i
Nielce Maria de Paiva
Expressão de TLR2, TLR4 e p-JNK em Mucosa de Reservatórios Ileais de Doentes Operados por Retocolite Ulcerativa Inespecífica e
Polipose Adenomatosa Familiar
Campinas 2011
iii
UNICAMP___________________________________________________________
Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Ciências Médicas
Expressão de TLR2, TLR4 e p-JNK em Mucosa de Reservatórios Ileais de Doentes Operados por Retocolite Ulcerativa Inespecífica e
Polipose Adenomatosa Familiar
Nielce Maria de Paiva
Dissertação de Mestrado apresentada a Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP para obtenção de título de Mestre em Ciências, área de concentração em Fisiopatologia Cirúrgica sob orientação da Profa. Dra. Raquel Franco Leal; co-orientadores: Profa. Dra. Maria Lourdes Setsuko Ayrizono.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA POR ROSANA EVANGELISTA PODEROSO – CRB8/6652 BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
UNICAMP
Informações para Biblioteca Digital
Título em inglês: TLR2,TLR4 and p-JNK expressions in ileal pouch mucosa of ulcerative colitis and familial adenomatous polyposis patients.
Palavra-chave em inglês: Toll-like receptor 4
Toll-like receptor 2 Cytocinas
Proctocolitis
Adenomatus polyposis coli
Área de concentração: Fisiologia Cirúrgica Titulação: Mestre em Ciências
Banca examinadora:
Raquel Franco Leal [Orientador] Carlos Walter Sobrado Junior Data da defesa: 14-12-2011
Programa de Pós-Graduação: Ciências
Paiva, Nielce Maria de, 1962 -
P166e Expressão de TLR2, TLR4 e p-JNK em mucosa de reservatórios ileais de doentes operados por retocolite ulcerativa inespecífica e polipose adenomatosa familiar / Nielce Maria de Paiva. -- Campinas, SP : [s.n.], 2011.
Orientador : Raquel Franco Leal.
Coorientador : Maria Lourdes Setsuko Ayrizono. Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
1. Receptor 4 Toll-like. 2. Receptor 2 Toll-like. 3. Citocinas. 4. Proctolite. 5. Polipose adenomatosa do colo. I. Leal, Raquel Franco. II. Ayrizono, Maria Lourdes Setsuko. III. Universidade Estadual de
v
vii
DEDICATÓRIA
À Profa. Dra. Raquel Franco Leal, exemplo de médica, docente e pesquisadora, pelo privilégio e honra de ser sua aluna e pela sua dedicação à minha formação acadêmica.
ix
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, João e Vera, minha sogra, Carmela e aos irmãos Vera, Neuza, Marilda e Silvio que me acolheram, educaram, formaram meu caráter e me consolaram nos momentos de tristeza. Alimentaram os meus sonhos e foram o alicerce para que pudesse realizá-los e ao Jorge que partilhou o sonho acadêmico quando este era apenas um projeto.
Aos meus cunhados e sobrinhos que me mimaram e me incentivaram com todos meus projetos. Suportaram com paciência a minha ausência e sempre tiveram um sorriso para me alegrar.
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) que me acolheu e aprimorou meu conhecimento.
Ao Prof. Dr. Cláudio Saddy Rodrigues Coy, Professor Livre-Docente do Departamento de Cirurgia, Chefe do Serviço de Coloproctologia da Disciplina de Moléstias do Aparelho Digestivo (FCM-UNICAMP), pelo acolhimento, carinho e ensino que me dedicou neste período acadêmico.
Ao Prof. Dr. Lício Augusto Velloso, Professor Livre-Docente do Departamento de Clínica Médica (FCM-UNICAMP) e Coordenador do Laboratório de Sinalização Celular, exemplo de dedicação à ciência, agradeço pela honra de tê-lo como meu co-orientador.
xi
Ao Prof. Dr. João José Fagundes, Professor Livre-Docente do Departamento de Cirurgia, do Serviço de Coloproctologia da Disciplina de Moléstias do Aparelho Digestivo (FCM-UNICAMP), Mestre, que não se cansa de partilhar seu conhecimento comigo, melhorando cada dia a minha formação acadêmica.
À Profa. Dra. Maria de Lourdes Setsuko Ayrizono, Docente do Departamento de Cirurgia, Serviço de Coloproctologia da Disciplina de Moléstias do Aparelho Digestivo (FCM-UNICAMP), pela honra de tê-la como minha co-orientadora, pelo acolhimento, amizade, confiança e contribuição para o aprimoramento acadêmico e clínico que tive nesses anos de convivência.
Ao Prof. Dr. Joaquim Murray Bustorff Silva, Chefe do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas - UNICAMP, pela sua confiança no meu potencial de aluna de pós-graduação, sendo fundamental na minha formação durante o Mestrado, sempre com introdução de novos conceitos.
À Profa. Dra. Ilka de Fátima Santana Ferreira Boin, Professora Livre-Docente do Departamento de Cirurgia, Disciplina de Moléstias do Aparelho Digestivo – UNICAMP e Coordenadora da Pós-Graduação em Ciências da Cirurgia, pelo grande interesse e cuidado que teve para com minha formação de mestre.
Ao Prof. Dr. Nelson Adami Andreollo, Chefe da Disciplina de Moléstias do Aparelho Digestivo do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas –
xiii
UNICAMP, pela dedicação ao ensino médico e da pós-graduação, possibilitando a formação de profissionais capacitados.
Aos Residentes e Médicos Voluntários que me ajudaram no aprendizado da rotina do Ambulatório de Doenças Inflamatórias Intestinais do Gastrocentro - UNICAMP e em tudo que precisei, sempre interagindo com amizade.
As psicólogas, Daisy e Arlete, que compartilharam seus preciosos conhecimentos e entusiasmo com minha caminhada neste aprendizado.
À enfermeira Lucia Helena, que partilhou comigo sua preocupação e cuidados com os pacientes do Ambulatório de Doenças Inflamatórias Intestinais, Gastrocentro - UNICAMP e permitiu uma integração proveitosa da minha prática clínica.
À recepcionista Claudete que se tornou minha querida amiga nesses anos de trabalho conjunto.
Ao colaborador Rocranino, presidente da Associação dos Ostomizados de Campinas, que me permitiu entender um pouco do mundo da pessoa acometida por doença inflamatória intestinal crônica.
À Profa. Dra. Marciane Milanski e Dra. Andressa Coope, pesquisadoras do Laboratório de Sinalização Celular FCM-UNICAMP, que puderam compartilhar seus
xv
conhecimentos, competência técnica e alguns dos seus finais de semana para realizarmos os experimentos.
Aos Departamentos da FMC-UNICAMP que colaboraram para eu chegar ao resultado deste trabalho científico.
Aos meus pacientes, pelo estímulo e entusiasmo que dedicaram ao meu projeto.
Aos meus amigos que partilharam dos meus sonhos, que tiveram paciência com minha ausência e que me escutaram nos momentos de solidão durante a confecção deste texto.
Ao Ronie e Sandra, amigos que foram meus cúmplices em todas as etapas deste projeto acadêmico, ora me animando, ora me desafiando.
xvii
EPÍGRAFE
§1
“A única e elevada missão do médico é a de restabelecer a
saúde dos pacientes, ou seja, curá-los das suas enfermidades”.
Organon da Arte de Curar Hahnemann
xix SUMÁRIO RESUMO xliii ABSTRACT xlvii 1- INTRODUÇÃO 01 1.1 - Considerações Gerais 03
1.2 - O Papel da Microbiota Intestinal 05
1.2.1 - Funções da microbiota 05
1.2.2 - Microbiota e o reservatório ileal 07
1.3 – Sistema imune inato 07
1.3.1 – Defensinas 08
1.3.2 – Vias de sinalização celular dos receptores de antígenos bacterianos 09
1.4 – Toll-like receptors e RCUI 16
1.5 – Vias de sinalização celular dos Toll-like receptors no reservatório ileal 17
2.0 – OBJETIVO 19
2.1 - Objetivo Geral 21
xxi
3.0 – CASUÍSTICA E MÉTODO 23
3.1 – Casuística 25
3.1.1 – Fatores de exclusão 27
3.1.2 – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa 28
3.2 – Método 28
3.2.1 – Coleta das amostras 28
3.2.2 – Anticorpos, reagentes químicos e materiais 29
3.2.3 – Soluções utilizadas 29
3.2.4 – Extração de tecidos e imunoblot 31
3.2.5 - Determinação das bandas 35
3.2.6 – Apresentação dos dados e análise estatística 36
3.2.7 - Análise Histológica (coloração com Hematoxilina – Eosina) 37
4.0 – RESULTADOS 39
4.1- Expressão de TLR2 41
4.2 - Expressão de TLR4 45
4.3 - Expressão de p-JNK 49
xxiii
6.0 – CONCLUSÃO 61
7.0 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 65
8.0 – ANEXOS 77
8.1 – Grupo Retocolite Ulcerativa Inespecífica (RCUI) 79
8.2 – Grupo Polipose Adenomatosa Familiar (PAF) 81
8.3 – Controle 83
8.4 – Análise estatística – Caracterização da Casuística 85
8.4.1 - Grupo PAF 85
8.4.2 - Grupo RCUI 85
8.4.3 - Grupo Controle 85
8.4.4 - Análise de variância da distribuição por idade 87
8.4.5 - Análise de variância da distribuição por gênero 87
8.4.6 - Análise de variância da distribuição com relação ao tempo
pós-operatório 89
8.4.7 - Análise de variância da distribuição com relação ao tempo
de fechamento da ileostomia 89
xxiv
xxv
no grupo RCUI 91
8.6 – Mensuração do índice de atividade da ileíte do reservatório
no grupo PAF 93
8.7 – Questionário específico 95
8.8 - Hábito intestinal e continência fecal – Grupo RCUI 97
8.9 - Hábito intestinal e continência fecal – Grupo PAF 99
8.10 -Parecer de aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa 101
8.11 - Parecer do Comitê de Ética (Adendo) 103
8.12 - Termo de consentimento informado - Grupos RCUI e PAF 105
8.13 - Termo de consentimento informado - Grupo Controle 107
8.14 - Descrição da análise estatística utilizada no estudo 109
8.14.1 - Análise de variância 109
8.14.2 - Desvio do erro padrão 109
8.14.3 - Valor p 109
xxvii
LISTA DE ABREVIATURAS
______________________________________________________________________
BRS Bactérias redutoras de sulfatos
CD Células dendríticas
CEI Célula epitelial intestinal
DC Doença de Crohn
DII Doença inflamatória intestinal
DNA Ácido desoxirribonucléico
dsRNA RNA de fita dupla
DSS Dextrano-sulfato de sódio
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA Teste imunoenzimático
IL-1 Interleucina 1 IL-4 Interleucina 4 IL-5 Interleucina 5 IL-9 Interleucina 9 IL-10 Interleucina 10 IL-11 Interleucina 11 IL-13 Interleucina 13 IL-18 Interleucina 18 IL-1β Interleucina 1β
xxix
IL-1R Receptor de Interleucina-1
IFN-β interferon β
IRAK Quinase associada ao receptor de IL-1
JNK Quinase c-Jun N-terminal
Linfócito Th Linfócito T helper
LPS Lipopolissacarídeo
MyD88–TIRAP Proteína adaptadora ativada por receptor
TLR
MAPK Proteína quinase mitógeno ativador
MDP Muramil dipeptideo
M Mol
mM Milimol
NF-kB Fator de transcrição nuclear Kappa B
NOD Família de receptores intracelulares de
antígenos bacterianos
NOD1 Família de receptores intracelulares tipo 1
NOD2 Família de receptores intracelulares tipo 2
p38 MAP Proteína quinase mitógeno ativador p38
PAF Polipose adenomatosa familiar
PAMPs Resposta molecular patógeno associada
PBS Fosfato de sódio dibásico
PMSF Fluoreto de fenilmetil sulfonila
RCUI Retocolite Ulcerativa Inespecífica
xxxi
RI Reservatório ileal
RNAm Ácido ribonucléico mensageiro
rpm Rotação por minuto
PRRs Receptores de reconhecimento padrão
RT-PCR Reação de cadeia de polimerase em tempo real
SAPKs Proteína quinase ativada por estresse
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
SRB Bactérias redutoras de sulfato
ssRNA RNA de fita simples
TAK1 Quinase ativada por TGF-
TLR Toll-like receptor TLR1 Toll-like receptor 1 TLR2 Toll-like receptor 2 TLR3 Toll-like receptor 3 TLR4 Toll-like receptor 4 TLR5 Toll-like receptor 5 TLR6 Toll-like receptor 6 TLR7 Toll-like receptor 7 TLR8 Toll-like receptor 8 TLR9 µ Toll-like receptor 9 TLR11 Toll-like receptor 11
xxxiii
TNF-α Fator de necrose tumoral α
TNF-β Fator de necrose tumoral β
TRADD Domínio de apoptose associado a tumor
TRAF6 Fator associado ao receptor de TNF 6
TRIS Tri(hidroximetil)-aminometano
TOLLIP Proteína de interação com TLR
X Vezes de aumento da objetiva ocular do microscópio óptico
μg micrograma
µl microlitro
xxxv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Interação entre células do sistema imune que expressam receptores
de reconhecimento padrão e agentes microbiológicos
(Nat. Rev. Immunol 2001) 12
Figura 2. Vias de sinalização celular dos Toll-like Receptors
(apoio didático da UNICAMP – modificado por Andrade) 15
Figura 3. Limites de ressecção da cirurgia de retocolectomia total (Leal) 25
Figura 4. Aspectos do reservatório ileal em “J” no intra-operatório
(Serviço de Coloproctologia da UNICAMP) 26
Figura 5. Fragmentos de biópsias antes da homogeneização
(Laboratório de Sinalização Celular – UNICAMP) 31
Figura 6. Homogeneização dos fragmentos de tecido
(Laboratório de Sinalização Celular – UNICAMP) 32
Figura 7. Aplicação das amostras no gel de poliacrilamida
xxxvii
Figura 8. Separação das proteínas por eletroforese com fonte elétrica
a 120 volts (Laboratório de Sinalização Celular – UNICAMP) 33
Figura 9. Transferência das proteínas do gel de poliacrilamida para
a membrana de nitrocelulose (Laboratório de Sinalização
Celular – UNICAMP) 34
Figura 10. Anticorpos primários
(Laboratório de Sinalização Celular – UNICAMP) 34
Figura 11. Esquema da ligação da proteína aos anticorpos
(Laboratório de Sinalização Celular – UNICAMP) 35
Figura 12. Bandas auto-radiografadas
(Laboratório de Sinalização Celular – UNICAMP) 36
Figura 13. Análise das bandas auto-radiografadas pelo programa
Gel-Pro Analyser 6.0 (Laboratório de Sinalização
Celular – UNICAMP) 37
Figura 14. Fragmento de biópsia congelada em base de inclusão para
realização de cortes histológicos (Laboratório de Anatomia
xxxviii
xxxix
Patológica – UNICAMP) 38
Figura 15. Aspecto histológico de mucosa ileal (Controle) com coloração
em Hematoxilina e Eosina. Aumento de 200X
(Laboratório de Anatomia Patológica – UNICAMP) 38
Figura 16. Determinação da expressão protéica de TLR2 nos Grupos
Controle, PAF e RCUI (apoio didático – UNICAMP) 41
Figura 17. Determinação da expressão protéica de TLR4 nos Grupos
Controle, PAF e RCUI (apoio didático – UNICAMP) 45
Figura 18. Determinação da expressão protéica de p-JNK nos Grupos
xli
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Toll-Like receptors e seus respectivos ligantes 11
Tabela 2. Números arbitrários das expressões de TLR2 nos Grupos
Controle, PAF e RCUI 43
Tabela 3. Aspectos da análise estatística das expressões de TLR2 43
Tabela 4. Números arbitrários das expressões de TLR4 nos Grupos
Controle, PAF e RCUI 47
Tabela 5. Aspectos da análise estatística das expressões de TLR4 47
Tabela 6. Teste de Tukey-Kramer (q) para avaliação das variações do TLR4 47
Tabela 7. Números arbitrários das expressões de p-JNK nos Grupos
Controle, PAF e RCUI 51
xlii
xliii
xlv
A retocolectomia total com anastomose do reservatório ileal (RI) ao canal anal é a cirurgia de escolha para doentes com retocolite ulcerativa inespecífica (RCUI) refratária ao tratamento clínico e para a polipose adenomatosa familiar (PAF). Entretanto, a ileíte primária do reservatório é uma das complicações mais comuns após a cirurgia do RI em pacientes com RCUI, sendo rara na PAF; e somente ocorre após o fechamento da ileostomia de proteção. Neste sentido, há necessidade de estudos que avaliem a forma como as bactérias, por meio de receptores específicos, possam participar no processo inflamatório do RI. Desta forma, foi analisada a expressão dos Toll-like receptors (TLR) em mucosa do RI endoscópica e histologicamente normal em pacientes operados por RCUI e PAF, a fim de se detectar alguma anormalidade nesta via em indivíduos assintomáticos, que poderia contribuir com processo inflamatório no RI. Casuística e Método: Doze pacientes (seis com RCUI e seis com PAF) submetidos à retocolectomia total e confecção do RI em “J”, foram estudados após a reconstrução do trânsito intestinal. Foram obtidas biópsias da mucosa do RI por meio de endoscopia do mesmo. O grupo controle foi constituído por seis doentes com íleo-colonoscopia normal. As biópsias foram congeladas em nitrogênio líquido e as expressões de TLR-2, TLR-4 (receptores de reconhecimento de antígenos bacterianos) e p-JNK (fator de sinalização nuclear) foram avaliadas por meio de imunoblot de extrato protéico total. A ausência de ileíte do RI foi determinada por parâmetros clínicos, histológicos e endoscópicos, de acordo com o Índice de Atividade da Ileíte do RI (PDAI). Os pacientes não estavam em uso de medicações. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Local e os participantes assinaram o termo de consentimento informado. Utilizou-se análise de variância (ANOVA), seguida por análise de significância (Teste de Tukey-Kramer) para a análise estatística. Nível de significância adotado foi p<0,05. Resultados: Houve maior expressão de TLR-4 em mucosa de RI de doentes
xlvi
operados por RCUI, quando comparada aos grupos Controle e PAF (p<0,05). Não houve diferença estatística das expressões de TLR-2 e p-JNK entre os diferentes grupos (p>0.05). Conclusão: Pacientes com RCUI apresentaram maior expressão de TLR4 na mucosa do RI, mesmo sem evidência clínica, endoscópica e histológica de inflamação no RI. Estes achados podem explicar a tendência de ativação de vias intracelulares deflagradas por antígenos bacterianos em pacientes com RCUI, o que pode contribuir com a produção de mediadores pró-inflamatórios, sendo coadjuvante do processo inflamatório inicial na mucosa do RI.
xlvii
xlix
Introduction: Ileal pouch-anal anastomosis (IPAA) is the preferred surgical procedure for patients with refractory ulcerative colitis (UC) and familial adenomatous polyposis (FAP). However, pouchitis is the most common complication after ileal pouch-anal anastomosis (IPAA) in UC patients, being rare in FAP; and only occurs after ileostomy closure. Therefore, it is important to get more information about the role of the ileal pouch microbiota and mucosa susceptibility to inflammation. Therefore, we evaluated Toll-like receptors (TLRs) expression in normal endoscopic and histological mucosa of the ileal pouch in patients with UC and FAP, in order to find any abnormality in this pathway in asymptomatic patients, which may contribute to pouchitis. Patients and Method: Twelve patients (six with UC and six with FAP) who underwent to total rectocolectomy and “J” pouch reconstruction, were studied. Biopsies were obtained from the mucosa of the pouch by endoscopy. Normal ileum biopsies were obtained from six patients submitted to ileocolonoscopy with no abnormalities. The specimens were snap-frozen and the expressions of TLR2, TLR4 (bacterial recognition receptors) and JNK (nuclear signalization factor) were determined by immunoblot protein extract. The absence of pouchitis was assessed by clinical, histological and endoscopic parameters, according to the Pouchitis Disease Activity Index (PDAI). The patients were not under any medication. The committee approved the study and informed consent was signed by all participants. The ANOVA and Tukey-Kramer Tests were applied for statistical analysis. The level of significance was p<0.05. Results: Patients with UC had significantly higher protein levels of TLR4 than controls and FAP (p<0.05). The expressions of TLR2 and JNK were similar in the groups (p>0.05). Conclusion: Patients with UC had higher levels of TLR4, even in the absence of clinical, endoscopic and histological pouchitis. These findings may explain a tendency towards the up-regulation of intracellular pathways activated by bacterial antigens
l
in UC patients, which could contribute to the production of proinflammatory mediators, being coadjuvant of the inflammatory process in the ileal pouch mucosa.
1
Introdução
Introdução
3
1.1 – Considerações Gerais
A retocolectomia total com anastomose do reservatório ileal (RI) ao canal anal é a cirurgia de escolha para doentes com retocolite ulcerativa inespecífica (RCUI) refratária ao tratamento clínico e para aqueles com polipose adenomatosa familiar (PAF) com múltiplos pólipos retais, em geral mais do que vinte.1,2,3
A RCUI é uma inflamação intestinal crônica que afeta o cólon e reto, de etiologia não completamente estabelecida, que atinge ambos os generos, com predomínio em adulto jovem. Enquanto que, PAF é uma doença autossômica dominante que acomete indivíduos jovens e esta associada à formação de múltiplos pólipos em todo o cólon e reto, que, invariavelmente, implica em maior risco de câncer. Ambas as doenças, apesar de distintas, podem requerer o mesmo procedimento cirúrgico, como descrito anteriormente.4,5
O reservatório em “J” tem sido o mais utilizado, descrito por Utsunomiya e cols.6 , com relatos de acompanhamento por longo prazo, e suas vantagens são a facilidade na sua confecção e a maior eficácia na evacuação.
Devido ao fato da retocolectomia total com confecção de RI ser considerada uma cirurgia de grande porte e complexa, a mesma está associada à elevada morbidade, apesar de baixa mortalidade.4 A ileíte primária do reservatório ileal (bolsite) é uma das complicações mais comuns e acomete principalmente os portadores de RCUI e menos aqueles com PAF. A incidência desta complicação entre os pacientes com RCUI pode atingir até 45% nas diferentes casuísticas, enquanto que na PAF é de aproximadamente 5%.2-4,7,8 Devido à diferença na incidência da ileíte do RI entre os pacientes com RCUI e PAF, tem-se postulado que esta complicação possa ser devido a reativação da própria RCUI no RI, uma vez que vias inflamatórias ativadas na mucosa do RI são similares àquelas encontradas em mucosa colorretal de paciente com RCUI ativa.3,9
Introdução
4
A ileíte do RI pode ser aguda, de evolução com menos de três meses, ou crônica, com evolução de mais de três meses. O diagnóstico é feito por meio das manifestações clínicas, achados endoscópicos e histológicos.10-13 É caracterizada clinicamente por urgência fecal, aumento do número de evacuações, cólicas abdominais, evacuações diarréicas noturnas, podendo ser acompanhada de febre, mialgia e artralgia.14
A etiologia da ileíte do RI não é totalmente compreendida. Fatores como susceptibilidade genética, estase fecal, isquemia, deficiência de ácidos graxos de cadeia curta e presença de ácidos biliares não conjugados que são potencialmente citotóxicos para a mucosa podem estar associados.2,5,15,16
Ainda existem dúvidas se as bactérias desempenham um papel crítico na patogênese da ileíte do RI na maioria dos pacientes, mas esta apenas se desenvolve após o fechamento da ileostomia, quando ocorre, então, a exposição da mucosa do reservatório ao trânsito fecal intestinal. Além disso, há evidências clínicas de melhora da inflamação do RI com o uso de antibióticos na maioria dos casos.1-4
O descobrimento de componentes produzidos por vírus, fungos, bactérias chamados resposta molecular patógeno associada (PAMPs), como por exemplo: lipopolissacarídeos (LPS), peptidoglicanas, flagelinas e lipoproteínas, podem ser reconhecidos por uma variedade de receptores de membranas celulares recentemente descobertos, chamados receptores de reconhecimento padrão (PRRs). Incluem-se neste grupo os Toll-like receptors (TLRs), que são receptores da parede celular protéicos ou de organelas citoplasmáticas, não catalíticos e uma família de receptores intracelulares de produtos bacterianos (NOD), que ajudam no entendimento do equilíbrio imunológico da mucosa e a patogênese da inflamação. Esse sistema culmina com a produção do TNF-α que é uma das principais
Introdução
5
citocinas pró-inflamatória envolvida nas DII, quando sua expressão se encontra exacerbada a partir de estímulos intra-luminais e por mecanismo ainda não bem esclarecido.17,18, 19
1.2 - O Papel da Microbiota Intestinal
O intestino constitui um complexo ecossistema que inclui uma microbiota variada. Estima-se que a população de microorganismo no intestino humano seja de cem bilhões de bactérias, com grande variedade de espécies. O estômago e intestino delgado albergam um reduzido número de microorganismos, tanto aqueles aderidos à mucosa quanto aqueles que são transitórios. O peristaltismo e as secreções gástricas, biliares e pancreáticas destroem grande parte dos microorganismos ingeridos. O número de bactérias aumenta progressivamente no jejuno e íleo, com predomínio de bactérias gram negativas aeróbicas e algumas anaeróbicas. No cólon, o tempo do trânsito é lento e o número de microorganismo aumenta até ao redor de 1011 unidades formadoras de colônias por grama de fezes.20
1.2.1 - Funções da microbióta
Atualmente se entende que as funções de digestão, nutrição e imunológica do tubo digestivo não dependem apenas das estruturas próprias (barreira mucosa, glândulas secretoras, sistema imune mucosa), mas dependem também da microbiota intestinal. Esta é perfeitamente integrada à fisiologia do hospedeiro e esta interação vai condicionar a homeostase do indivíduo com o meio externo.21
A microbiota intestinal apresenta algumas funções simbióticas com seu hospedeiro, como por exemplo:
Função na nutrição e metabolismo: recuperação de energia em forma de ácidos graxos de cadeia curta após digestão de carboidratos resistentes e
Introdução
6
fibras não digeríveis e de aminoácidos através da digestão da uréia, produção de vitaminas, tais como: vitamina K, vitamina B12, biotina, ácido fólico e ácido pantotênico e efeitos favoráveis na absorção de cálcio, magnésio e ferro.21
Função de proteção: prevenindo a invasão de agentes infecciosos e o supercrescimento de espécies residentes com potencial patogênico.21
Funções tróficas sobre o crescimento e diferenciação do epitélio intestinal, além do desenvolvimento e modulação do sistema linfóide intestinal, por meio da interação da microbióta presente com os mecanismos imunes locais e sistêmicos de adaptação. Desta forma, a colonização bacteriana é essencial para o desenvolvimento do sistema imune, influenciando na carga antigênica ambiental e no desenvolvimento da tolerância imune oral dos mamíferos. A colonização do intestino no parto vaginal e o aleitamento materno que contém Lactobacilus sp são os primeiros desafios imunológicos enfrentado pelo recém-nascido e promove um impacto na ativação do sistema imune inato.21
A microbiota é classificada em nativa ou transitória dependendo do tempo em que o microorganismo permanece no ecossistema.Sua composição e densidade podem ter efeitos importantes no desenvolvimento, não apenas da ileíte do reservatório, como também de doenças auto-imunes, mesmo que não haja contato direto entre a microbiota e o terreno afetado pela doença auto-imune.21
Introdução
7
1.2.2 - Microbiota e o reservatório ileal
Estudos da composição da microbiota do lúmen intestinal em pacientes com ileíte do reservatório, usando cultura e técnica de biologia molecular mostraram uma diminuição do número de Bifidobacterium e Lactobacillus spp e um aumento de Bacteroides e
Escherichia coli (E. coli), ambas enteropatogênicas. Essa disbiose induz a ruptura do
balanço entre espécies protetoras e prejudiciais e pode promover inflamação. Esses pacientes podem ter um aumento do número de bactérias associadas à mucosa quando comparados ao controle e essa desregulação pode ser localizada ou generalizada. A causa pode envolver diminuição das bactérias benéficas, aumento do número de bactérias enteropatogênicas ou diminuição da biodiversidade. Isso pode levar a infecção das placas de Peyer, agregação de linfócitos, formação de úlceras, microabcessos, fissuras e linfangite.2,4,16,22,23
1.3 – Sistema imune inato
O mecanismo imune inato mostra-se de fundamental importância na defesa do hospedeiro na interface com o meio externo. Tem sido refinado há mais de um bilhão de anos durante a evolução e uma significativa fração do genoma do hospedeiro é voltado para a defesa.4,24.
Uma camada de células epiteliais intestinais (CEI) forma a primeira barreira de proteção e que separa o tecido do hospedeiro da população bacteriana do lúmen intestinal e apresentam ações coordenadas com os sistemas imunes: inato e adquirido. Mecanismos de imunidade inata regulam esse relacionamento e contribui para proteção do hospedeiro contra a translocação bacteriana.4,17
Introdução
8
CEI são células estrutural e funcionalmente polarizadas, tendo como consequência o fato de que a composição lipídica e protéica da membrana luminal possa ser diferente da composição da membrana basolateral, o que mantém a polaridade celular nos domínios funcionais imunológicos do intestino.25
Fazem parte do sistema imune inato:
1- não somente células de defesa, como por exemplo: os macrófagos presentes na lâmina própria intestinal,
2- algumas proteínas que agem contra diversos microorganismos, entre elas: as defensinas,
3- e receptores bacterianos, dentre eles os de membrana celular que reconhecem antígenos microbiológicos chamados TLR.26
1.3.1 – Defensinas
Defensinas são um dos mais importantes componentes do sistema imune inato e apresentam-se como duas formas: α e β, e desempenham um papel significativo no controle da microbiota. Sabe-se que as β–defensinas ativam células mononucleares em sangue periférico através da ligação com TRL1 e TLR2, interagindo com o sistema de reconhecimento microbiológico.26,27 Defeitos nesses mecanismos podem permitir aumento da microbiota cólica normal e de bactérias aeróbicas adicionais, além de fungos. Isso pode determinar uma resposta inflamatória exacerbada na mucosa intestinal, observada após cirurgia de restabelecimento do trânsito intestinal em pacientes com RI, quando ocorre exposição da mucosa intestinal ao conteúdo fecal. Em função desta exposição, ocorre metaplasia da mucosa e aumento de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1α e IL-1β) de
Introdução
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maneira mais destacada nos pacientes com RCUI. Diferentemente, nos doentes operados por PAF, o mesmo estudo apontou a diminuição dos níveis de defensinas.1,2,28,29
Um dos marcadores da colonização de bactérias no RI é a expressão das sulfomucinas, proveniente das bactérias redutoras de sulfato (SRB), que foi encontrada em níveis maiores na mucosa de portadores de RCUI, quando comparada à PAF, relatado por Bambury e cols.2
1.3.2 – Vias de sinalização celular dos receptores de antígenos bacterianos
Uma variedade de produtos bacterianos e fúngicos chamados de resposta molecular patógeno associada (PAMPs) foram identificados como ligantes a receptores de membrana da CEI chamados receptores de reconhecimento padrão (PRRs), entre os quais, a família dos Toll-like receptors (TRL). Os TLR são responsáveis pela maior parte da vigilância da barreira intestinal promovida pelo sistema imune inato, estando no centro do reconhecimento e da resposta aos antígenos externos.30,31 Enquanto sinalização do TLR parece ser o ponto principal da resposta imune, as proteínas de reconhecimento padrão do citossol NOD parecem ser as responsáveis pela regulação da homeostase por meio da ativação do NF-κB.17,18,20,32 Algumas mutações nessa área produzem defeitos na detecção dos produtos das bactérias e predispõe a infecções recorrentes no hospedeiro, bem como, à perpetuação de inflamação intestinal crônica.8
O grupo de proteínas TLR receberam este nome devido à similaridade com a proteína codificada pelo Toll-gene identificado em Drosophila melanogaster por Nüsslein-Volhard e Wieschaus em 198032 e, no início de 1997, Janeway e cols33 foram os primeiros pesquisadores a reportar o primeiro homólogo da proteína Toll-gene Drosophyla, tanto em humanos como em outros mamíferos.34
Introdução
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Existem onze TLR humanos e apenas quatro proteínas transdutoras de sinal são conhecidas (TRAM, TRIF, TRAP e Myd88). Isto aponta, em alguns casos, que o sistema pode ser composto por diferentes partes e que ampliam a especificidade das moléculas que são reconhecidas.24
TLR estão expressos na superfície de monócitos, macrófagos, células dendríticas (CD).18,30 Além dessas, estudos recentes demonstraram que estão presentes também nas células endoteliais, cardíacas, miócitos, linfócitos T e nas CEI.25, 30
Já os NOD são receptores com composição química específica e sensores para várias moléculas associadas à patógenos. São receptores intracelulares, sendo que o NOD1 detecta ácido lanthionina meso-diaminopimelico (meso-DAP) e ácido γ-D-Glu-meso-diaminopimelico (iE-DAP) produzidos por bactérias gram-negativas e NOD2 detecta muramil dipeptídeo (MDP) que é secretado por bactérias positivas e gram-negativas.18
Existe evidência de que as famílias de proteínas NOD e TLR trabalham em sinergismo induzindo a produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-1β. Quando há uma mutação no NOD2 levando à diminuição de sua expressão, porém com sinalização de TRL2 adequado, pode haver aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias pelos macrófagos. Essa evidência pode mostrar uma alteração na função imunomoduladora dessas duas moléculas que podem se apresentar alteradas em alguns pacientes com DII.18
Uma vez os TLR estejam ativados, ocorre sinalização celular que culmina na ativação dos fatores de transcrição nuclear NF-КB e p-JNK, que atuam no núcleo celular, induzindo a produção de fatores pró-inflamatórios.30-32.
Introdução
11
TLR Produtos Bacterianos (PAMPs)
TLR1 Triacil lipopeptídeos TLR2 Lipoproteina, lipopeptídeos (Pam3CysSerLys4) TLR3 dsRNA TLR4 LPS (lipopolissacarídeo) TLR5 Flagelina TLR6 Diacil lipopeptídeos TLR7/TLR8 ssRNA TLR9 No-metilato CpG DNA
TLR11 Componente da bactéria uropatogênica
Introdução
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Figura 1. Interação entre células do sistema imune que expressam receptores de
reconhecimento padrão (PRRs) e agentes microbiológicos (PAMPs)
Além disso, a desregulação dos receptores TRL pode estar associada com aumento ou diminuição da susceptibilidade à infecção por vários patógenos. Em contra partida, sinalização excessiva ou inapropriada dos TLR pode estar associada a processos patológicos.12,18
Os TLR constituem uma classe de proteínas que representam papel primordial no sistema imunológico inato. São receptores protéicos transmembrana celular (TLR1, 2, 4, 5, 9) ou intracelular nas organelas (TLR3, 7 e 8), não catalíticos, estimulados por moléculas derivadas de bactérias, vírus, fungos.19, 20, 30
Introdução
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TLR2 e TLR4 são essenciais para o reconhecimento de diferentes componentes de produtos bacterianos chamados PAMPs.9,30
Foi demonstrado que o TRL4 está presente na CEI fetal, neonatal e adulta, e por estar pouco ativa, permite o desenvolvimento da tolerância imunológica durante a colonização do trato gastrointestinal neonatal por bactérias simbióticas sem ocorrência de inflamação crônica.9,30
TLR2 discrimina moléculas de bactérias gram positivas, tais como: peptideoglicanos, lipoproteínas, poliarabinomam e zimosan ou da membrana celular de fungos. TLR4 reconhece lipopolissacarídeos e taxol.30, 31
A sequência da cascata intracelular do TLR2 e TLR4 está bem descrita e é semelhante em diferentes espécies.30, 31
TLR4 é o único receptor conhecido que tanto ativa a cascata MyD88-dependente como a independente. Seu ligante é o LPS e o sinal de iniciação da cascata requer a presença da proteína CD14.30 Componentes das famílias de TLR e do receptor de Interleucina-1 (IL-1R) fazem parte do sistema de sinalização celular, incluindo a proteína adaptadora ativada por receptor de TLR (adaptador MyD88), proteína de interação Toll (TOLLOP), a proteína quinase associada ao receptor de IL-1 (IRAK) e fator associado ao receptor de TNF 6 (TRAF6). TRAF6 pode ativar NF-КB através da quinase ativada por TGF-β (TAKI) e de p-JNK. O sinal do TLR4 através do domínio citoplasmático TIR em adição ao MyD88-TIRAP ativa a via MyD88-independente no final da cascata do TLR4 (Figura 2).31
A quinase c-Jun N-terminal (JNK) é um dos quatro membros da família MARK, proteína quinase ativadora de mitogênese. É codificada por três locis gênicos diferentes e composta por proteínas citoplamáticas com capacidade de fosforilar a c-Jun o que leva ao
Introdução
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estímulo do fator de transcrição AP-1, um ligante heterodímero de DNA que ativa a transcrição do gene-alvo dependente da AP-1 com transcrição do RNA mensageiro, induzido a regulação de várias funções intracelulares da fisiologia dos mamíferos, tais como: rearranjo do citoesqueleto, ubiquinação protéica, secreção de citocinas pró-inflamatórias, produção de óxido nítrico e peptídeos antimicrobianos; promoção da proliferação, reparação e metabolismo do DNA, estimulação da diferenciação do linfócito T, regulação negativa do sinal de insulina, controle da deposição de gordura, degradação celular epitelial, sobrevivência e morte celular. Diversas doenças podem estar implicadas na cascata de JNK como: obesidade, doenças auto-imunes, Alzheimer, Parkinson, hipertrofia cardíaca e isquemia, doença hepática.12,32,37-40
As proteínas JNK são ativadas por uma variedade de estresses do meio ambiente, como por exemplo: exposição da mucosa gástrica ao etanol, radiação ultravioleta, lipopolissacarídeos (LPS) e outros produtos bacterianos e estímulos endógenos, tais como: citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1), oncoproteínas ativadoras Ras e Src, fatores de crescimento, dano tecidual após infarto agudo do miocárdio, hipóxia e isquemia/reperfusão.37,40
JNK constitui papel-chave da regulação da ativação do linfócito T e na expressão do gene da IL-2. Essa co-estimulação sugere o envolvimento da estimulação do fator de transcrição nuclear AP-1 que se liga a vários receptores de IL-2. Após diferenciação do linfócito T no timo, o linfócito T helper (CD4) se divide em duas linhagens: o linfócito Th1 que secreta as citocinas: IFN-γ e TNF-α, importantes na resposta imune contra vírus e outros fatores intracelulares. O linfócito Th2 secreta as citocinas IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-11 e IL-13 que estão envolvidas na coordenação da resposta imune humoral contra patógenos extracelulares.37
Introdução
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Introdução
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1.4 - Toll-like Receptors e RCUI
Identificou-se uma disfunção na resposta imune inata em pacientes com RCUI, que quando expostos a bactérias provoca uma resposta inflamatória exuberante e prolongada.41 O detalhamento in vitro, identificou que a resposta da via de sinalização do TLR4-TRIF dependente em macrófagos ao LPS estava defeituosa, mas não na resposta de TLR2, 3, 5 e 6. Este defeito resultou na elevação do IFN tipo I e em estimulação de genes associados ao recrutamento e ativação dos leucócitos. Esta resposta anormal pode desempenhar um papel no estado inflamatório crônico da RCUI e na ileíte do RI. Rakoff-Nahoum e cols.40 mostraram que a via de sinalização celular TLR com seu adaptador intracelular Myd88 é essencial para que ocorra inflamação da mucosa intestinal em ratos deficientes de IL-10.
Heimesaat e cols.42 referiram que ocorre uma menor translocação bacteriana durante inflamação da mucosa intestinal e que possivelmente esta é limitada pela atividade do TLR4.
Trabalho de Kasper e cols.43 demonstrou que bactérias e seus produtos, tal qual o LPS, são importantes na etiologia da inflamação intestinal crônica, mas que a reação do sistema imunológico do hospedeiro comporta-se diferente no organismo com fisiologia preservada, induzindo a produção de IgA com proteção na mucosa intestinal e nos indivíduos com RCUI, onde se observa a produção de citocinas pró-inflamatórias neste mesmo sítio.
Introdução
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1.5 – Vias de sinalização celular dos Toll-like Receptors no reservatório ileal
Há poucos estudos avaliando a expressão de TLR em RI, bem como a relação da expressão desses receptores de antígenos bacterianos com o processo inflamatório no RI.
Gribar e cols.44 mostraram dois fatores presentes na inflamação intestinal: hipóxia e altas concentrações de endotoxinas promovem o aumento do TLR4, tanto in vivo, como in
vitro.
Estudos de Yu e cols.45 mostraram que a expressão de TLR4 e NF-КB foi significativamente maior em mucosa de pacientes com ileíte do RI. Por outro lado, Lammers e cols.46 fizeram um estudo imunoistoquímico e verificaram que a expressão de TLR2 estava aumentada na ileíte do RI, e que o TLR4 estava aumentado na mucosa normal e na inflamada do RI, entretanto, não houve comparação com mucosa de RI de pacientes com PAF.
Scarpa e cols.47 estudaram um grupo de pacientes com RI e demonstraram que a expressão de TLR2 e TLR4 estava aumentada no grupo com inflamação crônica do RI em comparação com aqueles indivíduos com apenas uma crise de inflamação do RI. Alteração do gene do TLR1 mostrou-se como um dos fatores relacionados ao desenvolvimento da ileíte do RI em um estudo com 80 doentes com RCUI que apresentaram pelo menos um episódio dessa complicação após a cirurgia, reforçando o papel dos antígenos bacterianos neste contexto.48
Um estudo feito por Heuschen e cols.49 com pacientes operados devido RCUI, tanto com ileíte do RI como com mucosa normal, mostrou expressão diminuída de TLR3 em ambos os grupos, uma expressão aumentada de TLR5 no grupo com ileíte do reservatório em comparação com aqueles sem inflamação e não encontrou diferenças estatisticamente
Introdução
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significativas quanto à expressão de TLR2 e TLR4, apesar dos níveis de TLR4 serem maiores naqueles com ileíte do RI. Esses resultados levaram os autores a concluirem que, naquela população, a infecção por bactérias gram negativas flageladas era importante.12
Além disso, o polimorfismo genético dos TLR2 e TLR4 entre diferentes etnias pode contribuir para o entendimento das diferenças da incidência de ileíte do reservatório entre diversas populações.50
Desta forma, a ileíte primária do RI, por ser a complicação da cirurgia do RI cuja etiologia não é totalmente elucidada, tem sido pesquisada do ponto de vista molecular, no sentido de aprimorar o conhecimento das principais vias inflamatórias envolvidas, além do mecanismo de reconhecimento de antígenos no lúmen intestinal. A avaliação de RI com características endoscópicas e histológicas normais pode fornecer subsídios para o entendimento do processo inflamatório molecular inicial, bem como entender as diferenças no seguimento pós-operatório dos pacientes com RCUI e PAF.
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Objetivos
Objetivos
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2.1 - Objetivo Geral
Avaliar doentes portadores de RCUI e de PAF, submetidos à retocolectomia total com RI, quanto à presença de possíveis fatores envolvidos na atividade inflamatória na mucosa dos reservatórios endoscopicamente normais, relacionada aos antígenos bacterianos.
2.2 - Objetivo Específico
Avaliar a expressão de receptores de antígenos bacterianos TLR2 e TLR4 e do fator de transcrição nuclear p-JNK, em fragmentos de mucosa de RI endoscópica e histologicamente normais de doentes operados por RCUI e PAF.
Objetivos
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Casuística e Método
Casuística e Método
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3.1 – Casuística
Foram selecionados 12 doentes que foram submetidos à retocolectomia total com confecção de RI em “J”, operados no período de 1992 à 2002 pelo Serviço de Coloproctologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), sendo seis portadores de RCUI (Grupo RCUI) e seis de PAF (Grupo PAF). Os RI em “J” com 15cm de exrensão foram confeccionados com sutura manual utilizando-se fio de poligalactina 3,0. A anastomoutilizando-se reutilizando-sevatório-anal foi realizada no tempo perineal com sutura manual utilizando-se o mesmo fio após mucosectomia. Todos os pacientes foram submetidos a ileostomia de proteção.
Os pacientes participantes deste estudo estavam em seguimento no ambulatório de DII, e os do Grupo Controle eram pacientes dos outros ambulatórios do Serviço de Coloproctologia da UNICAMP.
Casuística e Método
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Figura 4. Aspectos do reservatório ileal em “J” no intra-operatório
O Grupo Controle foi constituído de seis doentes submetidos à colonoscopia cujo exame foi normal, e foram coletadas biópsias de íleo distal sem alterações endoscópicas. Todos concordaram voluntariamente em participar do estudo, permitindo biópsias durante o procedimento, as quais foram em número de seis em cada procedimento.
Os doentes incluídos no estudo, com determinação do gênero, idade, especificação do tempo de acompanhamento após a retocolectomia total e confecção do RI, o tempo da reconstrução do trânsito intestinal com o fechamento da ileostomia de proteção e a indicação cirúrgica estão listados nos Anexos 8.1 e 8.2. O Grupo Controle foi caracterizado no Anexo 8.3.
Quanto aos doentes com RCUI, 50% eram do sexo feminino, com média de idade de 50,5 (36-63) anos, enquanto que 50% dos portadores de PAF eram do sexo feminino, com média de idade de 35,5 (21- 59) anos. O tempo médio de acompanhamento dos doentes após a cirurgia do RI foi de 81 (30-168) meses, sendo 87 meses para os doentes com RCUI e 75 meses para aqueles com PAF e o tempo médio de pós-operatório do fechamento da ileostomia foi, respectivamente, de 75 (30-144) meses e de 68,3 (50-82) meses. (Anexo 8.4). Os doentes não estavam em uso de medicações e não haviam tido
Casuística e Método
27
episódio prévio de ileíte do reservatório. Todos os doentes portadores de RCUI e PAF obtiveram índice de atividade da ileíte do reservatório mensurados de acordo com Sandborn e cols.10, menor que sete, portanto considerados sem ileíte. (Anexos 8.5, 8.6). A análise histológica por meio da coloração de Hematoxilina e Eosina à microscopia óptica evidenciou presença de poucos poliformonucleares neutrófilos na lâmina própria, sem evidências de agressão epitelial. Não foram observados lesões ulceradas ou abscessos em cripta.
Os grupos foram submetidos a um questionário específico com os fatores de inclusão. (Anexo 8.7).
O hábito intestinal e a continência fecal foram avaliados por meio de questionário específico. Os resultados estão descritos nos anexos 8.8 e 8.9.
As indicações cirúrgicas dos doentes com RCUI foram: displasia de alto grau nas biópsias de seguimento endoscópico, megacólon tóxico, intratabilidade clínica. (Anexo 8.1) A indicação da retocolectomia total nos doentes com PAF esteve ligada à presença de numerosos pólipos no reto, em geral, mais que 20 pólipos adenomatosos. (Anexo 8.2.)
3.1.1 – Fatores de exclusão
Excluíram-se os doentes com evidência clínica e/ou endoscópica de ileíte do reservatório. Para tanto, os sintomas considerados para o diagnóstico clínico de ileíte do reservatório foram: febre, mialgia, aumento súbito do número de evacuações com ou sem sangue. Os critérios endoscópicos utilizados foram: presença de enantema com ou sem erosões, apagamento da trama vascular submucosa, friabilidade da mucosa, presença de exsudato ou úlceras. Excluíram-se também os doentes com menos de um ano de
Casuística e Método
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fechamento da ileostomia. Desta forma, todos os reservatórios ileais, assim como, o íleo distal dos pacientes do grupo controle foram considerados endoscopicamente normais.
3.1.2 – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP como adendo do parecer registrado sob no 543/2005 (Anexos 8.10 e 8.11). Todos os participantes assinaram o termo de consentimento informado (Anexos 8.12 e 8.13).
3.2 – Método
3.2.1 – Coleta das amostras
Os pacientes foram submetidos à endoscopia do RI no Serviço de Colonoscopia (GASTROCENTRO – UNICAMP) e foram coletadas seis biópsias do íleo distal de indivíduos do Grupo Controle e, naqueles com RI, foram feitas seis biópsias na porção média do reservatório ileal, a 10cm da margem anal. Os aparelhos utilizados foram videocolonoscópios das marcas Fujinon® ou Olympus®.
Logo após a biópsia, as amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas à –80ºC em freezer para posterior análise histológica (avaliação de inclusão/exclusão) e da expressão protéica por imunoblot.
Casuística e Método
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3.2.2 – Anticorpos, reagentes químicos e materiais
Os reagentes e aparelhos para realização de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio foram adquiridos da Bio-Rad® (Richmond, CA). Metano hidroximetilamina (TRIS), fenil-metilsufonilfluoreto (PSMF), aprotinina e ditiotreitol (DTT), Triton X-100, TWEEN 20, e glicerol foram fornecidos pela Sigma Chemical Co®. (St. Louis, Mo, USA). A membrana de nitrocelulose (BA85, 0,2μm) e a proteína A Sepharose 6 MB foram obtidas de Amersham® (Aylesbury, UK). O anticorpo específico anti-phospho-SAPK/JNK (#9251, Thr183/Tyr185, Mouse) foi obtido da Cell Signaling Technology®, e os anticorpos anti-TLR2(S-16) (sc 16237) e anti-TLR4(H-80) (sc-10741) foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology®.
3.2.3 – Soluções utilizadas
Tampão de extração: utilizado para a extração das proteínas celulares dos tecidos estudados, contém: trisma base pH 7,5 (hidroximetil amino metano) 100mM, SDS (dodecil sulfato de sódio) 10%, EDTA (ácido etileno-diamino metano) 10mM, fluoreto de sódio 100mM, pirofosfato de sódio 10mM, ortovanato de sódio 10mM, acrescentado no momento de utilização do tampão.
Solução tampão de extração B, para imunoprecipitação: utilizada para extração de proteínas celulares dos tecidos estudados, que são posteriormente imunoprecipitadas. Contém: trisma base 100mM, pirofosfato de sódio 10mM, fluoreto de sódio 10mM, PMSF 2mM (diluído em álcool etílico) , triton X-100 1% e 0,1 mg/ml de aprotinina. A solução foi
Casuística e Método
30
mantida a 4°C, sendo que o ortovanato, o PMSF e a aprotinina foram acrescidos no momento do uso.
Tampão de Laemmli (5x): usado para estocar o material extraído e sua posterior aplicação no gel de policrilamina para eletroforese (SDS-PAGE), contém: azul de bromofenol 0,1%, fosfato de sódio 1M pH 7,0, glicerol 50% e SDS 10%.
Solução tampão utilizada na eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) contém: Trisma base 200mM, glicina 1,52M, EDTA 7,18mM e SDS 0,4%. Para uso, a solução é diluída 1:4.
Solução tampão para transferência: empregada para a transferência das proteínas separadas no SDS-PAGE para a membrana de nitrocelulose, contém: Trisma base 25mM, glicina 192mM, Metanol 20% e SDS 0,02% para facilitar a diluição de proteínas de alto peso molecular. Foi mantida estocada a 4°C.
Solução tampão para SDS-PAGE – Gel de resolução (resolving): tampão composto de EDTA 4mM, SFS2%, Trisma base 750mM com pH ajustado para 8,9 com ácido clorídrico.
Solução tampão para SDS-PAGE – gel da fase de empilhamento (stacking): das proteínas contém: EDTA 4mM, SDS 2%, Trisma Base 50mM, com pH ajustado para 6,7 com ácido fosfórico.
Solução basal: solução básica utilizada para o manuseio da membrana de nitrocelulose após transferência das proteínas contém: cloreto de sódio 150mM, Trisma base 10mM, Tween 20 0,02%.
Solução bloqueadora: albumina 5% e azida sódica 0,02%, dissolvidos em solução basal ou solução com leite em pó desnatado e azida sódica 0,02% dissolvidos em solução basal.
Casuística e Método
31
Solução tampão para lavagem do imunoprecipitado contém: trisma base 100mM, EDTA 10mM, ortovanato de sódio 2mM e triton X-100 0,5%.
Solução para anticorpos: solução contendo anticorpos específicos que identificam as proteínas transferidas para a membrana de nitrocelulose. Contém 3% de leite em pó desnatado e azida sódica 0,02% diluídos em solução basal.
3.2.4 – Extração de tecidos e imunoblot
Fragmentos obtidos a partir de biópsias endoscópicas de RI e de íleo distal foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenados à – 80°C, no Laboratório de Sinalização Celular – FCM-UNICAMP, para posterior homogenização em tampão de imunoprecipitado contendo 1% de Triton X100, 100mM de Tris (pH 7,4), 100mM de pirofosfato de sódio, 100mM de fluoreto de sódio, 100mM de EDTA, 10mM de vanadato de sódio, 2mM de PMSF e 0,1mg/ml de aprotinina a 4°C, com PolytronPTA 20s em velocidade máxima por 30 segundos (modelo PT10/35, Brinkmann Instruments®, Westbury, NY).
Casuística e Método
32
Figura 6. Homogeneização dos fragmentos de tecido
O homogeneizado foi então, centrifugado a 11.000 rotações por minutos (rpm) por 20 minutos, a 4°C. Removeu-se 20 µl do sobrenadante, acrescentou-se biureto e foi determinada a concentração de proteína utilizando o método de Bradford,51 por meio de espectofotometria. Fizeram-se três leituras de cada amostra e utilizou-se o valor médio dessas medições.
O restante do sobrenadante das amostras de extrato total foi guardado com tampão Laemmli e DTT para proteína ficar reduzida à estrutura primária e voltou para o frezer à –80°C, ficando disponível para os experimentos de imunoblot.
Posteriormente, preparou-se amostra contendo 100μg de proteína total para ser utilizado nos experimentos de immunoblot e separação por SDS-PAGE. As amostras foram diluídas em tampão de Laemmli contendo 100mMol/L. Após rápida fervura, foram aplicadas em gel de poliacrilamida para separação por eletroforese (SDS-PAGE). As proteínas separadas em SDS-PAGE foram transferidas para membranas de nitrocelulose, em aparelho de transferência da BIO-RAD.
Casuística e Método
33
Figura 7. Aplicação das amostras no gel de poliacrilamida
Figura 8. Separação das proteínas por eletroforese com fonte elétrica a 120 volts
Casuística e Método
34
Figura 9. Transferência das proteínas do gel de poliacrilamida para a membrana de
nitrocelulose
As membranas de nitrocelulose foram incubadas “overnight” com 10µl de anticorpo primário específico a - 4°C.
1- Anticorpo anti-TLR2 (S-16): sc-16237, Santa Cruz Biotechnology®. 2- Anticorpo anti-TRL4 (H-80): sc-10741, Santa Cruz Biotechnology®. 3- Anticorpo anti-Phospho-SAPK/JNK: #9151, Cell Signaling Technology®.
Casuística e Método
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A ligação do anticorpo a proteínas não-específicas foi minimizada pela pré-incubação da membrana de nitrocelulose com tampão de bloqueio (albumina 5%) por 90 minutos.52,53
3.2.5 - Determinação das bandas
Após incubação com anticorpo primário específico, foi realizada incubação com anticorpo secundário, que possui em sua porção Fc uma peroxidase, que é uma enzima que se ligará ao reagente da reação de quimioluminescência que contém luminol, produzindo luz, que será captada através de auto-radiografia.
O sinal foi detectado por meio de reação de quimioluminescência (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate from Pierce Biothecnology®, Inc. Rockford).
Figura 11. Esquema da ligação da proteína aos anticorpos
proteína estudada
Anticorpo primário
Casuística e Método
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Figura 12. Bandas auto-radiografadas
A expressão das proteínas estudadas foram comparadas com a expressão da β-actina.
3.2.6 – Apresentação dos dados e análise estatística
Os resultados foram apresentados em unidades arbitrárias, como comparações diretas das bandas protéicas nas auto-radiografias, as quais foram quantificadas por meio de densitometria usando o programa “Gel-Pro Analyser 6.0” (Exon-Intron Inc. Farrell®
, MD). Os resultados foram notificados como média, com variação do erro padrão. Foi utilizada análise de variância (ANOVA), seguida por análise de significância (Teste de Tukey-Kramer). Nível de significância adotado foi p<0,05. (Anexo 8.14)
Casuística e Método
37
Figura 13. Análise das bandas auto-radiografadas pelo programa “Gel-Pro Analyser 6.0”
3.2.7 - Análise Histológica (coloração com Hematoxilina – Eosina) para cacterização da casuística
Foi realizada base de inclusão do fragmento de biópsia previamente congelado e armazenado a -80ºC, e utilizado gel de inclusão da Thermo Fisher Scientific®, Inc. (MA, USA). Realizaram-se cortes histológicos de 5 micra (μm) de espessura no Criocut (Modelo CM 1900; Leica®, Germany) e colocação em lâminas de vidro do tipo silanizadas da EasyPath Erviegas® (SP, Br). Passagem da lâmina no corante Hematoxilina por 20 segundos, lavagem em água corrente, seguida de passagem no corante Eosina por 10 segundos, com nova lavagem em água corrente. Seguiram-se quatro passagens no álcool
Casuística e Método
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absoluto anidro 99,3º INPM da Chemco® (SP, BR) e três passagens no xilol da Chemco® (SP, Br). Montagem das lâminas com resina Entellan (Merck®, cód. 7961).54
A análise do grau de inflamação foi de acordo com o Índice de Atividade da Ileíte do RI (PDAI), por meio de microscopia óptica.10
Figura 14. Fragmento de biópsia congelada em base de inclusão para realização de
cortes histológicos
Figura 15. Aspecto histológico de mucosa ileal (Controle) com coloração em
39
Resultados
Resultados
41
4.1 - Expressão de TLR2
A expressão do receptor de reconhecimento padrão TLR2 foi similar em todos os Grupos (p<0,05). Apesar de haver tendência de essa expressão ser maior no Grupo RCUI quando comparada aos demais Grupos, não houve concordância estatística. Foi utilizada a expressão de β-actina para se padronizar a concentração de proteínas das amostras. (Figura 16)
Figura 16. Determinação da expressão protéica de TLR2 nos Grupos Controle, PAF e
RCUI. Para fins de ilustração cada banda representa um paciente. Para todas as condições, n=6, *p<0,05 vs Controle, § p<0,05 vs FAP
Resultados
Resultados
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Amostra Controle PAF RCUI 1 263,58 2091,8 2349,60 2 687,71 788,45 1173,00 3 58,11 51,06 114,48 4 302,66 360,95 248,67 5 277,41 914,96 1481,00 6 292,35 578,74 1300,50
Tabela 2. Números arbitrários das expressões de TLR2 nos Grupos Controle, PAF e RCUI
Grupo Número das Amostras
Média Desvio-Padrão Erro padrão da média
Controle 6 313,64 204,75 83,59
PAF 6 797,66 287,94 683,60
RCUI 6 1111,2 830,36 1236,8
Resultados
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4.2 - Expressão de TLR4
A expressão do receptor de reconhecimento padrão TLR4 foi maior no Grupo RCUI em comparação com os Grupos PAF e Controle, sendo estatisticamente significativa (p<0,05). Foi utilizada a expressão de β-actina para se padronizar a concentração de proteínas das amostras. (Figura 17)
Figura 17. Determinação da expressão protéica de TLR4 nos Grupos Controle, PAF e
RCUI. Para fins de ilustração cada banda representa um paciente. Para todas as condições, n=6, *p<0,05 vs Controle, § p<0,05 vs FAP
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