65 Figura 14 - Histologia de Órgãos... 67
xviii
RESUMO __________________________________________________________________
RESUMO
__________________________________________________________________
A anemia falciforme é uma doença hereditária que acomete milhões de pessoas Promove destruição crônica das células vermelhas (eritrócitos) do sangue, causando anemia, vaso-oclusão, isquemia e consequentes sintomas deintensa dor, susceptibilidade à infecções e, em alguns casos, a morte precoce.
Nas últimas décadas, estudos têm mostrado que o aumento dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) inibe o processo de falcização das Hemácias melhorando os sintomas de pacientes com anemia falciforme. Neste estudo, produzimos um modelo animal humanizado com traço falciforme e expressão concomitante de HbF persistente, associando as características genéticas dos camundongos transgênicos B-HPFH195 e Berk-SCM . O primeiro é animal transgênico com persistência de hemoglobina fetal, onde aprodução de HbF continua após o nascimento. A segunda linhagem corresponde ao modelo para doença falciforme, Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA - HBBS ) 41Paz / J ( Berk - SCM) e mimetiza a doença humana em sua forma mais grave. Nestes animais a reprodução está comprometida, as fêmeas não levam a gestação ao termino e a maioria dos neonatos morrem horas depois do nascimento. Isto ocorre principalmente devido ao fato de que a (HbF) presente no transgene humano destes animais ser trocada pela HbS enquanto o feto ainda esta em gestação. O novo modelo desenvolvido foi analisado clinicamente e histologicamente para a caracterização e apresentou em sua constituição sanguínea hemoglobinas totalmente humanizadas com cadeias β, βs e γ persistente porém, ainda mantendo alterações histopatológicas semelhantes aos modelos da doença falciforme. Este novo animal representa um modelo potencial para uso em testes de drogas no aumento de HbF onde os resultados podem ser relevantes para o estudo e tratamento de hemoglobinopatias, bem como para compreender o comportamento das mutações hereditárias para a expressão persistente da cadeia de globina γ.
xx
ABSTRACT __________________________________________________________________
xxi
ABSTRACT __________________________________________________________________ Sickle cell disease is a hereditary disease that affects millions of people promotes chronic destruction of red blood cells (erythrocytes), causing anemia, vascular occlusion, ischemia, pain, and susceptibility to infections and in some instances, death premature. In recent decades, studies have shown that increased HbF levels play an important role in improving the symptoms of patients with sickle cell anemia. In this study, we produced and characterized a humanized animal model with sickle cell trait and concomitant expression of persistent HbF, using the genetic characteristics of transgenic mice B - HPFH195 with Berk–SCM. This model is a transgenic mice model with hereditary persistence of HbF. The second strain constitutes a mouse with sickle cell disease, Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA - HBBs ) 41Paz /J ( Berk - SCM ), an animal model used to study SCD with human hemoglobin S ( HbS ) in its blood. The Berkeley mouse mimics the human disease in severe form, which compromises in its, females do not lead to pregnancy termination and most newborns die hours after birth. This occurs mainly due to the fact that fetal hemoglobin (HbF), present in the human transgene of these animals,is exchanged to HbS while the fetus still in gestation. The new model produced was analyzed clinically and histologically for proper characterization and presents in its constitution humanized blood, hemoglobin chains with β, γ βs and persistent, but still maintains histopathological changes similar to models of sickle cell disease. This model may be a potential model for use in drug in testing increase HbF. And results may be relevant for the study and treatment of hemoglobinopathies as well as for understanding the behavior of hereditary mutations for the persistent expression of the γ globin chain.
22 Introdução
INTRODUÇÃO __________________________________________________________________
1.1- Histórico
A anemia Falciforme é uma doença genética e hereditária que acomete milhões de pessoas no mundo todo. De origem desconhecida acredita-se que se desenvolveu devido a uma mutação genética, onde a hemoglobina S – HbS passou a ser produzida ao invés da hemoglobina A, possibilitando uma “melhora” adaptativa do indivíduo protegendo-o contra a Malária que devastava a África há bilhões de anos. Em virtude da imigração, tráfico de escravos e dos movimentos populacionais em busca de melhores condições de vida, houve uma ampla distribuição do traço falciforme assumindo um caráter mundial.
A incidência de determinadas hemoglobinopatias variam de acordo com a colonização de determinados grupos raciais (Naoum, 2000). Segundo estimativa da OMS, 5% da população mundial é portadora do gene para hemoglobinopatias e a cada ano, nascem aproximadamente 300.000 com essa doença (World Health Organization, 2005). O Brasil apresenta uma população com alto grau de miscigenação, e grande porcentagem de descendentes africanos, tornando alta a incidência de doenças hematológicas, incluindo a Anemia Falciforme (Naoum 2000; Galiza Neto & Pitombeira, 2003). Estima-se que 2 a 8%, da população afro descendente possuem o traço falciforme, ou seja, 1 em cada 500 negros brasileiros nasce acometido da doença (Murao, et all, 2007). Segundo dados do Ministério da Saúde, as prevalências referentes à doença falciforme em diferentes regiões brasileiras permitem estimar a existência de mais de 2 milhões de portadores do gene da HbS, e, destes, mais de 8 mil são afetados com a forma homozigótica (HbS) (Rodrigues et al, 2010).
24 Introdução 1.2- Estrutura básica da Hemoglobina
A hemoglobina é uma molécula de proteína constituída por quatro cadeias polipeptídicas, duas alfa e duas beta, que são unidas por ligações não covalentes. Cada uma contém um grupo heme que é responsável pelo transporte de oxigênio (figura 1).
Figura 1 Estrutura da Hemoglobina
(figura retirada do site www.ecogenesis.com.ar)
As cadeias são constituídas por uma série de aminoácidos, sendo 146 na cadeia beta e 141 na alfa. Levam uma variação no nome de acordo com o estágio de desenvolvimento intra-uterino. As cadeias zeta e épsilon são
sintetizadas no início da vida intra-uterina; as alfa e gama, na vida fetal e as alfa, beta na vida pós fetal.
Alterações na estrutura química da Hemoglobina são capazes de modificar seu comportamento funcional. Por sua vez, afetam a captação, o transporte e a liberação de oxigênio para os tecidos do organismo (Souza, 2006).
1.3 A doença Falciforme
O distúrbio genético nesta doença constitui basicamente em uma mutação no códon 6 do gene da β-globina, no cromossomo 11 envolvendo a substituição do nucleotídeo Adenina pela Tinina (GAT→GTG), o que resulta na substituição do Ácido Glutaminic por Valina, produzindo hemoglobina S (HbS) Shiu 2000; Serjeant & Serjeant, 2001).
A mudança da Hemoglobina A pela S promove uma anormalidade crônica nas células vermelhas do sangue, responsáveis pelo transporte do oxigênio no organismo, sendo que a hemoglobina S não exerce de forma satisfatória a função de oxigenar o sangue. As hemácias sofrem polimerização sobre a desoxigenação, distorcendo os eritrócitos numa variedade de formas falcizadas modificando a estrutura do eritrócito (Pászty et. al.,1997).
Com esta mudança estrutural da molécula de hemoglobina, o sangue não consegue circular adequadamente na microcirculação, resultando em obstrução do vaso sanguíneo e hemólise, causando anemia, isquemia, infarto e progressivamente disfunção dos órgãos. Como consequência, sintomas variados aparecem: como intensas dores músculo esqueléticas, torácicas e abdominal, susceptibilidade às infecções severas nos pulmões, trato respiratório, sistema nervoso central, ossos e articulações, podendo levar à morte precoce do indivíduo. O aparecimento dos sintomas geralmente se dá na metade do primeiro ano de vida. Na figura 2 podemos de uma forma ilustrativa, observar um esquema da doença.
26 Introdução Figura 2- Fisiopatologia da anemia falciforme. (figura retirada do site www.sistemanervoso.com)
1.4- Manifestações Clínicas
Uma das características dessa doença é a sua variabilidade clínica. Enquanto alguns pacientes têm um quadro clínico grave, outros apresentam uma evolução mais benigna, e em alguns casos quase assintomática. Devido à falcização das hemácias, pacientes apresentam hemólise crônica que se manifesta por palidez, icterícia, aumenta o número de reticulócitos, apresentam episódios de vasoclusão que determinam fibrose e atrofia de baço. A destruição do baço é responsável pela suscetibilidade aumentada à infecções graves (Costa
et. al., 2001). Provoca também alterações cardíacas, oculares, ulcerações de
membro inferiores, lesões nos ossos e articulações, alterações renais, infecção, anticoncepção, episódios de priapismos e dores decorrentes da estagnação de
sangue nos capilares, causando vaso oclusão por coseguinte hipóxia tissular e de órgãos circundantes resultando em dores pulsáteis. (Gaston, et al., 1986).
Além das infecções severas serem a maior causa de mortalidade e morbidade dos pacientes com anemia falciforme, alguns problemas fisiológicos são comuns: a anemia hemolítica, crises álgicas, síndrome torácica aguda, manifestações cardiovasculares e neurológicas, manifestações renais, sequestro esplênico, fígado e vesícula biliar, são formas associadas à manifestação da doença.
1.4.1 A vaso oclusão
A vaso oclusão é a mais importantes fisiopatologia que acomete os doentes de anemia falciforme e a maior causa de morbidade, o que resulta em crises dolorosas agudas, danos teciduais crônico e até falência dos órgãos. Ocorrem principalmente em órgãos em que o fluxo sanguíneo é lento, a tensão de oxigênio é baixa e também onde o fluxo sanguíneo é limitado (Labie & Elion, 1999). Esse evento é um processo complexo que envolve não apenas a polimerização da Hb S desoxigenada, mas também interações entre os eritrócitos falciformes, o endotélio vascular, plaquetas, leucócitos e proteínas plasmáticas (Silveira et. al., 2002).
O processo vaso oclusivo tem início a partir da ativação do endotélio vascular e adesão das células falcizadas, e infecções que levam a secreção de citocinas inflamatórias. Estes fatores de ativação podem induzir a expressão de moléculas de adesão endotelial e promover o recrutamento dos leucócitos principalmente os neutrófilos que tendem a se aderir no endotélio e a eles os eritrócitos falciformes, devido à presença de citocinas inflamatórias. Pacientes com anemia falciforme (AF) apresentam níveis plasmáticos elevados de TNF-α citocinas inflamatórias responsáveis em relação a pacientes normais, favorecendo assim a vaso oclusão ( Lanaro et. al., 2006). Além das hemácias os neutrófilos parecem ter um papel importante na vaso oclusão ( Costa et. al., 2001). A contagem de neutrófilos no sangue periférico tem relação direta com a gravidade
28 Introdução
da doença e a leucocitóse é associada com o alto relato de mortalidade (Platt et.
al.,1994 e Okpala et. al., 2002). Os mecanismos de vaso oclusão também podem
ser observados na figura 2.
1.5- Hemoglobina fetal x anemia falciforme
A hemoglobina fetal (HbF) inibi funcionalmente o processo de falcização de hemácias em pacientes com anemia falciforme, isso torna-se um fator moderador das consequências clínicas da doença (Bianch et. al., 2007). A HbF é composta por duas cadeias alfa e duas cadeias gamaglobínicas, cuja interação com outros elementos da hemácia confere a essa hemoglobina maior afinidade pelo oxigênio que a hemoglobina A. (Ramalho 1986).
Devido as propriedades inibidoras da HbF, recém nascidos apresentam uma anemia falciforme relativamente benigna por estar presente e em altos níveis no nascimento (Ryan et. al., 1997). A HbF representa de 70 a 90% do total de hemoglobina no nascimento de um ser humano, sendo gradualmente substituída pela HbS até os 6 meses de idade em pacientes de anemia falciforme (Wu et. al., 2006). Em adulto a concentração máxima de HbF está entre 1 a 2%. (Zago et. al., 2004). Contudo, o aumento dos níveis de HbF por intervenções farmacológicas vem ganhando cada vez mais interesse.
1.5.1- Interações da HbS com Hb Fetal
A síntese de HbF continua mesmo após o sexto mês de vida em quadros de persistência hereditária de HbF (PHHF), com valores cujas elevações são variáveis: de 5 a 30% entre os heterozigotos e de 90 a 100% entre os homozigotos. As duas principais causas da PHHF devem-se à diferentes deleções que atingem os dois genes gama (glicina e alanina) do cromossomo 11, e às mutações que não são por deleção.
Na interação da Hb S/PHHF as células-F tem baixas concentrações de Hb S, fato que inibe a polimerização da Hb S, bem como o desencadeamento da falcização dos eritrócitos (Mousinho-Ribeiro et al., 2008). Assim, admite-se que a concentração de Hb fetal no eritrócito seja particularmente útil na proteção contra o processo de falcização por não interagir com a Hb S quando esta se insolubiliza Naoum, 2000. Testes realizados "in vitro" em soluções desoxigenadas contendo HbA e HbS mostraram que ocorre a insolubilização e precipitação somente da HbS, e, ao se redissolver o precipitado, se detecta ambas as hemoglobinas A e S. O mesmo experimento realizado em soluções contendo HbF e HbS mostrou que a HbF não se precipita como a HbS, e este fato sugere que as globinas gama exercem um efeito inibidor sobre a polimerização das globinas beta S, evitando a falcização. (Naoum, 2000)
1.6- Tratamento
Apesar de não haver tratamento específico para as doenças falciformes, medidas preventivas para minimizar as consequências da anemia crônica, crises de falcização e susceptibilidade às infecções podem ser tomadas. Estas medidas incluem: boa alimentação, profilaxia, diagnóstico e tratamento precoces de infecções, manutenção de boa hidratação e evitar condições adversas. Além disso, acompanhamento ambulatorial do paciente e família.
As perspectivas para pacientes com anemia falciforme têm melhorado consideravelmente nas últimas duas décadas. Esforços estão sendo feitos no sentido de amenizar os sintomas em pacientes com desordens da hemoglobina buscando tratamentos como transplantes de medula, óssea terapia transfusional, terapia gênica. Para tanto, múltiplas drogas estão sendo testadas.
Muitos são os fatores que podem atuar influenciando nos aspectos clínicos fisiopatológicos e moleculares na gravidade dos quadros clínicos da
30 Introdução
anemia falciforme, um deles é a presença de níveis elevados de Hemoglobina fetal (Costa et. al., 2001).
A gonadotrofina coriônica humana (hCG) foi administrada em pacientes com anemia falciforme HbS por Beutler em 1969. Assim como testes com progesterona que também foram realizados em 1969, por Beutler, e por Ceulaer e cols em 1982, todos obtiveram discretas elevações no nível de Hb Fetal.
Ainda assim, estudos na busca de medicamentos que elevassem os níveis de HbF continuaram com De Simone e cols em 1982, que utilizaram 5-azacitina (Aza-C), arabinosídeo (Ara-C); a vinblatina, por Veith e cols em 1985 e por Mileram e cols em 1990, que também mostraram estímulos na expressão da HbF. Apesar da eficácia dessas drogas no aumento da síntese da HbF, elas apresentam efeitos citotóxicos. Além disso, produzem efeitos carcinogênicos, fazendo com que os estudos continuassem em busca de medicamentos que pudessem ter um uso terapêutico na anemia falciforme.
Um dos mais considerados fármacos tem sido a Hidroxiuréia (HU), que vem sendo utilizada desde 1960. Capaz de aumentar concentração HbF sem se incorporar ao DNA como as outras drogas citadas acima. Os primeiros resultados dos efeitos positivos da HU, caracterizados pela elevação dos níveis de HbF em pacientes com anemia falciforme surgiu em 1984. Ela é um inibidor de síntese de DNA, com muitos efeitos benéficos, onde ocorre um aumento do nível de HbF, e também um efeito anti-inflamatório, que acontece com a inibição da produção de neutrófilos, que costuma aumentar a capacidade de deformação das células falciformes. Estudos com Hidroxiuréia mostraram induzir a hemoglobina fetal in
vivo em animais e em pacientes (Steimberg, 1999). Acredita-se que esses
mecanismos agem em conjunto para diminuir as crises relacionadas com vaso oclusões (Charache et. al., 1995).
Mesmo com a não compreensão total dos mecanismos de ação da HU, progressos consideráveis vem acontecendo no desenvolvimento de fármacos que induzem a HbF em pacientes com anemia falciforme (Fathallah e Atweh, 2006). A
HbF é considerada o mais potente modificador da doença e tem sido o modulador genético mais amplamente estudado na AF (Gualandro, 2009). A HU é capaz de aumentar essa concentração e melhorar o curso clínico da doença. Finalmente, a busca de outras drogas que elevam os níveis de HbF, como são os casos da eritropoietina (Epo) e butiratos, ainda apresentam grandes diversidades de resultados, fatos que tornam suas eficácias ainda inconclusivas (Naoum, 2000).
Ainda sim, todos esses estudos contribuíram muito para o entendimento da importância da interação da HbF com HbS nos mecanismos que elevassem os níveis de HbF pós-natal. Uma vez que nem todas intervenções, tratamentos e pesquisas podem ser possíveis em pacientes, os modelos animais vem sendo os grandes responsáveis pelo avanço do conhecimento da sintomatologia, dos mecanismos e de possíveis tratamento relacionados à AF.
1.7- Modelo animal
A busca pelo conhecimento científico pelo homem vem desde a Grécia antiga assim como a utilização de animais em experimentação. Entretanto, no século XX, consolidou-se a verdadeira importância da sua utilização, permitindo avanços no conhecimento dos processos vitais, aperfeiçoamento dos métodos de prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças tanto na medicina humana como na veterinária (Frajblat et. al., 2006).
Um dos reflexos da consolidação do uso de animais em pesquisa foi o questionamento sobre a questão do sofrimento animal. Contudo, em 1959 W. M. S. Russel e R. L. Burch em seu livro "The Principles of Humane Experimental
Technique" criaram o conceito dos "3Rs". Que significam: replacement, reduction e refinement, isto é, substituição, redução e refinamento, no que se refere aos
animais utilizados em experimentação científica. "Os avanços biomédicos dependem da pesquisa com animais, e não usá-los poderia ser não ético, pois isso privaria humanos e animais dos benefícios da pesquisa" (AMA, 1992:6).
32 Introdução 1.7.1- Importância dos modelos animais
Modelos animais como camundongos têm fisiologias similares à dos humanos e oferece muitas vantagens positivas com relação a sua utilização na pesquisa: são de fácil manipulação, manutenção, reprodução, controle (ambiental, genético e sanitário), reprodutibilidade experimental, sem contar a constatação de uma infinidade de conhecimentos gerados a partir deles nos últimos anos de pesquisa biomédica. (Dias, 2010).
O advento da tecnologia da engenharia genética nos trouxe poderosas ferramentas de pesquisa para a descoberta e o desenvolvimento de novos tratamentos para várias doenças. Possibilidades no campo da experimentação animal se desenvolveram nos últimos anos com o processo de produção de um animal transgênico pela introdução de DNA exógeno no seu genoma, de tal forma que suas células tornam-se geneticamente alteradas. Podendo assim, criar modelos específicos que mimetizam determinadas doenças humanas, evitando o uso desnecessário de um número elevado de animais, ou ainda, a não reprodutibilidade dos resultados esperados.
São inúmeros os benefícios do uso de animais transgênicos para o bem-estar do ser humano, à medida que auxiliam pesquisas que geram maior conhecimento de biologia humana. O Prêmio Nobel de medicina de 2007 foi dado à Oliver Smith, Martin Evans e Mario Capecchi que criaram a técnica de produzir camundongos knockout:. O primeiro camundongo knockout foi anunciado em 1989: um modelo animal para a doença de Lesh-Nyham. Doença neurológica rara, que entre outros sintomas, gera crises de auto-flagelação nas crianças afetadas. Desde então, essa técnica foi incorporada cada vez mais em grupos de pesquisa no mundo inteiro, que veem criando cada vez mais animais mutantes que auxiliem nas pesquisas. Hoje, existem camundongos knockouts que servem de modelos para estudos de inúmeras doenças como câncer, diabetes e doenças neurodegenerativas. Estes modelos são utilizados para se entender melhor as
doenças e também , desenvolver e testar novas terapias. Além disso, um esforço internacional em andamento pretende mudar cada um dos 20 mil genes do genoma do camundongo, criando uma coleção de animais knockout, cada um com um gene diferente alterado (Pereira, 2008).
Esses animais nos ajudarão a entender melhor a biologia do camundongo e consequentemente a do ser humano. Modelos que reproduzem doenças humanas proporcionam recursos inestimáveis para entender males e para a evolução do conhecimento biomédico, bem como, proporciona veículos experimentais para testes farmacológicos terapêuticos e abrem portas para terapias inéditas, como celulares e genéticas (Paw et. al., 2006). As pesquisas em torno da doença de anemia falciforme vêm aumentando consideravelmente, e com isso a necessidade de modelos animais que expressem a doença com maior fidelidade para o entendimento do mecanismo e tratamento a nível sistêmico no organismo.
1.7.2- Modelos para a doença de Anemia Falciforme
Um animal que modela doenças humanas fornece inestimáveis recursos para compreensão dos mecanismos moleculares que envolvem a patologia. Por causa da complexidade das doenças, modelos animais são necessários para proporcionar uma estratégia terapêutica para estudos experimentais, testes farmacológicos e terapias gênicas (Fabry, et. al., 2001). O camundongo vem servindo a esse propósito por várias décadas. Mais recentemente, tecnologias transgênicas possibilitaram o desenvolvimento de modelos cada vez mais complexos para os estudos da doença de anemia falciforme. Camundongos geneticamente modificados têm sido produzidos com diferentes alterações genéticas, a fim de entender a patologia dessa doença mais detalhadamente, possibilitando o seu uso na pesquisa deste mal (Nagel et. al., and Fabry,et. al., 2001 e Beuzard, et. al., 2008).
34 Introdução
O primeiro passo nesse sentido foi dado em 1990, quando Ryan et. al. e Greavs et. al. produziram um camundongo que sintetizava 50% de hemoglobina falcizada humana e 50 % de hemoglobina murina. Entretanto estes animais imitaram o traço falciforme, mas não a severidade da doença.
Outros animais foram produzidos para estudos de hemoglobinopatias que causam anemia severa. Dentre eles, animais que apresentavam diferentes variantes da hemoglobina S como no caso do “SAD mice” produzido por Trudel et.
al.,em 1994, que apresentou apenas 19% de hemoglobina humana e uma alta
taxa de mortalidade dos neonatos antes do desmame. Muitos modelos foram criados e forneceram importantes informações sobre a doença. Entretanto, todos ainda com grande porcentagem de hemoglobina endógena murina e nenhum deles modelou a anemia hemolítica severa, observada em humanos com anemia falciforme.
Dois dos maiores desafios para obter modelos animais para anemia falciforme que fossem anêmicos severos e viáveis foram: trocar toda a expressão de hemoglobina murina para hemoglobina HbS humana, e, evitar a morte fetal devido a uma alta expressão de HbS no feto. Para eliminar o primeiro desses problemas, foram gerados animais com deleção da cadeia α e β murina adulta.
Animais geneticamente modificados foram construídos por meio de tecnologia de silenciamento gênico através da produção de camundongos “knockouts”. Foram então produzidos animais “knockout” para os genes endógenos da cadeia α ou β da hemoglobina murina. Além disso, foram inseridas por adição as cadeias α e βs da hemoglobina humana, possibilitando o surgimento de um modelo animal “HbS-only”, onde, o seu organismo produziria apenas hemoglobina-S humana. Foram produzidos dois modelos em 1997, um por Ryan
et . al. e outro por Pászty et. al. ambos tinham no genoma a eliminação dos genes
das cadeias α e β da hemoglobina murina e a expressão das cadeias α e β humanas.
O primeiro modelo, chamado de modelo de Birminghan, um modelo a expressão de globinas humanas comandadas por um LCR (locus control region) modificado que, permitia a expressão de hemoglobina γ até um mês após o nascimento. Posteriormente, em 1990, Ryan et. al. mostraram a precoce troca da expressão de hemoglobina fetal para hemoglobina β em transgênicos com até 5 dias antes do nascimento. Infelizmente o gene humano para hemoglobina γ (hemoglobina fetal) é reconhecido como gene embrionário pelos fatores de transcrição murinos, permitindo sua expressão apenas até o meio do desenvolvimento no útero. Com isso, estes autores construíram esta mutação que permitiu um modelo de camundongo com boa natalidade e anemia severa, com taxa de hemoglobina ao redor de 5-6g/dL (Ryan et. al., 1997).
O segundo modelo, que foi o desenvolvido em Berkeley, denominado
Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA-HBBs) 41Paz/J, corresponde a um modelo
alterado geneticamente que expressa apenas globina α e βs humana (Pászty, et
al.,1997). Este animal tem um quadro bastante severo de anemia com taxa de
hemoglobina ao redor de 2,5g/dL.
Ambos veem sendo muito utilizados para estudos de várias afecções provocadas pela falcização das hemácias. As várias perturbações hematológicas e fisiológicas destes modelos animais estão paralelamente próximas ao paciente de anemia falciforme.
A nova geração de estudos descrevem os efeitos do aumento do nível de hemoglobina fetal em animais transgênicos para anemia falciforme. Evidências de que a elevação de HbF em pacientes com anemia falciforme seja um fator moderador das consequências clínicas do processo da falcização, fizeram com que muitos pesquisadores se interessassem em conhecer as situações fisiológicas e terapêuticas capazes de elevarem a síntese de HbF. Outro modelo foi feito por Blouin et. al. em 2000, que expressava diferentes níveis de A γ globina com o modelo SAD e, com isso observaram um melhoria no tempo de vida, na patologia e no perfil hematológico dos animais.
36 Introdução
Outros modelos com expressão exclusiva de hemoglobina humana e três níveis de HbF mostraram serem ainda mais fiéis à doença falciforme que os primeiros modelos criados. Nos modelos feito por Paszty et. al. 1997 e Yang et. al.
1995 que expressavam uma integração mini LCRα2 e mini LCRβs, usado para criar
o modelo de S+Antilles, a alta taxa de letalidade desse camundongos foi resgatada através de acasalamento com camundongos transgênicos expressando diferentes construções de y-globina com aumento da HbF pós-natal.
Os recursos apresentados por esses modelos aproximaram ainda mais a doença de anemia falciforme humana de bons modelos para estudos de drogas anti-afoiçamento e avaliar protocolos de terapias gênicas.
1.8- Justificativa
O modelo de Berkeley (Berk-SCM) hoje é um dos modelos mais utilizados para os estudos da doença falciforme, e também é a base do modelo que foi desenvolvido neste trabalho.
Apesar de sua importância, estes animais apresentam baixíssimo índice de sobrevivência dos homozigotos βs. Muitos desses camundongos ficam arroxeados e morrem poucas horas após seu nascimento, aparentemente por uma hipóxia devido a um desconforto respiratório, e a concentração baixa da γ-globina (Pászty,et. al.1997). A hemoglobina fetal nestes amimais está presente apenas nos primeiros 15 dias de gestação (por volta de 6 dias antes do nascimento), trazendo ainda mais complicações para os neonatos homozigotos dessa linhagem (Ryan, et. al.,1997). Diferentemente dos seres humanos que apresentam de 70 a 90% de HbF do total de hemoglobina no nascimento sendo gradualmente substituída pela HbS até os 6 meses de idade (Ryan et. al. 1997). O baixo nível de hemoglobina fetal no útero leva ao afoiçamento intrauterino e morte fetal, diminuindo a natalidade dos animais doentes (Ye et. al.,2008).
Este modelo para anemia falciforme é mantido atualmente no Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica - CEMIB, da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, em rotinas de acasalamento entre macho homozigoto knockout para cadeia α e β murina e a fêmea em heterozigose para cadeia β murina, pois a fêmea homozigota, por motivos fisiológicos, não leva a gestação adiante. Uma vez que todos possuem um transgene com expressão de cadeias γ, α e β humano, esse acasalamento produz animais com hemoglobina híbrida (α-humano/β-camundongo), exigindo genotipagem de todos os animais nascidos para identificação dos animais com anemia falciforme (homozigoze).
Esta linhagem apresenta uma anemia extremamente severa, debilitando fisiologicamente os animais homozigotos afetados e, de certa forma, em menor gravidade os heterozigotos, produzindo diversas manifestações clínicas, inclusive, problemas reprodutivos. Devido às dificuldades de reprodução destes animais, poucos são os biotérios no mundo que aceitaram este desafio e conseguiram prosseguir com a criação. O CEMIB, desde 2005, quando os primeiros casais desta linhagem foram importados, vem arduamente trabalhando na sua manutenção e produção, aprimorando as condições no ambiente físico e nutricional. A manutenção dessa colônia em nosso grupo tem se dado por meio de uma gama de procedimentos como: dieta especial, administração de vitaminas e suplementos em grãos, e a manutenção em isoladores com trocas constantes de ar. Dados gerados pelo grupo mostram que o fortalecimento das fêmeas heterozigotas aumenta o número de nascimento de animais homozigotos com condições de sobrevivência. (dados não publicados). Ainda assim, as dificuldades de se manter a colônia são grandes, e o número de animais homozigotos sobreviventes para serem usados na manutenção da linhagem e nas pesquisas de anemia falciforme é muito baixo, tornando assim inconstante o atendimento à demanda da comunidade científica. Esforços têm sido feitos para aumentar o número de neonatos homozigotos sobreviventes desta linhagem. Mantendo uma comunicação com criadores e especialistas mundiais, todos são unânimes na demonstração do quanto difícil é mantê-la produtiva.
38 Introdução
Tendo em vista o fortalecimento da fêmea geradora dos animais falciformes, assim como a necessidade de modelos animais para estudos de persistência hereditária de hemoglobina fetal (PHHF) em anemia falciforme, decidimos neste trabalho unir características de duas linhagens transgênicas que carregam as informações genéticas necessárias para isso: a Berk-SCM, já citada acima e muito utilizada para estudos de anemia falciforme, e também a B-HPFH195 um modelo transgênico com PHHF.
O modelo B-HPFH195 (Brazilian HPFH195) é um camundongo transgênico, também mantido no CEMIB, que apresenta expressão de HbF mesmo após nascimento. Este animal foi desenvolvido por pesquisadores do nosso grupo na Unicamp, conduzido pelo Dr. Fernando Costa, onde foi inserida uma construção de um transgene humano com uma mutação diagnosticada em um paciente do Hemocentro-UNICAMP com PHHF [Aγ-195(C>G)]. Este transgene possibilitou a expressão da cadeia β da hemoglobina humana e a persistência da produção de hemoglobina fetal após o nascimento nestes animais, devido a uma mutação na região do LCR deste gene (Cunha et. al., 2009). A PHHF consiste em um grupo heterogêneo de alterações hereditárias, sem manifestações clínicas significativas, onde ocorrem falhas na mudança perinatal normal de hemoglobina fetal para hemoglobina adulta, resultando altos níveis de HbF durante a vida adulta.
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2- OBJETIVOS __________________________________________________________________
40 Objetivos 2.1- Objetivos gerais
Produzir um modelo animal com o perfil genético falciforme da linhagem de camundongo Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA-HBBs) 41Paz/J (Berk-SCM) porém com persistência de expressão de hemoglobina fetal após o nascimento.
2.2- Objetivos específicos
1- Promover acasalamentos programados entre representantes das duas linhagens Berk-SCM e Brazilian HPFH195 a fim de se obter um animal que terá em sua constituição sanguínea somente hemoglobinas humanas com cadeias β, βs e γ persistente.
2- Estabelecer a metodologia mais eficaz para genotipagem do novo modelo. 3- Analisar e comparar a morfologia e a fisiologia do animal obtido com o animal Berk-SCM.
3- MATERIAL E MÉTODOS __________________________________________________________________
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Material e Métodos 3.1 Desenho experimental
Foram acasalados duas linhagens de camundongos transgênicos com objetivo de inserir o transgene B-HPFH com expressão persistente de HbF (Tg2) em um fundo genético de camundongo Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA-HBBs) - Berk-SCM (Tg1) animal que expressa a doença anemia falciforme. Em seguida, foi analisada sua característica patológica.
3.2- Animais utilizados
Machos homozigotos da linhagem Berk-SCM (camundongo falciforme) e fêmeas da linhagem Brazilian HPFH195 que contém globinas humanas β normal e fetal persistente após nascimento mantidas no CEMIB/UNICAMP, assim como sua prole como está exemplificado no esquema de estratégia de acasalamento abaixo (Figura 3).
3.3- Acasalamentos programados
Todos os animais deste estudo foram fornecidos pelo CEMIB / UNICAMP com o status SPF, o protocolo para a nossa pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal, CEEA - IB - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) (Número da autorização: 2277-1/2010). Esta coincide com os Princípios Éticos para Pesquisa Animal, instituído pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (CONCEA), de acordo com a legislação brasileira n ° 11.794.
A geração F1 dos camundongos machos homozigotos Berk/SCM com anemia falciforme, da linhagem Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA-HBBs) cruzados com fêmeas transgênicas Brazilian HPFH195, foram retro-acasaladas com machos homozigotos Berk/SCM e o produto avaliado quanto à presença dos
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alelos knockout da cadeia α e β murinas, assim como, a presença dos respectivos transgênes, como indicado na figura 3.
Subsequente, as fêmeas com perfil genético selecionado retro-acasalaram com machos homozigotos Berk/SCM, de forma programada e repetida, até se obter o fenótipo pretendido: uma fêmea com o perfil genético do animal Berk/SCM e com o transgene de persistência de HbF (HPFH), o qual denominamos B-HPFH/SCM como segue no esquema abaixo:
-Figura 3: Estratégia de acasalamento - ♀- fêmea; ♂- macho; α- cadeia alfa; β- cadeia beta; γ-cadeia gama; Tg1- presença da transgênese βs; Tg2- presença da transgênese HPFH; m- cadeia murina; h- cadeia humana; p- persistência; (+/-) heterozigose dos alelos knockout e cadeia murina endógena; (-/-) homozigose dos alelos knockout.
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Material e Métodos 3.4- Análise molecular
A prole F1 e produtos de retro-acasalamentos foram monitorados pela técnica de PCR que possibilitou fazermos a checagem dos knockouts murinos e também a checagem da presença da transgenese humana auxiliando no direcionamento dos acasalamentos. Os primers para as análises foram obtidos no site (www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide) e estão listados na tabela 1. O DNA para análise foi obtido pelo protocolo de extração de DNA por precipitação alcoólica com algumas modificações (Montoliu, L et AL 1995). O DNA purificado foi submetido à técnica de PCR. Os produtos de PCR obtidos foram avaliados por eletroforese em gel de agarose e revelados com brometo de etídio de acordo com Montoliu, et al 1995 e SAMBROOK, J. et al 1989).
3.4.1 Extração de DNA genômico
A extração foi realizada de acordo com o protocolo de extração de alto peso molecular Cauda/Orelha de camundongo (Montoliu et al, 1995) modificado.
Às amostras de tecido (cerca de 1 cm da cauda ou orelha do animal) foram adicionados 500 µl de tail buffer juntamente com 5 µl de Proteinase K à uma concentração de 20mg/ml, logo após foram incubadas em 56ºC “over night”. No dia seguinte foram deixadas em agitação lenta por 5 minutos para uma digestão mais uniforme do tecido, então foram adicionados 167 µl de NaCl saturado e mais uma vez deixamos em agitação lenta por 5 minutos, em seguida as amostras passaram por centrifugação a 13000rpms, em temperatura ambiente por 10 min. Foram transferidos 500 µl do sobrenadante para outro tubo contendo 500ul de isopropanol. Os tubos foram agitados para precipitação do DNA (medusa). A seguir prosseguimos com duas lavagens em etanol 70%, uma com 500 µl e outra com 300 ml sendo as duas seguidas por centrifugação a 5 minutos a 13000 RPM. Todo etanol foi cuidadosamente removido e os tubos foram deixados abertos para
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secagem do DNA. Após a secagem os peletes de DNA foram ressuspendidos em 150ul de H2O estéril e assim utilizados para a PCR.
3.4.2 PCR - (Reação em Cadeia da Polimerase)
A reação de PCR foi confeccionada com os seguintes valores para uma amostra com volume final de 25 µl. Foram adicionados à 15,45 µl de H2O estéril, 2,5 µl deTp10x, 2 µl de MgCl2 25mM, 0,5 µl de Dntps 10mM mais 1,2 µl do primer 1 e igual volume do primer 2, e por último 0,15 µl de Taq polimerase. O DNA de cada amostra foi distribuído em seu respectivo local (tubo ou placa). Logo em seguida 23 µl da mistura foi adicionada aos 2 µl de DNA.
As reações foram submetidas a um termociclador numa programação que teve início com 3 minutos à 94º, seguido de 49 siclos de 92º/1 minuto, 55º/ 45 segundos, sendo finalizada com 72º/5 minutos, 25º por 30 seg, Hold 4 º.
Tabela 1- Sequencia e tamanho dos fragmentos dos primers utilizados nas reações de PCR.
Tamanho do
Região Sequências do primers fragmento
em pares de bases(pb) α - globina murina: 3’ AGTGGGCAGCTTCTAACTATGC 5’ 280 3’ GTCCCAGCGCATACCTTG 5’ knockout para α -globina murina 3’ ATAGATGGGTAGCCATTTAGATTCC 5’ 461 3’ CCGGGTTATAATTACCTCAGGTC 5’
46 Material e Métodos 3’ACTGGCACAGAGCATTGTTATG5’ knockout para β- globina murina 3’AGATGTTTTTTTCACATTCTTGAGC 5’ 398 3’AATGCCTGCTCTTTCCTGAAGG 5’ Presença da transgenese humana: 3’ TCCTAAGCCAGTGCCAGAAG 5’ 771 3’ TCATTCGTCTGTTTCCCATTC5’
3.5- Diferenciação da presença da cadeia β ou βs humana 3.5.1 PCR em tempo real
A utilização da PCR anterior nos permitiu apenas a identificação dA presença dos transgêneses humanos (Tgh) no DNA genônico, então utilizamos a PCR em tempo real com utilização de sondas fluorescentes específicas para a diferenciação das cadeias humanas βs (Tg1h) e β (Tg2h) .
Para tanto, primers e sondas taqman foram desenhados, levando em consideração a diferença em apenas um nucleotídeo. Os fragmentos desenhados foram submetidos ao programa Blast (www.ncbi.nlm.mh.gov/blast) para confirmar homologia como gene de interesse. A formação de airpins e dimers também foi avaliada através do programa Gene Runner. Os primers e sondas utilizados nos SNPs estão listados na tabela 2. As análises foram realizadas para identificação de polimorfismo por SNP, uma vez que a diferença das cadeias β e βs corresponde a apenas um nucleotídeo. A figura 4 a seguir mostra como ocorre uma reação da PCR em tempo real, onde a sonda hibridiza à sequencia específica e é então quebrada pela polimerase, separando a região F (fluorescência) da região Q (“quencher”-região repressora da F fluorescência). Com isso, a
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fluorescência emite luz em comprimento específico que é detectada pelo equipamento. Cada sonda foi marcada com uma fluorescência com comprimento de onda diferente da outra, podendo diferenciar a cadeia βh normal da cadeia βsh, ou seja, diferenciando a Tg1 da Tg2 (Figura II).
Figura 4 - Esquema da reação em tempo real para análise de SNPs (Figura extraída do site http://www.foodsafetywatch.org/)
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Material e Métodos
Tabela 2- Primers e sondas utilizados nas reações de SNPs.
Região Sequências Primer HBB_RT_F ACATTTGCTTCTGACACAACTGTG Primer HBB_RT_R ACT TCATCCACGTTCACCTTGC
Sonda HBB TGAGGAGAAGTCTGCCGT Fluorescência
VIC
Sonda HBS TGTGGAGAAGTCTGCCGT FAM
3.5.2 Eletroforese de Hemoglobina
A eletroforese de hemoglobina (Hb) é o principal o método laboratorial utilizado para separação e medição de hemoglobinas normais e alteradas. Na eletroforese, são separados diferentes tipos de Hb formando uma série de bandas distintamente separadas em um meio (acetato de celulose ou gel de amido). Os resultados são, então, comparados com os de uma amostra normal.
Em pH 8,0 – 9,0 a hemoglobina é uma proteína carregada negativamente , migra em direção ao pólo positivo. A mobilidade verificada entre as hemoglobinas com defeitos estruturais se devem às alterações de cargas elétricas causadas por substituições de aminoácidos de diferentes pontos isoelétricos (PI). A troca de aminoácidos, que envolve a saída de um aminoácido de carga negativa (ácido Glutamínico) e a entrada de outro sem carga elétrica (valina) resulta na perda de cargas negativas da Hemoglobina, o que causa a mobilidade eletroforética mais lenta da HbS (NAOUM, 2000). As hemoglobinas que não envolvem alterações de cargas elétricas, geralmente apresentam mobilidade eletroforética semelhante à HbA.
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Procedimento: O sangue foi extraído por punção caudal e depositado em tubos contendo EDTA como anticoagulante. Em seguida à 5ul de sangue foi adicionado 10ul de solução hemolizante.
A seguir prosseguimos com a aplicação das amostras de sangue na fita de acetato de celulose imersa em tampão borato (por no mínimo de 15´) o mesmo utilizado nas cubas. As amostras de sangue foram aplicadas na fita de acetato de celulose, uma seguida da outra no lado do ânodo, com a ajuda de um bastonete. Após a corrida de aproximadamente 30 minutos, a fita foi corada rapidamente em corante Ponceau e logo em seguida mergulhadas em solução descorante até que fosse possível visualizar as bandas.
Os resultados foram interpretados pela diferenciação das alturas das bandas.
3.5.3- HPLC de Cadeias Globínicas
A técnica de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) é uma opção rápida e sensível que permite detectar outras variantes hemoglobinicas, porem é uma técnica que representa um custo muito elevado. Tema capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande variedade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade.
A análise das cadeias globínicas foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Performance em fase reversa (RP-HPLC) (Alliance HPLC System 2695, Waters, USA). O sangue foi coletado pela cauda do animal lavado com o dobro do volume centrifugado à 2000RPM por 5 minutos, o sobrenadante foi retirado e a papa de Hemácias foi mantida em -80C até o momento análise. Aproximadamente 105-106 células foram lavadas com tampão fosfato-salina (PBS) e lisadas em água Mili-Q (Millipore, USA). O hemolisado foi centrifugado para remoção da membrana celular e filtrado em membrana Millex Durapore PVDF 0,22 mm (Millipore, USA). Após esse procedimento, 20 ml do hemolisado foram utilizados para cada análise cromatográfica. As células lisadas foram separadas em uma
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Material e Métodos
coluna cromatográfica (Merck LiChrospher 100 CH8, 5 mm; Merck, Germany) em gradiente linear utilizando como eluentes acetonitrila: metanol: 0,155M de cloreto de sódio (pH 2,7): água (31: 31,2: 30,0: 7,8 v/v) tendendo aos volumes de 46,2: 19,6: 30 : 4,2 durante 75 minutos em um fluxo contínuo de 0,7ml/min. A concentração gradiente após esse tempo foi alterada para 64:6: 30:0 retornando as concentrações inicias dos eluentes (Leone et al., 1985; Malik et al., 1998; Gabbianelli et al., 2008).
3.5.4 Teste de solubilidade
É a metodologia utilizada para diferenciar amostras de sangue, portadoras ou não de HbS e é baseada na insolubilidade da hemoglobina S sob a ação de uma solução hemolisante o ditionito que age como redutor, ocorrendo precipitação da hemoglobina. Além da amostra a ser testada utiliza-se também uma amostra com padrão eletroforético HbA como controle.
A técnica foi adaptada para as amostras de sangue de camundongo pelo fato de que o volume deve ser necessariamente menor para que o animal fosse mantido vivo.
O sangue utilizado foi coletado em um tubo contendo EDTA como anticoagulante e também foi extraído por punção caudal do animal, 2,5ul de hemácias foram adicionados em 50 ul de solução de trabalho com ditionito de sódio em seguida agitadas vigorosamente. Aproximadamente 20ul da solução foram colocados em um tubo de hematócrito e imediatamente selou-se uma das extremidades. Os tubos foram submetidos à centrifugação por 5 minutos a 3000 RPM. Logo após seguiu-se a leitura dos resultados empregando-se os seguintes padrões;
Homozigoto – Formação de um alo na borda e a solução translúcida. Heterozigoto – Formação de um alo na borda e a solução rosada. Negativo – Não formação do halo e a solução translúcida.
51 3.6- Fisiopatologia
3.6.1- Análise Histopatológica dos órgãos
Análises histopatológicas de baço, fígado e rim permitiram uma análise comparativa para verificar alterações morfológicas causadas pelo perfil genético produzido.
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical para os órgãos serem coletados para análise histológica. Fragmentos de aproximadamente 6mm de diâmetro dos órgãos: foram fixados em solução de paraformoldeído 4% + sacarose 3% por 24 horas (Junqueira, 2004 adaptado). Após fixação, as peças foram processadas histologicamente para desidratação, diafanização e posteriormente inclusão em blocos de Paraplast Plus (Sigma, USA). Os cortes foram obtidos nos tempos listados no quadro abaixo.
Tabela 3- Tempos utilizados no processamento histológico
REAGENTE TEMPO Água 1:30 Etanol 70% 0:30 Etanol 90% 1:00 Etanol 100% 1:00 Etanol 100% 1:00 Etanol 100% 1:00 Xilol I 0:30 Xilol II 0:30 Parafina Histológica I 2:00 Paraplast PLUS 12:00
Foram feitos blocos de parafina para cada órgão. Os blocos de parafina foram cortados com 5um de espessura. Os cortes histológicos foram analisados
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Material e Métodos
em microscopia óptica após coloração com hematoxilina e eosina (HE) para visualização da morfologia e normalidade dos tecidos.
3.6.2- Curva de dissociação de oxigênio da hemoglobina
A curva de dissociação de oxigênio da hemoglobina foi um teste funcional para medir sua afinidade por oxigênio. Em Hemox analyzer os resultados foram obtidos e interpretados pelo software HAS-200. O sangue obtido por punção caudal com EDTA como anticoagulante, lavado com o dobro do volume de salina a 0,99% e centrifugado à 1500xg por 5 minutos forneceu as hemácias que foram armazenadas a -80C até o momento a análise.
A medida de p50 de O2 determinou a afinidade da hemoglobina por O2, ou seja, a pressão de oxigênio ( em mmHg) necessária para saturar 50% das ligações da hemoglobina com o oxigênio. Considerando quanto menor a p50, maior foi a afinidade pelo oxigênio.
3.6.3- Hemograma
O sangue coletado por punção caudal com EDTA como anti-coagulante e imediatamente utilizado para a leitura em CELL-DYN Hematology System forneceu o perfil sanguíneo dos animais em número de hemácias e níveis de hemoglobina.
A observação morfológica das hemácias foi realizada em lâminas de esfregaço coradas com Leishman.
Uma gota de sangue foi dispensada diretamente sobre a lâmina por punção caudal e com a ajuda de outra lâmina o sangue foi deslizado uniformemente em toda lâmina. As lâminas foram deixadas para secar em temperatura ambiente e logo depois prosseguimos com a coloração.
53 Figura 5 – esfregaço sanguíneo
Para coloração as lâminas foram imersas por 10 minutos em corante Leishman e em seguida por mais 20 minutos no mesmo corante diluído 1:1 em H2O. As amostras foram lavadas em água corrente e secadas em temperatura ambiente para posterior observação em microscópio com objetiva de imersão.
3.7- Análises Estatísticas
Foram feitas análises estatísticas utilizando o programa Graphpad Prism 5, com o teste-T para comparar os dados entre pares de amostras. Resultados significativos foram considerados com p <0,05.
54 Resultados
4- Resultados __________________________________________________________________
4.1- Acasalamentos
Para atingirmos o objetivo de produzir um modelo animal com as características genéticas combinadas da linhagem de Berkeley (Berk-SCM) e também as do modelo B-HPFH, acasalamos de forma programada representantes das duas linhagens. Acompanhando quatro variações genéticas destas linhagens, como podem ser observadas na Figura 3, uma variedade de possíveis combinações mostraram-se presentes na prole. Com isso, direcionamos os acasalamentos, com ajuda dos resultados de PCR e do HPLC, para obtenção de um animal com o genótipo “knockout” para cadeias α e β murinas e a presença das duas transgêneses humanas (-/- -/- Tg1h Tg2h), os quais denominamos de SCM/B-HPFH (Figura 3). Para verificação do perfil genético desejado foram realizados diferentes testes de genotipagem ao longo dos procedimentos de acasalamento e todos foram safisfatórios.
4.2- Genotipagem por PCR
A reação em cadeia da polimerase (PCR) possibilitou o monitoramento da prole resultante desses acasalamentos, quanto à presença dos alelos knockouts murinos e a presença das transgeneses humanas auxiliando no direcionamento dos acasalamentos. Na figura 6 podemos observar um gel representativo dos resultados das PCRs para verificação da presença dos knockouts para os genes das cadeias α e β murinas (A) e a presença dos transgêneses humanos Tg1 e/ou Tg2 (B).
56 Resultados
Figura 6- Eletroforese dos produtos de PCR em agarose contendo brometo de etídio. (A) verificação da presença dos knockouts para os genes das cadeias α e β murinas e (B) presença dos transgêneses humanos Tg1 e/ou Tg2.
4.3- Diferenciação das transgeneses por SNPs
A primeira técnica que utilizamos para diferenciar a transgenese presente foi a técnica de análise de SNPs, que possibilitou, num primeiro momento, constatar se as duas transgêneses desejadas encontravam-se no genoma do animal. Isto foi verificado da análise das cadeias β e βs humanas encontradas distintamente em cada transgenese e diferenciadas na análise de SNP pela mutação pontual presente na cadeia βs. Obtivemos os seguintes perfis mostrados na figura 7: abaixo na coluna A as curva I, II, III representam respectivamente os perfis que
utilizamos como padrão para Tg1 (βs), Tg2 (β) e ambos Tg1 e Tg2. Na coluna B observa-se as curvas que representam os perfis obtidos nos nossos animais, onde a curva 5 demonstra o perfil que representa a fêmea selecionada para os acasalamentos com os machos Homozigotos Berk-SCM ou seja a presença dos dois alelos beta e betaS. Num primeiro momento a técnica de SNPs serviu para complementar as análises de PCR com o propósito de ampliar a segurança nos acasalamentos.
Figura 7- Resultados da técnica de análise de SNPs por PCR em tempo real Após diversos acasalamentos, chegamos a obtenção de fêmeas com o perfil genético desejado (-/- -/- Tg1h Tg2h), onde todas as fêmeas com esse perfil foram
