MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
EDWARDS FRAZÃO-TEIXEIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ MARÇO - 2006
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
EDWARDS
FRAZÃO-TEIXEIRA
Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Orientador: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira
Co-Orientadora: Profª. Lílian Maria Garcia Bahia-Oliveira
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ MARÇO - 2006
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
EDWARDS FRAZÃO-TEIXEIRA
Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Aprovada em 03 de março de 2006 Comissão Examinadora:
___________________________________________________________________ Prof. Walter Flausino (Doutor, Parasitologia) - UFRRJ
___________________________________________________________________ Profª. Maria Angélica V. da C. Pereira (Doutora, Parasitologia) - UENF
___________________________________________________________________ Profª. Sílvia Regina Ferreira G. Pereira (Doutora, Microbiologia) - UENF
___________________________________________________________________ Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira (Doutor, Parasitologia) - UENF
“Maybe I will never be All the things that I want to be
But now is not the time to cry Now's the time to find out why
I think you're the same as me We see things they'll never see You and I are gonna live forever”
A
Todos aqueles que me conhecem na íntegra e, por isso, sei que sempre serão os meus
verdadeiros amigos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por continuar oferecendo sua proteção e me guiar por caminhos inimagináveis em busca de uma luz.
Ao meu pai, pelo constante zelo e por ser meu modelo de honestidade e caráter.
A minha mãe, pelo carinho e cuidados dispensados numa vida inteira de realizações. Ainda não sei como consegue fazer tantas coisas ao mesmo tempo.
Ao meu irmão Diego. Ver você crescer é como reviver grandes momentos da minha vida. O futuro exige apenas que nós tenhamos o trabalho de estender a mão para alcançá-lo.
Ao meu irmão Dariozinho. Crescemos juntos e aprendemos juntos. Sempre admirei sua inteligência, que me custou algumas partidas de xadrez perdidas. O sucesso é pouco para mentes brilhantes.
A Lu, suporte constante quando tudo parece perdido. Você é minha luz, minha maior incentivadora. Ainda espero, algum dia, ter 7% da sua praticidade.
Aos meus avós Frazão, Jutirene, Heloíza e Edwards, admiro vocês pela vida que viveram e pelo muito que ainda têm a viver. São os pilares da nossa família e onde minha vida começa. Obrigado por terem se amado, do contrário não estaria aqui.
A Tia Inês e Tia Lolô. O orgulho de vocês é alimento à minha caminhada, que está apenas começando. Torcemos juntos, comemoraremos juntos.
A Vulks e Zari. Muitos seres humanos tendem a adquirir características animais. Muitos animais demonstram as qualidades mais humanas.
Aos amigos, colegas e muitas outras pessoas que tive o prazer de conhecer nestes dois anos de trabalho. De várias maneiras diferentes, vocês contribuíram para a execução deste Projeto.
Ao meu amigo Lério, pela grande ajuda durante a coleta das amostras e cujo carinho e brincadeiras dão toque especial à Pesquisa Científica. Valeu “coisinha” !
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, pela oportunidade de fazer Ciência.
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudos.
Àqueles professores que sabem os mestres que são, mas nunca esquecem os alunos que foram.
Em especial, às Professoras Maria Angélica e Sílvia Regina, pelas constantes palavras de elogio e incentivo.
À Profª. Lílian, pela co-orientação, confiança, incentivo e conhecimentos passados durante estes anos de pesquisa.
Finalmente, ao “meu jovem” amigo Francisco. Obrigado pela constante confiança em meu potencial. Muitos têm a sorte de ter um Orientador amigável. Poucos têm o prazer de ter um grande amigo como Orientador.
BIOGRAFIA
EDWARDS FRAZÃO TEIXEIRA, filho de Manoel Dario Marinho Teixeira e Lídia Pessanha dos Santos Teixeira, nasceu em Campos dos Goytacazes, Estado do Rio de Janeiro, em 3 de setembro de 1979.
Concluiu o Ensino Fundamental em 1994 nas escolas Externato Nacional e Instituto Dom Bosco - Salesiano, em Campos dos Goytacazes. Em 1997, concluiu o Ensino Médio no Colégio Escola Santo Antônio – CESA.
Ingressou no Curso de Medicina Veterinária em 1999, na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF). No mesmo ano, iniciou suas atividades como bolsista de trabalho junto ao Laboratório de Biologia do Reconhecer do Centro de Biociências e Biotecnologia (CBB) da UENF, sendo selecionado em 2001 pela Comissão de Bolsas de Iniciação Científica para atuar no Laboratório de Sanidade Animal do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA).
Em fevereiro de 2004, foi selecionado para ingresso no Curso de Pós-Graduação em Produção Animal, área de concentração Sanidade Animal, nível de Mestrado, da UENF. Em março de 2005, iniciou suas atividades como bolsista no Pré-Vestibular Teorema, que envolve aulas ministradas por pós-graduandos da UENF. No referido curso, tem ministrado aulas na disciplina Inglês.
Em janeiro de 2006, foi selecionado para o Doutorado no Curso de Pós-Graduação em Produção Animal, Sanidade Animal, da UENF.
CONTEÚDO RESUMO... xiv ABSTRACT... xvi 1. INTRODUÇÃO... 1 2. OBJETIVOS... 3 2.1. Gerais... 3 2.1. Específicos... 3 3. REVISÃO DE LITERATURA... 4 3.1. Toxoplasma gondii... 4 3.1.1. Taxionomia... 4 3.1.2. Histórico... 4 3.1.3. Ciclo biológico... 6 3.1.4. Morfologia... 8 3.2. Pesquisas realizadas... 8 3.2.1. No mundo... 8 3.2.2. No Brasil... 13
3.2.3. Em Campos dos Goytacazes... 14
3.3. A infecção em bovinos... 15
3.4. A infecção em suínos... 17
3.5. Vigilância Sanitária e Toxoplasma gondii... 19
3.5. O ensaio imunoenzimático - ELISA... 21
4. MATERIAL E MÉTODOS... 23
4.2. Classificação das propriedades... 23
4.2.1. De bovinos... 23
4.2.2. De suínos... 24
4.3. Coleta de sangue e remoção dos soros... 24
4.4. Padronização do teste sorológico... 24
4.4.1. Para análise de soro bovino... 25
4.4.2. Para análise de soro suíno... 26
4.5. Avaliação sorológica... 27
4.5.1. Nos bovinos... 27
4.5.2. Nos suínos... 28
4.6. Visualização dos resultados sorológicos... 28
4.7. Seleção dos estabelecimentos comerciais... 29
4.8. Aquisição dos encéfalos suínos... 29
4.9. Digestão péptica das amostras encefálicas... 29
4.10. Bioprova... 30
4.10.1. Inoculação... 30
4.10.2. Isolamento do parasita... 31
a) Observação de taquizoítas em líquido peritoneal... 31
b) Impressão de órgãos em lâminas... 31
c) Observação direta de esfregaços de encéfalos... 32
d) Técnica de arrasto... 32
4.10.3. Eutanásia... 32
4.11. Análise estatística das medidas dos taquizoítas... 33
5. RESULTADOS... 34
5.1. Padronização do teste sorológico... 34
5.1.1. Para amostras bovinas... 34
5.1.2. Para amostras suínas... 34
5.2. Cálculo do “cut-off” e discriminação da soropositividade... 37
5.2.1. Em bovinos... 37
5.2.2. Em suínos... 37
5.3. Prevalência de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii... 41
5.3.1. Nos soros bovinos... 41
5.3.2. Nos soros suínos... 42
6. DISCUSSÃO... 46
6.1. Padronização do teste sorológico... 46
6.1.1. Para amostras bovinas... 46
6.1.2. Para amostras suínas... 46
6.2. Cálculo do “cut-off” e discriminação da soropositividade... 47
6.2.1. Em bovinos... 47
6.2.2. Em suínos... 47
6.3. Prevalência de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii... 47
6.3.1. Nos soros bovinos... 47
6.3.2. Nos soros suínos... 49
6.4. Isolamento de Toxoplasma gondii em encéfalos de suínos... 52
7. CONCLUSÕES... 57
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Prevalências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em bovinos no mundo... 17 Quadro 2. Prevalências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em suínos
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Presença de anticorpos anti-Toxoplasma gondii, pelo teste de ELISA indireto, em bovinos criados nos arredores e limites do município de Campos dos Goytacazes/RJ... 42 Tabela 2. Anticorpos anti-Toxoplasma gondii observados em soros de
suínos criados em regiões urbanas e arredores do município de Campos dos Goytacazes/RJ... 43 Tabela 3. Isolamento de Toxoplasma gondii de suínos (Sus scrofa)
comercializados em mercados populares do município de Campos dos Goytacazes-RJ... 44 Tabela 4. Dimensões de taquizoítas de Toxoplasma gondii isolados de
suínos (Sus scrofa) em lavado peritoneal de camundongos (Mus musculus)... 45
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo biológico de Toxplasma gondii... 7 Figura 2. Valores em densidade óptica (DO) em ensaio para padronização
de ELISA indireto em soros de bovinos. Diluição do conjugado 1:4.000; diluição dos soros controle positivo e negativo a 1:500 e 1:1000 e sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml. (A) Solução bloqueio com PBS-T 0,05% + BSA 1%. (B) PBS-T 0,05% + ovalbubina 1%. (C) PBS-T 0,1%....…... 35 Figura 3. Valores em densidade óptica para padronização do ELISA
indireto em soros de suínos. Diluição do conjugado 1:10.000; diluição dos soros controle positivos e negativos a 1:200, 1:400 e 1:800. (A) sensibilização da placa com antígeno a 5 µg/ml. (B) sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml... 36 Figura 4. Valores em densidade óptica em ensaio para padronização do
ELISA indireto em soros de suínos. Diluição do conjugado 1:20.000 e diluição dos soros controle positivos e negativos a 1:200 e 1:400. (A) sensibilização da placa com antígeno a 5 µg/ml. (B) sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml... 36 Figura 5. Valores em densidade óptica (DO) em ensaio imunoenzimático
(ELISA indireto) dos soros dos bovinos positivos (placa 1). Diluição do conjugado 1:4.000; diluição dos soros a 1:500; sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml e bloqueio com PBS-T 0,1%... 38
Figura 6. Valores em densidade óptica em ensaio imunoenzimático (ELISA indireto) dos soros dos bovinos positivos (placa 2). Diluição do conjugado 1:4.000; diluição dos soros a 1:500; sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml e bloqueio com PBS-T 0,05% e BSA 1%... 39 Figura 7. Valores em densidade óptica em ensaio imunoenzimático
(ELISA indireto) dos soros dos suínos positivos. Diluição do conjugado 1:20.000; diluição dos soros a 1:400 e sensibilização da placa com antígeno a 5 µg/ml... 40 Figura 8. Espécimes de Toxoplasma gondii isolados em lavado peritoneal
de camundongo corados por GIEMSA. Em A (— com 10 µm) e em B (— com 5 µm) são observados taquizoítas livres no exsudato peritoneal. Destaque para os núcleos dos parasitas (→). Em C (— com 5 µm) observa-se em detalhes o núcleo de um taquizoíta e grânulos de amilopectina em seu citoplasma (→). Em D (— com 5 µm), destaca-se o parasita em processo de divisão dentro de macrófagos (→ abaixo) e a formação do vacúolo parasitóforo (→ acima)... 55 Figura 9. Espécimes de Toxoplasma gondii observados em cérebros de
camundongos. Em A e B, cistos em observação a fresco. Destaque para a parede cística de espessura delgada (→). Em C e D, cistos corados por GIEMSA. Destaque para os núcleos dos bradizoítas (→). Barra com 20 µm... 56
RESUMO
FRAZÃO-TEIXEIRA, Edwards, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; março de 2006; Toxoplasmose em bovinos e suínos, e a viabilidade de cistos em encéfalos suínos no município de Campos dos Goytacazes-RJ; Orientador: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira. Co-Orientadora: Profª. Lílian Maria Garcia Bahia-Oliveira.
Soros de 73 bovinos e 62 suínos criados em Campos dos Goytacazes e arredores foram analisados para a presença de anticorpos do tipo IgG contra Toxoplasma gondii. Ainda, 12 cabeças de suínos foram adquiridas em estabelecimentos populares do município, os quais comercializam carne suína in natura diretamente para a população. Seus encéfalos foram removidos e processados para bioprova em camundongos, com o intuito de isolar formas infectivas viáveis do parasita. As prevalências de anticorpos anti-T. gondii foram 52,06% para bovinos em geral e 20,59% para suínos domiciliares. O nível de isolamento de encéfalos suínos foi 50%. A atenção dispensada pelos criadores aos suínos dos sistemas de criação intensiva devem ter contribuído para a baixa soroprevalência nestes animais. As prevalências verificadas para bovinos e suínos representam potenciais de infecção através do consumo de suas carnes, de acordo com informações relatadas por outros estudos. Para os suínos, a suspeita levantada pela soropositividade pôde ser confirmada pelo alto percentual de isolamento do parasita nos encéfalos analisados. Outros autores já relataram correlação entre a presença de T. gondii em cérebros de suínos e outros tecidos, incluindo músculos. A padronização da técnica de ELISA indireto para detecção de anticorpos em soros de
suínos e bovinos foi bem sucedida, o que confirma os relatos de outros pesquisadores acerca de seu uso para investigação de infecções em populações. Conclui-se, ainda, que existe alto percentual de infecção dentre os bovinos e suínos analisados, e que estes animais são fontes de infecção humana. Adicionalmente, a presença do parasita em suínos comercializados em estabelecimentos populares deste município confirma que a toxoplasmose tem uma importante fonte de infecção nesta espécie animal.
ABSTRACT
FRAZÃO-TEIXEIRA, Edwards, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; February 2004; Toxoplasmosis in cattle and pigs, and the viability of Toxoplasma gondii cysts in encephalons of pigs in the municipality of Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro state; Adviser: Professor Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira. Co-Adviser: Professor Lílian Maria Garcia Bahia de Oliveira.
Sera from 73 bovines and 62 pigs bred in Campos dos Goytacazes and surroundings were analysed for the presence of IgG antibodies against Toxoplasma gondii. Though, 12 pigs’ heads were acquired in popular establishments of the municipality, which commercialize in natura pig’s meat directly to the population. Their encephalons were removed and processed for bioassay in mice, in order to isolate viable infective forms of the parasite. The prevalences of anti-T. gondii antibodies were 52.06% for cattle in general and 20,59% for domicile pigs. The isolation level from pigs’ encephalons was 50%. The attention given by the breeders to the intensive breeding system pigs must have contributed for the low seroprevalence in these animals. The prevalence verified for cattle and pigs represent potential of infection through the consumption of their meat raw or undercooked meat, according to information reported by other studies. For pigs, the suspicion raised by the seropositivity could be confirmed by the high percentage of isolation of the parasite in the analyzed encephalons. Other authors have already reported correlation between the presence of T. gondii in pigs brains and other tissues, including muscles. The standardization of the indirect ELISA technique for detection of antibodies in pig’s and bovine’s sera was successful, what confirms the
reports by other researchers on its use for infection investigations in populations. It is concluded, though, that there is high percentage of T. gondii infection among the analysed bovines and pigs, and that these animals are sources for human infection. Additionally, the presence of the parasite in pigs commercialized in popular establishments of this municipality confirms that toxoplasmosis have an important source of infection in this animal species.
1. INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, parasitose que acomete animais de sangue quente e tem como hospedeiros definitivos os felídeos. A doença afeta seriamente indivíduos imunocomprometidos, com sérios danos ao sistema nervoso central. Vários pesquisadores relatam que indivíduos imunocompetentes são menos vulneráveis à infecção e aos danos causados pelo T. gondii ao tecido nervoso. Entretanto, com o advento de novas tecnologias moleculares e pesquisas comportamentais, diversos autores têm proposto que a situação pode ser mais grave do que se imagina. Vários sinais têm sido detectados em indivíduos imunocompetentes e a associação com a presença do parasita exaustivamente investigada.
Paralelamente a isso, cresce cada vez mais o interesse dos pesquisadores em estudar a cadeia epidemiológica de várias doenças e as principais fontes de infecção humana. Várias infecções estão re-emergindo, antigos patógenos se modificando. Estudos sobre zoonoses tornam-se ainda mais importantes e a toxoplasmose, a mais cosmopolita delas, vem atraindo cada vez mais atenção da comunidade científica.
A cidade de Campos dos Goytacazes, localizada no Norte do Estado do Rio de Janeiro, tem sido internacionalmente citada pela endemia de toxoplasmose humana, com relatos de alto percentual em indivíduos de baixa renda e doença congênita. Vários estudos têm sido realizados a fim de detectar a principal fonte de infecção humana neste município. Estas pesquisas comprovaram a ampla
contaminação ambiental e ponderam acerca do papel de fontes de água na epidemiologia da doença.
Por outro lado, este município possui papel histórico no ciclo da pecuária e até hoje destaca-se pela produção extensiva de gado bovino. Estes hospedeiros intermediários, após adquirirem a infecção a partir de ambientes contaminados, podem exercer papel fundamental não só para disseminação da toxoplasmose como para a intensidade da infecção. Isto porque um cisto tecidual de T. gondii pode albergar até centenas de formas infectivas do parasita. A carne de um animal infectado pode conter muitos cistos e é, definitivamente, uma fonte a ser considerada em regiões endêmicas para essa parasitose.
Bovinos e suínos são importantes fontes de proteína animal para populações humanas. Várias são as pesquisas que visam determinar os índices de infecção por T. gondii em rebanhos de inúmeras regiões do planeta. Os índices variam e o assunto é cada vez mais estudado à medida que a correlação com a possibilidade de infecção humana é confirmada. Os investimentos em métodos preventivos têm crescido, o que pode ser confirmado pela corrida em busca de uma vacina para a toxoplasmose animal e pela melhoria das condições sanitárias em criadouros.
Nesse contexto, cresce ainda mais a importância da Vigilância Sanitária na fiscalização e garantia de produtos de origem animal livres de patógenos. Vários são os relatos de isolamento de T. gondii viável em tecidos animais comestíveis, assim como os surtos da doença humana, tendo como causa a ingestão de alimentos de origem animal.
Com base nestes relatos, justifica-se um trabalho de pesquisa que avalie a prevalência da toxoplasmose em animais de produção em Campos dos Goytacazes, assim como a presença do parasita em tecidos de animais comercializados in natura nos limites deste município.
2. OBJETIVOS
2.1. Gerais
a) Examinar bovinos e suínos criados em áreas urbanas periféricas e arredores do município de Campos dos Goytacazes-RJ quanto à presença de anticorpos anti-T. gondii em amostras séricas;
b) Demonstrar a presença de formas infectivas viáveis de T. gondii em encéfalos de suínos comercializados in natura em estabelecimentos populares que comercializam carne suína neste município.
2.2. Específicos
a) Padronizar o teste de ELISA indireto (“indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”) para detecção de anticorpos anti-T. gondii em soros de bovinos e suínos;
b) Verificar a importância de bovinos e suínos na cadeia epidemiológica da toxoplasmose em Campos dos Goytacazes;
c) Verificar a importância das carnes suína e bovina como potenciais transmissoras da toxoplasmose neste município e arredores;
d) Avaliar o risco de ocorrência de toxoplasmose através da ingestão de tecidos e derivados da carne de suínos naturalmente infectados;
e) Alertar quanto à necessidade de maior controle na Inspeção Sanitária dos animais que servem ao consumo humano e são criados em regiões urbanas e arredores do município sem controle sanitário.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Toxoplasma gondii 3.1.1. Taxionomia
A classificação taxionômica do agente etiológico da toxoplasmose, de acordo com Current et al. (1990) e Cavalier-Smith (1993), é:
Império: Eucariota (CAVALIER-SMITH, 1993) Reino: Protozoa (OWEN, 1858)
Filo: Apicomplexa (LEVINE, 1970)
Classe: Sporozoazida (LEUKART, 1879) Ordem: Eucoccidiorida (LEUKART, 1879) Subordem: Eimeriorina (LÉGER, 1911) Família: Sarcocystidae (POCHE, 1913) Sub-família: Toxoplasmatinae (BIOCA, 1956)
Gênero: Toxoplasma (NICOLLE e MANCEAUX, 1909)
Espécie: Toxoplasma gondii (NICOLLE e MANCEAUX, 1909)
3.1.2. Histórico
Alfonso Splendore foi o primeiro a detectar T. gondii. Em um estudo com coelhos em São Paulo, o pesquisador de origem italiana observou uma patologia
com quadro semelhante ao kalazar humano. Ele descreveu as lesões e os corpúsculos parasitários presentes, tanto as formas livres como intracelulares (SPLENDORE, 1908). A descoberta de Splendore ocorreu em julho de 1908, porém em outubro do mesmo ano, Nicolle e Manceaux relataram uma descoberta semelhante em células de baço e do fígado de Ctenodactylus gundi, um roedor africano (NICOLLE e MANCEAUX, 1908).
Segundo OLIVEIRA (2002), um oftalmologista chamado Jankü fez a primeira descrição de toxoplasmose congênita humana, em 1923. O paciente era uma criança de 11 anos de idade com hidrocefalia e cegueira, que veio a falecer. Ao corte histológico do globo ocular durante a necropsia, pôde-se observar a presença de parasitas na retina. TORRES (1927) relatou toxoplasmose humana pela primeira vez no Rio de Janeiro e descreveu microorganismos em cortes histológicos do cérebro, miocárdio e músculos esqueléticos de um bebê que faleceu aos 29 dias de vida. Ele reconheceu os organismos como sendo semelhantes a Toxoplasma gondii e espécies do gênero Encephalitozoon.
A primeira caracterização de toxoplasmose fatal em recém-nascidos foi realizada por WOLF e COWEN (1937). Dois anos mais tarde WOLF et al. (1939 e 1940) conseguiram, pela primeira vez, infectar animais com cepas isoladas de uma lesão do sistema nervoso central de um bebê falecido com um mês de vida. A caracterização da doença em indivíduos adultos foi documentada por PINKERTON e WEINMAN (1940) nos Estados Unidos (EUA).
Após a padronização de testes sorológicos, em especial o teste de Sabin-Feldman (SABIN e FELDMAN, 1948), pôde-se quantificar a prevalência da infecção por T. gondii em seres humanos e animais, confirmando sua ampla distribuição na natureza (FELDMAN, 1982).
Todavia, o ciclo completo do parasita só foi desvendado em estudos realizados por HUTCHISON (1965) e DUBEY et al. (1970), que descreveram a transmissão do parasita pelas fezes de gatos e sua fase sexual no intestino destes felídeos, culminando com a produção de oocistos.
3.1.3. Ciclo biológico
Dentre todas as espécies de parasitas, T. gondii destaca-se pela complexidade do seu ciclo biológico (DUBEY, 1994). As formas infectivas se diferenciam de acordo com cada uma das três fases de seu ciclo.
No intestino de seu hospedeiro definitivo, o felídeo, a forma infectiva resultante é o oocisto. Este é liberado em sua forma não esporulada juntamente com as fezes do felídeo infectado. No ambiente, este oocisto sofre uma alteração em sua estrutura para tornar-se potencialmente infectivo. Esta transformação é catalisada pela ação da temperatura, umidade e concentração de oxigênio ambientes ideais e é chamada esporulação (DUBEY, 1994).
O oocisto é uma importante ferramenta de disseminação do parasita no meio ambiente (da SILVA et al., 2003). Nesse local ele pode alcançar uma grande variedade de hospedeiros intermediários, onde realiza mais uma etapa de seu desenvolvimento biológico. Ao ser ingerido por qualquer animal de sangue quente, seja através de alimentos ou água contaminados, o oocisto esporulado rompe-se no intestino, liberando oito esporozoítas. Estes se dividem rapidamente nas células intestinais e linfonodos associados e dão origem aos taquizoítas (DUBEY, 1994). Os taquizoítas aproveitam-se da circulação sanguínea e linfática para atingirem os mais variados tecidos do hospedeiro (DUBEY e BEATTIE, 1988). Entretanto, dependendo da competência imunológica do indivíduo, o parasita migra para tecidos nervosos, musculares e hepáticos, onde se encistam. É importante ressaltar que essa fase extra-intestinal ocorre também nos felídeos (FREYRE et al., 1989), tornando-os, conseqüentemente, hospedeiros intermediários (Figura 1).
As formas de proliferação rápida, os taquizoítas, responsáveis pela fase aguda da doença, reduzem sua velocidade de multiplicação dentro dos cistos teciduais. Por este motivo passam a se chamar bradizoítas. Um cisto pode abrigar até centenas de bradizoítas e essa é a fase crônica ou latente da toxoplasmose (DUBEY, 1994).
O carnivorismo é o principal responsável pela continuidade do ciclo biológico a partir dos hospedeiros intermediários. O tecido contendo cistos teciduais, ao ser ingerido, sofre a ação de enzimas proteolíticas do estômago e intestino. Estas enzimas digerem a parede do cisto e permitem que até centenas de bradizoítas infectem os enterócitos do hospedeiro. Nestas células, os bradizoítas transformam-se novamente em taquizoítas e infectam os tecidos do hospedeiro (DUBEY, 1994).
Figura 1. Ciclo biológico de Toxoplasma gondii (modificado de DUBEY, 1993).
Quando os felídeos ingerem cistos teciduais, o ciclo biológico se completa (Figura 1). Os bradizoítas iniciam um ciclo enteroepitelial com uma fase assexuada e outra sexuada (DUBEY, 1998a). Os oocistos se formam durante a fase sexuada no lúmen intestinal após a fertilização dos gametas femininos (macrogametas) pelos masculinos (microgametas), de acordo com DUBEY (1994).
Outra forma de transmissão do T. gondii é através da via transplacentária (DUBEY, 1994), que acontece quando hospedeiros não imunes são infectados durante a gestação. O parasita prolifera-se na placenta e atinge o feto, levando a abortamentos ou lesões congênitas irreversíveis. A infecção pode ocorrer ainda por transfusões sanguíneas e transplantes de órgãos, mas não possuem a mesma importância que a ingestão de tecidos infectados (DUBEY, 1994; 1998a) e água (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003) ou alimentos contaminados com oocistos (DUBEY, 1994).
3.1.4. Morfologia
O taquizoíta de T. gondii possui forma de meia-lua. Sua extremidade posterior é arredondada e torna-se afilada em sua porção anterior. Suas dimensões são, em média, 2 x 6 µm e seu núcleo é observado próximo à extremidade posterior ou no centro da célula (DUBEY, 1977). Ainda segundo este autor, pela coloração de GIEMSA, o núcleo torna-se avermelhado e expõe sua forma circular.
No organismo hospedeiro, os taquizoítas se multiplicam nas células do indivíduo e formam os chamados pseudocistos, grupos, clones ou colônias terminais (DUBEY, 1977; AMATO-NETO et al., 1982).
Os bradizoítas apresentam algumas singularidades que os discriminam morfologicamente dos taquizoítas. A principal diferença é a localização de seu núcleo. Este se situa, geralmente, na região posterior da célula parasitária (DUBEY, 1998a). Os cistos teciduais podem medir 5 µm e conter apenas quatro bradizoítas, quando ainda são jovens. Mas podem alcançar, com o tempo, tamanhos de até 100 µm e conter centenas de bradizoítas (DUBEY, 1998a). Os cistos são geralmente subesféricos, contudo podem tomar o contorno da célula hospedeira (AMATO-NETO et al., 1982).
A terceira forma infectiva do T. gondii, o oocisto, varia de tamanho e forma, de acordo com seu desenvolvimento infectivo. O oocisto não esporulado mede cerca de 10 x 12 µm, adquirindo uma aparência subesférica a esférica. Já o oocisto esporulado mede 11 x 12,5 µm e sua forma varia de subesférica a elipsóide (DUBEY et al., 1970; DUBEY, 1973, 1976).
3.2. Pesquisas realizadas 3.2.1. No mundo
A toxoplasmose adquiriu grande importância com a descoberta de sua influência negativa em indivíduos imunocomprometidos, principalmente portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana - HIV (KHAN et al., 2005). Inúmeras são as pesquisas realizadas com o intuito de melhor conhecer os fatores agravantes desta relação e encontrar métodos mais eficientes de diagnóstico precoce da encefalite causada pelo parasitismo (COLOMBO et al., 2005).
Por ser uma doença que acomete animais (ZAKI, 1995) e seres humanos (McALLISTER, 2005) e pelas graves seqüelas que podem advir da infecção humana (FRICKER-HIDALGO et al., 2005), a toxoplasmose tem sido cada vez mais estudada (BONFIOLI e OREFICE, 2005). Apesar de ser considerada uma infecção oportunista, raramente apresentando manifestações patológicas graves em indivíduos imunocompetentes (LUFT e REMINGTON, 1988), esta zoonose é diagnosticada em todo o mundo (DIAS et al., 2005). Pacientes acometidos pela infecção são vistos em consultórios e enfermarias de quase todas as especialidades médicas (WULF et al., 2005).
As lesões causadas pela infecção adquirem maior gravidade em recém-nascidos e caracterizam-se por encefalite, icterícia, urticária e hepatomegalia, geralmente associados a coriorretinite, hidrocefalia e microcefalia, com altas taxas de morbidade e mortalidade (DUBEY, 1986). Desta forma, a infecção congênita é considerada um tópico de destaque em pesquisas realizadas com populações de baixa renda (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003), onde a falta de informação e os hábitos precários de higiene são dominantes.
De todas as complicações que podem advir da infecção por T. gondii, aquelas decorrentes da transmissão mãe-feto merecem especial atenção. Em muitos casos a infecção pode se instaurar na mãe e permanecer silenciosa durante todo o período gestacional, enquanto o protozoário é passado via placenta ao bebê. CERMAKOVA et al. (2005) relataram toxoplasmose congênita em um bebê cuja mãe experimentara a forma assintomática da doença. Os pesquisadores diagnosticaram a patologia na mãe através da detecção de anticorpos anti-T. gondii dos tipos IgM, IgE e IgA em seu soro. Estas imunoglobulinas são, segundo os próprios autores, os marcadores da infecção aguda. A detecção da toxoplasmose congênita no feto ocorreu através do reconhecimento de DNA de T. gondii em seu sangue, dos marcadores de infecção aguda no soro, sinal de hidrocefalia e calcificação à ultra-sonografia cerebral. O diagnóstico acurado e instituição de terapia em ambos, mãe e feto, levaram à normalização progressiva dos testes laboratoriais.
Por outro lado, estudos recentes vêm considerando o impacto das novas terapias imunossupressoras e esclarecem que a infecção adquirida na fase adulta pode assumir aspectos graves (KHAN et al., 2005; FRICKER-HIDALGO et al., 2005). Vários têm sido os relatos de toxoplasmose cerebral em indivíduos adultos (COLOMBO et al., 2005), sem mencionar as complicações oftálmicas (PASHANINA
et al., 2005) e até de cunho psiquiátrico (BROWN et al., 2005). A doença é a causa mais comum de infecção de retina em todo o mundo (HOLLAND, 2003). Uma pesquisa avaliou o efeito dos tratamentos convencionais na toxoplasmose ocular (STANFORD et al., 2003). Segundo os autores, nenhuma das tentativas de tratamento em indivíduos imunocompetentes mostrou efeito benéfico. Ainda, em pesquisa realizada por BOSCH-DRIESSEN et al. (2002), que avaliou indivíduos com toxoplasmose ocular durante um longo período, foi possível observar que 24% dos olhos afetados tornaram-se cegos.
A década de 1990 foi singular para o estudo da toxoplasmose clínica, mais especificamente no caso da doença ativa em indivíduos imunocompetentes. Muitos estudos apontaram a importância de se observar as alterações decorrentes da infecção por T. gondii em indivíduos que não apresentam qualquer distúrbio do sistema imunológico (CARME et al., 2002; BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003). Os principais sinais incluem linfadenopatia, febre, fraqueza e debilidade, oftalmite e infecções multissistêmicas severas (DURLACH et al., 2003). Ainda, há estudos que realizaram avaliações mais complexas, passando a associar a toxoplasmose com desvios de comportamento e personalidade (LEWEKE et al., 2004; YOLKEN et al., 2001; BROWN et al., 2005). Trabalhos recentes com roedores trouxeram evidências de alteração de comportamento em animais acometidos com a parasitose (BERDOY et al., 1995 e 2000), cooptando com o reconhecimento de situações similares em seres humanos. Condições mentais como esquizofrenia, mudança de personalidade e inteligência reduzida estão cada vez mais sendo associados à infecção por T. gondii (FLEGR et al., 2003). Motivados pelo grande entusiasmo gerado pelas associações citadas, muitos pesquisadores têm postulado várias teorias. Um exemplo é o estudo realizado por NOVOTNA et al. (2005) em que são apresentadas provas de que a alteração nas características de personalidade podem ser resultado de infecções cerebrais em geral, e não em conseqüência de uma atividade manipuladora específica do T. gondii.
Dentre outras afecções clínicas às quais a toxoplasmose que vem sendo associada no decorrer dos anos, a urticária merece ser mencionada. MIRALLES LOPEZ et al. (2005), por exemplo, citam um caso em que o paciente, do sexo masculino, desenvolveu urticária fria associada à toxoplasmose. A patologia foi detectada através de sorologia e os efeitos da associação puderam ser observados no local da pele onde houve contato com cubos de gelo.
Por essas e outras razões, a toxoplasmose vem suscitando o interesse de muitos pesquisadores, no intuito de se detectar as principais fontes de infecção (DIAS et al., 2005). Por ser uma zoonose, é clara a importância dos animais de produção em sua disseminação na população humana (HOGHOOGHI-RAD e AFRAA, 1993). Altas prevalências de anticorpos anti-T. gondii têm sido reveladas em estudos realizados em todo o planeta, seja em animais (KLUN et al., 2006) ou em seres humanos (HOGHOOGHI-RAD e AFRAA, 1993), levantando hipóteses diretas a respeito do consumo de carne infectada pelo parasita (Figuras 1 e 2). Provas mais contundentes de que animais de produção são fontes importantes de infecção por T. gondii ao homem vêm sendo apresentadas através de isolamentos do parasita em produtos de origem animal (DIAS et al., 2005).
Com os avanços alcançados através do advento da biologia molecular, novas técnicas de diagnóstico têm se destacado. Uma delas é a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), capaz de detectar a presença de um microorganismo a partir de pequenas amostras de seu DNA. KHAN et al. (2005) detectaram a presença de T. gondii em líquido cérebro-espinhal de 8 em 10 pacientes HIV-positivos através de PCR.
Estudos recentes têm avaliado o poder sinérgico de diferentes técnicas de diagnóstico da toxoplasmose. COLOMBO et al. (2005) sugerem que o uso associado de técnicas sorológicas e PCR no diagnóstico da toxoplasmose cerebral pode ser uma boa estratégia, substituindo abordagens mais invasivas.
Vários trabalhos ressaltam a eficiência dos testes moleculares na caracterização genética dos isolados de T. gondii. GALLEGO et al. (2005) realizaram análise genética de amostras humanas (sangue, fluido cérebro-espinhal e amniótico) e animais (vários órgãos) na Colômbia. Das 33 amostras positivas caracterizadas como possuidoras do gene SAG2 de T. gondii, 31 eram do tipo I (93,9%), uma do tipo II e uma mostrou-se atípica. Os resultados cooptam com a predominância da linhagem tipo I em seres humanos e animais na América do Sul, segundo os autores.
A evolução dos níveis analíticos acarretada pelo maior refinamento das técnicas moleculares tem permitido aprofundamentos mais complexos nos estudos das linhagens de T. gondii. Estas pesquisas trazem novos questionamentos e levantam novas hipóteses a serem comprovadas. Um bom exemplo é a pesquisa
realizada por KHAN et al. (2005), onde detectou-se uma linhagem de T. gondii distinta das linhagens clones arquétipos, através de PCR.
Os estudos soroepidemiológicos têm fornecido informações preciosas a respeito do comportamento da doença em todo o mundo. Um recente estudo avaliou a ocorrência de anticorpos anti-T. gondii em seres humanos no Norte da Grécia durante os últimos 20 anos (DIZA et al., 2005). Através dos testes Ensaio de Imunofluorescência (IFA) e Ensaio Imunoenzimático de Micropartículas (MEIA), os autores puderam verificar um declínio significativo na prevalência. Ao discutirem os dados e verificarem que a população idosa aumentou no citado período, os pesquisadores explicam que esse declínio na prevalência de anticorpos anti-T. gondii resulta de uma melhoria na situação sócio-econômica. Todavia, um outro dado merece atenção. Segundo esta pesquisa, existe um grande número de mulheres em idade de reprodução e susceptíveis à infecção por T. gondii, o que pode representar um potencial risco à Saúde Pública. Ponderam ainda que a educação da população e a tomada de medidas profiláticas podem ser importantes.
Outros estudos salientam a importância dos testes sorológicos para o diagnóstico da toxoplasmose (PRESS et al., 2005), bem como do avanço das metodologias, em especial os imunoenzimáticos, no reconhecimento de reinfecções (DZITKO et al., 2006). Entretanto, é intensa a busca por métodos mais simples de se diagnosticar a parasitose. Sob esta ótica, SINGH et al. (2005) investigaram a presença de anticorpos anti-T. gondii na saliva de 125 indivíduos, sendo 100 deles portadores do Vírus da Imunodeficiência Adquirida Humana (HIV). Utilizando a técnica de ELISA, diagnosticaram-se 20% dos indivíduos como positivos para a presença de imunoglobulinas G (IgG) e 25% para imunoglobulinas M (IgM). Os autores afirmaram que amostras de saliva são substitutos viáveis ao soro no diagnóstico da toxoplasmose. Adicionalmente, STROEHLE et al. (2005) salientam a análise salivar como um método não invasivo para detecção de anticorpos anti-T. gondii. Em sua pesquisa, os autores analisaram soro e saliva de 201 voluntários saudáveis através do teste Immunoblotting para detecção de IgG. Pela análise sorológica, através do Teste de Avidez (VIDAS), “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” (ELISA) e “Immunoblotting”, o resultado foi 29,4% (59/201) de positividade. Dos positivos, 98,3% (58/59) apresentaram positividade também pela análise salivar.
3.2.2. No Brasil
Impulsionados pelas descobertas realizadas em universidades e institutos de pesquisa em todo o mundo, pesquisadores brasileiros vêm realizando trabalhos acerca da presença do parasita no país, tanto no homem como em animais. Em Brasília, um estudo retrospectivo em 2.636 mulheres grávidas, 17 foram diagnosticadas com toxoplasmose aguda. Destes 17 casos, 15 foram confirmados como infecções primárias (NOBREGA ODE e KARNIKOWSKI, 2005). No mesmo estudo, as autores reportam uma soroconversão anual de 6,4 para cada 1.000 indivíduos.
Em outro estudo, VIDAL et al. (2005) realizaram análise prospectiva de 55 casos com suspeita ou confirmados de toxoplasmose cerebral em pacientes HIV-positivos. Em 19 dos casos (35%), o diagnóstico da toxoplasmose levou à detecção de AIDS. Em 41 casos, a toxoplamose cerebral foi a principal doença associada à AIDS. De acordo com outros resultados, sinais de deterioração neurológica prevêem resposta não favorável ao tratamento e a administração do tratamento anti-retroviral altamente ativo (HAART) parece estar relacionado a melhores índices de sobrevivência e menores taxas de recidivas.
Estudo realizado por CARVALHEIRO et al. (2005) estimou a incidência da toxoplamose congênita no município de Ribeirão Preto. Na pesquisa, coletaram-se amostras de sangue de 15.162 neonatos, através de adsorção em papel filtro, que foram submetidas ao teste sorológico para detecção de IgM anti-T. gondii. Do total de amostras, 15 estavam positivas, mas somente 13 continuaram o estudo. Cinco destas amostras foram consideradas positivas para toxoplasmose congênita e tiveram como principais sinais a detecção de marcadores de infecção aguda, anticorpos do tipo IgG presente por mais de um ano de idade e anormalidades clínicas. Os autores ponderam ainda a respeito da necessidade da instauração de medidas preventivas contra a toxoplasmose e que o rastreamento neonatal é possível desde que sejam utilizados métodos com melhores performances, pois a infecção congênita pelo T. gondii raramente é identificada por exames clínicos de rotina.
GARWEG et al. (2005) compararam a resposta imune específica local de indivíduos de Erechim, Sul do Brasil, com aqueles da Suíça. Os indivíduos sofriam de toxoplasmose ocular ativa. Foram coletadas amostras pareadas de humor aquoso e soro de 27 brasileiros e 50 suíços. Os resultados foram sugestivos de uma
deficiência mais pronunciada na barreira uveovascular dos pacientes brasileiros. Em outra pesquisa, o sangue de 47 trabalhadores de oito fábricas de lingüiça no município de Londrina, Paraná, foi analisado e 28 (59,5%) tiveram anticorpos anti-T. gondii em seus soros (DIAS et al., 2005). Dos 36 que trabalhavam diretamente com a produção de lingüiças, 20 (55,5%) apresentaram os anticorpos contra o parasita, enquanto a prevalência para os envolvidos com outras funções foi de oito em 11 (72,7%). Segundo os estudo, não houve significância para o fator hábito dos trabalhadores em relação à infecção por T. gondii.
Um trabalho de pesquisa recém-realizado relatou o primeiro isolamento e caracterização genética de T. gondii viável em 7 de 28 suínos soropositivos em São Paulo (dos SANTOS et al., 2005). De acordo com os autores, todos os isolados foram letais para camundongos, sendo dois caracterizados geneticamente como do tipo I e cinco como do tipo III.
3.2.3. Em Campos dos Goytacazes
O município de Campos dos Goytacazes, localizado no Norte do Estado do Rio de Janeiro, apresenta alta soroprevalência humana para anticorpos contra T. gondii, de acordo com dados apresentados por BAHIA-OLIVEIRA et al. (2003). Segundo esta pesquisa, os vários casos de uveíte humana, condizentes com toxoplasmose, chamaram a atenção dos profissionais de saúde e pesquisadores e culminaram em um estudo de 3 anos (1997-1999). De acordo com os resultados, grande parte da população de baixa condição sócio-econômica do município apresentou anticorpos anti-T. gondii (84%). Os valores para prevalência nos grupos sócio-econômicos médio e alto foram 62% e 23%, respectivamente.
De posse destes resultados, uma série de estudos com o objetivo de se detectar as principais fontes de infecção e fatores de risco associados à transmissão da doença na região foram realizados (BAHIA-OLIVEIRA, et al., 2003; da SILVA et al., 2003; DUBEY et al., 2003). BAHIA-OLIVEIRA et al. (2003) ponderaram ainda a respeito da importância dos oocistos de T. gondii no ambiente, baseando-se no fato de o principal fator de risco associado à soroprevalência nas classes sócio-econômicas baixa e média ser a ingestão de água não filtrada.
Em outra pesquisa realizada no município, da SILVA et al. (2003) afirmaram que a contaminação ambiental com oocistos de T. gondii era alta, com base em
testes sorológicos realizados em galinhas criadas soltas no município. No estudo, 198 galinhas tiveram amostras de seus sangues coletadas e os soros analisados pelo MAT (Teste de Aglutinação Modificado), resultando em 129 amostras positivas. Ainda, corações e cérebros de 86 das 198 galinhas foram submetidas à bioprova em camundongos albinos para detecção de T. gondii. O protozoário foi isolado em 61 amostras (70,9%), inclusive de animais que haviam sido considerados negativos pelo teste sorológico.
DUBEY et al. (2003) realizaram estudos de caracterização genética de isolados em galinhas do município. A partir dos resultados os autores verificaram que a maior parte dos isolados eram do tipo I (70%), contra 27% de isolados caracterizados como do tipo III. Não foram encontrados isolados do tipo II nos tecidos das galinhas estudadas. Gatos inoculados com 11 cepas do tipos I eliminaram uma grande quantidade de oocistos em suas fezes (19-539 milhões), indício de que há grandes possibilidades de disseminação desta cepa no ambiente.
3.3. A infecção em bovinos
A doença natural em ruminantes foi diagnosticada, pela primeira vez, em bovinos na Alemanha, por HOUERSDORF e HOLTZ (1952), citados por MAYER (1965). Quase concomitantemente, SANGER et al. (1953) demostraram a presença de T. gondii em três vacas, um touro e dois bezerros procedentes de quatro rebanhos diferentes no Estado de Ohio, EUA. Um bezerro oriundo de uma destas vacas foi necropsiado logo após o nascimento. Toxoplasma gondii foi isolado do fígado deste bezerro, assim como do colostro, parede uterina, baço e pulmão maternos. Em pesquisa realizada por OLIVEIRA et al. (2001), os maiores títulos obtidos para as espécies bovinas (Bos indicus e Bos taurus) e bubalinas (Bubalus
bubalis) inoculadas com 2 x 105 oocistos de T.gondii foram 256, 16.384 e 256,
respectivamente.
SANGER et al. (1953) e BEVERLEY et al.(1977) produziram sintomatologia clínica em bovinos jovens e adultos semelhante a de animais naturalmente infectados, através de inoculações com taquizoítas e cistos. T. gondii pôde ser isolado após inoculação em camundongos e demonstrado histologicamente em lesões de pulmão, cérebro, fígado e baço de bezerros inoculados.
JACOBS et al. (1960) realizaram estudos nos EUA sobre a presença de cistos de T. gondii em carne de suínos, bovinos e ovinos, através da digestão péptica artificial e inoculação em camundongos. Dos 60 diafragmas de bovinos examinados, um apresentou infecção, demonstrada através da sorologia positiva dos camundongos inoculados.
CATAR et al. (1969), na Tchecoslováquia, isolaram oito (9,4%) amostras de T. gondii de cérebro e diafragma de 85 bovinos. Destas oito, seis foram isoladas de animais com 2 a 3 anos de idade e o restante com 5 a 6 anos. Quatro amostras foram obtidas de cérebro, duas de diafragma e 2 de ambos os órgãos. Das oito amostras isoladas de bovinos, sete eram oriundas de animais com título igual ou maior que 1:8 na reação de fixação de complemento. Apenas uma amostra foi isolada de bovinos com título 1:4. Baseando-se nestes achados, os autores consideraram os bovinos reservatórios de T. gondii.
Outros trabalhos sobre a tentativa de isolamento do T. gondii em ruminantes são encontrados na literatura (FERGUNSON e ELLIS, 1979; COSTA, 1979; OLIVEIRA et al., 2001). Fígado, baço, linfonodos mesentéricos, pulmão e musculatura foram os órgãos de maior prevalência do parasita.
COSTA et al. (1977), no Brasil, infectaram experimentalmente bezerros (B.taurus) com média etária de três meses, via oral, com oocistos de T. gondii. O isolamento na musculatura comprovou mais uma vez a importância da infecção por T. gondii em saúde pública, porquanto da ingestão de carne infectada crua ou mal cozida, representando perigo de infecção humana (COSTA et al., 1977). Evidentemente, tornam-se necessárias novas investigações especialmente delineadas para o estabelecimento definitivo da importância desta espécie animal na cadeia epidemiológica da toxoplasmose em diferentes países (DUBEY, 1993).
OLIVEIRA et al. (2001), inoculou oocistos via oral em três de cada espécie de ruminantes (Bos indicus, Bos taurus e Bubalus bubalis) isolando T. gondii de diversos tecidos. Chamou a atenção o isolamento do parasito nos músculos psoas maior (filé mignon) de dois B. indicus e no músculo glúteo superficial (picanha) de um B. indicus e um B. bubalis. Bubalinos e zebuínos apresentaram aparente normalidade clínico laboratorial, ao contrário dos taurinos (OLIVEIRA et al.,2001). Entretanto, apresentaram igual comportamento quanto a presença de cistos em seus tecidos (OLIVEIRA et al., 2001).
A prevalência da toxoplasmose em bovinos tem sido mensurada em todo o mundo, como pode ser observado no Quadro 1.
Quadro 1. Prevalências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em bovinos no mundo
PAÍS LOCALIDADE % AMOSTRAS ESTÁGIO APTIDÃO TESTE AUTORES
Bangladesh 75 16,10 205 - - Aglutinação em látex Samad et al. (1993) Brasil Bahia 1,03 194 - - Aglutinação em látex Pita Gondim et al. (1999) Brasil Rio de janeiro 14,8 589 vacas adultas leite Imunofluorescência Indireta Albuquerque et al. (2005) China Guangdong 4,4 90 - - Hemaglutinação Indireta Lin et al. (1990) Costa Rica - 34,4 601 - - Imunofluorescência Indireta Arias et al. (1994b) Etiópia Região central 6,6 785 - - Hemaglutinação Indireta Bekele e Kasali (1989) EUA Montana 3,2 - - - Aglutinação Modificado Dubey (1985)
- 1,2 - bezerros - - van Knapen et al. (1995) Holanda
- 27,9 - vacas adultas leite -
Índia Região Norte 19,3 243 - - Hemaglutinação Indireta Chhabra et al. (1985) Indonésia Lampung 9,0 200 - - Aglutinação em látex Matsuo e Husin (1996) Irã - 0,0 2000 - - Aglutinação em látex / Hemaglutinação Indireta Hashemi-Fesharki (1996) Paquistão Região sudeste 25,0 100 abate carne Aglutinação em látex Zaki (1995)
Polônia - 55,5 - - - Aglutinação Direta Uminski et al. (1989) Sérvia - 76,3 611 - - Aglutinação Modificado Klun et al. (2006)
- 3,0 - vacas adultas - Ensaio Imunoenzimático Wyss et al. (2000)
- 2,0 - touros jovens - -
- 6,0 - novilhas - -
Suíça
- 1,0 - bezerros - -
Vietnã Região Sul 10,5 200 vacas adultas leite Aglutinação Direta Huong et al. (1998)
3.3.2. A infecção em suínos
A detecção de anticorpos anti-T.gondii em suínos através da utilização de testes sorológicos foi introduzida por WEINMAN e CHANDLER (1956), os mesmos que, pela primeira vez, investigaram a associação entre a toxoplasmose nos suínos e nos seres humanos.
A dosagem de anticorpos específicos para T.gondii em suínos tem importantes aplicações na determinação das freqüências atuais da infecção e como uma ferramenta para a vigilância sanitária na detecção da toxoplasmose em granjas de suínos (LIND et al., 1997).
De acordo com D`ÁNGELINO e ISHIZUKA (1986), os levantamentos soroepidemiológicos visando a detecção de anticorpos anti-T. gondii em matadouros ou em rebanhos são realizados não só para estimar a freqüência da ocorrência da infecção em suínos, como também para avaliar o risco de infecção a que se expõe a população humana que se alimenta da carne e de outros produtos derivados desta
espécie animal. Diversos são os trabalhos que relatam a freqüência com que os suínos são diagnosticados como positivos para a presença de anticorpos anti-T.gondii (Quadro 2).
Quadro 2. Prevalências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em suínos no mundo.
PAÍS LOCALIDADE % AMOSTRAS MANEJO / ESTÁGIO TESTE AUTORES
Alemanha - 5,6 300 convencional / - -
- 0,0 100 orgânico / - - Schulzig e Fehlhaber (2005) Alemanha Hesse 19,0 2041 - Ensaio Imunoenzimático Damriyasa et al. (2004) Alemanha Munsterland 9,3 1500 - Ensaio Imunoenzimático Damriyasa e Bauer (2005) Suíça - 0,0 - - Ensaio Imunoenzimático Wyss et al. (2000) Argentina - 37,8 230 - / abate Aglutinação Modificada
Argentina - 4,5 88 tecnificado / - Aglutinação Modificada Argentina - 40,2 112 a pasto Aglutinação Modificada
Venturini et al. (2004) Áustria (1982) - 13,7 - -
Áustria (1992) - 0,9 -
Imunofluorescência
Indireta Edelhofer (1994)
Brasil São Paulo 9,6 300 abate Ensaio Imunoenzimático / Western Blot Suarez-Aranda et al. (2000) Peru Lima 32,3 96 abate Ensaio Imunoenzimático / Western Blot Suarez-Aranda et al. (2000) Canadá - 9,4 1443 abate Aglutinação Modificado Smith (1991)
China Guangdong 10,4 816 - Hemaglutinação Indireta Lin et al. (1990) Costa Rica - 43,8 496 - Imunofluorescência Indireta Arias et al. (1994b) Espanha - 38,4 507 animais selvagens Aglutinação Modificada Gauss et al. (2005)
Peru Lima 27,7 137
EUA Geórgia 16,4 152 - / abate Western Blot Saavedra e Ortega (2004) EUA Ilha de Ossabaw 0.9 1264 Dubey et al. (1997)
continente (Georgia) 18.2 170 animais selvagens
Aglutinação Modificada Sabin-Feldman Dye Test Hemaglutinação Indireta
EUA Illinois 20,8 5080 - / matrizes Aglutinação Modificada Weigel et al. (1995) EUA Illinois 3,1 1885 - / terminação Aglutinação Modificada Weigel et al. (1995) EUA Iowa 14,3 273 - / matrizes Aglutinação Modificada Smith et al. (1992) EUA Iowa 22,2 1000 - / abate Aglutinação Modificada Dubey et al. (1995) EUA Montana 5,0 413 - Sabin-Feldman Dye Test Dubey (1985) Finlândia - 2,5 1847 - / abate Ensaio imunoenzimático Hirvela-Koski (1992) Gana - 39 - - Ensaio Imunoenzimático Arko-Mensah et al. (2000) Havaí Oahu 48,5 59 - Agglutination Test Dubey et al. (1992) Holanda - 2,1 23348 - Ensaio Imunoenzimático Berends et al. (1991) Índia Região Norte 31,5 178 - Hemaglutinação Indireta Chhabra et al. (1985) Japão Ilha Amakusa 1,1 90 animais selvagens Aglutinação em Látex Shiibashi et al. (2004) Japão Kitakyushu 9,1 208 - / abate - Horio et al. (2001) Polônia - 27,9 - - Aglutinação Modificada Uminski et al. (1989) República Checa - 15,0 124 animais selvagens Sabin-Feldman Dye Test Hejlicek et al. (1997) Suécia - 5,2 807 - / abate Ensaio Imunoenzimático Lunden et al. (2002) Taiwan - 27,65 3880 - Aglutinação em Látex Chang et al. (1991) Taiwan - 47,11 3880 - Ensaio Imunoenzimático-IgM Chang et al. (1991) Taiwan Taoyuan 28,8 111 - / abate Aglutinação em Látex Fan et al. (2004) Trinidade e
Tobago - 5,5 - - / abate - Adesiyun e Cazabon (1996) Zimbábue - 9,3 97 domiciliar / - Aglutinação Enzimática Hove e Dubey (1999)
Sinais de toxoplasmose clínica em suínos foram relatados por WINGSTRAND et al. (1997) e incluíram inapetência, febre e debilitação. Os suínos, com oito semanas de idade, foram infectados experimentalmente e apresentaram perda significativa de peso em duas semanas de infecção. No entanto, obtiveram crescimento compensatório até a oitava semana de infecção. Os mesmos autores ponderaram a respeito do suco da carne como uma alternativa viável ao soro para detecção de infecção por T. gondii nestas espécies animais.
3.4. Vigilância Sanitária e Toxoplasma gondii
Além de causar prejuízo à pecuária, a toxoplasmose tem impacto também em saúde pública, visto que os cistos teciduais podem permanecer viáveis durante longos períodos (BLEWETT e WATSON, 1993; BUXTON, 1990) e o consumo de carne mal cozida pode levar à infecção humana e animal (FRENKEL, 1990; SMITH, 1993). Por outro lado, placentas e fetos mortos infectados com cistos de T. gondii podem servir como fonte de infecção para roedores e pássaros. Felídeos, após consumirem tais animais, excretam um grande número de oocistos de T. gondii (DUBEY, 1977), favorecendo a disseminação do agente na natureza.
Apesar de a toxoplasmose humana, enquanto doença, ser relativamente rara, a soroprevalência de anticorpos contra o parasita é alta. DESMONTS et al. (1965), citados por DUBEY (1977), descreveram alta soropositividade humana em Paris (80%), onde a ingestão de carne crua é costume. Em países dos mais variados climas o percentual de positividade sorológica humana varia de 20 a 83%.
A maioria dos surtos de toxoplasmose humana tem sido atribuída ao consumo de carne crua ou insuficientemente cozida. KEAN et al. (1969), citados por DUBEY (1977), descrevem uma pequena epidemia de toxoplasmose em estudantes de medicina da Universidade Cornell, os quais tinham ingerido hambúrgueres mal cozidos. MAGALDI et al. (1967) relataram 30 casos em um seminário no interior do Estado de São Paulo. Na Universidade de São José dos Campos, após a ingestão de carne mal cozida, 110 pessoas tiveram a infecção, com 79 indivíduos apresentando sinais de febre e linfadenopatia (MAGALDI et al., 1969). Outros surtos de toxoplasmose aguda após a ingestão de carne mal cozida têm sido relatados, mas a origem da carne não pôde ser determinada (SMITH, 1993).
Trabalhos com o objetivo de isolar T. gondii viável em tecidos de animais utilizados para consumo humano são cada vez mais freqüentes. Em recente trabalho de pesquisa, DUBEY et al. (2002) isolaram o parasita em 51 de 55 suínos destinados ao consumo humano numa fazenda em Massachussetts, EUA. Os suínos tinham idade de mercado (seis meses) e os tecidos testados foram coração e língua. Estes autores ponderam, ainda, que até a implementação de um exame de carnes para detecção de infecção por T. gondii em abatedouros, toda carne deve ser cozida de acordo com os padrões industriais antes de seu consumo.
JAMRA et al. (1969), numa tentativa de avaliar a importância dos alimentos de origem animal como fontes de infecção por T. gondii para a população da cidade
de São Paulo, examinaram 98 amostras de carne, fígado e cérebro de bovinos. Das amostras de carne 8,1% encontravam-se parasitadas por T. gondii. Os dados de isolamento destes autores basearam-se na sorologia positiva à reação de Sabin-Feldman dos camundongos inoculados e permitem inferir que os baixos títulos encontrados, iguais ou menores que 1:16, sem isolamento de parasito, possam resultar da presença de anticorpos específicos em camundongos inoculados com cistos inviáveis. Acreditam os autores que esta reação sorológica é sensível para detectar infecção em camundongos e que várias passagens sucessivas são usualmente desnecessárias para o isolamento do parasita.
Pelos trabalhos mencionados, pode-se verificar que a freqüência da infecção por T. gondii em bovinos e suínos é relativamente alta (COSTA et al., 1977). OLIVEIRA et al. (2001) comprovam ainda que a aparente normalidade clínico laboratorial de espécies mais rústicas, como bubalinos e zebuínos, não impede a disseminação do protozoário em seus tecidos.
Tendo em vista a importância da produção de alimentos de origem animal livres de doenças que afetam o homem, algumas pesquisas têm fornecido importantes informações acerca da inativação de parasitas na carne. HILL et al. (2004) avaliaram os efeitos de diversos condimentos e sais na viabilidade de T. gondii presente em carne suína. O estudo provou que soluções de cloreto de sódio a 2% e lactato de potássio ou lactato de sódio a 1,4% ou mais, sozinhos ou em combinação com outras substâncias, foram capazes de evitar a transmissão de T. gondii através de lombos de porcos infectados experimentalmente.
É crescente a quantidade de estudos a respeito de formas de prevenção da toxoplasmose. DUBEY et al. (1998) imunizaram suínos com oocistos inativados por radiação. A bioprova de tecidos destes animais em camundongos indicou menos cistos em amostras teciduais retiradas de animais vacinados. Outros trabalhos vêm respaldar essa necessidade de se investir em melhores métodos de detecção de T. gondii em alimentos. T. gondii viável foi isolado de uma de 67 amostras de carne suína curada pronta para consumo (WARNEKULASURIYA et al., 1998). Adicionalmente, maiores considerações são necessárias para implicações do consumo de carnes curadas durante a gravidez (WARNEKULASURIYA et al., 1998). NAVARRO et al. (1992) avaliaram a resistência de T. gondii presente em amostras de lingüiça suína ao cloreto de sódio e outros condimentos (pimenta e alho). Lingüiças preparadas com tecidos de suínos infectados experimentalmente foram
tratadas com as citadas substâncias. O tratamento com o sal em concentrações de 2% e 2,5%, por um período de no mínimo 48 horas eliminou efetivamente o parasita.
3.5. O ensaio imunoenzimático - ELISA
Os métodos de pesquisa de anticorpos vêm conquistando a confiança de pesquisadores em todo o mundo, principalmente como medida preventiva em substituição aos procedimentos de inspeção de produtos de origem animal, quando estes não são os mais indicados para o diagnóstico (HIRVELA-KOSKI, 1992). É o caso da detecção de T. gondii em carcaças animais, pois os métodos parasitológicos são muito dispendiosos (HIRVELA-KOSKI, 1992) para uso em procedimentos de inspeção rotineiros.
O ensaio imunoenzimático (ELISA) é um excelente teste para detecção de anticorpos anti-T. gondii em virtude de sua capacidade para captar respostas humorais ínfimas originadas, por exemplo, em casos de infecções latentes (DUBEY et al., 1996). Estes autores realizaram análises em suínos infectados experimentalmente por via oral com oocistos de T. gondii e obtiveram boa sensibilidade. Com o objetivo de determinar a sensibilidade e especificidade do ELISA para detecção de anticorpos do tipo IgG contra T. gondii, DUBEY et al. (1995) fizeram uso da bioprova em camundongos e gatos como prova comparativa. Os resultados foram 73% de sensibilidade e 86% de especificidade.
Nem sempre a positividade sorológica garante uma facilidade de isolamento (NAVARRO et al., 1992). DUBEY et al. (1996) isolaram T. gondii viável em suínos infectados sem, entretanto, encontrar soropositividade para quaisquer técnicas. Entretanto, ARAÚJO et al. (1998) ponderam que os sucessos do ELISA em várias pesquisas prevê uma rápida disseminação do seu uso em exames sorológicos em suínos.
Como todo método laboratorial, o ELISA possui vantagens e desvantagens. A única grande desvantagem para a aplicação rotineira do ELISA é a complexidade da padronização (FRENKEL, 1997). Todavia, seus prós são suficientemente satisfatórios, pois é um método altamente sensível e específico, além de não apresentar riscos aos técnicos que o executam (GUHL et al., 1981). Ainda, é indicado para estudos epidemiológicos pela possibilidade de utilização de uma única diluição dos soros a serem testados (GUHL et al., 1981).
Em adição, devido a peculiaridades inerentes à natureza do sistema enzima-substrato e ao antígeno utilizado, o valor do “cut-off” precisa ser constantemente calculado (SANCHEZ et al., 1985). Segundo VENKATESAN e WAKELIN (1993), não se pode presumir que os padrões utilizados para um sistema sejam ideais para outro. Não há padrões para os testes sorológicos no diagnóstico da toxoplasmose, desta forma, é fundamental adaptar cada ensaio para os diferentes sistemas (DUBEY et al., 1996).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Seleção das propriedades
Foram selecionadas para o estudo criações de bovinos e suínos de áreas urbanas do município de Campos dos Goytacazes-RJ e arredores, aproveitando-se a casuística de atendimentos a domicílio da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF).
A região Norte Fluminense possui um efetivo total de 518.465 bovinos e 18.114 suínos (IBGE, 1997). Todavia, existem propriedades urbanas e de arredores que criam bovinos e suínos, mas não são contabilizadas em estatísticas oficiais. Estas propriedades são responsáveis por um expressivo contingente animal.
4.2. Classificação das propriedades 4.2.1. De bovinos
As propriedades que tiveram sangue dos bovinos coletado foram classificadas de acordo com o tipo de produção e manejo. No que diz respeito à produção, as propriedades foram divididas em produtoras de leite, produtoras de carne e produção mista (leite e carne). Quanto ao tipo de manejo, foram classificadas em sistema de criação extensivo, semi-extensivo e intensivo. Os animais tiveram fichas individuais, onde constaram os números ou nomes, idade, sexo, estado geral e presença de outros parasitos.
4.2.2. De suínos
As propriedades cujo sangue dos suínos foi coletado foram classificadas de acordo com o sistema de criação em domiciliares e de confinamento. A exemplo dos bovinos, estes animais também tiveram fichas individuais, onde constaram o número ou nome, idade, sexo, estado geral e presença de outros parasitos.
4.3. Coleta de sangue e remoção dos soros
A escolha dos animais para coleta das amostras foi por conveniência (PEREIRA, 1995).
Foram coletadas 77 amostras sanguíneas de bovinos. O sangue foi obtido por punção da veia jugular, utilizando-se seringas e agulhas descartáveis de dimensões 30 x 8 mm.
Dos suínos, foram coletadas 62 amostras sanguíneas. O sangue dos animais de criações domiciliares foi obtido da veia marginal da orelha, através de seringas e agulhas descartáveis de dimensões 25 x 6 mm. O sangue dos animais de criações sob sistema de confinamento foi obtido diretamente de um abatedouro da cidade de Itaperuna, durante o abate dos animais.
Os sangues foram acondicionados em tubos de vidro de 5ml, sem anticoagulante, identificados e levados ao Setor de Parasitologia e Doenças Parasitárias do Laboratório de Sanidade Animal (LSA) da UENF, onde foram centrifugados a 200g por 10 minutos para sedimentação dos coágulos. Os soros foram removidos com o auxílio de uma micropipeta graduada de 100-1000 µl, acondicionados em microtubos de 2ml do tipo “eppendorf”, devidamente identificados e mantidos sob temperatura de -20ºC até o momento da realização do teste sorológico.
4.4. Padronização do teste sorológico
O teste sorológico para detecção de anticorpos anti-T. gondii do tipo IgG empregado nesta pesquisa foi o ELISA indireto, padronizado e executado no Laboratório de Biologia do Reconhecer (LBR) do Centro de Biociências e Biotecnologia (CBB) da UENF.
O antígeno utilizado no teste sorológico foi produzido a partir de espécimes de T. gondii da cepa RH. Esta é mantida em camundongos albinos (Mus musculus) no Infectório do CBB e em cultivo celular no LBR.
4.4.1. Para análise de soro bovino
Os soros controle positivo e negativos, para a padronização do teste de ELISA Indireto para detecção de anticorpos anti-T. gondii em soros de bovinos, foram gentilmente cedidos pelo Dr. Jitender. P. Dubey do U.S.D.A. (“United States Department of Agriculture”).
Uma placa de poliestireno com 96 poços1 (placa de ELISA) foi sensibilizada
com antígeno de T. gondii da cepa RH na concentração de 10µg/ml, diluído em tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6), durante 18 a 20 horas a 4ºC.
Após o período de sensibilização, a placa foi lavada três vezes com solução PBS/T (tampão salina fosfato + Tween 20) 0,05%, seca por inversão em papel toalha e bloqueada com PBS-T 0,1%, PBS-T 0,05% + BSA (Albumina Sérica Bovina) 1%, e PBS-T 0,05% + Ovalbumina 1%, em três setores proporcionalmente idênticos da placa, incubando-se a 37ºC por duas horas. As soluções bloqueio foram descartadas e a placa foi lavada conforme acima descrito.
Foram adicionados os soros controle positivo e negativos previamente diluídos em solução contendo PBS-T 0,05% + BSA 0,5%, 100µl/poço, sob as diluições 1:500 e 1:1000. As duas diluições foram associadas aos três tipos de bloqueio. A placa foi incubada a 37ºC por uma hora, lavada três vezes com solução PBS-T 0,05% e seca como acima descrito. Acrescentaram-se, então, 100µl/poço da solução contendo os anticorpos anti-IgG bovino conjugados a peroxidase2, previamente diluída na concentração 1:4000 em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%, incubando-se a 37ºC por uma hora.
Ao término deste período, a placa foi lavada, seca e revelada pela adição da solução substrato {ácido cítrico 2,1%, fosfato de sódio desidratado 2,84%, ABTS [2,2-azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-G-sulfonic acid)]1mg/ml, e H2O2 a 0,003%}, que
reagiu com a peroxidase e resultou numa coloração verde, onde a reação foi positiva.
1 IMMUNLON 2-DYNATECH 2 SIGMA
