Efeito da temperatura de ativação, ph e tempo de incubação na germinação de esporos de bactérias isoladas de processos de fermentação alcoólica

Texto

(1)EFEITO DA TEMPERATURA DE ATIVACÃO, PH E TEMPO DE INCUBACÃO NA GERMINACÃO DE ESPOROS DE BACTÉRIAS ISOLADÁS DE PROCESSOS DE FERMENTACÃO ALCOÓLICA ,·. C�LIA REGINA BERTECHINI GOMES DUQUE Biôloga. Orientador: Prof. Dr. ANTONIO JOAQUIM DE OLIVEIRA. Dissertação apresentada à Es cola Superior de Ayricultura "Luiz de Queiroz" . da Univer sidade de São Paulo� para ob tenção do titulo de Mestre em Agronomia: Microbiologia Agrí cola.. PIRACICABA. Estado de São Paulo - Brasil Maio - 1991.

(2) Ficha catalográfica preparada pela Seção de Livros da Divisão de Biblioteca e Documentação - PCAP/USP D946·2. Duque. C6lia Regina Bertcchini Gomes Efeito da temperatura de ativação. pH e tempo de iQ cubação na germinação de esporos de bact6rias isoladas Piracicaba. de processos de fermentação alcoólica. 199 1. 7lp, ilus. Diss.(Mcstre) - ESALQ BiblL)grafia. 1. Fermentação alcoólica - Contaminação bact�riana 2. Fermentação alcoólica - Efeito da temperatura 3. FcE mcntação alcoólica - Efeito do pH 4. Fermentação alcJ� lica - Esporo - Germinação 5. Fermentação alcoólica - In cubação I. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queir'.)Z, Pirac.icaba CDD 663, 13.

(3) ii.. EFEITO DA TEMPERATURA DE ATIVACÃO, PH E TEMPO DE INCUBACÃO NA GERMINACÃO DE ESPOROS DE BACTÉRIAS ISOLADÁS DE PROCESSOS DE FERMENTACÃO ALCOÓLICA C�LIA REGINA BERTECHINI GOMES DUQUE. Aorovada em: 05.08.1991 Comissão julgadora: Prof. Dr. Antonio Joaquim de Oliveira. ESALQ/USP. Prof. Dr. Claúdio Rosa Gallo. ESALQ/USP. Prof. Dr. Djanira R. de Angelis. IBRC/UNESP. Prof. Dr. António/k�iveira Orientador.

(4) iii.. Ao meu esposo ALVARO e aos meus pais: GUILHERHE E FLORINDA com muito amor DEDICO.

(5) iv.. AGRADECIMENTOS Agradeço a todos aqueles que direta ou retamente contribuiram para a realização e~. deste. indi-. trabalho. em especial: Ao Prof. Dr.. Antonio. Joaquim. de. Oliveira~. pela orientação, amizade e confiança constantes. Ao Prof. Dr. Claúdio Rosa e. sugest~es. Gallo~. pela amizade. oferecidas. Aos amigos Cleomar, Vera, Tais,. que, Walmir, Luciene,. José. Carlos,. Roberto e Carlos pela. preciosa. Maria. Roseli,. Fernanda,. convivência. e. RoLuis. colaboração. constantes. Aos funcionários do Departamento de Tecnologia Rural, em especial a Cleomar Maria de Carvalho e. Regina. Lúcia M. Lourenço pela prestação de serviços. Ao Luis Roberto Martin e Tadeu ques pela confecção das análises. estatisticas. Alcides e. Mar-. eficiente. trabalho de datilografia. Ao. meu. marido. Ãlvaro,. pelo. seu. incentivo, compreenção e Amor. Aos meus pais pelo amor e incentivo.. apoio,.

(6) v. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Ciêntifico e Tecnológico. bolsa. de. FERMENTE C S/C Ltda. Assistência Técnica. em. (CNPQ)~. pela. concessão. da. estudos.. À. Fermentação. Alcoólica~. Piracicaba~. SP, pelo apoio financeiro. às pesquisas. À Deus,. as etapas da vida.. por ser o meu guia constante em todas.

(7) vi.. SUMÁRIO Página LISTA DE FIGURAS. viii. LISTA DE TABELAS. ix. RESUMO. xii. SUMMARY 1.. INTRODUÇÃO. 01. 2. REVISÃO DE LITERATURA. 03. 2.1. Ativação. 03. 2.2. Processo de Germinação. 09. 2.3. Fatores que Afetam a Germinação. 14. 2.3.1. pH 2.3.2. Temperatura. 14. .. . . . . .. . . .. 16. 2.3.3. Tensão de Oxigênio. 17. 2.3.4. Atividade de Água (aw). 18. 2.3.5. Composição do Meio de Cultivo. 19. 2.3.6.. 3. MATERIAIS E. Inibidores Químicos. 22. M~TODOS. 26. 3.1. Matériais. 26. 3.1.1. Matéria-Prima. 26. 3.1.2. Culturas. 26. Métodos. 27. 3.2.1. Esporulação. 27. 3.2.2. Coleta dos Esporos. 27. 3.2.3. Ativação dos Esporos. 29. 3.2.4. Germinação dos Esporos. 30. Delineamento Experimental e t1stica dos Dados. Análise. Esta30.

(8) vii. Página 4. RESUL TADOS E DISCUSSÃO •.••••••••..•.•.••••..••.. .;).::... 4.1. Efeito da temperatura de Ativação na Germinação dos Esporos .•• ••••.••...•.••••...••.. 35. 4.2. Efeito do pH na Germinação dos Esporos 4.3. Efeito da Interação entre Temperaturas. de. Ativação e pH na Determinação de Esporos 4.4. Comportamento da Germinação dos Esporos. 33. 38 em. Relação ao Tempo de Incubação •••..••.••.•.. 39. 4.4.1. Efeito da Interação entre Temperatura de Ativação e Tempo de. Incubação. na Germinação dos Esporos ..••.••... 4.4.2. Efeito das. Interaç~es. 42. entre pH e Tem-. po de Incubação na Germinação de Esporos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 44. 5. CONCLUSOE.S....................................... 46. BIBLIOGRÁFICAS ••.••.••.••..•.....•.. 48. CE .•..•••..•••..•..•.•••..••.•.....•....•. 64. REFER~NCIAS. AP~ND I.

(9) viii.. LISTA DE FIGURAS FIGURA N°. Página. 01. Esquema de esporulação .••••••••••••••.•. 28. 02. Esquema da ativação dos esporos .•••••.•. 31. 03. Esquema da germinação dos esporos ...•... 32.

(10) . u 1. A .. LISTA DE TABELAS TABELA N° 01. Teste de Tukey para as interações Temperatura x Microrganismos •..•••••••••••••. 02. Teste de Tukey para as interações pH Microrganismo . . • . . • . . . . • . • . . . . . . . . . • . . .. 03. Teste de Tukey para as interações. pH. 43. Teste de Tukey para as interações. pH. A. Tempo 07. 40. Teste de Tukey para as interações Temperatura x Tempo. 06. 39. Teste de Tukey para as interações Microrganismos x Tempo . . . . . . . . . . . • . . . . • • • . . . .. 05. 36. x. Temperatura • . . . . • . . . . . . . . . . . . • . . • . . . . . .. 04. 33. 44. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus brevis (UFC 5. x 10 /ml), submetidos ao tratamento térmico de ativaç~o à 60°C por 10 minutos .•• 08. 63. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacil1us brevis (UFC 5. x 10 /ml), submetidos ao tratamento térmico de ativaç~o à 80°C por 10 minutos ..•. 63.

(11) :< •. 09. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus brevis (UFC x 10~/ml), submetidos ao tratamento térmico de ativação à 90°C por 10 minutos .••. 10. 66. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus subtilis (UFC x 10~/ml), submetidos ao tratamento térmico de ativação à 60°C por 10 minutos .••. 11. 66. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus subtilis (UFC x 10~/ml), submetidos ao tratamento térmico de ativação à 80°C por 10 minutos ••.. 12. 67. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacil1us subtilis (UFC x 10~/ml), submetidos ao tratamento térmico de ativação à 90°C por 10 minutos •... 13. 67. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus coagulans (UFC x 10~/ml), submetidos ao tratamento térmico de ativação à 60°C por 10 minutos ..•. 14. 68. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus coagulans (UFC x 10~/ml)~ submetidos ao tratamento térmico de ativação à 80°C por 10 minutos •••. 68.

(12) X1.. 15. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus coagulans (UFC 5. x 10 /ml), submetidos ao tratamento térmico de ativação à 90°C por 10 minutos .•• 16. 69. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus megaterium (UFC x. 5. 10 /ml), submetidos ao tratamento térmi-. co de ativação à 60°C por 10 minutos .•• 17. 69. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus megaterium (UFC. x 105 /ml), submetidos ao tratamento térmico-de ativação à 80°C por 10 minutos •.. 18. 70. Contagem Microbiológica do número de esporos germinados de Bacillus megateriua (UFC 5. x 10 /ml), submetidos ao tratamento térmi-. 19. co de ativação à 90°C por 10 minutos •... 70. Análise de variância •..•...••.•..•..•... 71.

(13) xii.. EFEITO DA TEMPERATURA DE ATIVACAOJ pH E TEMPO DE I NCUBACAO NA GERMINACAO DE ESPOROS DE BACTERIAS ISOLADAS DE PROCESSOS ÓE FERMENTACAO ALCOÓLICA. ~. AUTORA:. C~LIA. REGINA BERTECHINI GOMES DUQUE. ORIENTADOR: ANTóNIO JOAQUIM DE OLIVEIRA. Resumo. o. presente trabalho. visou basicamente. dar a influência dos fatores pH,. temperatura de. tempo de incubação na germinação dos. estu-. ativação. esporos. e. de. bactérias. de. Bacillus. isoladas da fermentação alcoolica. Para. Bacillus coagulansr. subtilis~. .egaterium foram. cc.. ativação,. os. esporas. Bacillus. brevis. Bacillus. e. submetidas aos aquecimentos a 60. 80 e. Depois. em calda de cana-de-açucar a pH 4,5. 5.5 e 6.5.. da tratamento. de ativação. as suspensões de. resfriadas. aproximadamente. à. 35. pré-incubadas a 35.0 ± 1.0. °c. por 6 horas.. cpletadas a. 6. horas.. O.. e. 4. plaqueadas e incubadas a 35.0 ± 1.0 O número de tpmado. como. sendo. o. °c. foram. seguida.. em. foram. Amostras. diluidas. colônlas número. esporos. e. 90. serialmente.. par 24 horas. desenvolvidas. de. esporas. foi. ativadas. e. germinadas. A. análise. estatistica. dos. dados. permitem. concluir Que houve uma diminuição na número de esporas minados.. ger-. para todas as espécies de Bacillus empregadas.. o aumento da temperatura e tempo de incubação. senda. com. que. a. ativação a 90°C provocou uma certa inativação das mesmos. Houve também redução germinadas para todas os niveis de. no pH,. numero. de. com. aumento. o. tempo de incubação. e o pH 4.5 mostrou um efeito. esporos do. inibitório.

(14) ~dii. mais. acentuado. na. germinação. dos. De uma. maneira. geral. esporos,. exceto. .. para. Bacillus brevis. ~. verificou-se. melhor tratamento para a ativação e germinação. dos. das quatro espécies investigadas, em meio de caldo de de-açúcar,. foi 80°C e pH 5.5.. que. o. esporos cana-.

(15) >~1. V.. EFFECT OF pH .. ACTIVATION TEMPERATURE AND INCUBATION TIME ON GERMINATION OF BACTERIA SPORES ISOLATED FROM ALCOHOLIC FERMENTATIONPROCESS. AUTHOR:. C~LIA. REGINA BERTECHINI GOMES DUQUE. ADVISER: ANTóNIO JOAQUIM DE OLIVEIRA. Summarv This study was undertaken to investigate infIuence of. pH~. activation temperature and incubation. on germination of. bacteria. spores. isaIated. from. the time. alcohoI. fermentation processo The spares coagulans~. Bacillus. activated. by. brevis. heating. sugar-cane-juice at pH. Bacillus. of. and. them 4.5~. subtilis~. Bacillus. at. 60.. Bacillus. megaterium and. 80. were in. 90. 5.5 and 6.5.. After the activation suspensions were cooIed to 35~0. °c. treatments. the. spares. and then pre-incubated at. Samples were withdrawn at 0, 4 and 6. ± 1,0. °c. hours~. serial diluited plated and incubated at. 35.0. for 24 hours. The number Df coIonies develooed was taken as. the number of spores activated and germinated. The statiscal analysis of. data. showed. that. there was a reduction of the number of spares germinated for alI Df four species. Bacillus,. of. as. the. temperature. of. activation and time Df incubation increased. The higher. activation. temperature. (90°C). showed an inactivation effect on the soores. There was a150 germinated for alI. pH. leveIs. a. reduction with. the. Df. the. increase. spores of. the.

(16) }!v.. incubation. time~. effect on the. and pH 4.5 showed a higher inhibitory. spore. germination~. In the. overall~. with. exception. for. B.. brevis spores.. the best. spores activation and germination in 80°C and pH 5.5~ what means that. present, in the. sugar-cane-juice,. for. the. sugar-cane-juice~. was. they at. treatment may the. germinated heat. conditions, for a sugar and alcohol production.. if. treatment.

(17) .... i. 1. INTRODUÇÃO. Uma industrial é. Que. a. inevitável que. contaminantes.. mais. a. do. presença. representam sérios. alcoólica. fermentação. realizada sem esterilização. equipamentos. é. tecnológicos. vez. de. um. encontrados. mosto. e. dos. microrganismos problemas. dos na. maioria. das. destilarias de álcool. Em geral. Que na maior parte acompanha. a. contaminantes. os. são. microrganismos. bactérias.. cana-de-açucar provocam. uma. contaminantes. provém. até. do. diminuição. metabólitos. como.. rendimento. no. industrial não s6 pelo consuma de açúcar. mas efeito de seus. Estes. indústria.. a. que. solo.. também. acetaldeido.. Delo. g I icerol •. ácido fórmico. ácido lático. ácido acético. etc •••• sobre a atividade fermentativa da levedura. bem como na viabilidade celular (STARKE et. alii~1952;. CARRUTHERS & OLDFIELD.. BEVAN & BOND. 1971; BUCHAN & GIBBONS. alii. 1983). Além disso. a. formação. pela infecção. viscosidade. aumenta. a. MAIORELLA. 1974; de. gomas do. caldo. et. provocada causando. problemas na operação da fábrica sendo esta uma situação de grande comprometimento do rendimento fermentativo. (FOSTER..

(18) 1969; TILBURY. 19711. Um dos grandes problemas que no processo de produção de álcool. é. mosto apÓs passar. de. aumento. da. centenas. e. esse. pelo. população. trocador bacteriana. seja. causado. calor.. que. Dela. onde. chega. disso~. grande parte. de. é. um. que. esporos. térmico. bactérias. do. atingir. hip6teses~. germinação. das. há. a. bacterianos que foram ativados pelo tratamento caldo. Além. ocorrendo. recontaminação. a. até milhares de vezes. Uma das. aumento. vem. até. do. agora. isoladas da fermentação alcoólica são produtoras de esporos como. Bacil1us. ~egaterium. brevis~. Bacillus. e Bacil1us coagulans. subt i 1 i. (GALLO~. Bacil1us. $,. 1989). Desta. o presente trabalho se propos a estudar o efeito do temperatura de ativação e dos. esporos. alcoólica~. uma. dessas vez. envolvidos no processo.. pH~. da. tempo de incubação, na germinação. bactérias que. forma. esses. da. fermentação. fatores. fundamentais. isoladas são.

(19) ~.. 2. REVISÃO DE LITERATURA. 2.1. Ativação. Há muito tempo se tem a. informação. suspensões frescas de endosporos bacterianos não ou germinam. pauca~. a. menos. que. sejam. fizeram. os. primeiros. esporos. dormentes.. Mais. tarde,. &. 1970); agentes redutores e exposição à. soluçaes. de. alii,. 1964;. outros. ISSAHARY. trabalhos. et. de. oH. alii,. pH baixo (KEYNAN et alii, 1964); dipicolinato. de. cálcio. ORDAL. 1963; KIRK & HAMBLETON,. 1982); par dimetil. e dimetilsulfoxido (WIDDOWSON,. 1967);. vapor d'água (HYATT et alii, 1966) e (LEVINSON & HYATT,. EVANS. germinação. mostraram que esporos também foram ativados através alto ou baixo (KEYNAN et. um. demonstrando. sistematicamente que o calor subletal induzia a de. oor. CURRAN. trabalhos. que. germinam.. aquecidos. determinado tempo. CURRAN & EVANS (1944); (1945)~. de. por. (LEE. &. formamida. aquecimento. em. por radiação ionizante. 1960; GaULD & ORDAL. 1968)..

(20) 4.. Segundo FINLEY & FIELDS requeridas para à esporos. de. as condiçBes. (1962)~. ativação podem ser muito diferentes. diferentes. espécies~. também. e. entre. diferentes preparaçBes de esporos para uma mesma pois algumas. linhagens. somente poucos minutos à enquanto. germinação ~. para as. linhagem~. de. Bacillus. megateriu.. requerem. 60. °c. uma. taxa. para. microrganismos. ótima. de. termofilicos. Bacillus srearothermophilus podem requerer até. como. 115°C. ou. estudando o efeito. de. mais para uma ótima ativação. MORAN et alii. (1990)~. várias temperaturas de ativação na germinação de esporos de. Bacil1us. spp.,. constataram. que. a. 80°C/lO. porcentagem de germinação foi maior que a 100°C/lO. mino. RAJARATHINAM. e. et. 100 alii. °C/l~O. (1987),. em. um. acentuado. germinação~. para esporos de B.. 90. min ••. Em. aumento. e. contraste~. que °C/l. 100. na. a. min. ,. determinaram. tratamentos de ativação a 90°C/lO mino resultaram. mino. os mino. porcentagem. subtilis e B.. de. megateriu.. quando comparados com o tratamento a 80°C/lO mino Ativação não ocorre em todos os esporos e dependente do meio de esporulação, esporo,. composição. ativação pelo calor como, um requerimento que. métodos. do. tempo de estocagem e natureza do agente germinante.. Fatores ambientais são também importantes. que é. qui mica. de. no. processo. por exemplo, a presença parece. ativação.(CURRAN. &. ser EVANS,. comum 1945;. a. de. de água. todos. os. HYATT. &.

(21) 5. LEVINSON~. 1962; BUSTA & KEYNAN. MORAN et. ORDAL~1964;. et. alii. alii~. 1990).. mostraram. (1964)~. que. à. com. pH. baixo. Esporos de Bacillus cereus, expostos a pH abaixo. de. 2,0 a 65°C por 30 minutos ou uma hora, não. na. ativação pode ser evitada. através. do. tratamento. presença de L-alanina e adenosina, os. quais. àgentes indutores da germinação. Foi que esporos submetidos a 65°C por. germinaram são. potentes contudo~. encontrado~. poucos. minutos. em. 1,0, foram ativados atingindo um máximo de ativação em minutos. Quando a incubação foi prolongada, capacidade de germinação. em. meio. rico. pH dez. entretanto,. a. L-alanina. e. com. adenosina, decresceu em função do tempo. LEE exposição. de. &. esporos. ORDALL. (1963),. ativados. a. relataram. pH. baixo. que. revertia. processo e que pouco tempo de exposição a pH baixo ativação~. enquanto que. longa. uma. exposição. a. o. induzia. bloqueava. a. capacidade dos esporos ativados de responderem a germinação na presença de L-alanina e adenosina. KEYNAN et alii que esporos. de. Bacillus. (1964),. cereus. não. também. demonstraram. foram. ativados. valores de pH acima de 8,5 quando aquecidos por No entanto,. alguns. esporos. ativados quando lavados e. comportaram-se. ressuspensos. aquec1"d os por uma hora a 60°C, era inibida em pH alto sem. indicando. causar. em. como pH. Há contudo, uma considerável variação entre. hora. esporos. neutro~. e. a. ativação. nos. esporos.. que. injúrias. uma. em. as. diferentes.

(22) 6.. espécies de bactérias. GIBBS. (1967)~. relatou que a ativação. de esporos de Clostridium bifermentans foi ótima em pH alto e foi inibida em pH baixo. As. propriedades. dependem do grau de ativação, altas. temperaturas. ou. por. dos. esporos. isto é, longos. germinam mais rapidamente do que. ativados. esporos. ativados. periodos. aqueles. de. que. a. tempo,. recebem. um. tratamento de ativação diminuido (LEE & ORDALL, 1963). Ativações. pelo. foram. calor. geralmente. estudadas por-exposição dos esporos por um curto periodo de tempo a temperaturas relativamente altas (65 geralmente acima. da. temperatura. °c. a. fisiológica. esses microrganismos. Por outro lado,. tempos. 70. ótima de. para. exposição. mais longos são necessários quando se diminui a temperatura (KEYNAN et alii, 1964). POWELL & HUNTER (1955), constataram longo periodo de aquecimento é inferiores a 55. o. que. necessário para temperaturas. C, e que esta poderia ser uma. temperatura. critica de ativação. Assim, por exemplo,. germinação. total de esporos de Bacillus. ocorreu. horas a 45 horas a. 44. o. um. quase. após. 18. C, e praticamente não houve germinação após. 18. °c.. Em. outros. esporos de B. aegateriullt. megateriullt. experimentos,. apresentaram. 90'l.. suspensões de. germinação. depois de receberem tratamento de ativação a 60°C minutos (POWELL, 1951).. de. por. 30.

(23) 7.. & EVANS. CURRAN calor. ativação por. subletal. (1944) acelerava. a. esporos mesofllicos termotolerantes, bem que. na. germinação. como. termofllicos~. tratamento~. esporos potencialmente viáveis não. A proporção de. esporos. responderam. que. de. ausência. aeróbios. e. que. relataram. ~. ao. de. esporos de. tal. germinaram. estimulo. da. ativação, mostrou ser dependente da quantidade de calor, da natureza do meio de aquecimento, da temperatura em e. esporos foram formados, subcultivados.. Assim,. da. quando. temperatura esporos. em. foram. que. os. foram. que. plaqueados. °c,. imediatamente após vários periodos de aquecimento a 95. a contagem de colónias aumentou com o tempo de aquecimento, mais rapidamente durante os primeiros minutos, sendo que em 10. minutos,. o. processo. completo, enquanto. que~. um. de. foi. ativação. periodo. maior. praticamente de. aquecimento. reduziu o número de colónias.. FINLEY. &. FIELDS. (1962) ,. constataram. a. ocorrência de um fenómeno interessante em duas linhagens de esporos de B. stearothermophilus, onde. à. ativação. máxima 110. foi frequentemente alcançada nas temperaturas entre 115. o. a. C. Entretanto, quando esporos foram aquecidos a 80, 90. e 100. o. C, a dormência foi aumentada. Certos cátions podem interferir na. quando presentes durante o. aquecimento.. ativação. SPLITTSTOESSER. &. FARKAS (1966), demostraram uma inibição na ativação térmica dos esporos de Bacillus po.pilliae,. na. presença. de. 10ns.

(24) 8. potássio. Metais pesados como ativaç~o. de. esporos. ferro. Bacillus. de. e. cobre. cereus. inibiram. à. (MURTY. &. T. HALVORSON, 1957), e Bacillus megaterium (LEVINSON &. HYATT,. 1955). HALMANN & KEYNAM (1962), determinaram que as reações de desencadeamento principal para a. germinação. esporos de Bacillus licheniror.is foram inibidas por Mg++. Por outro lado, LEVINSON & SEVAG que à. ativação, de esporos de. (1953),. Bacillus. Ca. de Bacillus stearother.ophilus foram ativados. ++. e. constataram. aegaterium e. de. foi. que. esporos. na. presença. de tons hidrogênio. Ativaç~o. térmica pode ser perdida durante. o. período de armazenagem dos esporos, portanto, é um processo reversível, onde esporos podem ser ativados por um tratamento (POWELL &. HUNTER,. 1955;. segundo. & HALVORSON,. CHURCH. 1957; KEYNAN et alii, 1964; GIBBS, 1967). Segundo KEYNAN et alii (1964), esta ambientais. Assim,. revers~o. pode ser afetada pelas condições. por exemplo, a. Bacillus cereus ocorreu lentamente a 4,0 indicando. que. a. de esporos de. desativaç~o. reaç~o. é. °c. e. foi ausente a. dependente. da. temperatura. Em. alguns. casos,. desativaç~o. também. foi. induzida quimicamente. HYATT et alii (1966), mostraram. que. esporos ativados de Bacillus .egateriu. pelo. álcool. absoluto,. e. puderam. ser. foram. desativados. subsequentemente.

(25) 9.. reativados por aquecimento. Já foi determinado que o pelo calor é dependente do pH. bai~{o. Em. grau. de. ativação. somente. adição~. o. KEYNAM. pode também ativar esporos para a germinação.. et alii. (1964). ~. relataram. que. incubação. pH. prolongada. de. esporos de Bacillus cereus T em tampão de pH baixo, induziu ~erminação. espontânea~. e sugeriram que. este'. pode. ser. um. método significativo de quebra da dormência "in nature". ISSAHARY Bacillus. cereus. e. et. alii. Bacillus. para. que. mostraram que. subtilis,. minutos e 3 horas respectivamente destilada~. ~. (1970). requerem. ativação. em. foram completamente ativados durante 12. 30 água. minutos. em pH 1,0 nas mesmas condiçBes de temperatura.. 2.2. Processo de Germinação. A germinação foi descrita por alguns autores como uma conversão irreversivel de endosporos dormentes uma. célula. metabolicamente. ativa.. completa ocorre somente após à por agentes indutores (LEVINSON &. HYATT~. da. Germinação. ativação. germinação,. e como. rápida. em e. desencadeada. é. a. L-alanina.. 1955; O'CONNOR & HALVORSON, 1961; KEYNAN. et alii, 1964). A. definição. clássica. de. germinação. de. esporos bacterianos inclue todas as mudanças que os esporos sofrem, no desenvolvimento da forma dormente para a. ti pica.

(26) 10.. &. forma vegetativa (POWELL outros trabalhos definiram. HUNTER~. aos. exudação de ácido coloração-~. agentes. Entretanto~. como. compreendendo. germinação. somente as mudanças iniciais dos resistência. 1955) •. baixa. quimicos~. aumento. dipicolinico~. envolvendo. esporos~. refratividade~. na. capacidade. decréscimo na densidade óptica, marcado. na atividade metabólica e excreção de. baixa. de. aumento. peptideoglicano.. As. mudanças dos esporos subsequentes à germinação (alongamento celular. e. divisão. & HYATT,. LEVINSON. Estas. PIERSON, 1982) . demonstradas. constituem. pos-germinativo.. desenvolvimento 1957;. celular),. na. 1956;. de. Clostridium (LEVINSON & HYATT,. 1970;. GOULD~. mudanças. germinação. &. (O'BRIEN. CAMPBELL, SMOOT. esporos. de. &. bastante. foram. já. de. fase. a. Bacillus. 1966; VEHARA & FRANK,. e. 1967;. HASHIMOTO et alii, 1969; DRING & GOULD, 1971). Segundo. alguns. autores,. certas reações envolvidas com a rápida excreção. dos. dipicolinico,. constituintes cálcio~. e. despolimerização. observadas. na. peptidioglicano,. ocupem. germinaç~o. decréscimo na densidade óptica e. e. ácido. esporos,. sitios especificos nos esporos durante a mudanças. que. provável. como. dos. manganês. é. germinaç~o.. Muitas. esporos,. como. de. fase de escurecimento. provavelmente um resultado dessa despolimerização. são. (GOULD,. 1970; SMOOT & PIERSON, 1982). Alguns inicialmente. autores. refractiveis. observaram perdem. que. rapidamente. esporos sua.

(27) 11. iniciando-se. refratividade~. assim. microlag e a microgerminação, e após. Da r t.;.. "fase. a a. a. 11 ,. ocorrência. dessas. mudanças, iniciam-se então as atividades metabólicas esporos. germinados. pos-germinativo. entram. no. estágio. e. crescimento. de. (VARY & HALVORSON,. e multiplicação. os. 1965;. HASHIMOTO et alii, 1969). Tem recebido grande. atenção. respeito do evento da iniciação da bacterianos. totalmente relação à. Algumas. das. reaçees.. bem. metabólico,. com. baseados. o. reaçees. inibição. na. germinação por agentes inibidores das vias. como. (1975) ,. GOULD. levantaram a hipótese de que o desencadeamento das seria naturalmente. esporos. cientifica,. &. a. consideradas. iniciação,. DRING. estudos de. foram. comunidade. da. natureza do processo de. desencadeamento. germinação. referências. discordantes. os. metabólicas.. da O. estudo feito por esses autores, com Bacillus cereus indicou que. uma. grande. variedade. transporte de elétrons adenosina,. e. de da. inibidores formação. de. cadeia. de. trifosfato. de. da. inibiram a germinação. Outros estudos mostraram. pode ocorrer na ausência de metabolismo,. que. a. germinação. sugerindo. então,. que esses inibidores provavelmente estariam afetando alguns estágios. tardios. na. germinação. crescimento pos-germinativo Com desencadeamento da. ou. no. processo. de. (SMOOT & PIERSON, 1982).. relação germinação,. às. a. reaçees. iniciais. hipótese. mais. de. aceita,.

(28) 12. indica Q'-le esse evento e de. VARY. metabólico.. um processa alosterica.. (1978)~. agentes germinantes não. em. para induzir germinação. glicose~. megaterium.. Foi. determinado~. estudos. seus. como. metabolizáveis~. em. utilizou da. Bacil1us. de. que. contudo~. invés. análogos. esporas. metabolizáveis foram capazes de induzir. ao. agentes. germinação. não. sem. a. necessidade de agentes metabolizáveis. Outros inorgânicos. e. agentes. assim. que. mostraram. como. iniciadores. processo. o. de. germinação é um evento fi si co-qui mico 1962; LEVINSON &. HYATT~. hipótese de que. este. que. quais. os. quelantes~. agiram. metabolizáveis~ sugerindo~. trabalhos. sais são. não. da. germinação.. desencadeamento (LEVINSON. &. da. HYATT~. 1966). Alguns autores levantaram evento. poderia. ocorrer. em. a. alguns. (FITZ-JAMES.. sitios especificos na membrana citoplasmática 1971; CHENG & ARONSON, 1978). Há indicias de que uma grande estimulos fisicas e qui micos sejam. variedade. capazes. bactérias. e~. atualmente,. induzir. de. germinação de esporos de diferentes espécies e tem sido possivel a. de a. linhagens de classificação. dos iniciadores para os diferentes grupos. No. primeiro. grupo. iniciadores metabolizáveis. os quais purina,. ribosideos.. bases. e. estão. aminoá cidos,. incluem~. açúcares.. nutriente germinante mais estudado tem que sozinha. ou na presença de. nutrientes. os. Dentre sido. determinados. a. estes.. o. L-alanina,. ions.. pode.

(29) 13. causar iniciação da germinação de grande parte dos das espécies de Bacil1us e Clostridium. L-alanina. são. linhagens ou espécies de bactérias. o iniciam a. sugerido por alguns é. não. é. 1959; CONNOR & mutantes. CHURCH~. HALVORSON~. alanina. a. aminoácidos Foi. conhecido.. 1960).. pois. CONNOR. Estudos negativa,. lentamente~. cataliza. transformação. 1957;. desidrogenase. estes germinaram mais. bem. esporos~. de. produção de piruvato e amónia!, e para NAD (HALVORSON &. certas. 1970).. (GOULD~. ainda. a. que a L-alanina desidrogenase.. autores~. importante na germinação. para. através do qual os. mecanismo~. germinação~. Iniciadores como. espec1 ficos. relativamente. esporos. de. a. NADH.. HALVORSON,. &. realizados. com. mostraram. que. na presença de. L-alanina. do que o tipo selvagem (FREESE et alii. 1964). Alguns inicia. germinação~. esporos.. cujo. L-alanina (1964)~. a. trabalhos. sugeriram. que. ativando alostericamente as enzimas. substrato. não. (WOESE et alii.. está. relacionado. 1968). Segundo. FREESE. identidade das enzimas alostéricas não. estabelecida~. L-alanina. mas os possiveis candidatos são as. com et está. dos a. alii bem. proteases. dos esporos. as proteínas iniciadoras e enzimas liticas dos esporos. Outros ribosi deos (glicose.. (adenosina. frutose~. nutrientes inosina~. como. germinantes~. etc •.. ) •. e. os. açúcares. etc .•• ) parecem ter uma forte influência. sobre os aminoácidos, . induzindo. germinação ~. possivelmente.

(30) 14. aumentando a permeabilidade dos esporos para os aminoácidos (WOLF &. THORLEY~. &. 1957; HYATT. LEVINSON,. 1962;. SMOOT. &. PIERSON, 1982). Estão. inclui dos. iniciadores de germinação de. outro. esporos,. germinantes (ions metálicos, cálcio);. em. os. não. bicarbonato,. dipicolinato. de. os. (subtilisina,. lisozima, enzimas. grupo. nutrientes. surfactantes,. germinantes liticas. de. enzimáticos. dos. esporos);. e. finalmente os germinantes fisicos (abrasão e deformação por pressão hidrostática). (RODE & FOSTER, 1960; GOULD et. alii,. 1966; GOULD, 1970; GOULD & SALE, 1970).. 2.3. Fatores que Afetam a Germinação. Uma. das. caracteristicas. esporos ativados, é que sua taxa. de. fundamentais. germinação. controlada ou bloqueada totalmente através da pH,. dos. pode. ser. variação. de. temperatura, potencial de oxidação e redução, tensão de. oxigênio, umidade disponivel,. composição do meio, bem. da concentração de esporos ativados (SMOOT & PIRSON,. como 1982;. MORAN et alii, 1990).. 2.3.1. pH. Os valores de pH de esporos variam amplamente e. ótimos para. a. germinação. são dependentes da espécie e.

(31) 15. linhagem~. (1954). ~. bem como do germinante utilizado. CHURCH et encontraram. que. esporos. de. Bacillus. alii. cereus. T. germinaram otimamente na presença de L-alanina em pH. 8~O,. mais. também. lentamente. em. pH. 10,0.. Esses. autores. determinaram que linhagens alcali resistentes. de. Bacillus. cereus e Bacillus circulans germinaram lentamente a pH e. pH 11,0 respectivamente. No. (1968),. estudo. de. e. 10~3. & GOULD. WARREN. foi determinado taxas ótimas de germinação paraB,. cereus na presença de L-alanina. mais. O-carbonil-D-serina~. na faixa de pH entre 8,0 e 9,0. WOLF & THORLEY (1957), estudaram o efeito do pH na germinação na presença de glicose e choque térmico, em linhagens de Bacillus. após. L-alanina, subtilis. 2588. Os resultados mostraram que em presença. 6281. de. e. glicose,. as linhagens 6281 e 2588, germinaram melhor em pH ácido. do. que em pH neutro e responderam. no. período de 3 a. 5 horas. experimentos com alanina, mais. B.. de. lentamente. incubação.. subtilis. 2588~. foi determinado que o. próximo. de. 7,5. do. pH. que. Em. pH. 8,5,. nos. contraste, presença. na. ótimo 8,5.. a. era Desta. o. de. alcalino~. as. forma,. porcentagens de germinação após 50 horas nos pH 5,5, 7,5 8~5,. foram 51%, 82% e 46%. autores,. essa. diferença . .. respectivamente. provavelmente,. L-. e. Segundo. esses. deve. estar. relacionada com a distribuição das enzimas necessárias para as várias vias de germinação, uma vez que são diferentes os pH ótimos para as germinaçôes em glicose e em L-alanina..

(32) 16.. No estudo feito com Bacil1us me9aterium 551~. foi. presença. observado de. uma. L-alanina. taxa a. ótima. pH. de. germinação.. mas. 6.0~. QMB. na. na. presença. de. glucosamina ou L-prolina. o pH ótimo passou a ser maior que 8.0 (HYATT & LEVINSON.. o. efeito do pH na germinação de. formas anaeróbias. muita. atenção.. 1962).. esporos. como Clostridium botulinum. Muitos. estudos. usando. de. tem. atrai do. vários. meios.. demonstraram que o pH ótimo para a germinação era em. torna. de 7.0 (HITZMAN et alii. 1957= ANDO & LIDA. 1970; ROWLEY FEEHERRY. 1970;. ANDO~. &. 1973).. Os menores niveis. de. pH. encontrados. como. limites para germinação de esporas de Clostridium botulinum tioos A e B foram 4,6 e. para o. tipo E. 4.8. Para outras espécies como C. sporogenes e C. ótimo para germinação foi. de. 8.0.. em. 1969) .. (GOULD, tetani. meio. oH. o. quimicamente. definido CUEHARA & FRANK. 1967).. 2.3.2. Temperatura. Temperatura é um outro. fator. germinação de esporos bacterianos. Em mostrado que germinação pode ocorrer dos. limites. ideais. vegetativas. KNAYSI. para (1964)~. máxima. ótima e minima para. o. que. geral. a. estudos. temperaturas. crescimento. de. determinou que as a. afeta. germinação. de. a têm. fora. células. temperaturas esporos. de.

(33) 17.. Bacil1us. foram. cereus. respectivamente.. Outros. algumas espécies. de. e. autores. Bacillus. encontraram. mesofilicos. para. a. temperatura. ótima para a germinação foi 50°C (WOLF & MAHMOUD~ 1957). Uma revisão na literatura indicou que para a maioria de esporos do gênero. Bacil1us~. a. temperatura. -germinação ideal se encontra na faixa entre 30 a 37°C pH na faixa de. a. 6~8. 7,3;. variando. conforme. a. alii~. com. espécie. (EVANS & CURRAN, 1943; LEE & ORDAL, 1963; LEVINSON & 1970; MORAN et. de. HYATT~. 1990).. Esporos de clostridia podem germinar sob uma larga faixa de temperatura. Alguns estudos habilidade dos esporos. de. ClostridiuD. demonstraram. botulinuD. tipo. a A. germinar a 4 °c (ROWLEY & FEEHERRY, 1970; ANDO, 1973). Para. CM botulinum tipo E foram encontradas de 4 °c permitindo a germinação. de. temperaturas. esporos. abaixo. (SCHIMIDT. et. alii, 1961}. ROWLEY & FEEHERRY (1970), determinaram que a germinação de esporos de C. botulinum 62 A, em meio químico definido ocorreu à. temperatura acima de 70°C com um. ótimo. a 37°C.. 2.3.3. Tensão de Oxigênio. Há alguns estudos relacionados ao efeito oxigênio e ou potencial de oxirredução (Eh). na. do. germinação.

(34) 18. dos esporos bacterianos. Muitos desses estudos afirmam. que. a germinação de esporos anaeróbios pode, algumas vezes, ser interrompida pelo. oxigênio.. Há,. variabilidade entre espécies relação. a. oxigênio~. sua. do. habilidade. de. ANDO & LIDA (1974),. germinação é. menos sujeito à. de. alii~1954;. GIBBS,. botul i num.,. C.. butyricul'R. de. propuseram que o processo. de. de. (FIELDES,. C.. alii, 1954; HITZMAN et alii,. germinação oxigênio,. de mas. esporos pode. LIVELY. acetobutyl icul'R. C.. de. somente (WINNE. et. 1957). (1956),. aeróbicos ser. et. WYNNE. esporos. anaeróbias. Vários. germinaram. 1930;. contraste,. Em e. vegetativas. clostridia. germinaram sob condiçaes totalmente. ROTH &. na. com. presença. células. aerobiose 1964) .. Clostridium~. gênero germinar. trabalhos mostraram que esporos condiçaes. grande. inibição pelo oxigênio, do que. o subseqtiente crescimento de. sob. uma. entretanto~. não. afetada. demonstraram. que pelo. inibida. é. condiçaes. sob. a. de. anaerobióse.. 2.3.4. Atividade de Água (aw). HAGEN et alii. (1967), no estudo do efeito da. umidade disponivel ou atividade de água (aw) na de esporos, determinaram que. com. uma. bai>:a. germinação aw,. nenhuma. germinação de esporos bacterianos pode ocorrer. Com uma. aw. média, somente a germinação acontece, mas. as. não. ocorrem.

(35) 19.. fases de crescimento. pos-germinativo. e. células vegetativas, e na presença de aw. multiplicação. de. germinação e. alta~. suas fases subseqüentes podem ocorrer. Os eventos descritos acima podem. variar~. dependendo do. organismo~. a germinação de esporos, ocorre em valores mais que. requeridos. aqueles. vegetativas.. Esses. para. autores. crescimento relataram. em. mas~. geral~. baixos. células. de. de. esporos. que. Bacillus cereus e Bacillus subtilis germinaram. do. em. valores. de aw abaixo de 0,80, mas somente puderam se multiplicar. a. niveis de aw de 0,90 ou maiores. Esporos plaqueados em a niveis de. de. condiç~es. aw. de. Clostridium. botulinum,. ótimas para crescimento. 0,85.. Foi. observado. germinaram. também,. germinação de esporos de C. botulinum tipos A. quando. e. que. a. foram. E,. mais sensiveis a niveis mais baixos de aw em valores baixos de pH, do que em valores próximos do ótimo (BAIRD-PARKER. &. FREAME, 1967).. 2.3.5. Composição do Meio de Cultivo. Outro. fator. que. exerce. influência. na. germinação de esporos bacterianos é a composição do meio de cultivo. Os meios favoráveis à. germinação de. esporos,. são, necessariamente, favoráveis ao crescimento de germinados (HILLS,. 1949;. SCHIMIT,. 1955;. O'BRIEN & CAMPBELL, 1957; LEVINSON & HYATT,. STEDMAN, 1960;. não. esporos 1956; BAYLISS.

(36) 20. et alii, 1981).. Esporos de Bacil1us megaterium germinaram em glicose, mas não sofreram desenvolvimento. pos-germinativo~. a. fosfato. menos. que. uma. fonte. adicionadas (HYATT & No. de. LEVINSON~. estudo. adenosina estimulou a. e. en~<ofre. fossem. 1957).. Bacil1us. com. mas. germinação~. anthracis,. a. estimulou. as. não. fases subseqüentes de crescimento (HILLS,1949). Outros estudos sobre o efeito. Bacillus. na germinação de esporos. de. subtilis, mostraram. esporos. que. da. cereus. adenosina. recentemente. foram mais exigentes nutricionalmente. do. Bacillus. e. que. germinados células. as. vegetativas (PULVERTAFT & HAYNES, 1951). AMAHA. &. SAKAGUCHI. (1952),. as. estudaram. exigências nutricionais de células vegetativas. de. esporos. de Bacil1us natta, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium I e. lI, Bacillus mycaides e Bacillus cereus. Verificaram. que. as células vegetativas de todas as linhagens de esporos. de. B. subtilis e B. mycoides não requereram nenhum dos dezoito aminoácidos. testados~. entretanto,. esporos. requerem isoleucina, esporos de B. cereus de B.megaterium I. alanina. e. treonina. de. B.. valina, e. natto esporos de. B.. estudaram. as. esporos. megaterium II requerem fenilalanina. O'BRIEN. &. CAMPBELL. (1957) ,. exigências nutricionais para crescimento pós-germinativo. e.

(37) 21.. crescimento. de. células. stearothermophilus~. vara. Bacil1us coagulans. de. Bacil1us ç:e reus. Bacillus. e. resultados. Os. te r71l i na 1 i s •. vegetativas. mostraram. os. que. requerimentos para germinação e crescimento pós-germinativo leucina~. de esporos de B. stearothermophilus a 55°C foram metionina, biotina.. histidina, arginina, As. exigências. para. tiamina, ácido nicotinico e células. idênticas, exceto para leucina e ácido nicotinico foram. As. requeridos.. crescimento pos-germinativo também diferiram. daquelas. quais requerem metionina, 35 e 55°C. requerem. Em. adição. ainda,. isoleucina~. para. exigências de. esporos. para. esses. leucina, valina.. B.. de. não e. ç:oagulans. vegetativas,. as. biotina e ácido fólico a componentes. ácido. a. que. germinação. células. tiamina~. a. foram. vegetativas. histidina,. glutâmico,. Entretanto. esporos. os. leucina. não. foi. essencial para os esporos a 35°C. LEVINSON & HYATT (1955), constataram germinação. de. estimulada. por. esporos calor,. do. gênero. L-alanina. manganês.. L-alanina e manganês estimulam a germinação de Bacil1us megateriu71l sendo que a L-alanina atua. a partir propuseram. dai que. aI to para. ni vel. de. esporos. Ambos,. esporos. de. rapidamente~. real izando o má>dmo de germinação, enquan to que o realiza germinação apenas após a. a ser. pode. Bacillus. e. que. manganês. longa fase lag, alcançando germinação. ativados. em. manganês, as enzimas proteoliticas promoveram. Esses. autores. presença a. de. liberação.

(38) 22. de aminoácidos, incluindo a. L-alanina,. que. por. sua. vez. estimula a germinação.. 2.3.6.. Inibidores Quimicos. A procura de substâncias capazes de inibir o. desenvolvimento dos esporos para a multiplicação bastante. estudada~. estágio. da. entretanto~. germinação. ou. foi. Já. desenvolvimento. que. pos-germinativo para. a. inibição. inibida ou retardada. através. interferirem. de. de. o. em. que. através lado,. dos. SMOOT. somente. numerosas conhecidos. &. PIERSON. poderá. substâncias. nas. de. processo. proporciona. determinaram que a germinação. capazes. sabe. desenvolvimento. do. determinado. inibidores metabólicos. Por outro (1982)~. se. sido. um inibidor particular é efetivo.. pos-germinativo~. possibilidades. ainda não. tem. ou. ser. fatores. iniciais. de. elucidação. do. reaçe5es. desencadeamento ou no processo degradativo. Os primeiros esforços para a. mecanismo de inibição da germinação de esporos estudo de agentes germinantes. envolveu. seus derivados. simples~. e. o a. ação da inibição desses derivativos. WOESE et alii. (1958),. examinaram a habilidade dos análogos da. induzir. germinação. de. esporos. determinaram que iniciada. por. a. de. Bacillus. germinação. L-alanina. e. seus. foi. bem. L-alanina sl.1btilis.. sucedida. análogos,. e. que. Eles quando esta.

(39) ,.,...,. 4_" • germinação pode ser inibida por D-alanina e seus Outros. também. pesquisadores. encontraram. &. semelhantes com D-aminoácidos (HARREL SCHIMIDT et. alii~. FEY et. 1961~. análogos. resultados. 1964; WAX. alii~. 1955;. HALVORSON~. V&. FREESE.. 1968) . No estudo com esporos de. Clostridiu.~. àutores determinaram inibição da germinação por e. indução por D-alanina (UEHARA &. FRANK~. 1967~. Esses resultados estão em desacordo com os aliL.. (1957),. onde. foi. constatado. L-alanina.. ANDO~. 1973).. HITZM~N. de. que. alguns. não. D-alanina. produziu efeito na germinação de esporos de Clostridia. quais foram inibidos. por. vários. et. os. incluindo. aminoácidos~. L-alanina. Devido à germinação. poder ia. ser. inibidores metabólicos e. suposição de um. evento. enzimas. que. a. iniciação. metabólico.. inibitórias. vários. especificas. foram estudados. STEWERT & HALVORSON (1953), relataram a germinação de esporos. de. Bacillus. inibida por arsenato, arsenito,. cereus. da. T,. não. que foi. barato, cianida ou monoiodo. acetato, quando adicionados ao meio de germinação. MURTY &. HALVORSON. (1957),. não. detectaram. inibição da germinação de esporos de Bacillus cereus T enzimas semelhantes determinou-se que. às a. inibitórias.. germinação. de. Em. outro. esporos. de. por. trabalho. Bacillus. thermoacidurans foi inibida por 2,4 dinitrofenol, arsenato. azida de sódio e iodoacetato (HEILIGMAN et alii, 1956)..

(40) 24. Além antibióticos como. das. enzimas. estreptomicina. subtilina~. os. inibi tórias~ e. penicilina. foram relatados como inibitórios ineficientes da germinação de esporos de. bo"tul inu~. Clostridiu~. (TREADWELL. et. alii.. 1958) . espontânea. germinação. A. Bacillus sp foi inibida por sais de prata~. o-fenantrolina saturada ou. (LEVINSON &. HYATT~. 1966;. metabólicos. cobre~. de. esporos. ferro~. soluçêíes. com. mercúrio. pH. baixo. ANDO~1973).. CURRAN &: KNAYSI inibidores. de. em. (1962)~. constataram. que. um o. estudo etanol. antagonista eficiente na germinação de esporos de. com é. um. Bacil1us. subtilis. Segundo atividade do aumento. álcool~. TRUJILLO. (1970). ~. a. na germinação de esporos aumenta com o. comprimento. do. LAIBLE. &:. da. cadeia.. autores. Esses. demonstraram que a inibição da germinação de. esporos. álcool pode ser revertida através da remoção do ambiente dos esporos. Foi sugerido então que o. pelo. alcool álcool. do age. inibindo enzimas requeridas para a germinação. Várias misturas de agentes qLÚ micos inibiram o processo de germinação. PARKER &: BRADLEY (1968) e (1969). determinaram que clorocresol germinação. de. esporos. nutriente.. Entretanto~. de. Bacillus. esta. revertida quando os esporas. inibiu. inibição foram. o. subtilis foi. lavadas. PARKER. ini cio em. da meio. completamente com. água~. ou.

(41) 25. quando adicionou-se polisorbato (Tween 80) ao autores acreditam que esta reversibilidade é de. que. os. inibidores. interferem. requeridas para a germinação.. em. meio. uma. algumas. Esses. evidência enzimas.

(42) 26.. 3. MATERIAIS E MÉTODOS. 3.1. Materiais. 3.1.1. Matéria-Prima. Como matéria-prima foi utilizado de ART (g/100 ml), preparado a. partir de xarope. de caldo de cana-de-açúcar e esterilizado 1~0. atmosfera de pressão, a. mosto~. o. 12~. a 10%. concentrado. em. autoclave. a. C durante 20 minutos.. 3.1.2. Culturas. As foram:. Bacil1us. coagulans isoladas de. e. bactérias. utilizadas. subtilis~. Bacillus. Bacil1us processos. megaterium.. nos. b,.evis~. Estas. fermen ta ti vos. experimentos Bacillus. bactérias. para. a. foram. produção. de. álcool de cana-de-açúcar. Encontram-se conservadas em estado liofilizado, e fazem Departamento de Ciência Escola. Superior. Piracicaba, S.P.. de. parte e. da. coleção. Tecnologia. Agricultura. de. bactérias. do. Agro-Industrial. da. "Luiz. de. Queiroz",.

(43) 27. 3.2. Métodos. 3.2.1. Esporulação. As culturas liofilizadas foram reativadas. em. Depois. de. tubos de cultura, contendo 10 ml de caldo GLT. -incubadas. por. repicadas e. 24. incubadas novamente nas. mais 24 horas.. A. partir. dai,. através do espalhamento de. as. horas~. mesmas. os. por. condiç~es,. foram. esporos. suspens~es. foram. culturas. das culturas. obtidos com. uma. espátula de Drigalsky, em frascos de Roux, contendo meio cultivo. completo. para. a. incubação foi feita em estufa a periodo de 28 dias, ou. (DIFCO. esporulação. até. se. um. obtivesse. método. (1908), que usa o verde de. malaquita. corante e. esporulação A esporulação. completa com liberação dos mesmos (Figura 1). foi determinada através do. A. ±. 35°C. que. 0582).. coloração. de e. de. a. de. WIRTZ. safranina. como. contra-corante respectivamente.. 3.2.2. Coleta dos Esporos. Inicialmente, os esporos foram água destilada esterilizada, a suspens~es. ±. Em. suspensos. em. seguida,. as 2.. de esporos foram centrifugadas a 3622,32 G (m/s ;. por 20 minutos.. Depois de eliminado o sobrenadante, a massa. de esporos foi novamente. ressuspensa. ecentrifugada. com.

(44) Culturas Liofi lizadas. 10ml caldo. GLT. [35 C/24h 0. Repicagem. {~. 10ml caldo. GL T. [35 C/24h 0. Espa I ha mento da suspensão em frasco de Roux. 1. 35°C/ 28 di a,. Determinação da esporulacão pelo método de coloração de WI RTS. Figura 1- Esquema da esporulação.

(45) 29. água~. nas mesmas condições acima. citadas. de. forma. que. a. ap6s. temperatura das suspensões não ultrapassasse. a centrifugação. Esta operação foi repetida por mais 5 vezes com a finalidade de eliminar o máximo possivel. de. "debris". celulares. Os esporos foram então armazenados em água a .,::.. o. C, até a momento de serem utilizados .. 3.2.3. Ativação dos Esporos. Para o suspensões de esporos. tratamento. de. consideradas~. ativação~. 1. foi inoculado em. das. ml 50. ml. de mosto em erlenmeyers de 250 ml, cujos pH foram corrigidos para 4,5, sódio.. com ácido cloridrico e 5,5 e 6,5 com hodró:-:ido. Em. seguida,. foram. submetidas. banho-maria regulado termostáticamente 60, 80 e 90. °c. por. 10. minutos.. Após. ao. de. aquecimento. em. às. temperaturas. de. o. aquecimento,. as. suspensões foram rapidamente resfriadas em água corrente até atingirem a. temperatura. ambiente. Das suspensões coletou-se. amostras (1,0 ml), as quais. foram. (Plate. plaqueadas em meio de cultivo PCA 0479) ,. cujos. pH. eram. ajustados. clori drico e hidró}ddo de sódio. serialmente. de. Count. previamente acordo. com. diluidas. Agar-DIFCO ácido. com o. pH. das. mesmas. foram. feitas. após. 24. das. e. As placas foram incubadas a 35,0 ± a contagem. e. horas. de.

(46) 30. incubação, em contador de. colónias. com. lupa. tipo. QUEBEC. (Figura 2).. 3.2.4. Germinação dos Esporos. Depois. do. plaqueamento. realizado. imediatamente após o tratamento de ativação, os. erlenmeyers. contendo as suspensões foram pré-incubados a 35°C ± 1,0 por 6 horas, sendo que novos plaqueamentos foram. °c. realizados. de 2 em 2 horas até completar 6 horas de pré-incubação. meio de cultivo e as condições de incubação foram as. O. mesmas. citadas anteriormente (Figura 3). Cada tratamento foi. realizado. independente-. mente e em triplicata.. 3.3. Delineamento Experimental e. Análise. Estatistica. dos Dados. O. delineamento. inteiramente casualizado,. num. para a análise da capacidade. experimental esquema. de. foi. fatorial. germinação. dos. Para se constatar diferenças entre as médias foi o teste de Tukey a 5% de probabilidade O. esquema. de. análise. apresentado na tabela 19 do apêndice.. (GOMES~. de. o. 4x3x3x4, esporos. utilizado. 1985). variância. é.

(47) 31.. Temperatura de ativacão (OC). 60} 80. 10min. 90 suspensão de esporos. SOml caldo de cana-de-acúcar. ~. resfriamento imediato. ~. suspensão de esporos ativados. -. diluição em água lÕ~ lÕ. I ncu bação das placas. 6. Plaqueamento em PCA, com pH ajustado de acordo com o pH da suspensão.. Contagem do número de colônias. Figura 2 - Esquema da ativação dos esporos.

(48) -:'!",...,.. ._.~. .. Pré-incuoação das suspensões de esporos ativados, por 6horas a 35°C. Plaqueamentos realizados de 2 em 2 horas até completar 6horas de pré-incul:x:Jcão. suspensão de esporos ativados e pré- incubados nos tempos 2, 4. diluição em água 'Õ5,~. plaqueamento em PCA,com pH ajustado de acordo com o pH da sus pensão.. e 6 horas.. Incubação das placas. Contagem do número de colônias. Fíg u ra 3 - Esquema da germi nação dos esporos.

(49) 33.. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO. Os. resultados. contagens. das. de esporas germinados das espécies de. Bacillus. submetidos aos diferentes tratamentos de de ativação e. da - número. pH,. estudadás, temperaturas. tempos de incubação, encontram-se nas Tabelas. 7, 8, 9, 10, 11, 12. 13, 14, iS, 16, 17 e 18 do apêndice. Na Tabela 19 do apêndice, análise. de. variância. com. seus. apresentada. é. respectivos. a de. niveis. significância.. 4.1. Efeito da Temperatura de Ativação. na. Germinação. no. estudo. dos Esporos. Os. valores. médios. influência da temperatura de. obtidos. ativação. na. germinação. da dos. esporos são apresentadas na Tabela 1.. De. uma. forma. geral,. apresentados na Tabela 1 mostram que. para. resultados. os a. maioria. espécies estudadas, a temperatura de ativação. é. um. das fator. que exerce marcada influência na capacidade germinativa dos esporos, pais houve uma queda significativa. no. número. de.

(50) 34. Tabela 1 -. Teste. de. para. Tukey. Temperan.lra. as. Interações. X Microrganismos. TEMPERATURA M~DIAS. MICRORGANISMO 60 °c. 90 °c. 80 °c. B. subtilis. BO 154,25. .1."::'. .-S , 7",Ab .:.... 87 ~64AC. B. megateriul'll. AO 1S6,97. Ab 146,7S. 85,97. 82,81 C o.. 75,31 B o.. 48,94. 88 ,:/"'7",co.. 7'" '"'SBb ..c...,..:... 00,. B.. bre~'. is. B. coagulans. ~. 128,19. MeDIAS. 0. 108,27. b. B. 126,87. AC cb. ,. 61 Bc. 70,79. c. Letras maiúsculas iguais na mesma coluna e letras minúsculas iguais na mesma linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.. esporos germinados à medida que se aumentou. a. de ativação de 60 para 80 e 90. para. e~{ceto. temperatura Bacillus. brevis que não diferiu entre 60°C e 80°C, mas que. apresentou um decréscimo significativo a 90. também. O~. L... Estes resultados diferem daqueles encontrados por RAJARATHIMAN et alli (1987), que constataram que. 90°C. por 10 minutos e 100°C por 1,0 minuto foram temperaturas de ativação. ideais. para. contraste, MORAN et. B.. alli. porcentagem de germinação. subtilis. (1990) , a. 80. e. megaterium.. B.. determinaram por. 10. uma. Em. maior. minutos. para. Bacillus spp. Segundo esses autores, essas discrepâncias. podem. estar. relacionadas. às. condições. de. esporulação.

(51) 35. empregadas~. às linhagens. e à natureza do. diferentes~. agente. indutor de germinação utilizado. Um fator importante que poderia justificar o fato da. maior. taxa. de. germinação. tratamento de. ativação. estar ligado à. presença de. - presentes no. inóculo. a. 60. ter. por. eventuais que. inicial~. ocorrido. 10. vegetativas. foram. durante o tratamento térmico de ativação a essa. destruidas temperatura~. o que certamente ocorre~ quando se utiliza 80 ou 90°C 10 minutos,. minutos. foi. por. pois segundo KELLY & KROLL (1987), 90°C por para. suficiente. a. vegetativas de Bacillus spp, e utilizaram 10 minutos a 80°C. destruição. ANDRADE para. &. o. deve. minutos,. células não. com. das. células. SERRANA. destruição. 10. (1990) ,. de. células. 10. minutos. vegetativas de Bacilus subtilis. No. presente. caso,. 80°C. por. poderia ser considerado o melhor tratamento de ativação para os esporos das espécies de Bacillus estudadas, nas condições empregadas, uma vez que o tratamento a 90°C por 10 causou uma. diminuição. estatisticamente. minutos. significativa,. número de esporos germinados em relação ao tratamento. °c. a. no 80. por 10 minutos.. 4.2. Efeito do pH na Germinação dos Esporos. Os. valores. médios. obtidos. no. estudo. da. influência do pH na germinação dos esporos são apresentados.

(52) 36. na Tabela 2.. para. Teste de Tukey. Tabela 2. as. Interaçôes. pH. x. Microrganismos pH. MICROR6ANISMO. M~DIAS 5~5. 4~5. 94,OOBb. B. subtilis B. megaterium B.. bre~1. ... 117 , .:;__ Ac :;,. Ba Aa 140,86 145,75. 126,87. 164~75Aa 137,64Ab. 139,91. 6"7' 8,",!"ca ....... is. 69 67. ....,)~. B. coagulans. 55,14. Mf::DIAS. 82,58. 6~5. Da. ~. 8--> ..c.., 5.:;,ca. Cb. --, ~6Ba "'". 83,94. A. 69 ,o...:. - ,",c. ,'"'!" ,/. B. Ba. -- ,. 87 /~:;,. c. C. letras Letras maiúsculas iguais na mesma coluna e minúsculas iguais na mesma linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.. Os mostram. que. para. resultados os. apresentados. esporos. da. maioria. na das. Tabela espécies. estudadas, o pH 4,5 exerceu efeito inibitório na capacidade germinativa, exceto para B.. brevis cuja diferença entre. os. três niveis de pH não foi significativa. Analisando cada espécie isoladamente, não se constatam diferenças estatisticamente significativas entre o efeito dos niveis de pH esporos de B. entanto,. para. subtilis.~. B.. 5,5. B.. megateriullll. e. na. 6~5. brevis. estas. e. B.. germinação. dos. coagulans,. diferenças. no. foram.

(53) 'T'F. -_, I. •. significativas nos três niveis de pH estudados. Os resultados médios esporos das espécies em mais. ,. favorável. comportamento. indicam que o pH. estudo~. para. do. condiçêíes. as. 5~5. dos o. é. germinação. de. empregadas~. uma vez que se observa uma. certa. inibição. da. germinação~. tanto no pH 4,5 como no pH 6,5, sendo que no pH. 4,5 a inibição foi mais acentuada. Estes resultados não concordam encontrados por alguns faixa de. pH. autores,. para. ideal. a. que. com. aqueles. determinaram. germinação,. da. que. maioria. a das. espécies de Bacil1us, encontra-se entre 6,8 a 7,3, variando conforme a espécie (EVANS &. CURRAN,. 1963; LEVINSON & HYATT, 1970; LEVINSON (1957) ;. HYATT. &. &. LEVINSON. 1943;. MORAN. HYATT. et. ORDAL,. alli, 1990).. (1962);MORAN. &. WOLF. (1956) ;. et. alli. determinaram que o comportamento dos esporos com relação aos pH, pode. &. LEE. THORLEY (1990). de. bactérias,. ser bastante variável,. dependendo. da composição do meio de germinação.. Segundo esses. autores. essas diferenças devem estar relacionadas com a distribuição das enzimas necessárias par as várias uma vez que são diferentes os pH. vias. ótimos para. das mesmas 1 inhagens de Bacillus, dependendo do. meio.. Assim,. por. exemplo,. comparando o efeito do. pH. na. glicose e L-alanina,. em. constataram. presença. que. na. duas. WOLF. &. de. a. germinação. da. composição. THORLEY. germinação linhagens. germinação,. de. presença. na de. glicose,. (1957),. B. as. de. subtilis, linhagens.

(54) 38.. germinaram melhor em pH. ácido~. enquanto que na. presença. de. L-alanina o pH 6timo foi o alcalino. No presente refletem. o. efeito. caso~. as diferenças. exclusivamente. estudados, uma vez que o meio de. dos. encontradas. niveis. germinação. pH. de. foi. o. mesmo. para todos os microrganismos empregados.. 4.3. Efeito da Interação entre Temperatura de Ativação e. pH na Germinação dos Esporos. Os. valores. médios. obtidos. no. estudo. da. pH. na. influência da interação, temperatura de ativação germinação de esporos, são apresentados na Tabela Os indicam que. de. r-esultados uma. maneira. apresentados. na. Tabela. geral. um. decréscimo. estatisticamente significativo (P. =. houve. 0,05) na germinação dos. esporos com o aumento da temperatura de. ativação. para. os. três niveis de pH estudados. com. Analisando-se o efeito dos pH as. diferentes. temperaturas,. verifica-se. que. diferença significativa entre os niveis de pH. para o pH 4,5, verifica-se um decréscimo significativo na. germinação. dos. esporos,. houve e. 6,5,. Entretanto,. estatisticamente para. temperaturas estudadas, sendo que a 90°C este mais acentuado.. não 5,5. para os tratamentos de ativação a 60 e 80°C.. relação. as. efeito. três foi.

(55) 39. Teste de Tukey. Tabela 3. para. as. Interações. oH. x. Temperatura. pH TEMPERAT.. Me:DIAS 4.5. C. 6~5. lO'") 1-,Ab - .a:.-. 143~17Ao.. 1'9 ,..,~a. Bb. 118~90Ba. 119~6yBa. 60. ':>. 80. °c. 86. 90. °c. 59.31. Me:DIAS. 5~5. ~. IJ. '-:;''''i ...... ~"'-. 82.58. Cc. 84.96. c. 115,67. ,,-I. ca. a.. ~. A. 128.19. ~_.. 68.10. 109~00. cb. b. Letras maiúsculas iguais na mesma coluna e letras pelo minúsculas iguais na mesma linha~ não diferem entre si teste de Tukey a 5% de probabilidade.. Estes resul tados estão de d.cordo com aqueles de LEE & ORDALL (1962). que constataram que a germinação de esooros através de oH tratamento de ativação. Assim.. megaterium ativados a. por. bai;.~o. exemplo~. temperaturas altas. 5,0 mas não germinaram a. 4.4. Comportamento. é. inibição. da. dependente. do. esporos. de. B.. a. pH. germinaram. pH 4.0.. da. Relação ao Tempo de. Germinação. dos. Esporos. em. Incubação. Os valores médios resultantes do. estudo. da.

(56) 40. influência do tempo de incubação na germinação dos esporos. são apresentados na Tabela 4.. Teste. Tabela 4. de. Tukey. para. a.s. Interações. Microrganismo x Tempo. TEl"lPO l'1ICRORGANISMO. B. :.-=:ü.btili:...-=:. ME':DIAS. ..., ..... (;. '"'6 ~.q.·'l. Aa. ..1. ,_,. 4. 128.81. 6. Aab 124.81 B a.b 117~44Ab. A b B. megate r i um 148~3ra 136.81 o. 148~22Aa. B.. bre~'. i. 82.70. S. 92 ~r:>Ba.. B. coagulans. Mt:DIAS. Ba. ~_..::.... 11<= --Q. ~I.OO. .J... B 71 , ""6 ""~. 77.67. 1 .-. ~. ,. .... U-::'.b. o. b. Bb. 4b. . '"'6 .1.-L.. 1?6 ??Ab - ,--. cbc cbc. 66,26. h. 8-yB j. 139.91. BC. 64.63. ~. A. 57,4a. 69 .0..:.. _...,c. - Bc 5 9 • ü4. 7~. "~,. a-C /. 90.05~. 100,98-. letras Letras maiúsculas iguais na mesma coluna "" pelo minúsculas iguais na mesma linha. não diferem entre si teste de Tukey a 5% de probabilidade.. Os. resultados. Tabela. 4. mostram que houve uma diminuição significativa no número. de. esporos germinados, para. todas. apresentados. as. na. espécies. estudadas.. à. medida que se aumentou o tempo de pré-incubação de zero para 6 horas. com. os. tempos, observa-se que não houve diferença significativa. (P. Analisando-se as médias relacionadas. =. 0,05). na germinação dos esporos para. os. tempos. 2. e. 4.

(57) 41. horas de. mas para 6 horas,. pré-incubaçãQ~. decrescimo. o. da. capacidade germinativa foi estatisticamente significativo em relação aos demais tempos. anãl ise. Numa. comparativa. relação ao comportamento das. brevis e B. coagulans, ~u. espécies.. das. com. médias~. tiveram um comportamento. B,. que. observa-se. semelhante.. seja. não apresentaram diferenças significativas a 5%. de. de. B,. probabilidade. Entretanto, essas espécies. subtilis. e. B,. megaterium. por. que,. diferiram sua. também. vez~. apresentaram diferença significativa entre si para. o. tempo. portanto, que a. maior. de 4 horas de incubação. Os resultados. indicam~. ta:<a de germinação ocorreu imediatamente após de. ativação~. tempos entre. ou seja. no tempo ~.. 4. horas,. e. zero. hora,. alguns. interferido no processo. Estes dados. tratamento. o. sendo. que. nos. devem. ter. con cordan tes. com. fatores. são. aqueles de WOLF & THORLEY (1957), que estudando o efeito. linhagens. vários agentes indutores de germinação para vinte de B,. subtilis constataram. bastante. variável.. que. tempo. o. dependendo. do. germinação e da linhagem empregada. de. germinação indutor. agente e. concluiram. que. cada linhagem e espécie podem e:-:istir diferentes padraes tempo. de. distribuição germinação.. germinação, de Por. encontraram que o. enzimas outro. como. resultado. necessárias lado,. MORAN. tempo de incubação. às et. de. de para de. diferente. da vàrias alli. posterior. é. à. vias. de. (1990).. ativação.

(58) 42. não apresentou diferença significativa entre 30 e 60 minutos de incubação para Bacillus sp, empregando-se L-alanina. como. agente indutor de germinação. Desta. forma~. o fato verificado de. uma queda na ta:{a de germinação com o. no. caldo. 4.4~1.. de. indutores. cana-de-açúcar. Efeito da interação entre Ativação de Tempo. houve. tempo de pre-incubação. pode estar relacionado com a falta de agentes germinação,. que. de. usado. Temperatura. pré-incubação. da nos. de na. Germinação dos Esporos. Os interação. da. valores. médios. obtidos. de. ativação. temperatura. no. estudo. da. temoo. de. pré-incubação na germinação são apresentados na Tabela 5.. Os mostram. que. de. resultados um. modo. geral,. significativa na germinação pré-incubação. para. as. apresentados. dos. três. sendo que entre 2 e 4 horas de foi significativa.. houve esporos. temperaturas. na. Tabela diminuição. uma com. '--'. tempo. de. experimentadas,. pré-incubação ~. a. di ferença.

(59) 43.. Tabela 5 -. Teste. de. Tukey. para. as. Interações. Temperatura x Tempo. TEMPO TEMPERAT.. Mt':DIAS. 60. 80 90. 4. '?. (i. L. '..J. o,~ L.,. 156,14Aa.. 129,17. Ab. AC 118,03. 0". 11 "':;" ~. 11'-' 7t::;B a. 10S~94Aa. 97~64Bb. 75, 9~a. 63,OSCb. .~. <:>. C. t-lt':DIAS. ~t:;.Ba. / ....'. 75,11. ca. 115,000.. ..... ,. J. .....,.. 69,OOcab. 103,64. b. 100,9S. b. 109, 42. AC. 128.19 1 .-. .J..tJ. A. S ~ LJ '"'7 9. 70~79c. 90 !!I V.-.~ c "-. Letras maiusculas iguais na mesma coluna e letras pelo minusculas iguais na mesma linha, nao diferem entre si teste de Tukey a 5% de probabilidade.. Pode temperatura de 60. ser. observado. após. inibição da germinação foi. também. horas maior. de. do. temperaturas (SO e 90 °c)~ sendo que. que a. para. que. a. pré-incubação para. menor. as. demais. inibição. da. germinação em relação ao tempo de pré-incubação ocorreu para a temperatura 90°C..

(60) 44. 4.4.2. Efeito das. entre pH e Tempo. Interaç~es. de. pré-incubação na Germinação dos Esporos. Os relação entre pH e. valores. médios. tempo de. obtidos. incubação. na. no. estudo. germinação. da dos. esporos são apresentados na Tabela 6.. Tabela 6 -. Teste de Tukey. para. as. Interaçé5es. pH. ". Tempo TEMPO. Mt:DIAS. pH 4. 2. O. cb. 6. 85 !f <..,..Bo.b v __. 95, 14C o.. S,5. 131,86Ao.. 122,11 Ao.b 112,4~b. 96,25. 6,5. 118,00Bo.. 107,64B o. b 10S,14Ab. lOS - ,":>";)Ab. 115,000.. 103,64. MeDIAS. 81,17. b. i. 100,98. b. c 82,58. 68,6~c. 4,5. AC. 115,6r 109,00B. ~..:..-. 90,OSc. letras Letras maiúsculas iguais na mesma coluna e minúsculas iguais na mesma linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5i. de probabilidade.. Analisando os dados da Tabela que para todos os niveis. de. pH. maior. houve. experimentados. diminuição do número de esporos germinados com pré-incubação, sendo que a. observa-se. 6,. taxa. tempo. o. germinação. para o pH S,5, enquanto que para o pH 4,5, este. uma de. ocorreu. número. foi.