MARIANA REGINA PASSOS DE SOUZA

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE – UNICENTRO

SETOR DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Química

Síntese de uma série de tiossemicarbazonas derivadas do (-)-Canfeno e avaliação da atividade frente à Mycobacterium tuberculosis.

Mestranda: Mariana Regina Passos de Souza

Orientador: Dr. Fábio Vandresen

Guarapuava

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MARIANA REGINA PASSOS DE SOUZA

Síntese de uma série de tiossemicarbazonas derivadas do (-)-Canfeno e avaliação da atividade frente à Mycobacterium tuberculosis.

Dissertação apresentada a Universidade

Estadual do Centro-Oeste para

obtenção do título de mestre em Química.

Área de concentração: Química Orgânica Linha de pesquisa: Síntese Orgânica Orientador: Prof. Dr. Fábio Vandresen.

Guarapuava

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MARIANA REGINA PASSOS DE SOUZA

SÍNTESE DE UMA SÉRIE DE TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS

DO (-)-CANFENO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTITUBERCULOSE FRENTE A Mycobacterium tuberculosis

Dissertação apresentada à Universidade Estadual do Centro-Oeste, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, área de concentração em Química Aplicada, para a obtenção do título de Mestre.

Aprovado em 26 de agosto de 2016

Profª. Drª. Isabel Craveiro Moreira - UTFPR

Profª. Drª. Yohandra Reyes Torres - UNICENTRO

Prof. Dr. Fabio Vandresen Orientador

GUARAPUAVA-PR 2016

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Dedico meu trabalho aos meus pais João David e Luzia, por tudo que fizeram para

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AGRADECIMENTOS

Deus por me proporcionar, todos os caminhos, e colocar em meu caminho oportunidades e pessoas para ajudarem a alcançar minhas metas.

A Prof. Dr Fábio Vandresen, que nestes dois anos de orientação e convivência me ajudou a entender e a compreender sobre área, e me proporcionou um crescimento científico e intelectual.

A Universidade Estadual do Centro Oeste, pela oportunidade de realização do curso de mestrado.

A Universidade Estadual de Maringá, e em especial ao Grupo de pesquisa Fitosin por abrirem as portas para que pudesse realizar as pesquisas.

Aos Profes. Dra. Cleuza Conceição da Silva, Dr. Armando Mateus Pomini e Dra. Silvana Maria de Oliveira Santim pelo aprendizado e sedimento do laboratório para realização dessa pesquisa.

A Prof.Dra. Regiane Bertin de Lima Scodro e aluna Vanessa Pietrowski Baldin pelos ensaios de atividade de Tuberculose, do departamento de Farmácia da Universidade Estadual de Maringá.

A todos meus amigos e colegas que me ajudaram a vencer a esta etapa, e principalmente minha amiga Prof.Dra. Vanessa Guimarães pela dedicação e aprendizado que me proporcionou.

A minha amiga Giovana Faneco Pereira, por me acolher durante partes da escrita do trabalho, dedicando um pouco de seu tempo a mim, ao seu companheirismo, atenção, conselhos e conversas, muito obrigada, serei eternamente grata.

E aos meus pais por compreenderem e me apoiarem nesta etapa, e principalmente ao meu pai por me apoiar neste seu momento tão conturbado,

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este trabalho e para você pai, iremos vencer sua batalha contra esta doença juntos.

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“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”. (Marthin Luther King)

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RESUMO

Ao longo dos anos a síntese Orgânica tem auxiliado na descoberta de novos fármacos com atividades biológicas, muitas vezes utilizando produtos naturais como precursores sintéticos para obtenção de compostos com potencial farmacológico diversificado. Dentre os produtos naturais que se destacam neste cenário estão os monoterpenos, compostos que apresentam diferentes aplicações sintéticas e farmacológicas. Do ponto de vista sintético, estas moléculas podem ser importantes substratos quirais para obtenção de novos fármacos, além de uma grande parte possuir alta disponibilidade e alguns representantes possuírem baixo custo.

Por outro lado, as tiossemicarbazonas apresentam considerável interesse científico devido à sua fácil aquisição sintética e pelas significativas atividades farmacológicas. No entanto, é muito comum a presença de substituição por grupamentos alquílicos ou arílicos na posição imínica N-1, sendo raros os casos onde ocorra a substituição na posição N-4.

Assim, este trabalho visou a formação de tiossemicarbazida como intermediário reacional sintético para obtenção de tiossemicarbazonas substituídas em N-4 pela unidade monoterpênica (-)-canfeno. Esta foi obtida pela condensação do isotiocianomonoterpeno com hidrazina resultando na

substituição desejada na posição N-4. Foram sintetizadas 21

tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno variando os grupos substituintes na posição imínica N-1 com a utilização de diferentes derivados carbonílicos: benzaldeído e derivados p-OMe, p-Me, p-N(Me)2, o-OH, p-OH, p-C(CH3)3, p-F,

o-F, o-Cl, m-F, p-CF3, p-Br, p-NO2, p-Cl; aldeídos heterocícilos:

2-nitro-5-tiofenocarboxialdeído e 2-nitro-5-furaldeído e isatina. Os derivados foram obtidos com bons rendimentos e caracterizados por diferentes técnicas espectroscópicas.

Após caracterização, as moléculas sintetizadas foram avaliadas para verificar sua potencial atividade antituberculose. Constatou-se que ao inserir

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novos grupos nitrogenados ao (-)-canfeno ocorreu um aumento da atividade para os derivados. Dos 22 compostos obtidos, 10 apresentaram relativamente bons resultados nos ensaios in vitro, além de ser verificado que os grupos heterocíclicos são os grupos com maior atividade frente à bactéria

Mycobacterium tuberculosis.

Palavra-chave: (-)-canfeno, isotiocianato, tiossemicarbazida, tiossemicarbazonas, atividade antituberculose

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ABSTRACT

Over time Organic Synthesis discovery of new drugs with biological activity, often using natural products such as synthetic precursors for obtaining the compounds with diverse pharmacological potential. Among natural products that excel in this scenario are the monoterpenes, which have different synthetic compounds, and pharmacological applications. Synthetic point of view, these molecules may be important chiral substrates to obtain new drugs, in addition to a large part to have high availability and low cost possess some representatives.

On the other hand, thiosemicarbazones are of considerable scientific interest because of their easy synthetic acquisition and the significant pharmacological activity. However, it is very common the presence of substitution by alkyl or aryl groups in imínica position N-1, are rare cases where the replacement occurs at the N-4 position.

This work aimed to thiosemicarbazide training as a synthetic reaction intermediate for obtaining thiosemicarbazone substituted N-4 by monoterpene unit (-) - camphene. This was obtained by condensation with hydrazine isotiocianomonoterpeno resulting in the desired substitution at C-4 position. 21 thiosemicarbazone derived were synthesized (-) - camphene varying the substituent groups on imínica position C-1 with the use of various carbonyl derivatives benzaldehyde and derivatives p-OMe, p-Me, p N (Me) 2, -OH, p-OH, pC (CH3) 3 pF, f, o-Cl, mf, p-CF3, p-Br, p-NO2, p-Cl; heterocícilos aldehydes: 2-nitro-5-tiofenocarboxialdeído and 2-nitro-5-furaldehyde and isatin. The derivatives were obtained in good yields and characterized by various spectroscopic techniques.

After characterization, the synthesized molecules were evaluated for their potential anti-tuberculosis activity. It was found that when inserting new nitrogenous groups to the (-) - camphene was an increase in activity for the derivatives. Of the 22 compounds obtained, 10 showed relatively good results in in vitro tests as well as being found that the heterocyclic radicals are more activity against Mycobacterium tuberculosis bacteria.

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Keyword: (-): (-) -camphene, isothiocyanate, thiosemicarbazide, thiosemicarbazone, antituberculosis activity

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FIGURAS

Figura 1: Fórmulas estruturais de Monoterpenos de cadeia lineares e cadeias cíclicas ... 22 Figura 2: Arranjo estrutural anti e sin de Tiosssemicarbazonas (Tenório et al., 2005). ... 24 Figura 3: Comprimento de ligações em Angstron (Å) (Tenório et al., 2005). ... 25 Figura 4: (a) Desenho da estrutura da RDR; (b) ciclo de oxi-redução, envolvida na transformação de ribonucleotídeos em desoxi-ribonucleotídeos, catalisada pelo RDR ... 31 Figura 5: Grupos de substituições em Tiossemicarbazonas ... 36 Figura 6: Isoticiano derivado do (-)-Canfeno (35). ... 53 Figura 7: Espectro na região de infravermelho (pastilha de KBr) do isotiocianato derivada do (-)-canfeno (34) ... 55 Figura 8: Correlação sugerida no mapa de contorno COSY para o isoticianato em acoplamento W. ... 55 Figura 9: Espectro de RMN de 1H (500,13MHz, CDCl3) para o isotiocianato derivado do (-)-canfeno (35) ... 56 Figura 10: Mapa de contornos COSY (1Hx1H) para o Isotiocianato (35) derivado do (-)-canfeno. ... 56 Figura 11: Espectro de RMN de 13C/DEPT (125,76 MHz, CDCl3) Isotiocianato

derivada do (-)-canfeno (35) ... 57 Figura 12: Tiossemicarbazida derivado do (-)-Canfeno (36) ... 58 Figura 13: Espectro na região de infravermelho (pastilha de KBr) da Tiossemicarbazida derivada do (-)-canfeno (36) ... 59

Figura 14: Espectro de RMN de 1H (500,13MHz, CDCl3) para a

tiossemicarbazida derivada do (-)-canfeno (36). ... 60 Figura 15: Espectro de RMN de DEPT/13C(125,76 MHz, CDCl3) da

tiossecarbazida derivada do (-)-canfeno (36). ... 61 Figura 16: Espectro de correlação HMQC do Tiossemicarbazida derivada do (-)-canfeno (36) ... 61 Figura 17: Acetofenona-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno ... 62 Figura 18: Espectro na região de infravermelho (pastilha de KBr) da Acetofenona-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno derivada do (-)- Canfeno (51). ... 63 Figura 19: Benzaldeídos Tiossemicabazonas derivas do (-)-canfenos com diferentes substituintes em posição p. ... 65 Figura 20: Espectro na região do infravermelho (pastilha de KBr) da p-fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)- Canfeno (44)... 66 Figura 21: Espectro na região de infravermelho (pastilha de KBr) do p-trifluor-metil-benzaldeído tiossemicarbazona derivada do (-)- Canfeno (43) ... 67 Figura 22: Espectro de RMN de 1H (500,13 MHz, CDCl3) para o

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Figura 23: Espectro de RMN de 1H (500,13MHz, CDCl3) para o p-

trifluor-metil-benzaldeído tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (43). ... 68 Figura 24: Espectro de RMN de DEPT/13C (125,76 MHz, CDCl3)

p-fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (44). ... 69

Figura 25: Espectro de correlação HMQC do

p-fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (44). ... 70 Figura 26: Espectro de RMN de DEPT/13C (125,76MHz, CDCl3) p-

trifluor-metil-benzaldeído tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (43). ... 70 Figura 27: Espectro de correlação HMQC do p- trifluor-metil-benzaldeído tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (43). ... 71 Figura 28: Benoaldeídos Tiossemicabazonas derivas do (-)-canfenos com diferentes substituintes em posição o ... 76 Figura 29: Espectro na região de infravermelho (pastilha de KBr) do o-fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)- Canfeno (48)... 77 Figura 30: Espectro de RMN de 1H (300,06MHz, CDCl3) para o

o-fluor-benzaido-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (48) ... 78 Figura 31: Espectro de RMN de DEPT/13C (75,45 MHz, CDCl3) o

o-fluor-benzaído-tiossemicarbazona derivado do (-)-canfeno (48). ... 79 Figura 32: Espectro de correlação HMQC do o-fluorbenzaidotiossemicarbazona (48) derivada do (-)-canfeno. ... 79 Figura 33: m-fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno ... 80 Figura 34: Espectro na região de infravermelho (pastilha de KBr) do m-fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)- Canfeno (50)... 81 Figura 35: Espectro de RMN de 1H (300,06MHz, CDCl3) para o

m-Flúor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (50). ... 82 Figura 36: Ampliação da regiões dos picos espectro de RMN de 13C(125,76 MHz, CDCl3) do m-Flúor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (50) ... 83 Figura 37: Espectro de RMN de DEPT/13C(125,76 MHz, CDCl3) do

m-Flúor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (50). ... 84 Figura 38: Espectro de correlação HMQC do m-Flúor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno (50). ... 85 Figura 39: Heterocíclicos derivado do (-)-canfeno ... 85 Figura 40: Espectro na região de infravermelho (pastilha de KBr) da 5-nitro-2-tiofeno-benzaldeído derivado do (-)-canfeno derivada do (-)- Canfeno (52). ... 86 Figura 41: Espectro de RMN de 1H (300,06MHz, CDCl3) para

5-nitro-2-tiofeno-tissemicarbazona derivada do (-)-canfeno (52). ... 88 Figura 42: Espectro de RMN de DEPT/13C(125,76 MHz, CDCl3) do

5-nitro-2-tiofeno-tissemicarbazona derivada do (-)-canfeno (52). ... 88 Figura 43: Espectro de correlação HMQC do 5-nitro-2-tiofeno-tissemicarbazona derivada do (-)-canfeno (52) ... 89 Figura 44: Isatina-tiossemicarbazona derivado do (-)-Canfeno ... 89 Figura 45: Espectro na região do infravermelho (pastilha de KBr) da Isatina derivada do (-)-canfeno (54). ... 90

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Figura 46: Espectro de RMN de 1H (500,13 MHz, CDCl3) para o Isatina

derivada do (-)-canfeno (51). ... 91 Figura 47: Espectro de RMN de DEPT/13C (125,76 MHz, CDCl3) da Isatina

derivada do (-)-canfeno (54). ... 92 Figura 48: Espectro de correlação HMQC do Isatina derivada do (-)-canfeno (54) ... 92

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ESQUEMAS

Esquema 1: Caminho sintético para obtenção de Tiossemicarbazonas ... 23 Esquema 2: Caminho sintético para obtenção indireta Tiossemicarbazonas partindo de Isotiocianatos. ... 23 Esquema 3: Formas tautoméricas das tiossemicarbazonas (Tenório et al., 2005). ... 25 Esquema 4: Obtenção de tiossemicarbazonas pelo método convencional (a) e em solução neutra (b) ... 26 Esquema 5: Reação geral para obtenção do isotiocianato e do tiocianato derivada do (-)-canfeno ... 41 Esquema 6: Reação geral para obtenção da tiossemicarbazida derivada do (-)-canfeno ... 42 Esquema 7: Reação geral para obtenção das tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno ... 42 Esquema 8: Reação geral para obtenção de tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno ... 50 Esquema 9: Proposta mecanistico dos Intermediários da síntese do tiocianato (SCN) e do isotiocianato (NCS) derivadas do (-)-Canfeno. ... 51 Esquema 10: Mecanismo de reação intermediários da síntese da tiossemicarbazida derivada do (-)-canfeno ... 52 Esquema 11: Mecanismo de reação proposta para a síntese das tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno ... 53

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TABELAS

Tabela 1: Nome, estrutura, massa molar (M.M), fórmula molecular (F.M) para os compostos sintetizados derivados do (-)-canfeno... 45 Tabela 2: Rendimento (R%), Tempo reacional, ponto de fusão (p.f), polaridade [α]D e característica para os compostos sintetizados derivados do (-)-canfeno 48

Tabela 3: Valores de deslocamento químico observados nos espectros de RMN de 1H (300,06 MHz) e 13C (75,45) em CDCl3 para o Isocianato derivado do

(-)-canfeno ... 54 Tabela 4: Valores de deslocamento dos espectros de RMN de 1H (500,13 MHz) e de 13C (125,76 MHz) em CDCl3 para tiossemicarbazida derivada do

(-)-canfeno ... 58 Tabela 5: Valor de deslocamento dos espectros de RMN de 1H (500,13 MHz) em CDCl3 para os composto de 51 derivada do (-)-canfeno ... 64

Tabela 6: Valores de deslocamento do espectros de RMN de 1H (500,13 MHz) e de 13C (125,76 MHz) em CDCl3 para os compostos de 37-41 derivadas do

(-)-canfeno ... 72 Tabela 7: Valores de deslocamento dos espectros de RMN de 1H (500,13 MHz) e de 13C (125,76 MHz) em CDCl3 para os compostos de 42-46 derivadas do

(-)-canfeno ... 74 Tabela 8: Valores de deslocamento dos espectros de RMN de 1H (500,13 MHz) e de 13C (125,76 MHz) em CDCl3 para os compostos de 47-49 derivadas do

(-)-canfeno ... 76 Tabela 9: Valor de deslocamento dos espectros de RMN de 1H (500,13 MHz) e de 13C (125,76 MHz) em CDCl3 para o composto 50. ... 80

Tabela 10: Dados de RMN de 1H (500,13 MHz) e de 13C (125,76 MHz) Isatina (54) derivado do (-)-canfeno. ... 85 Tabela 11: Valores de deslocamento dos espectros de RMN de 1H (500,13 MHz) e de 13C (125,76 MHz) em CDCl3 para os composto de 52 e 53 derivado

do (-)-canfeno ... 87 Tabela 12: Atividade Anti-Mycobacterium tuberculosis (CIM), citoxicidade (CC50) e índice de seletividade (IS) da serie de tiossemicarbazonas derivadas

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LISTA DE SIGLAS

αD

20 Medida de desvio da luz plano-polarizada a 20oC

δH Deslocamento quimico de Hidrogenio-1 (em ppm)

δC Deslocamento quimico de Carbono-13 (em ppm) 1

H Hidrogênio-1 ou proton

13

C Carbono-13

CC Cromatografia em coluna

CCDA Cromatografia em camada delgada analítica CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa CDCl3 Clorofórmio Deuterado

CG Cromatografia gasosa

COSY Espectroscopia de correlação (1Hx1H) CIM Concentração Mínima Inibitória

d Dupleto dd Duplo-dupleto

DEPT Incremento sem distorção por transferência de polarização DMSO Dimetilssulfóxido

eV Elétron-volt

CC50 Concentração citotóxica há 50%

VERO Célula de rim de Macaco verde IV Espectroscopia no Infravermelho

IUPAC União Internacional da Química Pura e Aplicada

J Constante de acoplamento

m Multipleto mult. Multiplicidade MHz Megahertz

ppm Partes por milhão

RMN Ressonância Magnética Nuclear s Simpleto

sl Simpleto largo t Tripleto

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INTRODUÇÃO

A síntese orgânica é definida como a área da química orgânica que constrói, em laboratório, substâncias, presentes ou não na natureza por meio de átomos ou substâncias mais simples, utilizando reações químicas (Souza, 2010). Essa área desempenha um papel de grande importância por proporcionar o desenvolvimento de novos fármacos, agrotóxicos, explosivos, cristais líquidos, combustíveis, corantes, entre outros (Souza, 2010).

Dentre essas áreas, a síntese de substância farmacologicamente ativa conhecida como Química Medicinal tem sido amplamente estudada ao longo dos anos. O relato mais conhecido de uso de substâncias químicas para tratamento de doenças inicia-se com o biologista Francês Antoine Béchamp em 1859, o qual, a partir de anilina e ácido arsênico, sintetiza o composto conhecido como “Atoxil” utilizado, para o tratamento de doenças de pele (Guimarães et al., 2010).

Dentro deste contexto, o uso de produtos naturais como percursores sintéticos também representa uma área de grande interesse. Alguns compostos como O barbital (1, ácido 5,5-dietilbarbitúrico), em 1903, indicado

como agente hipnótico; em 1904, foi sintetizada a epinefrina (2, broncodilatador e descongestionantenasal), seguida da procaína (3) e da benzocaína (4), dois anestésicos, sintetizados a partir da estrutura da cocaína (5). Já Dale (1910) relacionou a estrutura-atividade entre as aminas e as epinefrina e denominando os compostos análogos de “simpaticomiméticos”, ou seja, que imitam os efeitos do hormônio da adrenalina. Atualmente, a lidocaína (6) é mais utilizada como anestésicos locais.

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19 N N CH3 CH3 O O O H H H N HO HO OH CH3 H3C H3C N O O NH2 NH2 O O H3C O O N CO2CH3 CH3 H3C H3C N O H3C N CH3 H 1 2 3 4 5 6

Somente em 1860 ocorre a primeira rota sintética relevante, utilizando um percursor natural, no qual Johann A. Buchner isolou a substância salicina (7) das cascas de Salix alba L. Trinta e dois anos depois Kolbe e Lauteman a utilizam como precursor sintético do ácido salicílico (8). Esse foi

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utilizado como medicamento durante anos até a obtenção em 1898, do ácido acetilsalicílico (AAS) (9) por Hofman, o qual consiste acetilação do grupo hidroxila do ácido salicílico com um ácido mais fraco. Desde então, o uso da síntese para descobertas de novos fármacos vem despertando o interesse dos químicos sintéticos (Souza 2010; Queíroz et al.,2014; Yunes, 2012).

O-glicose OH OH COOH COOH OCOCH₃ 7 8 9

Atualmente constam vários estudos utilizando-se de produtos naturais, porém na literatura ainda é escasso os relatos de uso de terpenos como percussores sintéticos. E quando relacionado com tiossemicarbazona o número de estudos é menores ainda, nesse trabalho iremos abordar dados sobre uso de grupos terpenicos como percursores sintéticos para preparação de tiossemicarbazonas.

2. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

2.1.Terpenos

O uso de produtos naturais como precursores sintéticos tem sido utilizado ao longo dos anos desde a síntese do ácido acetilsalicílico. Neste contexto, as fontes naturais podem ser diversas, e essas são de grande interesse como precursores de moléculas complexas, pois suas estruturas químicas possuem em sua grande maioria centros estereogênicos, alta pureza enantiomérica, além de possuírem baixo custo.

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Dentre as várias fontes naturais, as plantas são as mais utilizadas pelo fato de possuírem duas vias de metabólitos, as quais, as mais utilizadas como precursores sintéticos, são as vias de metabólitos primários se destacando as fontes de aminoácidos e carboidratos e a via de metabólitos secundários se destaca uso de terpenos (Souza, 2010).

Dentre as classes d e metabólitos secundários vale destacar a dos terpenos como o segundo maior grupo de compostos naturais com relatos de atividades farmacológicas ficando atrás apenas dos alcalóides (Di Stasi, 1995). Esses são obtidos como principais constituintes dos óleos essenciais isolados de plantas superiores, sendo produzidos biologicamente por via biossíntetica do acetato-mevalonato a partir de unidades do isopreno que vão se ligando entre si, e orientados em sentido inverso. Já a outra via convencional é realizada no citoplasma e nas mitocôndrias, na qual ocorre preferencialmente a síntese de esteroides e sesquiterpenos (Yunes, 2015).

Existem mais de 30.000 terpenos reconhecidos e estes são classificados de acordo com o número de unidades de isopreno como hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) (Yunes, 2012; Di Stasi, 1995).

Dentre todos os terpenos, os monoterpenos são os principais constituintes dos óleos voláteis e podem possuir formas de cadeia lineares ou cíclicas (Figura 1), sendo responsáveis, por exemplo, pela atração de agentes polinizadores, pela defesa contra herbívoros e pela inibição da germinação e/ou desenvolvimento de outras espécies de plantas (Yunes, 2015).

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22 MONOTERPENOS ACÍCLICOS OH H MONOTERPENOS CÍCLICOS Mirceno Citronelol (S,R)-Limoneno

Alfa pineno Beta pineno

(+/-)-Canfeno

Figura 1: Fórmulas estruturais de Monoterpenos de cadeia lineares e cadeias cíclicas

Dentre estes, o (-)-canfeno é um monoterpeno bicíclico, de nome 2,2- dimetil-3-metileno-biciclo-[2.2.1]-heptano encontrado no óleo essencial de diversas espécies de plantas, como no crisântemo (Chysanthemum ssp) da família Asteraceae, no alecrim (Rosmarinus ssp) da família Lamiaceae, alcanforeira (Cinnamomum camphora) da família Laureacea, e também na Valeriana (Valeriana officinalis) da família Valereaceae, na qual pode ser encontrado num percentual de 6,9 a 8,6% (Taylor & Francis, 2010).

2.2.TIOSSEMICARBAZONAS

As tiossemicarbazonas são substâncias facilmente obtidas através da reação de condensação quimiosseletiva de tiossemicarbazidas com aldeídos

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e/ou cetonas (Casas et al, 2000 e Hang et al, 2001) (Esquema 1). Nesta reação ocorre a formação do grupo azometínico (C=N), tornando-a uma base de Schiff. R1 R₂ O NH2 N N R3 S H R4 N N N R3 S H R4 R₁ R2 1 2 3 ₄

Aldeído ou Cetona Tiossemicarbazida R1, R2, R3, R4= H, Aquil e Aril Tiossemicarzona

Esquema 1: Caminho sintético para obtenção de Tiossemicarbazonas

Para a obtenção sintética de tiossemicarbazonas são utilizadas diversas metodologias, porém as rotas mais empregadas são duas: a rota direta, em que cetonas/aldeídos reagem com tiossemicarbazidas, e a rota indireta (Esquema 2), na qual ocorre a preparação prévia das tiossemicarbazidas, utilizando hidrazina (NH2-NH2) e diferentes reagentes, seguida de condensação com derivados carbonilados específicos (Tenório et

al., 2005). R3NCS NH2 NH2 N NR3R4 H2N H S Isotiocianatos Hidrazina Tiossemicarbazida N NR3R4 N H S R1 R2 Tiossemicarbazona O R1 R2 Aldeídos ou Cetonas

Esquema 2: Caminho sintético para obtenção indireta Tiossemicarbazonas partindo de

Isotiocianatos.

As tiossemicarbazonas possuem quatro posições de substituição (Esquema 1) e quando a substituição não ocorre no nitrogênio 4 (N-4), possuem como característica uma estrutura básica, aproximadamente planar, com o átomo de enxofre em posição anti (Figura 2) em relação ao átomo de nitrogênio da função imina (Casas et al, 2000). Possivelmente o que ocorre

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24

é que o átomo de enxofre em posição anti, favoreça a ocorrência da ligação de hidrogênio intramolecular entre o nitrogênio da imina e os hidrogênios da tioamida (Chattopadhyay et al, 1984).

R1 R2 N N H N S H H Anti R1 R2 N N H S NR3R4 Sin A B R1, R2, R3e R4= H, alquil e aril

Figura 2: Arranjo estrutural anti e sin de Tiosssemicarbazonas (Tenório et al., 2005).

Porém, se ocorrer a substituição na posição N-4, ocorrem mudanças significativas no arranjo estrutural, favorecendo a conformação sin (Figura 2) entre o átomo de nitrogênio da imina e o átomo de enxofre (Chattopadhyay

et al, 1984).

Além disso, as tiossemicarbazonas apresentam forte deslocalização eletrônica, ocorrendo mais facilmente quando grupos aromáticos estão ligados ao carbono da imina. De maneira que ocorre influência nos comprimentos de ligações devido à deslocalização dos elétrons π (Palimik et al,1974).

Possivelmente é observado um fragmento N-C-N apresentando uma ligação próxima ao observado para duplas ligações (C=C; 1,20-1,24 Å) (Allen

et al, 1983). Já para a ligação C-S (1,685 Å) ocorre o contrário, demonstrando

que o átomo de enxofre permite que ocorra interação das duas ligações de C-N na deslocalização dos elétrons π (Figura 3) (Casas et al, 2000).

(25)

25

C N N C NH₂

S 1,₂₈₅ 1,₃₇₇ 1,₃₅₄ 1,₃₂₇

1,₆₈₅

Figura 3: Comprimento de ligações em Angstron (Å) (Tenório et al., 2005).

Por causa da deslocalização eletrônica, as tiossemicarbazonas coexistem na forma tiona ou tiol em equilíbrio tautomérico (Esquema 3).

N N N SH Ar Forma Tiol N N N H S Ar H H H H Forma Tiona Ar=aril

Esquema 3: Formas tautoméricas das tiossemicarbazonas (Tenório et al., 2005).

O aparecimento de uma banda no espectro de infravermelho em 1028-1082 cm-1 indica a presença da tiocarbonila (C=S), demonstrando a forma predominante desse tautomerismo. Porém ausência dessa banda, e a presença de outra na região de 2500-2600 cm-1 demonstra que a forma tiol é mais predominante (Bharti et al., 2003 e Antonini et al., 1977).

De modo geral, as sínteses destas moléculas apresentam como característica uma grande versatilidade de rotas sintéticas. Contudo, como já foi mencionado anteriormente são dois os métodos principais de obtenção: o convencional (Esquema 4, a) e em solução neutra (Esquema 4, b), estes métodos utilizam reação de tiossemicarbazida com aldeídos e cetonas em solução etanólica, com catálise ácida ou solução neutra (Karah,2002 ; Chiyamzu et al., 2003). Ainda vale ressaltar o baixo custo destas rotas sintéticas.

(26)

26 R1 R2 N H O O H N H2N NH2 S a ou b EtOH R1 R2 N H O N N H NH2 S Método a= 97-99% Método b= 40-90% R1= H, CH3, NO2, F, Cl, Br ou I R2= H ou CH3 a=H2SO4 b=Neutra

Esquema 4: Obtenção de tiossemicarbazonas pelo método convencional (a) e em solução

neutra (b)

2.2.1 Propriedades biológicas de Tiossemicarbazonas:

São inúmeros os casos descritos na literatura para as atividades biológicas envolvendo tiossemicarbazonas, e por isso atraem cada vez mais os pesquisadores a desenvolver novas moléculas com potencial de atividade como: antiviral, antifúgica, antiprotozoaria, antibacteriana, antitumoral e entre outros.

Porém, entre esses relatos de atividade farmacológica, os casos mais

comuns que ocorrem em tiossemicarbazonas é a substituição

majoritariamente nos substituintes R1 e R2 na posição imínica N-1. As substituições em posição R3 (N-4) não são usuais, e quando ocorre geralmente são por grupos metila, etila ou arila.

As tiossemicarbazonas possuem poucos relatos de substituições com grupos terpênicos, e quando ocorrem este grupo são condensados com N-1, formando a parte imínica da molécula, como nos casos de derivados de (3-R)- (+)-citronelal (10), citral (11) e uridina (12), que apresentam inibição da proliferação celular quando usadas em concentrações de até 10μg/ml, contra células tumorais leucêmicas (U937) (Tarasconi et al, 2000).

(27)

27 H3C H N N NH2 S H N N NH2 S H H2N H N S N H O O O N N O H 10 11 12

Já em relação à substituição em posição N-4 os relatos são escassos. Com isso, nosso grupo de pesquisas tem desenvolvendo trabalhos visando a substituição nesta posição, utilizando terpenos como precursores sintéticos para formação inicial de isotiocianatos, e utilizando estes intermediários para síntese de tiossemicarbazidas. Por fim, estas são submetidas à reação com aldeídos ou cetonas para formação de tiossemicarbazonas. O grupo já obteve êxito na obtenção de diferentes tiossemicarbazonas utilizando os terpenos S-(-)-Limoneno, R-(+S-(-)-Limoneno, (-)-bisabolol e ácido caurenóico e todos os derivados sintéticos apresentaram significativo potencial biológico. Nos ensaios de avaliação de atividade antitumoral, a acetofenona-tiossemicarbazona derivada do α-bisabolol (13) apresentou significativa atividade frente a células

tumorais leucêmicas (K-562) enquanto que o

p-Fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivado do R-(+)-limoneno apresentou-se ativo e seletivo para células tumorais de próstata (PC-03) (14). Em relação à atividade antiprotozoária, se destacam as moléculas (o, m, p)-clorobenzoaldeídos-tiossemicarbazona derivadas do R-(+)-limoneno (15) para L.amazonensis, cujos IC50 foram ambos de 5,4 μmol.L-1 (Vandresen, 2010; Vandresen et al,

(28)

28

Também foi observada atividade antileishmania se destacando p-nitro-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do R-(+)-limoneno e do S-(-)-limoneno com IC50 de 3,00 e 2,44 μmol.L-1, respectivamente (16 e 17) (Silva et

al., 2011). Ainda para o parasita T.cruzi foi observado atividade com

N-(4)-(ácido caurenoico-18-β-metil-19-óico)-N-(1)-(E)-(2-nitrofenil)-tiossemicarbazona em IC50 de 2,0 μmol.L-1, porém sua citoxicidade foi alta (para células LLC-MK2)

(18) (Haraguchi et al., 2011). H HO N H S N H N CH3 N H S N H N H H F N H S N H N H H Cl (13) ₍₁₄₎ (15) N H S N H N H (16) NO2 N H S N H N H (17) NO2 N H S N H N H (18) NO2 COOH H H

(29)

29

2.3.1.1Atividade Antiviral

A atividade contra herpes (HVI) foi relatada para tiossemicarbazonas derivados do perixal (19), complexadas com estanho IV (Casas et al, 2000). Já para os compostos metil-isatina-4´:4´dietiltiossemicarbazona (MIBDET) e N-alil-isatina- 4´:4´dialiltiossemicarbazona (A-IBDAT) apresentou atividades sobre a síntese de proteínas estruturais do HIV (Teitz et al, 1994).

Em trabalhos mais recentes, a fim de verificar se complexo de paládio II de benzil bis tiossemicarbazona aumenta a atividade nas células de HSV 1 e 2 (herpes simples 1 e 2), foram feitos estudos comparativos entre o ligante e o complexo (20 e 21), verificando atividade superior no complexado com Pd (II) (Genova et al, 2004).

N N N N H H NH2 H2N S S N N N N H H NH2 H2N S S Pd HO OH N N H NH2 S

ocorrencia de ligações com metais

Benzil bis (Tiossemicarbazonas) e seus complexos de Pd (II)

(21)

(30)

30

2.3.1.2 Atividade Anti-protozoária

São diversos os estudos utilizando tiossemicarbazonas frente a parasitas. Por exemplo Bharti (2002) obteve excelentes resultados contra

Entamoeba histolytica e Trichomona vaginalis com o uso de 1,71 µM do

5-nitro-tiofeno-2- carbaldeído-N(4)-hexa-metil-imina tiossemicarbazona (5-NT-HMINTSC) (22).

O composto 4-dimetil-amino-2-cloro-benzaldeído-tiossemicarbazona (23) apresentou atividade contra o parasita Trypanossoma cruzi, sendo capaz de inibir o crescimento em concentrações de 2µg/ml (Wilson et al,1974). Também foram relatadas atividades para os compostos da série de acetofenona-tiossemicarbazona (24), sendo esses capazes de proteger células do hospedeiro contra o parasita T.crusi.

S NO2 N N H S N H N Cl N N H H3C CH3 S NH2 (22) (23) R N H N NH2 S (24)

R= 3' fenil; 3'-NH-fenil; 4'-NH-fenil; 3'-O-fenil; 4'-O-fenil; 3' Br

H

2.3.1.2. Atividade Antitumoral

No inicio de 1956 foi reportado o uso de tiossemicarbazonas com atividade antitumoral. A 2-formil-piridina tiossemicarbazona (25) apresentou atividade frente a células de leucêmicas, porém com baixo índice terapêutico. Posteriormente observou-se que com aumento do caráter lipofílico, diminui a toxidade e aumenta a atividade do composto, como no caso da molécula 1-formil-isoquinolina tiossemicarbazona (26). Acredita-se que a interferência na

(31)

31

atividade do ribonucleotído redutase (Figura 4) esteja relacionada com o desenvolvimento de tumores. N N H N S NH2 N N N H S NH2 (25) (26)

Figura 4: (a) Desenho da estrutura da RDR; (b) ciclo de oxi-redução, envolvida na

transformação de ribonucleotídeos em desoxi-ribonucleotídeos, catalisada pelo RDR

O aumento da atividade enzimática pode estar relacionado ao câncer, esta é constituída em duas subunidades, R1 e R2. No qual R1 consiste no sítio

(32)

32

catalítico que se divide em sítio especifico e ativo, já o R2 possuí dois íons de

Fe3+ ligados entre si por uma ponte µ-oxo e radical tirosila (Nocentini,1996).

Os pesquisadores acreditam que tiossemicarbazonas se ligam ao ferro no organismo, sendo capazes de remover o ferro da ferritina ou da transferrina (Petering e colaboradores). Já para Therlander e Graslund (1983), as tiossemicarbazonas bloqueiam a ação enzimática através da destruição do radical livre tirosila presente na sub-unidade R2, em presença de oxigênio.

Devido a estes relatos, vários pesquisadores vêm desenvolvendo novos fármacos derivados de tiossemicarbazonas que atuem na inibição de células cancerígenas.

Compostos como o

3-amino-piridina-2-carboxaldeído-tiossemicarbazona (Triapina-3-AP) (27) (Liu et al, 1992; Niu et al, 1998) estão entre os principais compostos no combate de alguns tipos específicos de células tumorais de fígado ( M-109), carcinoma de Ovário humano ( A2780) e Leucemia ( L1210) em ratos. A substância atua inativando a ribonucleotíde redutase, por meio do complexo organometálico formado por um átomo de ferro, inibindo a etapa limitante da síntese de DNA.

Em estudos mais recentes, o composto Triapina-3-AP (28) demonstrou em ensaios pré-clínicos de fase 1 resultados promissores em pacientes em

estágio avançado de câncer utilizando doses variando de 5mg/m2 a

105mg/m2. Além disso, apresentou atividade sobre tumores resistentes à hidroxuréia, sem o aparecimento de toxicidade significativa (Feun, 2012).

Por outro lado, estudos realizados com substituição no grupo N-4, com tiossemicarbazonas derivadas de terpenos também apresentaram atividade antitumoral. O composto p-fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivado R-(+)-limoneno (14) exibiu atividade antiproliferativa contra as células tumorais de próstata (PC-3) na concentração de 2 µM (Vandresen et al, 2014) e ainda a molécula acetatofenona-tiossemicarbazona obtida a partir do (-)-bisabolol (13) apresentou significativa atividade antiproliferativa com IC50 de 0,01µM frente à células leucêmicas (K-562) (Silva, 2010).

(33)

33 N H2N N N NH2 S H (27) N N N N NH2 S H (28) H O O (ONa)2(O)PO 2.3.1.3. Atividade Antibacteriana 2.3.1.3.1 Tuberculose

Tuberculose (TB) é uma doença bacteriana causada pelo

Mycobacterium tuberculosis, que atinge principalmente a região pulmonar. É

transmitida pelas gotículas expelidas dar garganta e pulmão de pessoa com a doença respiratória ativa. Porém, em pessoas saudáveis, a infecção causada pela bactéria pode não causar sintomas, pois o sistema imunológico atua se defendendo (OMS, 2015).

Os sintomas observados são: tosse, às vezes com expectoração ou sangue, dores no peito, fraqueza, perda de peso, febre e sudorese noturna. A tuberculose é tratável com o uso de antibióticos por um período de seis meses (OMS, 2015).

Em 2004 foram constatados cerca de 1,2 milhões de pessoas que vivem com HIV e desenvolveram tuberculose. Esses grupos de pessoas são as mais afetadas pela bactéria consta que de 2000 a 2014 a TB matou cerca de 1,5 milhão de pessoas (1,1 milhões de HIV-positivos e 0,4 milhões de HIV-negativos). Para ter um parâmetro em cada três mortes por HIV uma é devido a tuberculose (OMS, 2015).

(34)

34

De modo geral cerca de 9,6 milhões de pessoas foram atingidas pela bactéria em 2014. Destas, 5,4 milhões são homens; 3,2 milhões são mulheres e 1,0 milhão são crianças (OMS, 2015).

Neste cenário, a descoberta de novos fármacos é essencial já que, a bactéria pode ganhar resistência pelo medicamento utilizado. Deste modo, a indústria de fármacos deve ser sempre renovada com novos compostos com potencial atividade. Na qual deve correlacionar com a característica do bacilo é a constituição da parede celular, que possui alto conteúdo lipídico, que dificulta a penetração de alguns fármacos no interior da célula.

Em 1946 foi desenvolvido o primeiro medicamento desenvolvido para o tratamento da tuberculose, com a síntese da acetamido-bezaldeído-tiossemicarbazona (29), comercialmente chamada de Tiacetazona (Beraldo, 2004).

Atualmente ainda são desenvolvidas novas tiossemicarbazonas que apresentam atividade biológica frente a bactérias, se destacando a atividade antituberculose. Como derivados da molécula 5-metíl-trifluormetoxi-1H-indole-2,3-dieno-3-tiossemicarbazona (30). Onde foi verificado para essas tiossemicarbazonas que com o aumento de quantidade de halogênios na molécula ocorria um crescimento em sua característica lipofílica aumentando significativamente a atividade anti-tuberculose (Guzel et al, 2008).

Por outro lado foi observado por Maia et al. (2009) que a presença de grupos volumosos ligados em posição N(4) a tiossemicarbazona aumenta atividade do composto verificando que os compostos Hapmtsc (31) e Happtsc (32) apresentaram atividades frente a tuberculose nas concentrações de 7,8 µg/ml e 15,6 µg/ml, respectivamente.

(35)

35 N N N H N H S (31) N N N H N H S (32) (29) H3C N N O R1 N N R2 S H H R1= CH3, F3CO R2= CH3, C2H5, CH2-CH=CH2, n-C4H9, cyclo-C6H11, C₆H₅CH_2, C₆H_5, 4-CH₃C₆H_4, 4CH₃OC₆H_4, 4-FC₆H_4, 4ClC₆H_4, 2-BrC₆H_4, 3-BrC₆H_4, 4-BrC₆H_4, 4-NO₂C₆H₄ (30) 3. JUSTIFICATIVA

Em trabalhos anteriores, o (-)-canfeno já foi utilizado como precursor sintético para obtenção de algumas tiossemicarbazonas com rendimentos

satisfatórios. Com isso, resolvemos complementar a série de

tiossemicarbazonas derivado do (-)-canfeno utilizando compostos carbonílicos não utilizados anteriormente. De maneira geral, terpenos e tiossemicarbazonas apresentam amplo perfil farmacológico e diferentes formas sintéticas de preparação. A maioria das tiossemicarbazonas tem variação estrutural ocorrendo no grupo azometínico (N1) em R1 e R2 (Figura 5), devido à facilidade de reação com diferentes oxo-compostos.

(36)

36

Figura 5: Grupos de substituições em Tiossemicarbazonas

No entanto, são poucos os relatos da variação em R4 (N-4). Trabalhos iniciados anteriormente pelo grupo Fitosin da Universidade Estadual de Maringá/PR, conseguiram a incorporação de grupos terpênicos volumosos em N-4 através da obtenção de isotiocianatoterpenos. Sua obtenção consiste na reação de HSCN com diferentes terpenos olefínicos. Tal reação foi realizada com êxito com o uso de R-(+) e S-(-)-limoneno (Vandresen

et al, 2014), (-)-canfeno, (-)-α- bisalolol (Silva et al., 2010) e ácido caurenoico

(Garcia et al, 2011). Após a preparação dos isotiocianatos, estes podem ser utilizados sinteticamente em reações com compostos nitrogenados (aminas, hidrazinas, etc.) levando à formação de tiossemicarbazidas, que, por sua vez, podem reagir com diferentes compostos carbonílicos levando formação de tiossemicarbazonas.

Com isso, conseguiu-se combinar em uma única molécula, grupos individualmente bioativos (terpenos e tiossemicarbazonas) e/ou (terpenos) para analisar o efeito cooperativo das mesmas em ensaios de atividades biológicas. Isso vale como uma estratégia eficiente na busca de novos compostos farmacologicamente ativos.

Portanto, como a obtenção de tiossemicarbazonas terpênicas se mostrou viável em outros estudos e que os derivados obtidos apresentaram significativas atividades antileishmania, antitipanossoma, antifúgica e antitumoral, pretendeu-se no presente trabalho a obtenção de novas

(37)

37

tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno e a avaliação de suas atividades farmacológicas

4. OBJETIVO GERAL

O presente trabalho visou inicialmente incorporar o (-)-canfeno ao grupo isotiocianato, possibilitando posteriormente, sínteses de outros derivados nitrogenados como tiossemicarbazida e tiossemicarbazonas. Posteriormente, realizou-se ensaio in vitro para avaliar a atividade antiturbeculose frente à

Mycobacterium tuberculosis.

4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Levando em consideração os estudos já realizados com a síntese do (-)-canfeno, e os resultados promissores das atividades biológicas de tiossemicarbazonas, o presente trabalho teve como objetivos específicos: - sintetizar o isotiocianato derivado do (-)-canfeno, conforme procedimento já descrito na literatura (Silva, 1995);

- sintetizar a tiossemicarbazida derivada do (-)-canfeno, conforme procedimento já descrito na literatura (Silva, 1995);

- sintetizar uma série de tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno utilizando benzaldeido e derivados contendo grupos doadores de elétrons: p-OMe, p-Me, p-N(Me)2, o-OH, p-OH, -C(CH3)3;

- sintetizar uma série de tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno utilizando benzaldeído e derivados contendo grupos retiradores de elétrons: p-F, o-p-F, m-, p-CF3, p- Br, p-NO2, p-Cl;

- sintetizar tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno utilizando derivados contendo grupos heterocíclicos com núcleos furânicos e tiofênicos;

(38)

38

- sintetizar tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno utilizando acetatofenona;

- avaliar a atividade anti-Mycobacterium tuberculosis in vitro dos derivados sintetizados a partir do (-)-canfeno.

5. PARTE EXPERIMENTAL

5.1. INSTRUMENTAÇÃO

Os espectros de RMN (1_H,13_{C, DEPT 135°, NOESY 1D, COSY, NOESY}

2D, HSQC, HMBC) foram obtidos em um aparelho espectrômetro da Bruker, modelo AVANCE III HD, 500 MHZ, com fundo de 5mm e no espectrômetro da VARIAN, modelo Mercury Plus, 300,06 MHZ, realizada na Universidade estadual de Maringá.

Os espectros de absorção na região do infravermelho (IV) foram registrados em um espectrofotômetro Bruker, modelo Vertex 70v, em pastilha de KBr, na região de 400 a 4000cm-1.

A rotação óptica dos compostos sintetizados (desvio da luz plano-polarizada- 𝛼_𝐷20_{) foi medida em um polarímetro Perkin Elmer, modelo 343, a}

20°C e 589 nm, com cela de caminho óptico de 10 mílimetros.

Os pontos de fusão foram determinados em um aparelho de ponto de fusão Microquímica, modelo MQAPF-301.

5.2. MATERIAL CROMATOGRÁFICO

A cromatografia em coluna (CC) foi realizada em colunas de vidro, com gel de sílica 60 Merck (0,063-0,200 mm) (70-230 mesh ASTM) como fase estacionária, sendo variada pela quantidade de massa utilizada de material, utilizando 20-30 de massa do material para sílica.

As análises por CCD (cromatografias em camada delgada) foram realizadas em placas de vidro 5,0 X 20,0 cm, nas aplicações analíticas. A

(39)

39

espessura da camada de gel de sílica (gel de sílica 60G e 60GF254-Merck) e utilizada à confecção de 0,25mm, e suas revelações são realizadas com Iodo e revelador de terpeno (ácido acético: ácido sulfúrico: anisaldeído na proporção 1,0: 48,5: 0,5).

5.3. REGENTES E SOLVENTES

Os reagentes utilizados para desenvolvimento do trabalho foram: (-)-Canfeno (Acros Organics, 75%), bissulfato de potássio P.A (vetec) dicloridrato de hidrazina (Carlos Erba, 99%), bicarbonato de sodio P.A. (Labsynth), benzaldeido (Acros Organics,99%), p-anisaldeido (Acros Organics, 98%), o-hidroxibenzaldeido (Vetec, 98%), dimetilaminobenzaldeido (Merck, 98,5%), p-clorobenzaldeido (Acros Organics, 98,5%), p-nitrobenzaldeido (Acros Organics, 99%), p-fluorbenzaldeido (Acros Organics, 98%), o-fluorbenzaldeido (Acros

Organics, 98%), m-fluorbenzaldeido (Acros Organics, 98%),

bromobenzaldeído (Sigma, 99%), trifluorbenzaldeído (Sigma, 98%), p-tercbutilbenzaldeído (Sigma, 97%), benzaldeído(Acros Organics, 97%) acetofenona (Sigma, 99%), Isatina (Sigma), 2-nitro-5-tiofenocarboxaldeído (Sigma, 99%), 2-nitro-5-furanocarboxaldeido (Sigma, 99%).

Os solventes utilizados foram previamente destilados ou evaporados sob pressão reduzida: hexano P.A. (Nuclear e Vetec), acetato de etila P.A. (Vetec, Dinamica e Nuclear), clorofórmio P.A. (Nuclear), álcool etílico P.A. (Dinamica e Vetec), álcool metílico P.A. (Nuclear e Dinâmica), éter (Fmaia, 98%), ácido sulfúrico P.A. (Nuclear) e água destilada.

5.4. DETERMINAÇÃO DA ROTAÇÃO ESPECÍFICA

A determinação da rotação da luz plano-polarizada foi realizada para os compostos de (33-53). Uma solução de cada composto foi preparada na concentração de 5mg/ml em clorofórmio, tendo sua leitura realizada no polarímetro. O αD20 foi calculado através da equação abaixo (eq.).

(40)

40 𝛼_𝐷20 𝛼 [α]= Leitura do aparelho; b= caminho óptico (dm); c= é a concentração (g/ml).

5.5. PROCEDIMENTO GERAL PARA SÍNTESE DOS COMPOSTOS

5.5.1 Preparação do isotiocianato derivado do (-)-canfeno

Primeiramente, o ácido tiociânico (HSCN) foi obtido pela maceração dos sais tiocianato de potássio (KSCN) e o bissulfato de potássio (KHSO4), e

então solubilizado em clorofórmio e adicionado ao meio reacional contendo o (-)-canfeno. A reação foi realizada utilizando uma proporção de 5:1 ( mol/mol) de sais:terpeno. A fim de minimizar a polimerização do produto em decorrência do ácido, a reação foi mantida em temperatura ambiente e na ausência de luz.

KHSO₄ + KNCS CHCl3 HSCN + H₂SO₄

O isotiocianato do (-)-canfeno e consequentemente seu tiocianato foram sintetizados a partir de metodologia descrita na literatura (Silva,1995; Silva et al., 1993). A reação é conduzida usando a proporção de 1mol de (-)-canfeno para 5mol dos sais, e mantida na ausência de luz em e temperatura ambiente para evitar a formação de produtos de polimerização, durante 4-24 horas, sendo o andamento da reação acompanhado por CCD. Após o término da reação é realizada uma extração liquido-líquido utilizando solução de bicarbonato de sódio 10% para a neutralização do excesso de ácido remanescente.

Em seguida, o solvente foi evaporado usando pressão reduzida e os produtos constituídos de tiocianatotêrpenico (34) e isoticianatotêrpenico (35) são separados e purificados em coluna cromatográfica de sílica gel usando uma proporção de 8/2 hexano e acetato de etila como eluente (Silva, 1995). Os

(41)

41

isotiocianoterpenos são eluídos primeiro e obtidos como produtos majoritários, (Esquema 5). Por ultimo o isotiocianoterpeno é cristalizado em bancada e purificado com etanol P.A e água destilada.

H S C N + NCS SCN + (33) (34) (35)

Esquema 5: Reação geral para obtenção do isotiocianato e do tiocianato derivada do

(-)-canfeno

5.5.3.2 Preparação da tiossemicarbazida derivada do (-)-canfeno

A preparação da tiossemicarbazida derivada do (-)-canfeno (Esquema 6) foi realizada através da adição da hidrazina ao isotiocianato do (-)-canfeno já purificado (Silva, 1993; Yamaguchi et al, 2009). Inicialmente, o bicloridrato de hidrazínio é tratado com bicarbonato de sódio 10% em água para a liberação da hidrazina na forma livre.

NH2NH2.2HCl + 2 NaHCO3 → NH2NH2 + 2 NaCl + 2 CO2 + 2 H2O

Logo após, o isotiocianato do (-)-canfeno foi solubilizado em etanol e mantido em agitação e refluxo a temperatura de 90°C pelo período de 2-4horas. Após o resfriamento, a mistura reacional foi concentrada em evaporador rotativo, e o sólido formado foi lavado com hexano para remoção do isotiocianato remanescente e posteriormente com água destilada, resultando na tiossemicarbazida do (-)-canfeno (36).

(42)

42 N C S N N H H H H N N NH2 H S H 90°C R-OH

(35)

₍₃₆₎

Esquema 6: Reação geral para obtenção da tiossemicarbazida derivada do (-)-canfeno

5.5.4. Preparação das tiossemicarbazonas derivados do (-)-canfeno pelo método via seca

As tiossemicarbazonas foram obtidas pela reação de condensação quimiosseletiva de tiossemicarbazidas com quantidades equimolares de aldeídos ou cetonas na presença de quantidade catalítica de SiO2: H2SO4 5%

como suporte sólido na ausência de solvente (Esquema 7) (Hang et al, 2001; Holla et al., 2003). O andamento da reação foi verificada por CCD e após completada, utilizou-se etanol e clorofórmio para remoção do produto da sílica, a qual foi separada via filtração.

N N NH2 H H S R R´ O H N N N H H S R´ R O H H H + SiO2: H2SO4 5% (36) (37-54)

(43)

43

5.5.5. Preparação da isatina tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno pelo método via úmida

A preparação da isatina tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno ocorreu por meio da reação de condensação entre a tiossemicarbazida (36) com a isatina, sob catálise ácida em meio alcoólico sobre refluxo durante 24 horas. A foi acompanhada por CCD, e após concluída a mistura reacional foi rotaevaporada, e filtrada lavando os cristais com hexano. Porém, o uso desta metodologia acarretou problemas indesejáveis, como a formação de subprodutos, necessidade de purificação do produto bruto e tempo relativamente longo principalmente para a obtenção de tiossemicarbazonas derivadas de cetonas.

5.5.6. Avaliação da atividade contra tuberculose dos compostos derivados do (-)- Canfeno

Foram realizados testes microbiológicos dos compostos derivados do (-)-canfeno, para verificação da atividade antituberculose.

A concentração inibidora mínima (CIM) dos derivados do (-)-canfeno foi determinada utilizando a cepa padrão de M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294),

pelo método colorimétrico resazurin microtiter assay plate (REMA), em placa de microtitulação, como descrito por Palomino et al. (2002). Os compostos foram diluídos em DMSO (Amresco) e foram realizadas diluições em série em meio Middlebrook 7H9 (Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) suplementado com ácido oleico, albumina bovina, dextrose e catalase (OADC) Enrichment (BBL / Becton-Dickinson, Sparks, MD, EUA). As concentrações dos derivados variaram de 250 a 1,9 µg/ml. A isoniazida (Disco Laboratories, Detroit, MI, EUA) foi utilizada como fármaco de referência nas concentrações de 1,0 a 0,007 µg/ml. Para todos os compostos forão utilizados 100 μl de inóculo bacteriano, padronizados a uma turbidez n. 1 de McFarland, diluído 1:20 em meio Middlebrook 7H9 suplementado com OADC.

(44)

44

Após, realizadas as diluições, as microplacas foram cobertas com tampas e seladas com fita de polietileno. Em seguida, foram incubadas a atmosfera normal durante 7 dias a 35°C. As leituras das CIMs foram realizadas 24 horas após adição de 30 μl de resazurina a 0,01% (Acros, Morris Plains, NJ, EUA) em cada poço. Uma segunda leitura foi realizada após 48 h de incubação e a mudança de cor de azul para róseo indicou o crescimento de micobactérias. A CIM foi interpretada como a concentração mais baixa que impediu a mudança de cor do composto testado. Controles de esterilidade do meio de cultura, do fármaco de referência, dos compostos derivados de (-)-canfeno, bem como o controle de crescimento bacteriano com e sem DMSO a 2,5% (v/v) foram incluídos em todos os ensaios. Os ensaios foram realizados em triplicata.

5.5.7. Avaliação da atividade citoxicas dos compostos derivados do (-)- Canfeno

Os testes foram realizados em triplicata utilizando células epiteliais VERO (ATCC CCL81) cultivados em frascos de cultura de células contendo o meio de cultura DMEM (SIGMA-ALDRICH®) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (GIBCO BRL, LIFE TECHNOLOGIES), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 µg/mL) (GIBCO® INVITROGEN CORPORATION, CA, USA) sendo mantidas em estufa modelo MCO-18AC-PA (PANASONIC) a 37

o

C e sob tensão de 5 % de CO2. Depois de atingir a confluência, as células

foram destacadas com Tripsina-EDTA (GIBCO® Invitrogen Corporation, CA, USA), a 37 °C, por 5 minutos e contadas. O experimento foi realizado em microplacas de 96 poços, onde foram adicionados 5 x 104 células/poço e então

incubados com DMEM suplementado com 10 % de SFB por 24 horas a 37 oC e

sob tensão de 5 % de CO2. Em seguida, foi aspirado o meio de cultura dos

poços e adicionados diferentes concentrações das substâncias puras a serem testadas diluídas em DMEM nas concentrações de 1000 a 1,95 µg/ml. Após 24 horas de incubação a 37 oC sob tensão de 5 % de CO2 foi retirado todo o meio

de cultura da microplaca e esta foi lavada por duas vezes com tampão fosfato salina (PBS). O MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio)

(45)

45

(AMBRESCO®)1 foi dissolvido em PBS na concentração 2 mg/mL e em seguida foi adicionado 50µL em todas as cavidades da microplaca exceto no branco da reação.A microplaca foi incubada na estufa a 37 oC e sob tensão de 5 % de CO2, protegida da luz, por quatro horas. Após 4 horas o MTT foi retirado e

então foi colocado 150 µL de Dimetilsulfóxido (DMSO) (AMRESCO®). A microplaca foi agitada e a leitura procedida com o auxílio de um leitor de Elisa (ASYS EXPERT PLUS), em comprimento de onda de 550 nm. DMSO foi usado como controle negativo. Os dados foram calculados como a porcentagem de inibição. A concentração de 50 % de toxicidade celular (CC50) foi definida como

a concentração que reduz a densidade óptica das células tratadas em 50 % em relação às células não tratadas (Mosmann T, 1983).

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1. SÍNTESE

6.1.1. Rota de síntese geral para a obtenção dos compostos desejados

Na Tabela 1 é representados os compostos que foram sinteticamente obtidos neste trabalho, contendo os dados respectivos nomes, estruturas, massas molares (M.M), fórmulas moleculares (F.M), no Esquema 8, pode-se verificar rota de síntese geral para a obtenção dos compostos desejados.

Tabela 1: Nome, estrutura, massa molar (M.M), fórmula molecular (F.M) para os compostos sintetizados

derivados do (-)-canfeno

TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DO (-)-CANFENO

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46 35 Isotiocianato 195,32 C11H17NS 36 Tiossemicarbazida 227,37 C11H19N2 S 37 Benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 315,48 C18H25N3S 38 p-Terc-butil-benzaldeido-tissemicarbazona derivada do (-)-canfeno 371,58 C22H33N3S 39 p-metóxi-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada (-)-canfeno 345,50 C19H27N3OS 40

p-dimetil-amino-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada (-)-canfeno 358,54 C20H30N4S

41 p-nitro-benzaldeído-tiossemicarbazona

derivada do (-)-canfeno 360,47

C18H24N4O2S

42 p-hidroxido-benzaldeído-tiossemicarbazona

(47)

47 43 p-trifluor-metil-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 383,47 C19H24F3N3S 44 p-fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 333,47 C18H24FN3S 45 p-cloro-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 349,92 C18H24ClN3S 46 p-bromo-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 394,37 C18H24BrN3S 47 o-hidroxido-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 331,48 C18H25N3OS 48 o-fluor-benzaldeído-tiossemicarbaznona derivada do (-)-canfeno 333,47 C18H24FN3S 49 o-cloro-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 349,92 C18H24ClN3S 50 m-fluor-benzaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 333,47 C18H24FN3S 51 Acetofenona-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 329,50 C19H27N3S

(48)

48

52

2-nitro-5-tiofeno-carboxaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno 366,50

C16 H22N4O2S2

53

2-nitro-5-furano-carboxaldeído-tiossemicarbazona derivada do (-)-canfeno

350,44

C16H22N4O3S

54 Isatina-tiossemicarbazona derivada

(-)-canfeno 356,49

C19H24N4OS

Na Tabela 2 são representados os dados físicos dos compostos sintetizados, Rendimento (R%), Tempo reacional, ponto de fusão (p.f), polaridade [α]D.

Tabela 2: Rendimento (R%), Tempo reacional, ponto de fusão (p.f), polaridade [α]D e característica para os

compostos sintetizados derivados do (-)-canfeno

Compostos R% _reacionalTempo p.f (°C) Polaridade [α]D Características _Físicas

35 43 24h 88,4-90 Polar -4,00 Sólido Branco

36 99 4h 150-154 Polar -4,00 Sólido Branco

37 45,5 10min 211,8-215,8 Polar -4,00 Sólido Laranja

38 85 10min 180,8-183,7 Polar -8,00 Sólido Branco

39 98 10min 158,6-161,5 Polar -2,04 Sólido Amarelo

40 28 10min 162,3 Polar +51,5 Sólido Laranja

46 75 10min 217-220 Polar -35,18 Sólido Branco

47 99 10min 208-213,8 Polar -4,00 Sólido Amarelo

51 80 2h # Polar -2,00 Sólido Marrom

52 99 10min 236,8-240,3 Polar -49,81 Sólido Laranja

53 99 10min 183,7 Polar -18,36 Sólido Laranja

54 99 10min 150,2-153,4 Polar -6,12 Sólido Laranja

De maneira geral, pode-se observar que todas tiossemicarbazonas foram obtidas com altos rendimentos com exceção do derivado 40. Esses rendimentos satisfatórios podem ser atribuídos ao uso de uma metodologia de síntese por via seca, pois os derivados obtidos não necessitaram de purificação após o término da reação, sendo estes apenas removidos do suporte sólido com uso de solvente alcóolico e clorofórmio. Este método é favorável sob os

(49)

49

preceitos da química verde por não utilizar solventes tóxicos, e por apresentar menor tempo de reação em comparação ao método de via úmida.

Em relação aos pontos de fusão, verifica-se a ocorrência de possíveis interferências com o aumento da força intermolecular, tamanho da molécula e os substituintes ligados diretamente a parte fenílica das moléculas de tiossemicarbazonas.

Para verificar a questão da polaridade das moléculas sintetizadas foram observadas as presenças de grupos alquílicos, nitrogenados e halogenados. Os derivados nitrogenados que possuem o grupo nitro tal como a substância 41 foram os que apresentaram maior ponto de fusão bem como maior solubilidade em solventes mais polares como metanol e etanol.

Já em relação à rotação óptica, os derivados não apresentaram alteração na mudança da configuração em relação ao (-)-canfeno, com exceção do derivado 41 que apresentou uma rotação óptica de +51,5, para verificar o que ocorreu com este composto deve-se realizar novos estudos.

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50 SCN N N NH2 H S H H2O/Etanol 90°C NH2NH2 NCS HSCN CHCl3 N N N H S H Aldeídos/Cetonas Sílica/H3O+ N N N H S H Etanol/H3O+ N O H N O H O R R1 N N N H S H _H S NO2 N N N H S H _H O NO2 S íli ca /H 3_O + S íli ca /H 3_O + S NO2 H O O NO2 H O R= H (34-47) R1= (37) 4H (38) 4C(CH3) (39) 4OCH3 (40) 4N(CH3) (41) 4NO2 (42) 4OH (43) 4CF3 (44) 4F (45) 4Cl (46) 4Br (47) 2OH (48) 2F (49) 2Cl (50) 3F R=CH3 (51) R1= 4H (33) (34) (35) (36) (52) (53) (54)

Esquema 8: Reação geral para obtenção de tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno

6.1.2. Síntese de isotiocianato derivado do (-)-canfeno

Para a formação do isotiocianato, o (-)-canfeno inicialmente atua como nucleófilo e o ácido tiociânico (HSCN) como eletrófilo. O próton do ácido adiciona-se ao carbono menos substituído da dupla ligação, formando um carbocátion terciário que provavelmente se estabeleça por par iônico íntimo, devido ao solvente utilizado, clorofórmio, possuir baixa polaridade (Esquema 9).

A base conjugada (-SCN) do ácido tiociânico é ambidentada, inicialmente adiciona-se ao carbono terciário pelo enxofre, fornecendo o tiocianomonoterpeno derivado do (-)-canfeno (35) como produto cinético da reação. E através colapso do par iônico íntimo, ocorre a isomerização para o

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51

isotiocianomonoterpeno derivado do (-)-canfeno (33), o produto mais estável termodinamicamente desta reação.(Silva et al., 1993).

H S C N + S C N SCN Is o m e ri z a ç ã o S C N

Par iônico intimo

NCS SCN

+

Esquema 9: Proposta mecanistico dos Intermediários da síntese do tiocianato (SCN) e do

isotiocianato (NCS) derivadas do (-)-Canfeno.

6.1.3. Síntese de tiossemicarbazida derivado do (-)-canfeno

A formação da tiossemicarbazida (36) ocorre pela adição de hidrazina ao isotiocianato derivado do (-)-canfeno (33) de maneira semelhante às adições de aminas às carbonilas. Desta forma, a hidrazina atua como nucleófilo enquanto que o isotiocianato age como um eletrofílo. A proposta mecanística inicia-se com o ataque nucleófilico do nitrogênio hidrazinico ao carbono isotiociânico originando um intermediário dipolar (Esquema 10). Na sequência o intermediário é estabilizado pela troca intramolecular de um próton levando à formação da tiossemicarbazida como o único produto.

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52 N C S N N H H H H N N NH2 H H S N N NH2 H S H

Esquema 10: Mecanismo de reação intermediários da síntese da tiossemicarbazida derivada

do (-)-canfeno

6.1.4. Síntese de tiossemicarbazonas derivadas do (-)-canfeno

Atualmente os pesquisadores tem buscado para a síntese alternativas, afim de, otimizar as reações, afim de diminuir o tempo de reação e se utilizar processos que favoreçam a química limpa. Desta maneira, foi utilizado o procedimento que envolve a SiO2:H2SO4 5% (Vandresen, 2011). Este caminho

de síntese proporciona menor tempo de reação, e a retirada do uso de solventes tóxicos durante a reação e a obtenção de produtos com maior pureza comparada ao método tradicional que consiste em uma reação por refluxo de tiossemicarbazonas, no qual se utiliza solvente em meio ácido, demorando de 2-24 horas, em grau de rendimento abaixo do que é obtido por este método (Coelho, 2011).

A tiossemicarbazida atua como nucleófilo na reação com aldeídos e cetonas e age atacando o carbono carbonílico ativado pela captura do próton

do íon hidrônio pelo oxigênio carbonílico, formando um intermediário com o

nitrogênio protonado (íon imínico). Logo após, ocorre a troca de próton, com eliminação de uma molécula de água, resultando em um segundo intermediário protonado no nitrogênio. A ultima etapa ocorre com a captura do próton excedente pela água com regeneração do catalisador (íon hidrônio) e