OTIMIZAÇÃO DA TÉCNICA DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DE ALGODOEIRO CV. CEDRO VIA TUBO POLÍNICO (*)
Osmundo Brilhante de Oliveira Neto (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e Unieuro / osmundo@cenargen.embrapa.br), Isabela Bueno Ribeiro Evangelista (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Raquel Sampaio de Oliveira (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Antônio Américo Barbosa Viana (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Maria Fátima Grossi de Sá (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia).
RESUMO - A técnica de transformação via tubo polínico não requer o estabelecimento de um protocolo de cultura de tecidos, que é uma etapa que leva muito tempo é extremamente laboriosa e tem sido apontada pelos especialistas como a que tem limitado sensivelmente o aumento das estatísticas de produção de plantas transgênicas. O objetivo principal deste trabalho é o estabelecimento das condições ótimas para o uso eficiente da técnica de transformação genética de algodão via tubo polínico, que consiste na aplicação de DNA exógeno no ovário da planta, através da passagem deixada pelo tubo polínico, que vai integrar as células zigóticas, já fertilizadas, mas não divididas. Este trabalho faz parte de um esforço coletivo para tornar o Brasil um importante centro produtor de algodão, com um produto competitivo no mercado internacional com variedades transgênicas.
Palavras-chave: algodoeiro, transgênico, tubo polínico
OPTIMIZATION OF THE MICROINJECTION TECHNIQUE IN COTTON PLANT TRANSFORMATION (CV CEDRO)
ABSTRACT - The transformation via pollen tube prevents the need the tissue culture step, which is usually not only extremely long and demanding, but also limiting to the transgenic plants production. The main objective of this work is to establish optimal conditions to the effective use of the pollen-tube transformation procedure. This method consists on the injection of exogenous DNA into the plant ovary, through the space provided by the pollen tube. The DNA then integrates the already fertilized, but not divided zygotic cells. This work is part of a greater effort in order to place Brazil as an important cotton production center, with transgenic varieties, resulting in a competitive product both in the internal and external market.
Key words: cotton, transgenic, pollen-tube pathway. INTRODUÇÃO
A transformação genética pode contribuir substancialmente para o melhoramento genético das plantas, permitindo a introdução de genes que contribuam para o aumento da produtividade e estabilidade da produção. A metodologia de transformação genética de algodão ora disponível (biobalística em embriões) apresenta baixa eficiência, o que dificulta o seu uso em pesquisas envolvendo a transferência de genes e não permite seu uso de forma ampla em programas de melhoramento genético das culturas. Um método efetivo e reprodutível de transformação de plantas é essencial em estudos de genética e melhoramento envolvendo a transferência de genes pela engenharia genética (GATEHOUSE e GATEHOUSE, 2000; OLIVEIRA NETO et al., 2004a; OLIVEIRA NETO et al., 2004b; OLIVEIRA NETO et al., 2003; ZHOU et al., 1983).
A introdução de um DNA exógeno em um embrião de algodoeiro via tubo polínico após a polinização foi divulgada pela primeira vez por Zhou e colaboradores em 1983. A teoria desta técnica pode ser descrita como a seguinte: após a polinização, as células da nucela formam um canal para permitirem a passagem do tubo polínico até o saco embrionário, sendo assim, com a remoção do estigma e a aplicação de uma solução de DNA na parte superior da jovem maçã após a polinização, o DNA exógeno pode alcançar o ovário através da passagem deixada pelo tubo polínico e integrar as células zigóticas já fertilizadas, mas não divididas. As células podem ser transformadas uma vez que as mesmas ainda não apresentam parede celular normal. Assim, o gene de interesse pode então ser integrado dentro do genoma da cultivar receptora. Uma vez incorporado no genoma e expresso de maneira estável, o transgene passa a fazer parte do patrimônio genético da planta, não alterando sua constituição genética global. As sementes transformadas podem então ser obtidas sem preparação de protoplasto, cultivo de células e regeneração de planta. Após a colheita das sementes, as mesmas serão semeadas e submetidas a uma seleção onde as plantas transgênicas serão selecionadas. Sendo assim, o uso da técnica de transformação via tubo polínico requer a planta inteira, perfeita e em estádio de floração, período em que são aplicadas as microinjeções com as construções gênicas desejadas.
Apesar da técnica ter sido inicialmente descrita em 1983, várias mudanças foram feitas na mesma durante os últimos meses com o objetivo de aumentar a sua eficiência, principalmente no que diz respeito ao abortamento das maçãs. Sendo assim, o objetivo este trabalho foi testar o efeito das microinjeções no abortamento de maçãs da cultivar cedro.
MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal
Este experimento foi realizado com plantas da cultivar Cedro. As plantas foram mantidas durante todo o experimento em casa-de-vegetação. As plantas foram distribuídas na casa de vegetação por sorteio e a estatística utilizada o inteiramente casualizado.
Ensaio experimental
O experimento foi realizado com 240 plantas, sendo 40 plantas para cada tratamento e com 10 microinjeções por planta. Os tratamentos utilizados no experimento foram os seguintes: (CONT) controle, ou seja, plantas em que suas maçãs não foram submetidas a microinjeção, mas tiveram suas 10 maçãs acompanhadas, quando não abortavam, até a produção de sementes; (DNAM) plantas que tiveram 10 maçãs microinjetadas com a construção gênica no período de 07 as 08:00 h do dia; (DNAN) grupo de plantas que tiveram 10 maçãs microinjetadas com a construção gênica no período de 18 as 19:00 h do dia; (DNAV) grupo de plantas que tiveram 10 maçãs microinjetadas com a construção gênica no período de 18 as 19:00 h do dia e que após a microinjeção tinha o orifício deixado pela agulha selado com vaselina; (DNAA) grupo de plantas que tiveram 10 maçãs microinjetadas com água no período de 18 as 19:00 h do dia; (DNAS) grupo de plantas que tiveram 10 maçãs submetidas à perfuração com a agulha da microseringa, entretanto, nenhum material foi microinjetado na maçã no período de 18 as 19:00 h do dia.
Construção gênica utilizada
BTCI (inibidor de tripsina Bowman-Birk e inibidor de quimotripsina) e da Tarina (Tar1)
Foram selecionados dois genes a serem introduzidos no algodoeiro: o gene codificador do inibidor BTCI (inibidor de tripsina Bowman-Birk e inibidor de quimotripsina) e da Tarina (Tar1), devido às suas atividades contra o bicudo-do-algodoeiro e lepidópteros, respectivamente. Porém, visando a transformação de algodoeiro via tubo polínico faz-se necessário a introdução destes genes em vetores de expressão de plantas. Para isso, os genes foram inseridos sob controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor duplicado (CaMV35Sd), com o enhancer do vírus do mosaico da alfafa (AMV), de expressão constitutiva, num vetor de subclonagem. Em seguida, o vetor foi digerido com SacII e ApaI e o cassete contendo os genes Tar1 e BTCI foi inserido no vetor da série pCAMBIA (pC2300). Este vetor é o que tem sido utilizado até o momento nos trabalhos de transformação de plantas de algodão via microinjeção.
Aplicação das microinjeções
Durante a época de floração as plantas de cada tratamento tiveram suas flores selecionadas. A seleção das plantas consistia em selecionar plantas floridas que apresentassem flores de cor roxa. O algodoeiro é bem peculiar quanto às características da flor. Em um primeiro momento tem-se o botão floral, e após a antese tem-se a flor de pétalas branca e em seguida a flor de pétalas roxa. Para os procedimentos da técnica de transformação via tubo polínico é necessária que já tenha ocorrido polinização com conseqüente desenvolvimento do tubo polínico e fecundação. A entrada do tubo polínico no óvulo levará a dupla fecundação que realizará a fusão do primeiro núcleo masculino com a oosfera e a do segundo núcleo masculino com os dois núcleos polares Estes se mantêm juntos, mas independentemente, até o momento da entrada do núcleo masculino.
Imediatamente depois da fusão dos três núcleos se dá a primeira divisão da célula mãe do endosperma. Algumas horas depois já se vêem óvulos com dois núcleos do endosperma e outros com quatro núcleos. A fertilização ocorre 30 horas depois da polinização, entretanto é muito importante frisar que neste momento e nas próximas 24 horas o ovo fecundado permanece indiviso.
Sendo assim, no dia do aparecimento da flor roxa, o botão correspondente ao tratamento era etiquetado pelo pecíolo com a data. Em seguida a flor tinha cuidadosamente as pétalas, estames e estigma retirados com objetivo de expor o primórdio de maçã. A microinjeção é feita uma microseringa do tipo Hamilton na parte superior da maçã jovem do algodoeiro.
Cada maçã referente aos tratamentos DNAM, DNAN e DNAV recebeu uma dose de 10 µL da construção gênica ou de água no caso do tratamento DNAA. O tratamento DNAS apenas tinha a maçã perfurada pela a agulha e o CONT não tinha nenhuma maçã submetida a microinjeção.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A tecnologia da transformação do algodoeiro via tubo polínico vem sendo feita no nosso grupo desde agosto de 2004 e trata-se de uma ferramenta com grande potencial para a geração de uma planta transgênica de algodoeiro. Esta metodologia dispensa os protocolos de cultura de tecido o que mostra a princípio ser uma grande vantagem, uma vez a cultura de tecido demandar muito tempo nos protocolos de transformações de plantas.
Devido à baixa umidade relativa em Brasília durante o período das aplicações das microinjeções alguns ajustes foram necessários para a aplicação da técnica de transformação via tubo polínico em nosso laboratório.
O princípio da técnica de transformação via tubo polínico consiste na aplicação de uma microinjeção de DNA na parte superior da maçã jovem do algodoeiro. Após a polinização ocorre a “germinação” do pólen no estigma originando o tubo polínico, o qual se desenvolve até atingir o saco embrionário. Quando a flor chega ao estágio de flor roxa, a polinização e a fecundação já ocorreram, e assim utiliza-se do “canal” deixado pelo tubo polínico e aplica-se o DNA exógeno na porção superior do tubo polínico. Neste estádio de desenvolvimento, apesar da fecundação ter ocorrido o que se tem são células zigóticas não divididas e sem a presença de parede celular o que facilita a integração do DNA exógeno no genoma da planta hospedeira. Esta parte do procedimento técnico é a mais delicada uma vez que qualquer lesão deixada em função da aplicação, que não seja o orifício deixado pela microseringa no ápice da maçã, leva ao abortamento das mesmas.
Atualmente o trabalho encontra-se na sua fase final, com a colheita praticamente terminada e já iniciado o processo de desafio das sementes. Uma vez que metade das plantas que constituíam o experimento (tratamentos DNAM, DNAN e DNAV,) foram submetidas a microinjeções com a construção gênica, tem-se a possibilidade de terem produzido sementes transformadas. A produção nesses tratamentos foi de aproximadamente 30.000 sementes correspondentes a 816 maçãs microinjetadas e que não abortaram.
Tabela 1. Efeito dos tratamentos na taxa de abortamento de maçãs de algodoeiro quando submetidas a microinjeções.
TRATAMENTO MICROINJEÇÕES MAÇÃS FIXAS ABORTAMENTOS TAXA DE
ABORTAMENTO (%) CONT 265 201 64 24 DNAM, 247 154 93 38 DNAN 258 179 79 31 DNAA 227 154 73 32 DNAS 269 210 59 22 DNAV 292 212 80 27 Total 1.558 1.110 448 29
De acordo com a Tabela 1 é possível verificar que o horário em que a maçã é submetida a microinjeção tem influência no abortamento. A taxa mais alta de abortamento foi nas maçãs provenientes do tratamento que tinham as maçãs microinjetadas no horário de 07 as 08:00 h do dia (DNAM). A taxa de abortamento no tratamento DNAS para verificar o efeito do dano físico deixado pela seringa foi inferior ao controle mostrando que a agulha em si não elevou o número de abortos nas maçãs. A aplicação das microinjeções no horário noturno (18 as 19:00 h do dia), tratamento DNAN, mostrou uma diminuição na taxa de abortamento de 7% quando se compara com o tratamento DNAM (plantas que tiveram maçãs microinjetadas no período de 07 as 08:00 h do dia). Verificou-se que quando apenas água era microinjetada na maçã, tratamento DNAA, o abortamento permanecia na mesma taxa do tratamento DNAN (plantas que tiveram microinjetadas com a construção gênica no período de 18 as 19:00 h do dia). E finalmente, quando as maçãs foram microinjetadas com a construção gênica no período de 18 as 19:00 h do dia e após a microinjeção tinha o orifício deixado
pela agulha selado com vaselina (tratamento DNAV), a taxa de abortamento foi reduzida 11% quando comparada com o tratamento DNAM e 4% com o tratamento DNAN; ficando somente 3% acima do abortamento do tratamento controle (CONT).
Estabelecer as condições ótimas para a tecnologia de microinjeções em algodoeiro será fundamental para os experimentos futuros que visam à transformação desta planta via tubo polínico, uma vez que o nosso intuito é produzir um planta transgênica de algodoeiro com esta técnica expressando uma proteína entomotóxica que venha conferir resistência contra o bicudo-do-algodoeiro e/ou outras pragas do algodoeiro, poderá apresentar uma nova metodologia na manipulação genética de plantas que tem como foco principal a obtenção, em um aspecto mais amplo, de plantas resistente a insetos-praga.
CONCLUSÕES
1. A técnica de microinjeção que é utilizada para a transformação de algodoeiro via tubo polínico induz um aumento na taxa de abortamento;
2. O abortamento nas maçãs microinjetadas não ocorre devido o dano físico deixado pela agulha da seringa de microinjeção;
3. Verificou-se que a água que é o diluente da construção gênica, quando microinjetada isoladamente provoca aumento na taxa de abortamento;
4. As microinjeções realizadas no grupo de plantas que tiveram as maçãs microinjetadas com a construção gênica no período de 18 as 19:00 h do dia e que após a microinjeção tinha o orifício deixado pela agulha selado com vaselina (tratamento DNAV) foi o grupo de plantas que apresentou a menor taxa de abortamento, com apenas 3% acima da taxa de abortamento encontrada no controle (tratamento DNAV), sugerindo que aplicações noturnas e seladas com vaselina aumentam a eficiência da técnica de microinjeção em algodoeiro.
(*) Trabalho com apoio financeiro das seguintes instituições: FACUAL, FIALGO, FAP-DF, CNPq e Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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