FACULDADE DE ENGENHARIA QUírÁféÁ ~; LOREN~ DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE Candida guilliermondii

FTI

20037 PARA OBTENÇÃO DE XILITOL EM HIDROLISADO

HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora:

Estudante:

Dr. Sílvio Silvério da Silva (presidente)

Dr. Ismael Maciel de Mancilha

Dr. Michele Vitelo

Walter de Carvalho

Lorena - SP - Brasil 2000

Tranferido da Biblioteca do

DEB1Q para a Biiblioteca

Universitária em Junhoí2004

Proc. nº 202/04

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE

Candida guilliermondii

FTI 20037 PARA OBTENÇÃO DE XILITOL EM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora

Dr. Silvio Silvério da Silva

Presidente da Banca Examinadora

Lorena - SP - Brasil

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AGRADECIMENTOS

A Deus.

Ao Departamento de Biotecnologia e à Faculdade de Engenharia

Química de Lorena.

À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES).

Ao Prof. Sílvio, orientador e amigo inestimável, pela amizade, pela

confiança, compreensão e estímulo constantes, pelo exemplo profissional e

pela dedicação e competência com que orientou este trabalho.

Ao Prof. Ismael, pela amizade, pela confiança, pelo apoio constante e

pelos ensinamentos e valiosas sugestões, fundamentais para a concretização

deste trabalho.

Ao Prof. Michele, pela amizade, pelos ensinamentos e pelas valiosas

contribuições durante a realização deste trabalho.

À Prof. Inês, pela amizade, pelos ensinamentos e pela valiosa ajuda

durante as análises estatísticas dos dados experimentais.

Às Profs. Maria das Graças e Adriane, pela amizade, pelos

ensinamentos e pelo apoio constante durante a realização deste trabalho.

Aos Profs. Arnaldo Márcio, João Batista, Maria Bernadete, André,

Adilson, Heizir e Attilio, pela amizade e pelos ensinamentos.

Aos funcionários do Departamento de Biotecnologia, em especial à

Maria Eunice, pela amizade e pela ajuda durante o desenvolvimento deste

trabalho.

À Rita, ao Paulinho e ao Nicamor, pela amizade e pela ajuda constante

durante a realização dos experimentos.

À todos os colegas do curso, pela amizade, pela ajuda e pela presença

constante.

À todos aqueles que, embora não citados, contribuíram direta ou

Walter de Carvalho, filho de Walter José de Carvalho e Elizabeth

Aparecida Lima Carvalho, nasceu em Ribeirão Vermelho, Minas Gerais, no dia

23 de setembro de 1973.

Em fevereiro de 1994, ingressou no curso de Farmácia da Faculdade de

Farmácia e Bioquímica, Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora -

M.G.

Em dezembro de 1997, graduou-se em Farmácia pela Faculdade de

Farmácia e Bioquímica, Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora -

M.G.

Em fevereiro de 1998, ingressou no curso de Mestrado em

Biotecnologia Industrial da Faculdade de Engenharia Química de Lorena,

Estudo da imobilização de Candida guilliermondii FTI 20037 para obtenção de xilitol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-

açúcar. Walter de Carvalho. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia,

Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Sílvio Silvério da

Silva (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, C.P. 116, 12600-000,

Lorena, S.P., Brasil). Banca examinadora: Dr. Michele Vitolo e Dr. Ismael

Maciel de Mancilha. Abril de 2000.

Um planejamento fatorial completo foi utilizado para verificar se a variação dos níveis dos parâmetros de imobilização celular em gel de alginato de cálcio poderia exercer efeitos sobre a estabilidade química do suporte e sobre a capacidade fermentativa das células imobilizadas. Os parâmetros de

imobilização testados foram concentração de alginato de sódio (1 %, 1,5 % e

2 % ), concentração de cloreto de cálcio (O, 1 M, O, 15 M e 0,2 M) e tempo de

cura das esferas (12 h, 18 h e 24 h). Os ensaios fermentativos foram conduzidos em frascos Erlenmeyer de 125 mL incubados em estufa com

movimento rotatório a 30 ºC e 200 rpm por 72 h. De acordo com os resultados,

a variação dos parâmetros de imobilização exerceu influências com intensidades variadas sobre a estabilidade química do suporte e sobre a

capacidade fermentativa das células imobilizadas. A análise geral dos

resultados obtidos levou à conclusão de que a concentração de alginato de

sódio de 2 %, a concentração de cloreto de cálcio de O, 1 M e o tempo de cura

das esferas por 24 h representam as condições de imobilização mais adequadas para a produção de xilitol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar concentrado.

Estudou-se também as variações nos teores de açúcares, ácido acético, furfural e hidróxi-metil-furfural e nos valores de pH e de absorbância a 280 nm ao longo de cada uma das etapas de preparo do meio de fermentação. Os resultados mostraram que o tratamento do hidrolisado por meio da alteração

de pH, adição de carvão ativo e autoclavagem não influencia os teores de

glicose e xilose. Entretanto, diferentes teores de arabinose e ácido acético, e

diferentes valores de pH e de absorbância a 280 nm foram observados ao

longo das etapas de preparo' do meio de fermentação, em função da

velocidade de adição de óxido de cálcio ao hidrolisado. A adição de 0,9 g de CaO I h de tratamento para cada 100 ml de hidrolisado permitiu a obtenção de um hidrolisado límpido, bem como de melhores taxas de conversão de xilose em xilitol e de maior estabilidade do suporte de imobilização.

Após a definição das condições de imobilização e tratamento do hidrolisado, a estabilidade operacional do sistema imobilizado foi avaliada

durante a realização de cinco bateladas sucessivas de fermentação. Após a

primeira batelada da série de repetições, os valores médios de concentração

final de xilitol, eficiência de bioconversão e produtividade volumétrica foram

aumentados para 28,4 g/L, 61,5 % e 0,59 g/L.h, respectivamente, sendo os

coeficientes de variação relativos à estas determinações inferiores a 2,5 %.

Não se verificou nenhuma solubilização das esferas de alginato de cálcio ao

Study of the immobilization of Candida gui/liermondii FTI 20037 for obtaining xylitol in sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate. Walter

de Carvalho. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-Graduação em

Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de

Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Sílvio Silvério da Silva

(Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, C.P. 116, 12600-000, Lorena,

S.P., Brasil). Banca examinadora: Dr. Michele Vitelo e Dr. Ismael Maciel de

Mancilha. Abril de 2000.

A fui! factorial design was employed to find out if variations in the Ca- alginate cell immobilization parameters would have any effects on the chemical stability of the beads and on the fermentative capacity of the immobilized cells. The immobilization parameters tested were sodium alginate concentration

(1 %, 1.5 % and 2 %), calcium chloride concentration (0.1 M, 0.15 M and

0.12 M) and beads curing time (12 h, 18 h and 24 h). The fermentation runs

were carried out in 125-mL Erlenmeyer flasks mantained in a rotatory shaker at

30 ºC and 200 rpm for 72 h. According to the results, the variation in the

immobilization parameters influenced the chemical stability of the beads and

the fermentative capacity of the immobilized cells with varied intensities. From

a general analysis of the results obtained, it was possible to conclude that

sodium alginate concentration of 2 %, calcium chloride concentration of 0.1 M

and beads curing time of 24 h represented the most appropriate immobilization

conditions for xylitol production in concentrated sugarcane bagasse

hemicellulosic hydrolysate.

Changes in the contents of sugars, acetic acid, furfural and hydroxy- methyl-furfural, as well as in the pH and 280 nm absorbance values along each one of the stages involved in the preparation of the fermentation medium were also studied. The results showed that the hydrolysate treatment by varying the pH, adding active charcoal and heating had no influence on the glucose and

xylose concentrations. However, different arabinose and acetic acid

concentrations, and different pH and 280 nm absorbance values were

observed along the preparation of the fermentation medium, as a function of

the speed of calcium oxide addition to the hydrolysate. The addition of 0.9 g of

CaO I h to each 100 mL of hydrolysate provided a limpid hydrotysate, as wett

as higher xylose-to-xylitol bioconversion rates and calcium alginate beads

stability.

After defining the immobitization and hydrolysate treatment conditions, the operational stability of the immobilized system was evaluated during a repeated batch fermentation with five successive batches. After the first batch, the mean values of xylitol final concentration, bioconversion efficiency and

volumetric productivity were increased to 28.4 g/L, 61.5% and 0.59 g/L.h,

respectively, being the relative variation coefficients below 2.5 %. tt was not

verified any beads solubilization at the end of the five fermentation batches.

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,n \.,' t. ,;,. '/ LISTA DE FIGURAS ~}J R t. ~\ ./ IV "-···- .....•. -r· 1. INTRODUÇÃO ---1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4

CONTEÚDO

2. 1 Uso da biomassa lignocelulósica como fonte alternativa de carbohidratos

2.1. 1 Uso da fração hemicelulósica do· bagaço de cana-de-açúcar como

fonte de xi/ase para a produção de xilitol 8

2.2 Xilitol: um composto alternativo para as indústrias alimentícia e

farmacêutica

_---~

9

2.2. 1 Processos de produção de xilitol 13

2.2.1.1 Produção de xilitol por via química 13

2.2.1.2 Produção de xilitol por via biotecnológica 13

2. 3 Condução de bioprocessos utilizando células viáveis imobilizadas_ 31

2.3. 1 Métodos de imobilização

e tipos de suporte

32

2.3.1.1 Imobilização de células pelo método de aprisionamento em gel de alginato de

cálcio

_---

35

2. 3. 2 Imobilização de células viáveis para a produção de xilitol 41

3. MATERIAIS E MÉTODOS 43

3. 1 Obtenção, concentração e tratamento do hidrolisado hemicelulósico do

bagaço de cana de açúcar 43

3.2 Microrganismo e obtenção das células 43

3. 3 Imobilização das células 44

3.4 Meio e condições de fermentação 45

3. 5 Métodos analíticos 46

3. 5. 1 Determinação da concentração celular 46

3.5.2 Determinação da variação no diâmetro das esferas de alginato de

cálcio

_---

47

3.5.3 Determinação do teor de açúcares, xilitol, ácido acético, etanol,

furfural e hidróxi-metil-furfural

_---

47

3. 5. 4 Determinação dos parâmetros fermentativos 48

concentração 51

4.2 Caracterização parcial do hidrolisado durante as etapas de tratamento,

autoclavagem e adição de nutrientes 54

4.3 Caracterização das fermentações em função das diferentes condições

experimentais avaliadas 64

4.4 Estudo dos efeitos das variáveis sobre a fermentação do hidrolisado _ 73

4.5 Avaliação da estabilidade operacional das células imobilizadas no

sistema de bateladas repetidas 85

5.CONCLUSÕES 93

6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS _~~~~~~~~~~ 95

Tabela 1 - Composição (%) de resíduos agrícolas e de madeiras (KUHAD e

SINGH, 1993) 5

Tabela 2 - Características e propriedades físico-químicas do xilitol

(BAR, 1986) 1

o

Tabela 3 - Valores de produção de xilitol, fator de rendimento, eficiência de

conversão e produtividade volumétrica em xilitol obtidos em diferentes

sistemas fermentativos 30

Tabela 4 - Codificação e níveis das variáveis estudadas 49

Tabela 5 - Matriz experimental do planejamento fatorial completo do tipo 23

com 3 ensaios no ponto central 50

Tabela 6 - Valores de pH, absorbância a 280 nm e concentração (g/L) de

glicose, xilose, arabinose, ácido acético, furfural e hidróxi-metil-furfural do

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar antes e após a

etapa de concentração a vácuo 51

Tabela 7 - Valores de pH e concentração (g/L) de glicose, xilose, arabinose e ácido acético do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar concentrado tratado pela adição rápida de óxido de cálcio antes (A) e após as etapas de tratamento (B), autoclavagem (C) e adição de nutrientes para

elaboração do meio de fermentação (O) 54

Tabela 8 - Valores de pH e concentração (g/L) de glicose, xilose, arabinose e

ácido acético do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar concentrado tratado pela adição lenta de óxido de cálcio antes (A) e após as etapas de tratamento (B), autoclavagem (C) e adição de nutrientes para

elaboração do meio de fermentação (O) 57

Tabela 9 - Valores de pH, absorbância a 280nm e concentração (g/L) de

furfural e hidróxi-metil-furfural do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar concentrado antes (A) e após as etapas de adição de

óxido de cálcio (B), adição de ácido fosfórico (C), adição de carvão ativo

(O), autoclavagem (E) e adição de nutrientes para elaboração do meio de

Tabela 1 O - Valores de pH, absorbância a 280nm e concentração (g/L) de furfural e hidróxi-metil-furfural do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar concentrado antes (A) e após as etapas de adição de óxido de cálcio (8), adição de ácido fosfórico (C), adição de carvão ativo (D), autoclavagem (E) e adição de nutrientes para elaboração do meio de fermentação (F), no ensaio com adição lenta de óxido de cálcio 64 Tabela 11 - Percentual de consumo de xilose (A), arabinose (8) e ácido acético (C), concentração final de xilitol (D) e etanol (E), proporção entre a concentração final de xilitol e a concentração final de etanol (F), produtividade volumétrica em xilitol (G), eficiência de conversão de xilose em xilitol (H) e pH final do meio (1) determinados para os ensaios

fermentativos após 48 h de fermentação 75

Tabela 12 - Diâmetro médio das esferas de gel de alginato de cálcio após a

imobilização (A), redução no diâmetro médio das esferas de gel de alginato

de cálcio (8), proporção entre a concentração celular imobilizada final e a

concentração celular imobilizada inicial (C), e concentração celular livre em suspensão no meio de fermentação (D) determinados para os ensaios

fermentativos após 48 h de fermentação 76

Tabela 13 - Estimativa dos valores dos efeitos, erros-padrão e t calculados das

variáveis em estudo em relação à concentração de xilitol nos 11 ensaios

realizados de acordo com o planejamento experimental utilizado 77

Tabela 14 - Estimativa dos valores dos efeitos, erros-padrão e t calculados das

variáveis em estudo em relação à concentração de etanol nos 11 ensaios

realizados de acordo com o planejamento experimental utilizado 78

Tabela 15 - Estimativa dos valores dos efeitos, erros-padrão e t calculados das

variáveis em estudo em relação à proporção entre as concentrações de

xilitol e etanol nos 11 ensaios realizados de acordo com o planejamento

experimental utilizado 79

Tabela 16 - Estimativa dos valores dos efeitos, erros-padrão e t calculados das

variáveis em estudo em relação à produtividade volumétrica em xilitol nos

11 ensaios realizados de acordo com o planejamento experimental

utilizado 79

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Exemplos de produtos que contêm xilitol.

_~~~~~~~~-

12

Figura 2- Esquema dos passos iniciais da utilização de 0-xilose por

Figura 3 - Via metabólica utilizada na fermentação de 0-xilose por leveduras.18 Figura 4 - Sistema de classificação dos métodos de imobilização de enzimas e

células (BÁLES, 1994). 34

Figura 5 - Ilustração dos quatro grandes grupos de métodos de imobilização

de biocatalisadores (KAREL etal., 1985). 35

Figura 6 - Estruturas dos blocos de manuronato (blocos M), guluronato

(blocos G) e mistos (blocos MG) presentes nos alginatos

(GEMEINER et ai., 1994). 39

Figura 7 - Dimerização da cadeia de poli-L-Guluronato induzida na presença

de íons cálcio. Os átomos de oxigênio envolvidos na quelação são

mostrados como círculos cheios (GEMEINER et ai., 1994). 40

Figura 8 - Modelo para a formação da malha de alginato de cálcio envolvendo: a) dimerização inicial, e b) subsequente agregação dos dímeros

preformados induzida por íons cálcio (GEMEINER et ai., 1994). 41

Figura 9 - Ilustração do equipamento utilizado para a imobilização das células

de Candida guilliermondíi em gel de alginato de cálcio. 45

Figura 1 O - Hidrolisado antes do tratamento (A), após a adição de óxido de

cálcio (8), após a adição de ácido fosfórico (C), após a adição de carvão

ativo (D) e após a autoclavagem (E), em função da forma de adição de

óxido de cálcio. (1) Adição rapida de CaO ao hidrolisado; (2) Adição lenta

de CaO ao hidrolisado. 56

Figura 11 - Variação do pH do hidrolisado em função do tempo de adição de óxido de cálcio durante o tratamento pela adição rápida (•) e lenta (•)

deste composto. 61

Figura 12 - Variação das concentrações (g/L) de xilose (•) e xilitol (•) em sistema de bateladas repetidas de fermentação com reutilização das

Figura 13 - Variação da concentração (g/L) de etanol ( +) em sistema de bateladas repetidas de fermentação com reutilização das células

1. INTRODUÇÃO

O Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química

de Lorena vem, nos últimos anos, concentrando esforços e realizando estudos

intensivos para o aproveitamento integral dos resíduos lignocelulósicos. Como

resultado imediato, algumas tecnologias encontram-se em fase de

desenvolvimento para transferência para o setor produtivo.

Especificamente, os trabalhos de pesquisas do Grupo de Processos

Fermentativos deste Departamento estão concentrados no aproveitamento da

fração hemicelulósica de resíduos lignocelulósicos por processos

fermentativos, visando a geração de produtos de interesse econômico e social

para o Brasil.

O xilitol é um álcool pentahidroxilado que apresenta poder adoçante equivalente ao da sacarose. Além de prevenir a formação de cáries, exerce também um efeito sobre as lesões já existentes ocasionando remineralização

do esmalte dos dentes e regeneração das cáries já formadas. Além disso,

pode ser utilizado por diabéticos, por pessoas obesas e por pacientes que

apresentam desordens no metabolismo de gorduras.

Atualmente, este poliol é produzido em escala industrial pela via

química, caracterizada pela redução inorgânica de uma solução de xilose com

elevado grau de pureza, sob condições de elevadas temperatura e pressão.

Desde a descoberta da habilidade de certas leveduras em produzir

xilitol, a possibilidade de produção deste composto por via biotecnológica vem

despertando interesse crescente em grupos de pesquisa ao redor do mundo.

Neste processo, a redução da xilose é realizada diretamente no hidrolisado.

Desta forma, espera-se uma redução significativa dos custos de produção.

Além disso, a produção por via biotecnológica não necessita do emprego de

elevadas condições de temperatura e pressão e não leva à formação de

compostos tóxicos.

O Grupo de Processos Fermentativos do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química de Lorena vem empreendendo esforços para o desenvolvimento de um processo, técnica e

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litol por via biotecnológica desde

ção

de leveduras potenciais para

ío sido selecionada a levedura

mais promissora. Desde então,

o desenvolvimento de um meio de para um processo em escala iivos têm sido empreendidos para os sistemas fermentativos que ío obter elevados rendimentos e

produtividades.

Apesar de todos estes esforços, os valores de rendimento e produtividade obtidos em meios constituídos por hidrolisados são ainda inferiores aos valores obtidos quando se trabalha em meio sintético, fato

atribuído à presença de substâncias tóxicas ao microrganismo, originadas

durante a etapa de hidrólise dos materiais lignocelulósicos.

A adaptação dos biocatalisadores ao hidrolisado, a reciclagem de

células, o emprego de elevadas concentrações celulares e a condução do processo no sistema de bateladas repetidas são procedimentos que contribuem para superar estes efeitos tóxicos. Neste contexto, a utilização de

técnicas de imobilização celular tem sido recomendada uma vez que possibilita

a obtenção de elevadas concentrações celulares por unidade de volume do

reator, maximiza a fração de meio descarregada ao final de cada batelada,

facilita a reutilização dos biocatalisadores, minimiza tempos mortos e custos de

separação e confere maior estabilidade às células.

O aprisionamento em gel de alginato de cálcio é a técnica mais amplamente utilizada para a imobilização de células viáveis. A gelificação ocorre rapidamente na presença de íons cálcio sem alterações drásticas de

temperatura, pH e pressão osmótica, o que permite preservar a atividade e a

viabilidade dos microrganismos imobilizados. Além disso, o alginato é um

material barato e facilmente encontrado no mercado, e a técnica de

imobilização permite o preparo de grandes quantidades de pellets de maneira relativamente fácil.

Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a utilização de células

da levedura Candida guilliermondii FTI 20037 imobilizadas em gel de alginato

de cálcio na produção de xilitol a partir da xilose presente no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Especificamente, foram determinadas condições adequadas de imobilização das células em esferas de

alginato de cálcio, utilizando-se conceitos de estatística descritiva e

multivariada. Posteriormente, avaliou-se a estabilidade operacional dos

biocatalisadores imobilizados no sistema de bateladas repetidas, utilizando-se

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1

uso

DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA COMO FONTE

ALTERNA TIVA DE CARBOHIDRA TOS EM BIOPROCESSOS

" No início deste século, a maior parte dos produtos industriais era

confeccionada a partir de árvores e vegetais em geral. Por volta dos anos 70,

entretanto, os produtos industriais derivados da biomassa vegetal foram

largamente substituídos por aqueles derivados do petróleo. As tecnologias

baseadas em hidrocarbonetos, propiciadas pela economia favorável,

chegaram a deter acima de 95 % dos mercados previamente supridos por produtos elaborados a partir de biorecursos. A indústria de produtos de consumo substituiu o carbohidrato pelo hidrocarboneto como bloco molecular

de construção da nossa economia industrial. Atualmente, impulsionados por

avanços tecnológicos e regulações ambientais, os bioprodutos estão

retornando para ocupar o seu espaço". (LOUWRIER, 1998).

A biomassa vegetal constitui uma fonte potencial de carbono e energia que pode ser empregada em bioprocessos para a produção de diversos

produtos de valor agregado, uma vez que é abundante, renovável e de baixo

custo (TSAO, 1986). O mercado para os produtos derivados da biomassa

vegetal inclui combustíveis e insumos químicos em geral. Dentre estes,

encontram-se alimentos, fármacos e enzimas (LOUWRIER, 1998;

WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998).

Os materiais lignocelulósicos representam a fração mais expressiva da

biomassa vegetal, a maior fonte de compostos orgânicos da biosfera (LUTZEN

et ai., 1983). Estima-se que quantidades significativas destes materiais, da

ordem de 60 bilhões de toneladas, acumulam-se anualmente na natureza, gerando problemas de poluição ambiental e caracterizando a perda de valiosos recursos potenciais (MOO-YOUNG et ai., 1986).

Estes materiais são compostos principalmente por uma mistura de

carbohidratos polimerizados (celulose e hemicelulose) e lignina. A composição

constituintes e às proporções entre eles (KUHAD e SINGH, 1993), conforme apresentado na Tabela 1.

Tabela 1 - Composição (%) de resíduos agrícolas e de madeiras (KUHAD e

SINGH, 1993)

Resíduos Hexasanas Pentasanas Ugnina Cinzas

Bagaço de Cana-de-Açúcar 33 30 29 4

Palha de Cevada 40 20 15 11

Vidoeiro (Birch Wood) 40 33 21 4

Sabugo de Milho 42 39 14 2 Talo de Milho 35 15 19 5 Casca de Amendoim 38 36 16 5 Palha de Aveia 41 16 11 12 Pi nus 41 10 27 8 Palha de Arroz 32 24 13 12 Casca de Arroz 36 15 19 20 Serragem 55 14 21 5 Palha de Sorgo 33 18 15 10 Palha de Trigo 30 24 18 10

A celulose, principal componente da parede celular da fibra vegetal, é

um homopolissacarídeo linear formado por unidades de D-glicose unidas entre si através de ligações glicosídicas do tipo B (1~4), com grau de polimerização

de até 25.000 unidades. As fibrilas de celulose envolvem as células vegetais

em arranjos paralelos regulares e são geralmente mantidas juntas por uma matriz de outro material polimérico, a hemicelulose (FENGEL e WEGENER,

A hemicelulose, fração que chega a representar até 40 % do material da parede celular da fibra vegetal e age como substância de reserva e

sustentação, é um heteropolímero formado por pentases (xilose e arabinose) e

por hexases (glicose, manose e galactose) e seus correspondentes ácidos urônicos. Esta fração é geralmente acetilada e sua composição varia

amplamente, dependendo da espécie considerada, do tipo de crescimento do

tecido e do método de extração. O grau de polimerização deste heteropolímero

é geralmente inferior a 200 unidades (FENGEL e WEGENER, 1989).

A lignina, fração responsável pela rigidez e baixa reatividade destes

materiais, é encontrada na parede celular de todas as plantas vasculares. Este

polímero de elevado peso molecular é uma macromolécula que possui

estrutura polifenólica complexa, formada através da polimerização

desidrogenativa de três álcoois: trans-p-cumaril, trans-coniferil e trans-sinapil.

Junto com hemicelulose e pectina, a lignina preenche os espaços entre as

fibrilas de celulose, atuando assim como um material de ligação entre

componentes da parede celular (FENGEL e WEGENER, 1989).

Os constituintes dos materiais lignocelulósicos encontrados em menores

proporções incluem extrativos e não-extrativos. Os extrativos consistem de

graxas, gorduras, gomas, amidos, alcalóides, resinas, óleos essenciais e

outros constituintes citoplasmáticos. Os não-extrativos incluem compostos

como sílica, carbonatos e oxalatos, sendo frequentemente responsáveis por características como cor, sabor, resistência ao apodrecimento e propriedades

abrasivas (D'ALMEIDA, 1988; KUHAD e SINGH, 1993).

A utilização dos diferentes componentes, passíveis de serem obtidos a

partir dos materiais lignocelulósicos, requer a separação seletiva de cada uma

das frações. Isto implica na ruptura do complexo lignina - hemicelulose -

celulose e na remoção de cada fração por técnicas de pré-tratamento, hidrólise

e deslignificação (FENGEL e WEGENER, 1989). A separação simultânea de

cada um dos principais constituintes (lignina, celulose e hemicelulose) em sua

forma polimérica, usando procedimentos de separação convencionais como

cristalização, precipitação ou extração, não é factível. No mínimo um dos

polímeros acima citados deve ser degradado tendo em vista as diferenças

entre suas propriedades químicas (PARAJÓ et el., 1998c)

-

-_..,..,

A estrutura heterogênea e com baixo grau de polimerização da fração hemicelulósica faz com que esta seja a principal fração de interesse para os

processos fermentativos, uma vez que a conformação tridimensional aberta

favorece a difusão do catalisador na molécula, propiciando um melhor

rendimento de hidrólise em condições mais amenas (MAGEE e KOSARIC,

1985).

Vários métodos diferentes têm sido empregados para a separação da

fração hemicelulósica do complexo lignina - hemicelulose - celulose: hidrólise

ácida (PESSOA JÚNIOR. 1991), explosão a vapor (SILVA, 1989), hidrólise

enzimática (MILAGRES e LACIS, 1991), hidrólise alcalina (du TOIT et ai.,

1984), biodegradação (BISARIA e GHOSE, 1981) e extração com dimetil-

sulfóxido (JOSELEAU, 1980). Dentre estes métodos, a hidrólise ácida tem se

mostrado o mais eficiente para a obtenção de um hidrolisado fermentescível

(PESSOA JÚNIOR, 1991 ). Entretanto, devido à decomposição da

hemicelulose, a hidrólise amena (também conhecida como pré-hidrólise) -

baixas concentrações de catalisador, baixas temperaturas e menores tempos

de residência - se mostra mais adequada. Como vantagens da pré-hidrólise,

podem ser citadas: prevenção da formação de produtos de degradação,

aumento da susceptibilidade da celulose à hidrólise subsequente e redução do

requerimento de equipamentos protegidos contra corrosão, em geral onerosos (MAGEE e KOSARIC, 1985).

Uma característica crítica dos hidrolisados preparados através de catalise ácida é a presença de inibidores do metabolismo microbiano. Estes inibidores tornam os hidrolisados substancialmente mais difíceis de serem

utilizados por microrganismos em relação à correspondente mistura de

açúcares puros. São, em sua maioria, produtos de degradação (furfural,

hidróxi-metil-furfural, ácido acético, ácido p-hidróxi-benzóico, vanilina, etc}

formados durante a hidrólise ácida dos materiais lignocelulósicos. O

conhecimento dos inibidores e de como minimizar seus efeitos no metabolismo microbiano é de extrema importância para se alcançar um processo de

2.1.1 USO DA FRAÇÃO HEMICELULÓSICA DO BAGAÇO DE CANA-DE- AÇÚCAR COMO FONTE DE XILOSE PARA A PRODUÇÃO DE XILITOL

O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo e, atualmente,

para a produção de açúcar e álcool, processa 295 milhões de toneladas deste

material por safra. Deve-se salientar ainda que, nos últimos três anos, a lavoura canavieira gerou um excedente de cana-de-açúcar de 9% ao ano, com perspectivas de aumento a curto prazo (CARVALHO, 1998).

Pode-se estimar que o Brasil produz atualmente entre 53 e 82 milhões de toneladas de bagaço de cana-de-açúcar por safra, tendo em vista que cada tonelada de cana-de-açúcar processada gera de 180 a 280 Kg de bagaço

(SANTANA e SOUZA, 1984).

5

Apesar de parte deste bagaço ser utilizada como fonte energética pela

própria indústria sucro-alcooleira (VENTURINI FILHO e ADDISON, 1992) e

como suplemento em rações para animais (LACÔRTE et ai., 1986), há ainda

um grande excedente deste material. Este excedente tende a aumentar em um

futuro próximo, devido à oferta do gás natural boliviano disponibilizado ao

mercado brasileiro através do gasoduto Bolívia-Brasil. De acordo com FAIRBANKS (1999), a chegada do gás natural pode colocar em risco a queima do bagaço de cana-de-açúcar e incentivar a valorização deste subproduto, uma vez que o gás é um combustível eficiente, não deixa resíduos, admite

modulação de chama, reduz a poluição ambiental e dispensa armazenagem,

além de contar com o apoio dos órgãos de fiscalização ambiental.

O bagaço, material fibroso obtido após moagem para extração do caldo,

é composto de água, fibras e pequenas quantidades de sólidos. Sua

composição varia com a espécie, com o tempo de cultivo, com o método de

colheita e com a eficiência de moagem. Em média, apresenta uma composição

de 46-52 % de água, 43-52 % de fibras e 2-6 % de sólidos solúveis (PAIVA,

1980).

O desenvolvimento de tecnologias visando a utilização do bagaço de cana-de-açúcar pode contribuir para a redução dos problemas relativos ao excedente de produção bem como para o seu aproveitamento racional. Neste contexto, a utilização da xilose presente na fração hemicelulósica desta

matéria-prima como substrato para a produção de xilitol, um adoçante com várias aplicações, se apresenta como uma alternativa atraente e promissora.

De acordo com KUHAD e SINGH (1993), a xilose pode perfazer até 80 % dos

carbohidratos presentes na fração hemicelulósica do bagaço de cana-de-

açúcar.

2.2 XILITOL: UM COMPOSTO ALTERNATIVO PARA AS INDÚSTRIAS ALIMENTÍCIA E FARMACÊUTICA

O xilitol, um álcool pentahidroxilado que apresenta poder adoçante

equivalente ao da sacarose (BAR, 1986), é um produto intermediário do

metabolismo de carbohidratos no homem e em animais (MANZ et ai., 1973). A

produção endógena diária é em média de 5 a 15 gramas em uma pessoa

adulta normal (EMODI, 1978). Este poliol ocorre naturalmente em certas frutas

e vegetais, entretanto a extração a partir destas fontes é economicamente

inviável devido às pequenas concentrações (EMODI, 1978). As propriedades

físico-químicas deste biocomposto são apresentadas na Tabela 2.

O xilitol tem se destacado nos últimos anos devido às suas propriedades, que o tornam um composto de interesse para as indústrias

farmacêutica e alimentícia. Prova disso é o número crescente de produtos que

vêm sendo lançados no mercado. Alguns exemplos de produtos que contêm

xilitol são apresentados na Figura 1 .

O xilitol apresenta propriedades anti-cariogênicas, uma vez que não é

fermentado pelos microrganismos da flora bucal (PEPPER e OLINGER, 1988).

À luz das evidências científicas disponíveis, é considerado o melhor de todos

os adoçantes alternativos em relação à prevenção de cáries

(WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998). Pode ser utilizado em substituição

ao açúcar sacarose por pacientes diabéticos e obesos, uma vez que seu metabolismo independe de insulina e contribui pouco para a formação de

tecidos gordurosos (MAKINEN, 1976; YLIKAHRI, 1979). É também indicado

para pacientes portadores de deficiência da enzima glicose-6P-desidrogenase

(WANG e van EYS, 1981 ). Além disso, não participa de reações de

cetônicos na sua molécula, o que o torna apropriado para a utilização em alimentos processados em temperaturas elevadas (MANZ et ei., 1973) e apresenta elevado calor de dissolução negativo, que confere sensação

agradável de frescor, tornando-o apropriado ao revestimento de gomas de

mascar (BAR, 1986).

Tabela 2 - Características e propriedades físico-químicas do xilitol (BAR, 1986) Características e Propriedades Físico-Químicas do Xilitol

Fórmula Molecular

Peso Molecular 152, 15 g/mol

Aparência Pó cristalino de cor branca

Odor Nenhum Ponto de Fusão 92-96 ºC 216 ºC 5-7 Ponto de Ebulição pH da Solução 5 % p/v Densidade da Solução 1 O% p/v - 1 ,03 g/cm3; 60 % p/v - 1 ,23 g/cm3 Solubilidade (30 ºC) 68 g/100 g solução Viscosidade da Solução (20 ºC) 10 % p/v - 1,23 cP 60 % p/v - 20,63 cP Calor de Dissolução Valor Calórico Índice de Refração (25 ºC) - 36,6 cal/g 4 kcal/g 10 % p/v - 1,3471 50 % p/v - 1 ,41 32

Ressalta-se ainda que, pelo fato deste adoçante apresentar poder de

alimentícia na confecção de alimentos dietéticos em substituição ao açúcar é vantajosa quando comparada aos demais adoçantes. Como a substituição ocorre na proporção de 1 :1, o balanço de massa dos produtos não é afetado, proporcionando manutenção das propriedades organolépticas do produto final (EMODI, 1978).

Segundo SCHEININ et ai. (1975), o xilitol além de prevenir a formação

de cáries, exerce também um efeito sobre as lesões já existentes ocasionando

uma remineralização do esmalte dos dentes e das cáries já formadas. De

acordo com WÃLER et ai., (1992) este é um efeito único do xilitol entre os

demais polióis como sorbitol e manitol. Em relação aos demais polióis, pode-se também afirmar que o xilitol apresenta poder adoçante e calor de dissolução negativo superiores (BAR, 1986; PEPPER e OLINGER, 1988).

De acordo com EMODI (1978), o xilitol apresenta propriedades laxativas

e a sua utilização em grandes quantidades pode acarretar a ocorrência de

diarréia osmótica. Entretanto, a adaptação das pessoas sensíveis à

quantidades progressivamente crescentes elimina tais distúrbios

gastrointestinais (MAKINEN, 1976), sendo este adoçante classificado como GRAS (General/y Recognised as Safe) pela FDA (Food and Drug

1 -. ,....

2.2.1 PROCESSOS DE PRODUÇÃO DE XILITOL

2.2.1.1 PRODUÇÃO DE XILITOL POR VIA QUÍMICA

A produção de xilitol por via química ocorre através da redução de xilose pura sob elevadas condições de temperatura e pressão, na presença do catalisador níquel de Raney (MELAJA e HAMALAINEN, 1977).

A necessidade de passos extensivos de fracionamento da solução de xilose, obtida por meio da hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos ricos em xilana, visando a eliminação de impurezas que podem interferir na catálise, bem como a necessidade de passos extensivos de purificação da solução de xilitol, visando a eliminação de resíduos tóxicos do catalisador e subprodutos gerados durante a redução da xilose, conferem ao processo um custo relativamente elevado (OJAMO et ai., 1988).

Apesar disto, a produção atual de xilitol em escala industrial ocorre

através da via química, sendo dominada pela FINISH SUGAR CO., localizada

em Helsink, Finlândia. Esta indústria iniciou suas atividades em 1975 e dispõe

de planta industrial com capacidade para produzir 300 toneladas deste produto

por ano (HYVÔNEN et ai., 1982).

2.2.1.2 PRODUÇÃO DE XILITOL POR VIA BIOTECNOLÓGICA

Apesar da grande gama de aplicações, o uso do xilitol como adoçante é

ainda limitado. O custo de produção comparativamente alto (cerca de 1 O vezes

o custo de produção da sacarose ou do sorbitol) parece ser o fator responsável. Isto tem encorajado o desenvolvimento de tecnologias capazes

de diminuir os custos de produção (PARAJÓ et ai., 1998a).

A produção por via biotecnológica está se tornando mais atrativa nos últimos anos porque se espera redução significativa dos custos relacionados

com separação e purificação (WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998), uma

vez que a redução da xilose ocorre diretamente no hidrolisado, não

necessitando dos extensivos passos de purificação característicos do processo

Os primeiros trabalhos significativos referentes à produção microbiológica de xilitol relatam a busca por microrganismos adequados para

serem empregados neste bioprocesso ( GONG et ai., 1981; BARBOSA et ai.,

1988). Entretanto, o interesse científico real iniciou-se nos últimos anos,

quando o xilitol, devido às suas propriedades únicas como adoçante

alternativo, começou a ser amplamente utilizado (WINKELHAUSEN e

KUZMANOVA, 1998).

Poucas bactérias como Corynebacterium sp. (YOSHITAKE et ai., 1971 ),

Enterobacter liquaefaciens (YOSHITAKE et ai., 1973) e Mycobacterium

smegmatis (IZUMURI e TUZAKI, 1988) têm sido reportadas na literatura como

produtoras de xilitol. Entretanto, devido às pequenas quantidades de xilitol

formadas, as bactérias produtoras de xilitol não despertam, atualmente,

interesse nos pesquisadores (WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998). Entre

os fungos filamentosos, apenas um trabalho é relatado na literatura utilizando

o fungo Petromyces albertensis (DAHIY A, 1991 ).

Em geral, entre os microrganismos, as leveduras são consideradas as

melhores produtoras de xilitol, especialmente aquelas que pertencem ao

'

gênero Candida, permitindo a obtenção de melhores taxas de conversão

(WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998). A eficiência e a produtividade da

bioconversão dependem principalmente do microrganismo, do meio de

fermentação e das condições de condução do processo fermentativo

(BARBOSA et ai., 1990; TAYLOR et ai., 1990).

A obtenção de xilitol por via biotecnológica é possível graças à

capacidade de alguns microrganismos, especialmente leveduras, de

sintetizarem a enzima xilose redutase, a qual catalisa a redução de xilose em

xilitol (BARNETI, 1976; JEFFRIES, 1983).

O primeiro passo do metabolismo da xilose é o transporte deste açúcar

através da membrana celular. Alguns trabalhos têm mostrado que, sob

condições limitadas de oxigênio, a taxa de transporte através da membrana pode limitar a utilização de xilose pela levedura. Entretanto, em condições

anaeróbicas, a limitação ocorre nas duas primeiras enzimas do metabolismo,

xilose redutase e xilitol desidrogenase (ALEXANDER et ai., 1988; KILIAN e van

Uma vez dentro da célula, a xilose é reduzida a xilitol pela enzima xilose

redutase (EC 1.1.1.21) com a participação das coenzimas NADPH ou NADH. A

seguir, o xilitol é secretado para fora da célula ou oxidado a xilulose pela

enzima xilitol desidrogenase (EC1 .1.1.9), com participação de NAD+

(SLININGER et ai., 1987). A xilulose é fosforilada a xilulose 5-fosfato, a qual

pode ser convertida em piruvato através do complexo enzimático transcetolase-transaldolase, que faz a conexão entre via das fosfopentoses e

via EMP (WEBB e LEE, 1992; NOLLEAU et ai., 1993). A Figura 2 apresenta

um esquema do metabolismo inicial da xilose em leveduras.

Xi1ose Xilitol Xilwoa

deridro .

Xiloze (\ >~1 0;Xilclo,e

R

•

ntlo~=w,:::w;;:;..e----

""

NADPH NADP+ lf

1

+ NADH2 A

t

ADP Via El,&>

\ \,.

• .. _ '-

02 ~ CADEIARESPIP-P.TéRIA ---t H20

Figura 2- Esquema dos passos iniciais da utilização de 0-xilose por leveduras. As enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase diferem na

especificidade pelas coenzimas NADPH, NADH, NAD+ e NADP+ (HORITSU et

ai., 1992; NOLLEAU et ai., 1993). Em Candida utilis, Debaryomyces hansenii e

Candida tropicalis, a enzima xilose redutase requer apenas NADPH como

coenzima, enquanto a xilitol desidrogenase requer apenas NAD+ (SKOOG e

HAHN-HAGERDAL, 1988; ROSEIRO et ai., 1991; HORITSU et ai., 1992).

NOLLEAU et ai. (1993) constataram baixos níveis de atividade de xilose redutase dependente de NADH nas leveduras Candída guílliermondii e

Candida parapsilosis. Resultados semelhantes foram encontrados por SILVA et

ai. (1996c) para a levedura Candida guilliermondii. Em estudos realizados com

as leveduras Candida shehatae e Píchia stipitis, a xilose redutase mostrou ser

dependente tanto de NADPH quanto de NADH (BRUINEMBERG et ai., 1984).

de NADH, a oxidação de xilitol em xilulose é o passo limitante da velocidade

do metabolismo da xilose, exercendo a atividade da enzima xilitol

desidrogenase papel relevante no acúmulo de xilitol (PARAJÓ et ai., 1998a).

Segundo Jeffries (1982), citado por GONG et ai. (1983), o metabolismo

de xilose ocorre em um ciclo fechado, o que garante a regeneração do NADPH

necessário para a redução de xilose em xilitol, já que o xilitol produzido é

eventualmente catabolisado, produzindo glicose 6-fosfato, a qual é metabolizada pela via das fosfopentoses regenerando este cofator e mantendo

o ciclo. De acordo com BARBOSA et ai. (1988), durante o metabolismo de

xilose em leveduras ocorre a oxidação completa de 1 mol de glicose 6-fosfato

a C02 pela via das fosfopentoses, gerando 12 moles de NADPH a partir de

NADP+. Estes autores propõem um rendimento teórico de 0,9 mal de xilitol

para cada mal de D-xilose utilizado, levando em consideração a seguinte

equação geral da bioconversão:

60 Xilose + 12 ADP + 12 Pi+ 12 H20 + 3 02 ~ 54 Xilitol + 12 ATP + 30 C02

Entretanto, de acordo com SLININGER et ai. (1987), o metabolismo de

xilose em leveduras gera vários produtos, como dióxido de carbono, etanol,

ácido acético e polissacarídeos. Os fatores de rendimento em produto são

dependentes da regulação do fluxo de carbono através das rotas metabólicas disponíveis. Segundo WINKELHAUSEN e KUZMANOVA (1998), a conversão de xilose em xilitol não pode ser separada da conversão de xilose nos

produtos acima mencionados. O processo de formação de xilitol não pode ser

interrompido após o primeiro passo, quando a xilose é convertida em xilitol. O

crescimento celular depende de alguns produtos metabólicos, sendo também

necessário que os cofatores sejam regenerados através de diferentes passos na via metabólica. Desta forma, para a obtenção de bons rendimentos em xilitol, a quantidade de xilose que é convertida em xilitol e a quantidade de

xilitol que é disponibilizada para o metabolismo devem ser bem balanceadas.

Schneider et ai. (1985), citados por PARAJÓ et ai. (1998a), correlacionaram a

formação de xilitol com o decréscimo da concentração de oxigênio dissolvido e da velocidade de duplicação celular.

O esquema proposto por HAHN-HAGERDAL et ai. (1994), demonstrado pela Figura 3, representa a principal via metabólica envolvida na fermentação

de xilose por leveduras.

De acordo com MEYRIAL et ai. ( 1991 ) , a levedura Candida guilliermondii

apresenta alto potencial para ser empregada na produção de xilitol à partir de

materiais ricos em xilose, uma vez que a especificidade de redução da D-

xilose é alta, apresenta altos rendimentos e taxas de produção de xilitol, produz etanol em quantidades negligíveis e a excreção extra-celular de xilitol

ocorre rapidamente. Recentemente, o gene que codifica a síntese da enzima

xilose redutase nesta levedura foi isolado, clonado e expressado em Pichia pastoris, uma levedura metilotrófica adequada para emprego em processos fermentativos a nível industrial (HANDUMRONGKUL et ai., 1998).

Uma linhagem desta espécie, Candida guilliermondii FTI 20037,

previamente selecionada nos laboratórios do Grupo de Processos Fermentativos do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química de Lorena por BARBOSA et ai. (1988), tem se mostrado um biocatalisador promissor para ser empregado na conversão de xilose em xilitol

tanto em meio sintético (SILVA et ai., 1996a), quanto em hidrolisados de

materiais lignocelulósicos (FELIPE et ai., 1996a; ROBERTO et ai., 1996;

Y..ilose Glicose

Membrana Citoplasmática

Xilose Glicose

NADPH-+-- NADH ~ ATP

NADP+ V~ NAD+ Ni,.DPH Ni,.DP+ ~ ADP

Xilitol ~ Glicose-6P

/::: coa

6-Fo,:1,;';;;,ato

I

Xilulose ~ ~ADPH ~rutose-6P

:::::i

/llibul\ose_SP -···

t: ::

_ / . Frutose-1,6PP

x.Iulose-5P~( ~

Sedoheptulose-7P .,-· · Gliceraldeido-Sf . Dihidroxiacetona-P

"---

_A--"

ADP

:i:-

NAD+ t: NADH

.

~

i

~..

ATP ~NADH NAD

Entrose-4P .. -·· Frutose-6P +

- Piruvato Glicero1_3P

N'AD+~ t:ADP

~ _{_ .. -· ~ .. ··· NADH ·} '· _"-. C02 _ATP

Frutose-6P Gliceraldeíd(o-3P Acetil-CoA ~co2A~;taldeido Glicerol

~~:::~

_Acetato NADH NAD+ Etanol

\

\, <, fADH f-.,. ·, FAD O E GTP~ KREBS GDP+Pi

J

FADH FAD NADH NAD+ C02

DE ELÉTRONS SISTEMA DE TRANSPORTE

~

ADP+Pi ATP

Figura 3 - Via metabólica utilizada na fermentação de 0-xilose por leveduras.

2.2.1.2.1 PRINCIPAIS FATORES QUE INTERFEREM NA BIOCONVERSÃO

A bioconversão de xilose em xilitol é sensível à diversas condições

ambientais, como nutrição, temperatura, pH, concentração de inóculo,

1998). Além da forma de condução do processo, os principais fatores que interferem na bioconversão de xilose em xilitol em meios constituídos por

hidrolisados de materiais lignocelulósicos são: concentração inicial de xilose,

fornecimento de oxigênio e presença de compostos inibidores no meio de fermentação.

2.2.1.2.1.1 CONCENTRAÇÃO INICIAL DE XILOSE

A concentração inicial de xilose no meio de fermentação exerce grande influência na produção de xilitol. De uma maneira geral, pode-se dizer que a elevação da concentração inicial de xilose promove o seu rápido consumo e

intensifica a produção de xilitol, resultando em maiores eficiência e

produtividade volumétrica (SILVA e AFSCHAR, 1994; PARAJÓ et ai., 1998b).

Entretanto, o aumento excessivo da concentração de xilose acarreta um decréscimo nas taxas de crescimento do microrganismo, com consequente

queda das taxas de produção de xilitol (NOLLEAU et ai., 1993; SILVA e

AFSCHAR, 1994; PARAJÓ et ai., 1998b). Dependendo da espécie da levedura

e das condições operacionais, a inibição ocorre geralmente entre 150 e 200

g/L de xilose (PARAJÓ et ai., 1998b).

Segundo GONG et ai. (1981 ), a produção de xilitol por Candida tropicalis foi favorecida quando aumentou-se a concentração de xilose de 50 para 200 g/L. Entretanto, em concentrações de xilose superiores a 300 g/L

verificou-se interferência negativa na produção de xilitol, fato também

verificado por OJAMO

et

ai. (1988). VANDESKA

et

ai. (1995) constataram que

a produção de xilitol por Candida boidinii aumentou significativamente quando a concentração inicial de xilose foi aumentada de 20 para 150 g/L. Entretanto, concentrações iniciais de xilose de 200 g/L determinaram decréscimo na produção de xilitol.

As interferências negativas na produção de xilitol, determinadas pelas

maiores concentrações de xilose, podem ser explicadas em função da pressão osmótica elevada e da repressão de enzimas que participam do metabolismo

reduzidas ou mesmo eliminadas alterando-se a condução do processo para

descontínuo alimentado (OJAMO et ai., 1988).

Deve-se observar que, quando os meios de fermentação são

elaborados com hidrolisados lignocelulósicos, existem também efeitos

adicionais relativos à concentração do substrato que devem ser levados em

consideração. Se a concentração de xilose é elevada por evaporação, ocorre

também um aumento simultâneo na concentração de outros compostos não-

voláteis, alguns deles causando inibição do metabolismo microbiano com

consequente efeito negativo na produção de xilitol (PARAJÓ et ai., 1998b). O

efeito combinado das concentrações de xilose e inibidores é o determinante do fator de concentração do hidrolisado adequado para a produção de xilitol

(PARAJÓ et ai., 1998c).

2.2.1.2.1.2 FORNECIMENTO DE OXIGÊNIO

Dentre os fatores que influenciam a bioconversão de xilose em xilitol, o

fornecimento de oxigênio ao meio é o mais importante, uma vez que a sua

variação acima ou abaixo de um valor ótimo leva à uma diminuição

significativa do rendimento e/ou da produtividade em xilitol (JEFFRIES, 1983;

SKOOG e HAHN-HAGERDAL, 1988; LIGHTELM et ai., 1988b; SILVA et ai.,

1996b; SILVA et ai., 1997a).

De acordo com DELGENES et a/.(1989), o fator de rendimento em xilitol

depende da velocidade de transferência de oxigênio, estando esta influência

relacionada com a regeneração de coenzimas e com a produção de ATP

durante a fosforilação oxidativa (JEFFRIES, 1983; NOLLEAU et ai., 1993). Em

condições aeróbias ocorre maior produção de massa celular, enquanto que em

condições limitadas de oxigênio uma grande parte da xilose é convertida em

xilitol (LIGHTELM et ai., 1988b; GROOT JEN et ai., 1991 ). Um rigoroso controle

da disponilidade de oxigênio é fundamental para se obter elevada eficiência

fermentativa, evitando-se o desvio do metabolismo para a formação de células.

Por outro lado, a falta deste nutriente proporciona um desbalanço no potencial

assimilação de xilose e consequentemente da formação de xilitol

(SCHNEIDER, 1989; NOLLEAU et ai., 1995, VANDESKA et ai., 1995).

O suprimento limitado de oxigênio favorece a produção de xilitol devido ao desbalanço entre as concentrações de NAD+ e NADH (BRUINENBERG et

ai., 1984 ). À taxas específicas de fornecimento de oxigênio decrescentes, o

sistema de transporte de elétrons não é capaz de reoxidar todo o NADH2

produzido. Como consequência, o nível de NADH2 intracelular aumenta,

reduzindo a velocidade de reação da enzima xilitol desidrogenase e

determinando acúmulo de xilitol no meio de cultivo (RIZZI et ai., 1989a;

1989b).

KIM et ai. (1997), utilizando células de Candida parapsilosis, verificaram

que o aumento do Kt.a de 20 h-1 para 85 h-1 propiciou aumento no crescimento

celular. A máxima produção de xilitol (35,8 g/L) foi obtida em Kt.a de 30 h-1. Por

outro lado, a máxima produtividade (0,667 g/Lh) foi obtida em KLa de 45

n".

Na

faixa de valores de Kt.a compreendidos entre 45 e 85 h-1, o fluxo de xilose foi

desviado da produção de xilitol para o crescimento celular. SILVA et ai. (1997a) verificaram que a máxima produção e a máxima produtividade

volumétrica em xilitol (41,76 g/L e 0,87 g/Lh, respectivamente) foram obtidas

em fermentações do hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar por Candida

guilliermondii em Kt.a de 27

h'

e agitação de 400 rpm. Entretanto, em valores

de Kt.a e agitação iguais a 18 h-1 e 300 rpm, respectivamente, foram verificados

valores similares de concentração final e fator de rendimento em xilitol.

Na literatura, condições microaeróbicas para trabalhos em frascos Erlenmeyer incluem relações entre volume de meio e volume de frasco na

faixa de 0, 16 a 0,8 e velocidades de agitação na faixa de 100 a 250 rpm

(PARAJÓ et ai., 1997).

De uma forma geral, pode-se dizer que a velocidade de transferência de

oxigênio é um parâmetro que determina se a xilose será fermentada ou

respirada. Desta forma, para um processo eficiente, é extremamente

importante determinar o fluxo de oxigênio que permite a utilização balanceada do carbono para crescimento e produção de xilitol (WINKELHAUSEN e

Salienta-se que os efeitos da concentração de oxigênio dissolvido e da

concentração inicial de xilose estão intimamentes relacionados, sendo estes

dois parâmetros pontos críticos na bioconversão xilose-xilitol. Desta forma,

estudos que levem em consideração os efeitos combinados destes fatores são indicados para a determinação das influências reais na produção de xilitol

(PARAJÓ et ai,. 1998a; WINKELHAUSEN e KUZMANOVA 1998).

2.2.1.2.1.3 INIBIDORES DO METABOLISMO CELULAR

Os hidrolisados hemicelulósicos de materiais lignocelulósicos, obtidos por meio de hidrólise ácida, contêm substâncias inibitórias do metabolismo

microbiano (FERRARI et ai., 1992; KUHAD e SINGH, 1993), as quais

constituem o principal problema relativo ao uso destes materiais como meio de fermentação (FELIPE et ai., 1997b). Estes inibidores podem limitar o consumo

do substrato, prejudicar o crescimento celular e a formação de produtos, e até

mesmo interromper o processo fermentativo. (PARAJÓ et ai., 1998c).

Dentre estes compostos estão aqueles oriundos da degradação de

açúcares, como furfural e hidróxi-metil-furfural (JEFFRIES e STREENATH,

1988; FERRARI et ai., 1992), ácido acético (van ZYL et ai., 1991; MEYER et

ai., 1992a e b), compostos fenólicos derivados da lignina, tais como

seringaldeído e vanilina (LADISCH et ai., 1983), íons contidos nos materiais

lignocelulósicos ou resultantes da corrosão do equipamento de hidrólise

(PARAJÓ et ai., 1998c), além de extrativos como resinas ácidas, taninos e

terpenos (LEE e McCASKEI, 1983; TRAN e CHAMBERS, 1985; FERRARI et

ai., 1992).

A máxima concentração de cada inibidor permitida no meio de

fermentação, de modo a não interferir no processo fermentativo, não pode ser

estabelecida de forma geral, uma vez que é dependente de fatores como

espécie e grau de adaptação do microrganismo utilizado, processo fermentativo empregado e presença simultânea de outros inibidores (PARAJÓ

et et., 1998c). Entretanto, o grau de inibição depende fortemente da natureza e

concentração dos inibidores, assim como da natureza do microrganismo

O ácido acético é o inibidor mais estudado. O efeito inibitório deste composto sempre presente em hidrolisados hemicelulósicos é dependente do

grau de dissociação, que por sua vez é função do pH do meio de fermentação

(PARAJÓ et ai., 1998c; WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998). Em valores

de pH inferiores a 4,75 este composto encontra-se principalmente na sua

forma não dissociada (van ZYL et ai., 1991 ). Nesta forma, o ácido acético

atravessa a membrana celular e dissocia-se no citoplasma, determinando decréscimo no pH intracelular para valores inferiores aos limites fisiológicos

(HERRERO et ai., 1985; van ZYL et el., 1991; LOHMEIER-VOGEL et ai.,

1998). De acordo com LOHMEIER-VOGEL et ai. (1998), o mecanismo pelo

qual o acetato afeta a homeostase intracelular relativa ao pH ainda não é conhecido. Estes autores sugerem ainda que o acetato poderia exercer ações

sobre a enzima ATPase da membrana plasmática, responsável pela

manutenção do pH intracelular em leveduras.

Em estudos conduzidos com a levedura Candida guilliermondii em meio

contendo xilose comercial, SILVA (1994) verificou que a faixa ótima de pH para

a bioconversão de xilose em xilitol foi entre 4,0 e 5,0. Entretanto, em estudos

conduzidos com a mesma levedura em hidrolisado hemicelulósico de bagaço

de cana-de-açúcar, FELIPE et ai. (1997a) constataram a inibição do consumo

de açúcares e da produção de xilitol em valores de pH inferiores a 4,5. Este contraste foi atribuído à presença do ácido acético no meio constituído por

hidrolisado. FERRARI et ai. (1992), utilizando hidrolisado de eucalipto com

concentração de ácido acético em torno de 1 O g/L, não verificaram produção

de xilitol e consumo de ácido acético em pH 5,0. Entretanto, o aumento do pH

para 5,5 ou 6,5 resultou em produção de xilitol e consumo de ácido acético.

Por outro lado, FELIPE et ai. (1995) verificaram que pequenas quantidades de

ácido acético favorecem a formação de xilitol, uma vez que na presença de

1, O g/L deste composto a concentração de xilitol obtida foi superior à detectada

em meios de fermentação ausentes deste ácido. Este comportamento sugere a

estimulação da conversão de xilose à xilitol por Candida guilliermondii na

presença de baixas concentrações de ácido acético, fato anteriormente observado por LEE e McCASKEI (1983) durante fermentações conduzidas com

Dados relacionados ao efeito do ácido acético na bioconversão de xilose em xilitol sugerem que o efeito inibitório deste composto depende também da composição e origem do meio de fermentação (FELIPE et ai.,

1997a), bem como da taxa de aeração. Em condições de maior aeração o

ácido acético é consumido mais rapidamente (van ZYL et ai., 1991; PARAJÓ et

ai., 1997).

De acordo com SANCHEZ e BAUTISTA (1988), o efeito inibitório do furfural e do hidróxi-metil-furfural sobre a atividade metabólica dos microrganismos parece estar relacionado com a inibição de enzimas-chave da

via glicolítica, como triase-fosfato desidrogenase e álcool desidrogenase.

Entretanto, de acordo com LOHMEIER-VOGEL et ai. (1998), o modo preciso

de ação destes compostos ainda não é completamente entendido, sendo a de-

energização celular um dos possíveis mecanismos envolvidos na ação

inibitória.

Face aos problemas que ocasionam, os compostos que inibem o

metabolismo microbiano devem ser removidos do meio ou terem suas concentrações reduzidas para que o hidrolisado possa ser utilizado em

processos de bioconversão (JEFFRIES e STREENATH, 1988; van ZYL et ai.,

1988), uma vez que a interferência na atividade microbiológica leva a uma

queda nas taxas de conversão dos açúcares presentes. Desta forma,

diferentes tratamentos do hidrolisado têm sido utilizados: evaporação

(MARCHAL et ai., 1986}, extração com álcalis (PARAJÓ et ai., 1996a),

tratamento com carvão ativo e resinas trocadoras de íons (van ZYL et ai.,

1991; DOMÍNGUEZ et ai., 1996; PARAJÓ et ai., 1996c), alteração do pH pela

adição de ácidos e bases (ROBERTO et ai., 1991; ALVES et ai., 1998) e

tratamento com sais de alumínio (RAMOS, 1996).

A adaptação do microrganismo ao hidrolisado (CHEN e GONG, 1985;

AMARTEY e JEFFRIES, 1996; FELIPE et ai., 1996b; SENE et ai., 1998), o

reciclo de células (PARAJÓ et ai., 1995; SENE et ai., 1998) e a utilização de

inóculos com elevada densidade celular (ROBERTO et ai., 1996; PARAJÓ et

ai., 1996b; FELIPE et ai., 1996a; FELIPE et ai., 1997b) são também

procedimentos que buscam contornar o efeito tóxico do hidrolisado sobre a