PESQUISA DE MICROBIOTA ORAL DE SERPENTES

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__________________________________________________________________________________________ Projeto de Aperfeiçoamento Teórico e Prático – Getúlio Vargas – RS – Brasil 1

PESQUISA DE MICROBIOTA ORAL DE SERPENTES

BRUM, Patrine Caroline Zonin¹ patrinebrum@yahoo.com

DALBOSCO, Marlon¹ marlon-dalbosco@hotmail.com

DRZINGLERSKI, Ana Paula¹ anapaulad007@hotmail.com MACHAJEWSKI, Djessica Rita¹

tds_djessica_7@hotmail.com PAINES, Beatriz Detofol¹ beatriz_paines@hotmail.com

GALLIO, Miguel² vetgallio@yahoo.com.br

MAHL, Deise Luiza ² deisemahl@ideau.com.br OLIVEIRA, Daniela dos Santos³

danielaoliveira@ideau.com.br PIEROZAN, Morgana Karin² morganapierozan@ideau.com.br

ROSÉS, Thiago de Souza² roses@ideau.com.br URIO, Elisandra Andreia² Elisandra-urio@ideau.com.br

¹ Discentes do Curso de Medicina Veterinária, Nível III 2016/1- Faculdade IDEAU – Getúlio Vargas/RS. ² Docentes do Curso de Medicina Veterinária, Nível III 2016/1 - Faculdade IDEAU – Getúlio Vargas/RS

³ Coordenador do Curso de Medicina Veterinária, Nível III 2016/1 - Faculdade IDEAU – Getúlio Vargas/RS

RESUMO: Acidentes com serpentes acontecem a todo o momento, acometendo principalmente agricultores, pois estão mais propícios ao contato com as mesmas, pelo trabalho que desenvolvem, que na maioria das vezes são manuais, representam 88,89% dos acidentes. Mas também pelo fato de a civilização estar invadindo e destruindo o habitat natural de várias espécies de serpentes, torna-se comum o aparecimento das mesmas em ambientes urbanos. A maior parte dos acidentes ofídicos ocorre em nações subdesenvolvidas, sendo assim considerados um problema de saúde pública, com dados epidemiológicos escassos e subestimados. Dentre os gêneros de bactérias isolados da cavidade oral de serpentes pode-se citar Proteus sp., Staphylococcus sp.,

Providencia sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Morganella sp., Klebsiella sp., Escherichia sp., Citrobacter sp., Corynebacterium sp., Micrococcus., Streptpcoccus sp., Enterobacter sp., Clostridium sp., Bacillus sp., Bulkolderia sp., e Yersinia sp. A presença dos micro-organismos reforça a

importância da antissepsia em caso de acidente com serpentes. Para este estudo foram utilizadas, secreções orais de oito espécies diferentes de serpentes (Boa constrictor constrictor, Epicrates cenchria cenchria, Lampropeltis

triangulum, Lampropeltis getula, Gongylophis colubrinus, Crotalus durissus terrificus, Elaphe guttata e Elaphe obsoleta) criadas em cativeiro na cidade de Dom Viçoso – MG, coletadas através de Swab Stuart e inoculadas

em meio de cultura ágar sangue. Os gêneros de bacilos gram negativos, mais provavelmente presentes na cavidade oral das serpentes utilizadas nesta pesquisa, foram Proteus sp., Providencia sp., Salmonella sp.,

Shigella sp., Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Morganella sp., Klebsiella sp., Escherichia sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Bulkoderia sp. e Yersinia sp. Concluiu-se assim que os gêneros de bacilos Gram negativos,

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Providencia sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Morganella sp., Klebsiella sp., Escherichia sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Bulkoderia sp. e Yersinia sp. Neste estudo também foi

encontrado cocos Gram positivos, que através dos testes realizados pode-se afirmar que pertencem ao gênero

Staphylococcus sp.

Palavras-chave: Cavidade Oral; Serpentes; Micro-organismos.

ABSTRACT: Accidents with snakes occur at all times, affecting mainly farmers, since they are more likely to be in contact with them, because of the work they do, which in most cases are manual, represent 88.89% of the accidents. But also because civilization is invading and destroying the natural habitat of several species of snakes, it becomes common the appearance of the same in urban environments. Most ophidian accidents occur in underdeveloped nations and are therefore considered a public health problem with scarce and underestimated epidemiological data. Among the genera of bacteria isolated from the oral cavity of snakes can be mentioned

Proteus sp., Staphylococcus sp., Providencia sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Morganella sp., Klebsiella sp. , Escherichia sp., Citrobacter sp., Corynebacterium sp., Micrococcus., Streptococcus sp., Enterobacter sp., Clostridium sp., Bacillus sp., Bulkolderia sp., And Yersinia sp. The presence

of microorganisms reinforces the importance of antisepsis in case of a snake accident. For this study, oral secretions of eight different species of snakes (Boa constrictor constrictor, Epicrates cenchria cenchria,

Lampropeltis triangulum, Lampropeltis getula, Gongylophis colubrinus, Crotalus durissus terrificus, Elaphe guttata and Elaphe obsoleta) were used in captivity in the city of Dom Viçoso - MG, collected through Stuart

Swab and inoculated in blood culture agar medium. The genera of gram negative bacilli, most likely present in the oral cavity of the snakes used in this research, were Proteus sp., Providencia sp., Salmonella sp., Shigella sp.,

Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Morganella sp., Klebsiella sp. Escherichia sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Bulkoderia sp. And Yersinia sp. It was concluded that the genera of Gram-negative bacilli, most likely

present in the oral cavity of the snakes used in this research, were Proteus sp., Providencia sp., Salmonella sp.,

Shigella sp., Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Morganella Sp., Klebsiella sp., Escherichia sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Bulkoderia sp. And Yersinia sp. In this study, Gram-positive cocci were also found, which

through the tests performed can be said to belong to the genus Staphylococcus sp.

Keywords: Oral cavity; Snakes; Microorganism.

1 INTRODUÇÃO

Segundo, (OLIVEIRA, A. J. A 2011), a microbiologia teve seu início em 1686 quando Anton Van Leeuwenhoek, comerciante e artesão holandês, relatou a existência de organismos microscópicos, encontrados em diferentes materiais, como, saliva, alimentos, água vinda da chuva, etc. O meio de cultura utilizado foi o ágar sangue, uma base altamente nutritiva que favorece o crescimento de todos os micro-organismos relevantes.

Sendo que os bacilos Gram negativos são os principais micro-organismos encontrados na microbiota de serpentes. A predominância nos processos infecciosos está diretamente relacionada a caracterização situacionista assumido pela microbiota normal desses animais rastejantes. (KOLENISKOVAS, 2006).

Dentre os gêneros de bactérias isolados da cavidade oral de serpentes pode-se citar o Proteus sp., Staphylococcus sp., Providencia sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp.,

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Pseudomonas sp., Morganella sp., Klebsiella sp., Escherichia sp., Citrobacter sp., Corynebacterium sp., Micrococcus., Streptpcoccus sp., Enterobacter sp., Clostridium sp., Bacillus sp., Bulkolderia sp., e Yersinia sp. (ELLIE et al., 1981; FONSECA et al., 2008; JORGE et al., 1990; SHEK et al;. 2009). A presença dos micro-organismos reforça a importância da antissepsia em caso de acidente com serpentes.

Embora tendo conhecimento que a microbiota da cavidade oral das serpentes é de considerável diversificação e é composta por bactérias que possuem potencial zoonótico, em baixas concentrações, a peçonha destes répteis pode ser utilizada como inibidores de bactérias, principalmente das espécies Gram negativas (TALAN et al., 1991: PÁRAMO et al., 1998).

O objetivo deste estudo foi avaliar a microbiota oral de serpentes peçonhentas e não peçonhentas através de meios de cultivo, bacerioscopia e testes bioquímicos.

2 MATERIAL E MÉTODOS

Para este estudo foram utilizadas, secreções orais de oito espécies diferentes de serpentes: Boa constrictor constrictor, Epicrates cenchria cenchria, Lampropeltis triangulum, Lampropeltis getula, Gongylophis colubrinus, Crotalus durissus terrificus, Elaphe guttata e Elaphe obsoleta. Estes animais são criados em cativeiro na cidade de Dom Viçoso – MG, sendo as coletas realizadas através de Swab Stuart (Figura 1) e inoculadas em meio de cultura ágar sangue.

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Com os animais contidos, respeitando o código de ética e o bem estar animal, foi realizada a técnica de antissepsia externa com solução de clorexidina 0,2%, para prevenir que alguma bactéria ambiental entrasse em contato com o swab já que algumas serpentes possuem a boca muito pequena.

Depois da antissepsia utilizou-se um “abre boca”, previamente desinfetado com solução de clorexidina 0,2%, e seco, sendo então realizada a coleta através do Swab Stuart e armazenado a 4°C (Figura 2).

Figura 2: Material coletado com Swab Stuart. Fonte: BRUM, P. Getulio Vargas RS, 2017.

As amostras foram conduzidas até o laboratório de bioquímica da Faculdade do Instituto de Desenvolvimento Educacional do Alto Uruguai (IDEAU), a bancada foi limpa com álcool 70%, e sobre ela colocada a lamparina e as placas de Petri esterelizadas em autoclave. Com o auxílio de um termômetro e um bastonete de vidro o meio de cultura foi homogeneizado (Figura 3) até chegar na temperatura desejada (50°C) (Figura 4). Para que o meio de cultura não solidificasse com o bastonete de vidro foi homogeneizado continuamente. Depois de chegar a temperatura ideal, foi adicionado o sangue coletado de uma ovelha e acondicionado em tubo de EDTA 5,4mg.

As placas de Ágar sangue foram semeadas com as amostras através da técnica de esgotamento, que havia sido esterilizado também em autoclave, nas placas de Petri, utilizou-se a lamparina para evitar a contaminação de micro-organismos no momento da utilizou-semeadura.

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__________________________________________________________________________________________ Projeto de Aperfeiçoamento Teórico e Prático – Getúlio Vargas – RS – Brasil 5 Figura 3: Ágar Sangue sendo preparado. Fonte: BRUM, P. Getulio Vargas RS, 2017.

Figura 4: AS a 50°C. Fonte: BRUM, P. Getulio Vargas RS, 2017.

Em seguida, distribuiu-se o ágar sangue nas 12 placas de Petri e aguardou-se cerca de 15 minutos até que a solidificação (Figura 5).

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__________________________________________________________________________________________ Projeto de Aperfeiçoamento Teórico e Prático – Getúlio Vargas – RS – Brasil 6 Figura 5: Ágar sangue distribuido em placas de Petri. Fonte: BRUM, P. Getulio Vargas RS, 2017.

Após a solidificação do ágar, as placas foram identificadas e realizou-se a semeadura das secreções que estavam armazenadas no gel do Swab (Figura 6) e mantidas em estufa por 24 horas.

Figura 6: Semeadura da secreção. Fonte: BRUM, P. Getulio Vargas RS, 2017.

Passado o período ideal para o crescimento bacteriano (24 horas), foi realizada a técnica de catalase e coagulase respectivamente, em tubo. Para a catalase, com auxílio de uma alça bacteriológica, foi retirado uma amostra da colônia da placa, feito esfregaço em lâmina própria pra bacterioscopia, e sobre a amostra foi colocado uma gota de peróxido de

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hidrogênio 3%, nos permitindo visualizar a fermentação, que ocorreu nas 12 amostras, confirmando catalase positiva (Figura 7).

Figura 7: Resultados. Fonte: BRUM, P. Getulio Vargas RS, 2017.

Para realizar o tesde de coagulase em tubo, utilizou-se 12 mL de sangue de um equino que foi centrifugado durante 10 minutos, onde ocorreu fibrina e fez-se necessário uma nova centrifugação por mais 10 minutos, após este processo obtivemos 6 mL de plasma que foram distribuídos em 12 tubos, sendo que cada tubo ficou com 0,5 mL de plasma, com a alça bacteriológica foi colocado uma amostra da colônia em cada tubo que continha o plasma. Analisando-se 24 horas após, constatando que todas amostras eram coagulase negativas, pois não houve coagulação, que é caracterizada pelo plasma não se desprender do fundo do tubo mesmo com a inversão de posição do mesmo (Figura 8).

Figura 8: Coagulase positiva. Fonte: DRZINGELERSKI, A. Laboratório de Analises Clínicas FHSTE, Erechim, 2017.

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Após o desenvolvimento das técnicas de catalase e coagulase em tubo, foi realizada o esfregaço das lâminas, para isso, através de uma alça de bacteriologia, foi retirado uma amostra da colônia reisolada (Figura 9).

Figura 9: Desenvolvimento das lâminas com colônias reisoladas. Fonte: BRUM, P. Getulio Vargas RS, 2017.

Realizado esfregaço em lâmina, aguardado por 2 horas a secagem do material conforme orientação recebida, na sequência deu-se início a coloração de Gram (Figura 10).

Figura 10: Desenvolvimento da coloração de Gram. Fonte: BRUM, P. Getulio Vargas RS, 2017.

A coloração de Gram foi realizada em 4 etapas sendo que entre cada uma delas foi realizado enxágue com água destilada, a primeira etapa foi gotejado solução de violeta genciana 1% afim de cobrir o esfregaço por um período de 1 minuto, na segunda etapa a lâmina foi coberta por aproximadamente 5 gotas de lugol 2%, para que acontecesse a fixação do tom violeta na bactéria, aguardado agir por 1 minuto, na terceira etapa foi utilizada a solução descorante por 5 segundos, a quarta e última etapa foi gotejado a solução fucsina

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0,03% que tem a finalidade de corar a bactéria Gram negativa deixando-a com a coloração rosada, o tempo de ação foi de 30 segundos. Para fazer a visualização das lâminas em microscópio optico foi aguardado até a secagem das mesma, para visualizar em microscópio óptico, as análises finais

3 RESULTADOS E ANÁLISE

O teste da catalase demosntrou resultado positivo para todas as amostras nos permitindo-se descartar o gênero Streptococcus da microbiota oral analisada, pois possui catalase negativa em todas as espécies. A coagulase em tubo resultou em negativo para todas as amostras permitindo a eliminação de algumas espécies de Staphylococcus que possuem coagulase positiva, como por exemplo: S. aureus, S. intermedius, S. schleiferi, S. delphini, S. hyicus, sendo que esta última espécie pode apresentar coagulase negativa ou positiva dependendo da fonte de onde foi isolada. Como não foi encontrado em literatura que a S. hyicus fosse encontrada na microbiota oral normal de serpentes foi optado pela eliminação dessa espécie.

Na coloração de Gram, onde ao contrário do esperado, apresentou como resultado bacilos Gram negativos para 10 das 12 amostras (Figura 11 A), sendo que na bacterioscopia da amostra 10 pôde ser visualizado cocos Gram positivos e bacilos Gram negativos (Figura 11 B).

Figura 11 A: Bacilos Gram Negativo. Foto:DRZINGELERSKI, A. Laboratório de analises clinicas FHSTE, Erechim RS,2017. Figura 11 B: Cocos Gram positivos e bacilos Gram negativos. Foto:

DRZINGELERSKI A. Laboratório de analises clinicas FHSTE, Erechim RS,2017.

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Concluiu-se assim que os gêneros de bacilos Gram negativos, mais provavelmente presentes na cavidade oral das serpentes utilizadas nesta pesquisa, foram Proteus sp., Providencia sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Morganella sp., Klebsiella sp., Escherichia sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Bulkoderia sp. e Yersinia sp. Neste estudo também foi encontrado cocos Gram positivos, que através dos testes realizados pode-se afirmar que pertencem ao gênero Staphylococcus sp.

Entre as espécies avaliadas, são consideras não peçonhentas: Boa constrictor constrictor que são apresentadas como animais pacíficos por não possuírem peçonha e não atacarem o homem; Epicrates cenchria cenchria que pertence a mesma família da serpente Jibóia, citada anteriormente; Lampropeltis triangulum que imita a coral em suas cores, porém não possui peçonha; Gongylophis colubrinus que fica a espera de sua presa sob a areia; Pantherophis guttatus são inclusive adaptadas para viver em cativeiro; Elaphe obsoleta matam a apresa por asfixia (FRAGA et. al, 2013).

As espécies consideradas peçonhentas são Lampropeltis getula é uma das serpentes mais criadas como pet não tendo peçonha; Crotalus durissus terrificus sua peçonha atua no sistema nervoso central da vítima podendo levar a perda total dos sentidos (FRAGA et al. 2013).

Acidentes com serpentes acontecem a todo o momento, acometendo principalmente agricultores, pois estão mais propícios ao contato com as mesmas, pelo trabalho que desenvolvem, que na maioria das vezes são manuais, segundo Franco et. al. (2001), representam 88,89% dos acidentes. Mas também pelo fato de a civilização estar invadindo e destruindo o habitat natural de várias espécies de serpentes, torna-se comum o aparecimento das mesmas em ambientes urbanos. A maior parte dos acidentes ofídicos ocorre em nações subdesenvolvidas, sendo assim considerado um problema de saúde pública, com dados epidemiológicos escassos e subestimados (LIMA et al., 2009).

Segundo POUGH et al. (2001), BARBOSA et al. (2007) e BAPTISTA et al. (2008) apud MOUTA et al. (2010) a falta de conhecimento que a população apresenta sobre algumas espécies pode intensificar seu extermínio indiscriminado. O que pode ser observado em noticiários e jornais que mostram a morte destes animais de forma desnecessária.

São inúmeras as células microbianas existentes e consideradas como microbiota normal, que são encontradas na superfície cutânea e mucosas das diferentes espécies animais (MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004; TANNOCK, 1988; TRABULSI;

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ALTERTHUM, 2008). Alguns destes micro-organismos estão ligados a doenças em répteis e outros podem ser transferidos para a vítima no momento do acidente, ocasionando inflamação no tecido, aliados às propriedades necrosantes dos venenos de algumas serpentes (ANDRADE et al., 1989; FOWLER, 1986; GRAG, 2009; JORGE; RIBEIRO, 1997; MARCUS, 1971; NISHIOKA et al.,2000).

4 CONCLUSÃO

O estudo das secreções orais das serpentes possibilitou um maior conhecimento sobre as mesmas, devido as técnicas que permitiram que a identificação e diferenciação das colônias estudadas, através da coleta com Swabs Stuarts, confirmando na maioria das amostras, bactérias bacilos Gram negativas e em duas amostras cocos Gram positivos, com coagulase negativa e catalase positiva.

5 REFERÊNCIAS BAPTISTA et al. 2008. BARBOSA et al. 2007. ELLIE et al. 1981. FONSECA et al. 2008. FRAGA et al. 2013. FRANCO et al. 2001. JORGE et al. 1990. KOLENISKOVAS et al. 2006. LIMA et al. 2009. MADIGAN et al. 2008. MOURA et al. 2010. OLIVEIRA, A. J. A 2011. POUGH et al.(2001. SHEK et al. 2009.