Metabolismo do DNA
• Replicação do DNA
• fidelidade + velocidade
• Reparo
• múltiplos processos - resolução de danos
• Recombinação
• rearranjo da informação genética - aumento da diversidade
• Três etapas: (1) iniciação da cadeia, (2) ampliação, ou alongamento, da cadeia, (3) término da cadeia
Fidelidade da Replicação
• Modelo Watson & Crick: • dupla fita
• complementares e antiparalelas • pareamento estrito de bases
• Conceito de “molde”
Universalidade de processo e mecanismos de catálise para todos os organismos estudados
Síntese de um novo filamento em grande velocidade Em humanos:
Síntese com alta precisão
1 erro / 1.000.000.000 (bilhão) de nucleotídeos incorporados
• 3.000 nucleotídeos / minuto
Em bactérias:
• 30.000 nucleotídeos / minuto
Watson e Crick (1953)
Modelo da Dupla Hélice Sugeria duplicação
semiconservativa
Fitas velhas - molde
Fitas velhas - molde
Fitas novas
• A replicação do DNA é semiconservativa
• a replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente
• a síntese de DNA ocorre na direção 5’ → 3’ e é semidescontínua
Hipótese 1
Semiconservativa
Hipótese 2 Hipótese 3
Conservativa Dispersiva
meio com N pesado (15N) meio com N leve (14N) DNA pesado (15N) DNA híbrido (15N/ 14N) DNA leve (14N) DNA híbrido Molécula mãe original Primeira geração de moléculas filhas Segunda geração de moléculas filhas Centrifugação em gradiente de densidade de CsCl
Replicação conservativa
1a geraçãoReplicação dispersiva
1a geração 2a geraçãoMeselson e Stahl (1958)
E. coli
Regras Fundamentais
A replicação tem uma
(ou +) origem (s) e
Origem de Replicação
• Seqüência nucleotídica variável
• únicas X múltiplas
• múltiplas repetições curtas
• proteínas ligantes (organização do sítio)
• ↑ conteúdo AT
Para as fitas velhas funcionarem como molde, a dupla hélice precisa ser aberta
Várias origens ou uma única ?
Cairns, 1963 (3H-timidina radioativa)
Em procariotos, existe uma única origem de duplicação
Duplicação em Procariotos
Sentido da duplicação
Bidirecional
Unidirecional
Cairns, 1963Pulsos de timidina H3 antes do
término da duplicação : marcação radioativa visualizada nas duas
forquilhas de duplicação (Y)
Forquilha de duplicação
Forquilha de duplicação
Seqüências de 13 pb
Sítios de ligação da proteína DnaA Seqüências de 9 pb
Ricas em AT
Origem de replicação : Seqüência específica para ligação de proteínas iniciadoras (promovem abertura da dupla hélice)
Menor gasto de energia para separar as fitas (bolha de replicação)
A sequência da origem é casual ou existe uma seqüência consenso ?
A sequência da origem é casual ou existe uma seqüência consenso ?
N = C/A
Estrutura de OriC, a única origem de replicação no cromossomo de E. coli
Uma vez que a dupla hélice está aberta, como é feita
a síntese da nova fita ?
DNA polimerases
Arthur Kornberg (1957) : DNA polimerase I
Requerimentos da DNA pol I para sintetizar nova fita de DNA :
• Desoxirribonucleosídeos trifosfatados (dNTPs): desoxiadenosina-trifosfato (dATP), dGTP, dCTP e dTTP
• Íons Mg2+
• DNA pré-existente, para servir como molde
• Uma extremidade 3’-OH de uma cadeia de DNA pré-existente para realizar a ligação fosfodiéster (3’-OH livre) → iniciador (primer)
Atividade polimerase 5’ 3’
Catalisa o crescimento da cadeia
Atividade polimerase 5’ 3’
Catalisa o crescimento da cadeia
DNA polimerase I
Desoxinucleotídeo incorporado Cadeia de DNA crescente Cadeia de DNA molde DesoxirriboseA síntese ocorre sempre
no sentido 5’→ 3’
DNA polimerase I – outras atividades
Atividade exonuclease 3’ 5’ Atividade exonuclease 5’ 3’ Remove bases mal pareadas
extremidade 3’OH da fita nova
Degrada a dupla hélice de DNA
remove blocos de nucleotídeos (~ 20 nt)
Nuclease : degrada ácidos nucléicos Exonuclease : cliva extremidades
Endonuclease : cliva ligações internas
reparo do DNA
retirada dos
DNA pol II :
• Reparo do DNA
• Atividade polimerase 5’ – 3’ • Atividade exonuclease 3’ – 5’
DNA pol III :
• Possui várias subunidades • Atividade polimerase 5’ – 3’ • Atividade exonuclease 3’ – 5’ • Replicação cromossômica
DNA polimerase IV e V – envolvidas em diferentes processos de reparo
Processividade : habilidade da enzima de repetir a sua função catalítica sem dissociar-se do seu substrato
Definida pelo no médio de nucleotídeos incorporados sem que a DNA
polimerase se dissocie do DNA molde
Para a DNA pol :
As DNA polimerases diferem em processividade
DNA pol III : a enzima responsável pela replicação em
procariotos
τ
A holoenzima DNA pol III
α
θ
ε
β
Núcleo catalítico mínimo Liga dois núcleos catalíticos Mantém a enzima ligada ao DNAα:
polimeraseε:
proofreading (exonuclease 3’-5’) θ: estabilização Complexo “clamp-loading” (síntese dos fragmentos de okazaki)DNA pol III : a enzima responsável pela replicação em
procariotos
Cerne catalítico mínimo Subunidade α
Subunidade ε Subunidade θ
Duplicação do DNA : um processo de alta fidelidade
• DNA polimerase tem um sítio ativo que só se fixa quando as bases estão pareadas corretamente
• DNA polimerase apresenta oscilação ocasional das bases (1 vez a cada 105 vezes) para a forma tautomérica incorreta (imino ou enol);
também ocorre na PCR, mas não tem reparo
• DNA polimerase tem capacidade de verificar a fidelidade da replicação na cadeia nascente (proofreading) e corrigir os erros (atividades exonucleásicas)
• Depois da replicação, existe um sistema de reparo que corrige qualquer erro de pareamento de bases
E. coli – 1 erro a cada ~ 109 bases adicionadas ou após mil ou 10 mil eventos de replicação
Duplicação do DNA : um processo de alta fidelidade
Pareamento incorreto : • Geometria diferente • Não acomoda-se no sítio ativo da DNA polimeraseDNA pol I
Sítio ativo da atividade exonucleásica 3’→5’ (proofreading)
Sítio ativo da atividade polimerase
Forma rara da C Pareia-se com A
C na forma rara volta para a forma normal – pareamento inadequado
Bloqueio da duplicação
Pareamento errôneo localizado no sítio da atividade exonucleásica
O nucleotídeo mal pareado é removido
DNA pol reassume a atividade polimerase
Polimerase tem a forma de uma
Início da duplicação
Ligação de 20 – 40 monômeros de DnaA
(SSB)
(SSB)
A replicação do DNA é fortemente controlada na iniciação
Primer
5’
3’
3’
5’
O problema da iniciação
DNA pol I não consegue iniciar a síntese da nova fita – ausência de extremidade 3’-OH livre
Primase : sintetiza oligonucleotídeo (primer) de RNA, fornecendo a extremidade 3’-OH livre para a DNA pol I
DNA primase
Direção em que as fitas se estendem 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’
3’ DNA pol só age no sentido 5’- 3’ !!!
Direção em que as fitas se estendem 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’
A síntese é contínua numa fita e descontínua na outra...
Fita líder (contínua - Leading)
Síntese dos primers na fita descontínua
Síntese, substituição de primers de RNA e fechamento do
filamento descontínuo (Lagging)
DNA ligase
base presente; ausência de ligações fosfodiéster
Síntese, substituição de primers de RNA e fechamento do
filamento descontínuo (Lagging)
Fechamento do filamento descontínuo (Lagging)
Fragmento de Okazaki Primer de RNA DNA polimerase I polimerase exonuclease DNA ligase Quebra Quebra fechada a b c dLigase une os fragmentos de Okazaki 1.000-2.000 nt procariotos
Abertura e desenrolamento do DNA
Topoisomerase Helicase SSBs (single strand binding proteins) estruturas em grampo DNA pré-replicativo unifilamentar sem proteína SSB DNA pré-replicativo unifilamentar com proteína SSBAbertura e desenrolamento do DNA
As topoisomerases causam quebras transitórias no DNADesenrolando o DNA parental
Torção das fitas de DNA a frente da forquilha de replicação
Quebra transitória serve como suporte giratório que permite a livre rotação das fitas de DNA Topoisomerase
Abertura e desenrolamento do DNA
As topoisomerases causam quebras transitórias no DNAQuebra
Topoisomerase I
Quebras unifilamentares
temporárias Antitumorais (etoposide) – inibem a ação da topoisomerase I, ou estabilizam o complexo
Abertura e desenrolamento do DNA
As topoisomerases causam quebras transitórias no DNAQuebra
Topoisomerase I Topoisomerase II (DNA girase)
quebras bifilamentares temporárias
O antibiótico coumermicina bloqueia a replicação do DNA em E. coli, inibindo a atividade da DNA-girase
3’ 3’ 3’ 5’ 5’ Topoisomerase Helicase SSBs 5’ Holoenzima DNA pol III
Primase
DNA pol I
Ligase
Início e alongamento
•Separação das Fitas: Helicases
•Estresse Topológico: Topoisomerases (DNA girase)
•Manutenção da “bolha”: SSB
•Adição de Iniciadores: Primases
•Polimerização (adição de nucleotídeos): Polimerase III
•Retirada de Oligo-RNA: Polimerase I
•Resolução dos “Nicks”: DNA Ligase
Diagrama da forquilha de replicação em E. coli
As duas unidades da DNA polimerase III estão conectadas, e o molde do filamento
lagging forma uma alça, de modo que a
replicação pode ocorrer nos dois filamentos de polaridade inversa do DNA.
T
T
é
é
rmino da replica
rmino da replica
ç
ç
ão do DNA
ão do DNA
Procariotos
DNA circular, quando as duas forquilhas de replicação se encontram
E. coli: produto do gene tus → reconhece a seqüência consenso no sítio ter DNA topoisomerase tipo II separa os produtos circulares topologicamente
ligados um do outro
Eucariotos
Seqüências de nucleotídeos específicas no final dos cromossomos (telômeros) problema da duplicação no final da fita do DNA (3’- 5’) → DNA polimerase
Duplicação em eucariotos
O ciclo celular
Complexos ciclinas /quinases dependentes de ciclinas →
controlam e garantem que o DNA seja replicado apenas uma vez
Síntese de DNA
Em eucariotos: v
Em eucariotos: v
á
á
rias origens de replica
rias origens de replica
ç
ç
ão
ão
o movimento das forquilhas de replicação a partir de cada origem possibilita uma fusão dos réplicons
Genoma humano – ~ 10 mil locais de origem (maior velocidade de replicação)
Em eucariotos: v
Tipos de DNA polimerases (Eucariotos)
• POLIMERASE α • POLIMERASE δ • POLIMERASE ε • RPA • POLIMERASE γ • POLIMERASE β - Núcleo- Atividade de polimerização e primase - Sem atividade exonuclease 3’-5’
→ Fita descontínua
- Núcleo
- Atividade de polimerização e exo 3’-5’ → Fita contínua - Sem atividade primase
- Núcleo
- Atividade de exonuclease 3’-5’ (~ DNA Poli I) - Reparo de lesões provocadas por UV
- Núcleo
- Atividade semelhante à das SSB de procariotos - Mitocôndria
- Replicação e reparo do genoma mitocondrial - Sem atividade exo 3’-5’
O aparato de replicação eucarioto
Procariotos – dois complexos catalíticos de uma mesma DNA polimerase (III) para os filamentos contínuo e descontínuo
Eucariotos – duas ou mais polimerases diferentes para cada filamento (α, δ, ε)
PCNA: antígeno
nuclear de proliferação celular (grampo
deslizante que prende pol δ ao DNA; similar a subunidade β da DNA pol III em E. coli
Duplicação de nucleossomos (grandes quantidades de
histonas devem ser sintetizadas durante cada geração celular - duplicação da cromatina)
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
DNA pol.
3’
gap
O problema da duplicação no final da fita do DNA
Encurtamento do telômeroa cada divisão: humanos de 50 – 150 pb por divisão
• Transcriptase reversa - RNA (molde)
- proteína
• atividade células tumorais e germinativas
• organismos unicelulares, células embrionárias iniciais; algumas células somáticas proliferativas (medula óssea, revestimento do intestino)
• Tratamento do câncer – inibidores de telomerase Telomerase Template interno Polimerização Translocação Nova polimerização Fita molde Fita nova primase
Telomerase
• Tamanho do telômero e
envelhecimento em humanos: distúrbios chamados progerias
(envelhecimento prematuro), como Síndrome de Werner e Síndrome Hutchinson-Gilford (HGPS)
Telomerase
Células somáticas
com telômero curto • Estimativa de vida:
14 – 16 anos • Incidência: 1 em
Replica
