AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS NA INFECÇÃO AGUDA E CRÔNICA DE CAMUNDONGOS INFECTADOS PELO

(1)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NUCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS NA

INFECÇÃO AGUDA E CRÔNICA DE CAMUNDONGOS

INFECTADOS PELO

Trypanosoma cruzi E SUBMETIDOS

A DIETA HIPERLIPÍDICA

Vívian Paulino Figueiredo

(2)

II

VÍVIAN PAULINO FIGUEIREDO

AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS NA

INFECÇÃO AGUDA E CRÔNICA DE CAMUNDONGOS

INFECTADOS PELO

Trypanosoma cruzi E SUBMETIDOS

A DIETA HIPERLIPÍDICA

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração imunobiologia de protozoários.

Orientador: Prof. André Talvani

(3)

(4)

(5)

V

“Lembremo-nos de que o homem interior se renova sempre. A luta enriquece-o de experiência, a dor aprimora-lhe as emoções e o sacrifício tempera-lhe o caráter. O Espírito encarnado sofre constantes transformações por fora, a fim de acrisolar-se e engrandecer-se por dentro.”

(6)

VI

Dedico este trabalho a minha mãe, meus irmãos,

(7)

VII

Agradecimento Especial

Ao professor André Talvani, que muito mais que orientador é um grande amigo. Agradeço por acreditar em mim, por me dar a oportunidade de fazer pesquisa, pelo respeito, confiança, ensinamentos recebidos e todos os desafios a mim propostos em todos esses anos de convívio. Reconheço seu profissionalismo e exemplo a ser seguido, assim como o seu imenso dom em ensinar. Meu imenso respeito e admiração!

Ao professor Richard Schulz pela orientação no doutorado sanduiche e todos os pesquisadores do Laboratory of Pharmacology por me receberem no Canadá, pela colaboração neste trabalho

(8)

VIII

Agradecimentos

Agradeço a Deus por estar ao meu lado.

Á minha mãe Altair, pela compreensão, pelo amor, doação e sensibilidade. Aos meus irmãos Anderson, Leiliane e Alessandro, pela amizade e apoio. Sem vocês eu não teria conseguido, amo muito todos vocês!

A professora Paula Mello pelos ensinamentos e colaboração neste trabalho.

As minhas amigas e amigos do laboratório de doença de Chagas, Patologia, em especial Aline Horta, Ana Luiza, Kelerson, Laís, Guilherme, Gleisiane pela amizade, ajuda, apoio e bons momentos!

A Aline Horta, Evandro, Ayla, Júlia, Daiane, Sílvia, Ayla e Carolina Nogueira pela amizade e colaboração no trabalho.

A todos os amigos que fiz no Canadá, em especial Carolina Morais, Anny Graycy e Giulia Sterchelle pelo carinho, conforto e proteção nos momentos bons e ruins.

Aos meus amigos de Ouro Preto, em especial, Victor Almeida, Kíssila, Mariana, Éder Firmino e Victor Fernandes pela companhia e amizade.

(9)

IX À professora Daniela Caldeira Costa e todos do LBM, em especial Pedro e Rafaela pela ajuda e por disponibilizar reagentes e equipamentos quando necessários.

Aos demais laboratórios do Nupeb por disponibilizar reagentes e equipamentos quando necessários.

Aos amigos de Ouro Branco, muitas saudades.

Ao Ailton pelo carinho e apoio.

A FAPEMIG, CAPES, CNPq e UFOP pelo auxílio financeiro a este trabalho.

(10)

X Resumo

O estado nutricional vem se destacando nas interações entre agentes infecciosos e a resposta imunofisiológica de seus hospedeiros apresentando-se diretamente ligado à qualidade da dieta na qual o indivíduo é submetido. Como exemplo, uma dieta rica em lipídeos pode desencadear alterações metabólicas e cardiovasculares. Na linha das alterações cardiovasculares, a infecção pelo protozoário Trypanosoma cruzi aparece como uma condição

predisponente, ao lado da resposta imune do hospedeiro infectado. Assim, este estudo objetiva avaliar a interferência da dieta hiperlipídica (DH) no processo inflamatório agudo e crônico da infecção experimental pelo T. cruzi. Para tanto, foram utilizados camundongos machos da

linhagem C57BL/6 divididos em 4 grupos: (i) dieta convencional, (ii) dieta convenciona l infectado com a cepa VL-10 do T. cruzi, (iii) DH e (iv) DH infectado com o T. cruzi. Os anima is

(11)

XI Abstract

The quality of the diet defines the nutritional and immunophysiological status in the human population. The dissemination of a high fat (HF) diet enhances the metabolic and cardiovascular disturbances. Infectious disease, such as the Trypanosoma cruzi infection, is

another predisposed condition to development of cardiovascular disturbances, in particular, conducted by the host immune response. In this present study the interference of a (HF) diet on the immune response and the metalloproteinase (MMP) activities was investigated during the acute and chronic infection with the VL-10 strain of T. cruzi. Thereby, C57BL/6 male mice were grouped (n=10) in (i) under regular diet (RD); (ii) under RD + T. cruzi; (iii) under HF and

(12)

XII Lista de figuras

Figura 1 - Representação esquemática das alterações induzidas no tecido adiposo pelo quadro

de obesidade ...14

Figura 2 - Efeitos da leptina no sistema imune e na inflamação ...15

Figura 3 - Delineamento experimental ...21

Figura 4 - Massa corporal ... 28

Figura 5 - Índice de Lee ...29

Figura 6 - Ingestão alimentar ...30

Figura 7 - Curva de parasitemia ...31

Figura 8 - Taxa de sobrevivência ...32

Figura 9 - Teste de tolerância oral a glicose (TTG) ... 33

Figura 10 - Teste de tolerância a insulina (TTI) ...34

Figura 11 - Colesterol total, HDL e triglicerídeos ...36

Figura 12 - Avaliações de lipídeos totais hepáticos ...37

Figura 13 - Síntese de TNF, IL-10 e Leptina plasmáticos ... 38

Figura 14 - Síntese de CCL2 e CCL5 plasmáticos ... 39

Figura 15 - Análise histológica do coração nas fases aguda e crônica ... 41

Figura 16 - Análise morfométrica da celularidade cardíaca ... 42

Figura 17 - Análise histológica do fígado coração nas fases aguda e crônica ... 43

(13)

XIII Figura 19 - Atividade de Metalloproteinase-2 (MMP2) e -9 (MMP9) no tecido cardíaco durante as fases aguda e crônica da infecção pelo T. cruzi. ... 46 Figura 20 - Atividade de Metalloproteinase-2 (MMP2) e -9 (MMP9) no tecido hepático durante as fases aguda e crônica da infecção pelo T. cruzi. ... 47 Figura 21 - Avaliação da expressão proteica de MMP-2 ... 48

Lista de quadros

(14)

XIV Lista de siglas e abreviaturas

BSA - albumina de soro bovino CD25 - cluster de diferenciação 25 CD71 - cluster de diferenciação 71 Células NK - célula natural killer

DC’s - células dendríticas

DCV - doenças cardiovasculares DH - dieta hiperlipídica

ECM - Matriz extracelular

GAPDH - proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase JNK - proteína Janus kinase

IFN-y - interferon gama

IKK - proteína quinase do inibidor do fator de transcrição NF-κB

IL-1β - interleucina 1 beta IL-4 - interleucina 4 IL-6 - interleucina 6 IL-10 - interleucina 10

IMC- índice de massa corporal IRS - substrato do receptor de insulina LDLr - receptor de lipoproteína NFkB - fator nuclear kB

MCP-1(CCL2) - proteína quimiotática de monócitos-1 MMP - matriz de metaloproteinase

MyD88 - fator 88 de diferenciação mielóide PCR - proteína C reativa

PPAR-g - receptor ativado por proliferadores de peroxissoma PDH - piruvato desidrogenase

PDK4 - Piruvato desidrogenase quinase 4

RANTES (CCL5) - regulada pela ativação de célula T normal expressa e secretada

RIPA - ensaio de imunoprecipitação

(15)

XV T CD4+ _{- linfócito T auxiliar 4}

T CD8+ _{- linfócito T auxiliar 8}

TIMP - inibidor tecidual de metaloproteinase TG - triglicerídeos

TLR - receptores do tipo Toll

TNF- fator de necrose tumoral T reg - célula T reguladora

TTG - teste de tolerância oral a glicose TTI - teste de tolerância a insulina

(16)

XVI Sumário

1- Introdução... 8

1.1 - O Trypanosoma cruzi e as interações lipídicas ... 8

1.2 - Imunopatogênese na infecção pelo Trypanosoma cruzi ... 9

1.3 - Metaloproteinases de Matriz... 10

1.4 - A dieta hiperlipídica ... 11

1.5 - Citocinas secretadas pelo tecido adiposo... 14

2 - Justificativa... 18

3 – Objetivos ... 19

3.1 – Objetivo geral... 19

3.2 – Objetivos específicos ... 19

4 – Material e métodos ... 20

4.1 – Animais e cepa do T. cruzi... 20

4.2 - Delineamento experimental ... 20

4.3 - Dietas e controle do peso ... 21

4.4 - Parâmetros fisiológicos e bioquímicos ... 22

4.4.1 - Cálculo do Índice de Lee ... 22

4.4.2 - Teste de tolerância a glicose ... 22

4.4.3 - Teste de tolerância a insulina... 23

4.4.4 - Avaliação de Colesterol total, suas frações e lipídeos totais ... 23

4.5 - Sorologia convencional ... 23

4.6 - Histologia... 24

4.7 - Zimografia e Western blotting ... 25

4.7.1 - Preparo do homogenato dos tecidos ... 25

4.7.2 – SDS-PAGE e Westernblotting ... 25

4.7.4 - Densitometria de bandas... 27

4.8 - Análise estatística ... 27

5 - Resultados ... 28

6 – Discussão ... 50

7 – Conclusão ... 56

8 – Referências bibliográficas ... 57

(17)

8 1- Introdução

1.1 - O Trypanosoma cruzi e as interações lipídicas

O Trypanosomacruzi, descrito por Carlos Chagas em 1909, é um protozoário flage lado

digenético pertencente à ordem kinetoplastida que apresenta, durante seu ciclo evolutivo, as formas evolutivas amastigota, epimastigota, esferomastigotas e tripomastigotas (BRENER, 1979). Este parasito possui cinetoplasto volumoso terminal ou subterminal, podendo apresentar formas predominantemente delgadas, largas ou extremamente largas (BRENER, CHIARI, 1963; BRENER, 1979). A interiorização do T. cruzi na célula se dá por meio de fagocitose

induzida, fenômeno no qual atuam tanto parasitos quanto células do hospedeiro vertebrado. Nesta etapa, ocorre a ingestão do parasita por macrófagos ou por outras células que passa a se alojar na matriz citoplasmática após escapar do vacúolo fagocitário formado, onde inicia a sua reprodução (BRENER, 1979).

Um grande número de mamíferos pode ser infectado pelo T. cruzi, incluindo o homem,

no qual pode ocasionar a doença de Chagas com suas diferentes manifestações clínicas. Esta doença acomete aproximadamente 6 a 7 milhões de pessoas, sendo grande maioria na América Latina (WHO, 2016). O curso da infecção é extremamente variável nos hospedeiros vertebrados susceptíveis, sendo influenciado pelas características da população dos parasitas e comportamento do hospedeiro (ANDRADE et al. 2011; HENRIQUES et al. 2014). Após o período pré-patente caracterizado pelo baixo parasitismo inicial, onde o parasita se reproduz exponencialmente, se dá a infecção patente marcada pela visibilidade dos parasitos ao exame de sangue a fresco. Na fase aguda, o parasitismo possui intensidade e duração variáveis e decresce como resultado da resposta imune específica do hospedeiro, tornando-se subpatente enquanto se instala neste hospedeiro a fase crônica da infecção. Aspectos como tropismo celular, parasitemia, capacidade de produzir lesões, mortalidade, dentre outros, são muito peculiares às diferentes populações genéticas do parasito sendo, portanto, muito importantes no decorrer da infecção (BRENER, 1979; ZINGALES et al. 2009).

O T. cruzi esta adaptado a diferentes ambientes e estudos tem demonstrado que o T. cruzi tem alta afinidade por lipoproteínas e induz alterações no perfil lipídico em seus

(18)

9 Em nivel celular, a taxa de oxidação dos ácidos graxos na mitocôndria é controlada pelo fluxo de glicose através da via glicolítica e pela taxa de conversão do piruvato em acetilcoenzima-A pela ação da piruvato desidrogenase (PDH). A infecção das células cardíacas pelo T. cruzi desencadeia uma supra-regulação precoce de genes da β-oxidação de ácidos graxos

seguido por regulação negativa do complexo PDH (GARG et al. 2004).

Adicionalmente, moléculas de superfície como receptor de lipoproteína (LDLr) encontram-se envolvidas na invasão pelo T. cruzi e na subsequente fusão do vacúolo

parasitóforo com lisossomos das células do hospedeiro. Sua ligação a esse receptor facilita a entrada do parasito na célula hospedeira o que sugere que esse receptor e sua acumulação no coração pode alterar a homeostase lipídica contribuindo para a patogêneses na infecção pelo T. cruzi (NAGAIYOTHI et al. 2011).

1.2 - Imunopatogênese na infecção pelo Trypanosoma cruzi

A resposta básica do hospedeiro mamífero frente à invasão do T. cruzi apresenta

natureza inflamatória. Nas infecções de fase aguda, há infiltrados focais exsudativos ao redor de células parasitadas e um componente difuso, mononuclear, em torno de intensa dilatação vascular, congestão e edema. Com a intensificação do processo inflamatório, pode ocorrer processos degenerativos acarretando em alteração estrutural ou mesmo perda funcional do órgão (ANDRADE, ANDRADE, 1979). Em órgãos como o fígado e o baço, que são ricos em células fagocíticas, a presença de parasitos pode estimular um acúmulo difuso e focal destas células, com obliteração de sinusóides, necrose, esteatose e ascite (DIAS, 1997). A inflamação de fase aguda não tem potencial fibrosante, ao contrário do que ocorre na fase crônica, onde se observa infiltrado inflamatório com a presença de células polimorfonucleares e variável número de macrófagos e plasmócitos.

A inespecífica imunossupressão que ocorre durante o primeiro estágio da infecção e a capacidade do T. cruzi de adaptar e evadir da resposta imune, o permite a invasão de células e

(19)

10 Entretanto, seus efeitos alteram a integridade do tecido podendo elevar a resposta inflamatória o que leva a uma piora do fenótipo da doença (TALVANI & TEIXEIRA 2011).O equilíb rio entre citocinas pro-inflamatórias e regulatórias tem sido sugerido como crítico no desenvolvimento da fase crônica da infecção. O IFN-γ e o TNF são importantes citocinas neste contexto pois regulam respostas pro-inflamatórias, sendo críticos para a resposta inata e adaptativa na infecção pelo T. cruzi (ROMANHA et al. 2002, PINAZO et al. 2015). A ativação

de células NK, macrófagos e linfócitos leva a decorrente produção de citocinas pro-inflamatórias e regulatórias como IL-10 e IL-4 para reduzir os perigosos efeitos associados ao excesso de estimulação do sistema imune (BASSO, 2013).

Apesar da transmissão da doença de Chagas ter diminuído em razão das campanhas de saúde pública para erradicação do vetor e do melhor controle de qualidade das transfusões de sangue e derivados, hoje, a questão prioritária está voltada para o contingente de pessoas já infectadas pelo T. cruzi, considerando-se que uma parcela irá desenvolver a cardiopatia

chagásica crônica, forma clínica mais frequente e de maior gravidade (COURA, 2007; MEDEI, 2008).

A cardiopatia chagásica caracteriza-se por intensa miocardite de natureza inflamatória, com um processo de fibrose progressiva que afeta as células dos átrios e ventrículos em consequência do depósito de colágeno intersticial, alterações na matriz extracelular (ECM) e ao remodelamento do órgão (ROCHA, 2007). Contudo, o remodelamento da ECM é regulada por enzimas proteolíticas, tais como as metaloproteinases de matriz (MMPs).

1.3 - Metaloproteinases de Matriz

As MMPs são importantes enzimas que participam de várias condições fisiológicas e patológicas, degradando as moléculas da matriz extracelular (ECM), por exemplo, o colágeno, a laminina e a fibronectina (GEURTS et al. 2012).

(20)

11 e fibrose. Por isso, os inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) participam controlando a atividade das MMPs (MURPHY, NEGASE, 2008).

Entre as MMPs, a MMP-2 e MMP-9 são bem descritas em seu envolvimento na patogênese de muitas doenças cardiovasculares (VANHOUTTE et al. 2006; POLYAKOVA et al. 2010; FARES et al. 2013) por serem capazes de degradar todos os componentes da matriz do coração contribuindo para o remodelamento da ECM que ocorre na dilatação ventricular progressiva (POLYAKOVA et al. 2010). A participação de MMP-2 e MMP-9 foi, previame nte, estudada na infecção experimental pelo T. cruzi mostrando que a inibição das mesmas reduzia

a inflamação e melhorava o prognóstico dos animais infectados (GUTIERREZ et al. 2008). No entanto as metaloproteinases têm um amplo espectro de funções biológicas e podem agir em várias outras biomoléculas, incluindo hormônios influenciando, inclusive a resposta imune (GEURTS et al. 2012).

Múltiplos fatores parecem contribuir para os eventos cardiovasculares na infecção pelo

T. cruzi, sendo a resposta imune do hospedeiro essencial para definir o prognóstico clínico tanto

em humanos quanto em modelo experimental. Em particular, a produção de citocinas e quimiocinas inflamatórias tem apresentado extrema relevância na alteração da homeostasia e no recrutamento leucocitário, ambos essenciais para a imunopatogênese da doença (TALVANI, 2000, 2011). Atualmente sabe-se que a imunopatologia associada à infecção pelo T. cruzi possui

íntima relação com o estado nutricional do hospedeiro (MALAFAIA, TALVANI, 2011; SANTOS et al. 2013).

1.4 - A dieta hiperlipídica

(21)

12 O ganho de peso e a adiposidade podem ser, frequentemente, atribuídos ao excessivo e inadequado consumo de dietas ricas em gorduras (MELHORN et al. 2010). A composição da dieta influencia a ingestão de energia e mudanças de peso em roedores, e neste contexto tanto a quantidade de energia quanto a composição de micronutrientes estão envolvidos nos riscos a saúde e acumulação de gordura corporal (PETZKE et al. 2007; LOMBA et al. 2010).

Os mecanismos envolvidos nas alterações imunes observadas em camundongos submetidos a DH ainda são, em parte, desconhecidos. Entretanto, uma inadequada resposta celular já tem sido observada, incluindo reduzida atividade de células NK, diminuído processamento e apresentação em células dendríticas e a baixa atividade de células T CD8+ (SMITH at al. 2009; KARLSSON et al. 2010). Componentes da membrana como os receptores da família TLR (toll like receptors) desempenham uma conexão importante entre o sistema

imune inato e o sistema metabólico (YAMAUCHE et al. 2007). Esses receptores reconhecem estruturas moleculares de patógenos e desempenham importante atividade pró-inflamatória. Entretanto, esses mesmos receptores, principalmente os TLR-4, são sensíveis também a alguns nutrientes, como os ácidos graxos. Uma alimentação inadequada, rica em gorduras saturadas, pode ativar esses receptores ativando também mesmo na ausência de patógenos, uma resposta inflamatória capaz de interferir nos sinais mediados pelos hormônios controladores da fome e gasto energético (MILANKY et al. 2009).

Uma questão associada ao uso de uma DH esta em elucidar os mecanismos envolvidos na resposta imune frente à infecção por distintos patógenos. Camundongos submetidos a dietas hiperlipídicas e infectados com Leishmania major, apresentaram maior resistência à infecção

devido ao pior funcionamento de células dendríticas e imunidade relacionada ao perfil TH1 (SHAMSHIEV et al. 2007). Adicionalmente, a infecção crônica por Schistosoma mansoni em

animais submetido a DH confere proteção contra desordens metabólicas pela promoção de forte resposta TH2 no tecido adiposo, levando a um aumento de eosinófilos e macrófagos alternativamente ativados (M2) (HUSSAARTS et al. 2015).

(22)

(23)

14 Figura 1: Representação esquemática das alterações induzidas no tecido adiposo pelo quadro de obesidade. O aumento da concentração de ácidos graxos livres associado com o crescimento dos adipócitos pode gerar um estado de estresse do retículo endoplasmático, levando a ativação de JNK e de NFkB. Essa ativação levaria à indução de MCP-1 pelos adipócitos e, assim, propiciando a migração dos monócitos para o tecido. Fonte: adaptado de Gustafson et al. 2007.

1.5 - Citocinas secretadas pelo tecido adiposo

O conceito de que os adipócitos são células secretoras têm se estabelecido nos últimos anos. Eles sintetizam e liberam uma variedade de peptídeos e não-peptídeos, além da capacidade de depositar e mobilizar triglicerídeos, retinóides e colesterol, estas propriedades permitem que o tecido adiposo interaja com outros órgãos (WAJCHENBERG, 2000). A observação importante de que os adipócitos secretam leptina como o produto do gene ob estabeleceu o tecido adiposo como um órgão endócrino que se comunica com o sistema

nervoso central (VAISSE et al. 1996).

A leptina tem seus níveis intimamente correlacionados com a quantidade de gordura corporal, podendo atuar indiretamente na resposta imune (FANTUZZI et al. 2005; WANG et al. 2010). Ela pode atuar na regulação da proliferação e ativação de células T, influencia ndo

Ganho de peso Inflamação do tecido adiposo _{Resistência a insulina}

Estresse oxidativo Estresse do RE Dano endotelial Ácidos graxos livres Necrose dos adipócitos

Recrutamento de macrófagos

Fatores secretados i.e. MCP-1

SAA Adipócitos

Macrófagos Pré-adipócitos Células endoteliais Eritrócitos

(24)

15 também na produção de citocinas, geralmente com a mudança do fenótipo para uma resposta TH1. Além disso, a leptina também influencia na ativação, fagocitose e produção de citocinas por monócitos (FANTUZZI et al. 2005). Em células endoteliais, ela induz o estresse oxidativo e regula a adesão de moléculas (Figura 2).

Figura 2: Efeitos da leptina no sistema imune e na inflamação. A leptina é produzida por adipócitos e atua em receptores presentes em distintos tipos celulares como células T, monócitos e células endoteliais. A Leptina modula a proliferação de células T, aumentando células T naive em detrimento da reduzida proliferação de células T de memória. A leptina

modula a produção de citocinas derivadas de células T e aumenta a expressão de marcadores CD25 e CD71 em células CD4+_._{Fonte: Adaptado de Fantuzzi et al. 2005.}

Outra importante citocina secretada pelo tecido adiposo é a adiponectina. Conhecida por seu papel na resistência à insulina, seus níveis estão reduzidos em obesos, sendo inversame nte proporcional a quantidade de tecido adiposo (ROBINSON et al. 2011). A adiponectina parece ser uma molécula com atividade anti-inflamatória, atuando na redução da produção e atividade do TNF, inibindo a produção de IL-6, acompanhada pela indução da produção de citocinas regulatórias como IL-10 e o receptor antagonista IL1 (WOLF et al. 2004). Além do mais, ela inibiria o NFkB, e reduziria a estimulação de moléculas de adesão endoteliais (MASAKI et al. 2004; KUMADA et al. 2004; WULSTER-RADCLIFE et al. 2004). Outras citocinas e quimiocinas liberadas pelo tecido adiposo são a IL-6, TNF, MCP-1(CCL2) e RANTES (CCL5), sendo que estas últimas são responsáveis pelo recrutamento de monócitos e células T

LEPTINA Proteção contra apoptose Elevação da proliferação de células naive

Redução da proliferação de células de memória Modulação em marcadores de ativação

Aumento da produção de citocinas

LINFÓCITO T

MONÓCITO ENDOTÉLIO

Modulação em moléculas de adesão

Estresse oxidativo Modulação em marcadores de

(25)

16 (WESTERBACKA et al. 2008; BATURCAM et al. 2014). Os altos níveis de IL-6 são provavelmente os responsáveis pela elevação de proteínas de fase aguda, como a proteína C reativa (PCR), encontradas em obesos (FANTUZZI et al. 2005).

A expressão de TNF aumentada em indivíduos obesos pode levar diretamente à resistência a insulina pela indução da fosforilação de serina do receptor de insulina, no qual inibe a sinalização da insulina (HOTAMISLIGIL et al. 1994). Resumidamente, a ativação dos substratos intermediários da via de sinalização do TNF, como a serina quinase JNK, pode interferir na funcionalidade dos substratos do receptor de insulina, o IRS-1 e IRS-2. Uma vez fosforilados em serina pela JNK, a possibilidade de serem fosforilados em tirosina pelo receptor de insulina fica comprometida, contribuindo para a resistência à transdução do sinal da insulina através dessa via (YUAN et al. 2001; SHOELSON et al. 2003; HOTAMILIGIL et al. 2003). Outra via pró-inflamatória que pode levar à fosforilação em serina de substratos do receptor de

insulina é a via IκK/IκB/NFκB. Essa via pode ser também ativada pelo TNF, mas também por outras citocinas pró-inflamatórias como IL-1β (interleucina 1β). A ativação do IκK promove a

dissociação do complexo IκB/NFκB, mas também pode induzir a fosforilação em serina dos

IRS, que compromete a transdução do sinal da insulina através dessa cascata. A sinalização de insulina além de induzir a ingestão de glicose, transporte de aminoácidos, metabolismo de lipídeos, pode modular a função e ativação de células T promovendo um fenótipo TH2 (BAUCHE et al. 2007; OTABE et al. 2007; QUIAO et al. 2008).

Estudos in vitro, em roedores e em seres humanos sugerem que o excesso de adiposidade

altera a função imune celular e eleva a susceptibilidade a infecções, enfraquecendo a defesa do hospedeiro (NIEMAN et al. 1999; NAGAJYOTHI et al. 2008 e 2010). De forma complementar, obesos exibem um perfil pro-inflamatório e elevada proliferação de linfócitos por estimulação policlonal quando comparados a pessoas eutróficas (NIEMAN et al.1999; GHANIM et al. 2004).

Recentemente, estudos com culturas de adipócitos infectadas com a cepa Talahuen do

T. cruzi foram avaliadas por 48-96 horas sendo observado um aumento na expressão de

citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (IL-1, IFN-y, TNF, CCL2 e CCL5), bem como um aumento na expressão de receptores TLR 2 e 9 (NAGAIYOTHI et al. 2008; COMBS et al. 2005). Esses resultados, em concordância com os estudos prévios sobre a resposta imune

(26)

17

miocárdio (NAGAJIYOTHI et al. 2008; FERREIRA et al. 2011). Porém, estudos em modelos animais com a infecção aguda e crônica tornam-se necessários para a elucidação de alguns aspectos deletérios da doença cardíaca, ainda que as alterações clínicas observadas no modelo animal sejam distintas das alterações clínicas da doença cardíaca em seres humanos (DIAS et al. 1997).

Poucos estudos abordaram a relação entre dieta hiperlipídica e suas contribuições para o agravamento clínico da cardiopatia chagásica. Nesse contexto, o tecido adiposo emerge como um importante alvo de estudo por ser constituído por inúmeros tipos celulares tornando-se um potencial sítio inflamatório para a resposta inflamatória sistêmica e/ou focal na infecção pelo

(27)

18 2 - Justificativa

O ganho de peso e a adiposidade são, frequentemente, atribuídos ao excessivo e inadequado consumo de dietas ricas em gorduras (MELHORN et al. 2010) e, neste contexto, a composição de macronutrientes estão envolvidos nos riscos a saúde (PETZKE et al. 2007; LOMBA et al. 2010). Em contrapartida, a infecção pelo T. cruzi, prevalente no Brasil e países

latino-Americanos, emerge como uma condição predisponente de alterações cardiovascula res em diferentes graus (ANDRADE, ANDRADE, 1979) e os estudos sobre a influência dos lipídeos na infecção são escassos. A dieta desempenha um papel importante na regulação dos níveis de lipídeos do corpo, o que inclui adipogenese e lipogênese. Então, sabendo-se que a dieta de qualquer indivíduo/animal afeta diretamente seus parâmetros fisiológicos, em particular aqueles associados à resposta imune, e sendo a resposta imune o fator predisponente para a patogênese cardíaca observadas na infecção pelo T. cruzi, compreender a inter-relação

entre a dieta hiperlipídíca e a resposta inflamatória/fisiológica decorrente da infecção experimental pelo T. cruzi abriria novas perspectivas para a compreensão e possível interve nção

(28)

19 3 – Objetivos

3.1 – Objetivo geral

Avaliar parâmetros inflamatórios na infecção aguda e crônica de camundongos infectados pelo trypanosoma cruzi submetidos ao consumo de dieta hiperlipídica.

3.2 – Objetivos específicos

Avaliar, nos animais isogênicos C57BL/6 infectados ou não pelo T. cruzi durantes as fases

aguda e crônica da infecção:

(i) a interferência da DH e da infecção sobre o ganho de peso e ingestão diária, o percentual de lipídeos hepáticos, assim como avaliar o perfil bioquímico (glicose, colesterol total, HDL, LDL, VLDL e triglicerídeos), teste de tolerância oral a glicose (TTG) e teste de tolerância a insulina(TTI).

(ii) o efeito da DH sobre a infecção (parasitos circulantes e teciduais) e sobre a mortalidade de camundongos isogênicos.

(iii) os efeitos da associação da DH X T. cruzi na produção plasmática de citocinas (TNF,

IL-10, CCL2, CCL5 e Leptina).

(iv) as alterações histopatológicas teciduais (coração e fígado) com quantificação do infiltrado inflamatório e esteatose.

(29)

20 4 – Material e métodos

4.1 – Animais e cepa do T. cruzi

Camundongos machos C57BL/6, com 21 dias de idade e peso de 16g, foram fornecidos pelo Centro de Ciência Animal da UFOP. Estes animais foram alocados em gaiolas de polipropileno, em salas climatizadas, sendo a oferta de ad libitum. Durante todo o período

experimental os animais permaneceram em condições controladas de luminosidade (12h claro-escuro) e temperatura (22,0±2 ºC).

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comissão de Ética e Experimentação Animal (CEUA) da UFOP (Protocolo nº 2012/42).

Foi utilizada a cepa VL-10 do T. cruzi, isolada de uma paciente crônica na forma

indeterminada da doença de chagas no estado de MG (SCHLEMPER et al. 1983).

4.2 - Delineamento experimental

Foram utilizados 80 animais, divididos em quatro grupos e inoculados ou não, intraperitonealmente, com 5x103_{formas tripomastigotas do}_{T. cruzi}_{, da seguinte forma: (i) 10} animais receberam a dieta convencional padrão AIN 93M; (ii) 10 animais receberam a DH. Em paralelo, animais não infectados foram também agrupados constituindo os grupos controles (iii) 10 animais receberam a dieta AIN 93M e (iv) 10 animais receberam a DH.

(30)

21 A)

B)

Figura 3:Delineamento experimental. As dietas foram introduzidas logo após o desmame dos camundongos (21 dias de idade) e continuadas durante todo o experimento. Após 2 meses de dieta (81 dias de idade) os animais foram inoculados (grupos infectados) ou não (grupos não infectados) com a cepa VL-10 do T. cruzi. No 30º dia

de infecção (111 dias de idade), os animais da fase aguda foram eutanasiados. Posteriormente, no 100º dia de infecção (181 dias de idade), os animais da fase crônica foram eutanasiados (A). Fluxograma com o delineamento dos grupos amostrais. O mesmo delineamento foi realizado tanto na fase aguda quanto crônica (B).

4.3 - Dietas e controle do peso

Os animais foram alimentados com dieta convencional padrão AIN 93M ou esta mesma dieta acrescida de 60% de lipídeos (REEVES et al. 1993), conforme descrito na tabela 1. As dietas foram confeccionadas e fornecidas pela PragSoluções e Comércio Ltda São Paulo – SP.

Dieta Hiperlipídica

(DH) Dieta padrão

AIN93M

Infectados Cepa VL-10

(n=10)

Não Infectados

(n=10)

Infectados Cepa VL-10

(n=10)

Não Infectados

(31)

22 As respectivas dietas foram administradas nos animais durante todo experimento, com acompanhamento diário da ingestão e pesagem corporal semanal.

Quadro 1: composição das dietas experimentais (g/Kg)

NUTRIENTES DIETAS

CONVENCIONAL HIPERLIPÍDICA*

AMIDO 465,692 145,692

CASEÍNA 140,000 140,000

MALTODEXTRINA 155,000 155,000

SACAROSE 100,000 100,000

ÓLEO DE SOJA 40,000 40,000

FIBRA 50,000 50,000

MIX DE MINERAIS1 _35,000 _35,000

MIX DE VITAMINAS2 _10,000 _10,000

L-CISTINA 1,800 1,8000

COLINA 2,500 2,500

TERT-BUTYLHIDROQUINONE 0,008 0,008

BANHA - 320,000

Total de Kilocalorias 3810 5410

1_{Mistura de minerais (expresso em g/kg da mistura): NaCl – 139,3 / KI- 0,79 / MgSO}

4.7H2O- 57,3 / CaCO3- 381,4 / MnSO4.H2O – 4,01 / FeSO4.7H2O – 0,548 / CuSO4. 5H2O – 0,477 / CoCl2.6H2O – 0,023 / KH2PO4 – 389,0. 2Mistura de vitaminas (expresso em mg/kg da mistura): Acetato de retinol – 690; colecalciferol – 5; ácido p- amino benzóico – 10 000; inositol – 10 000; niacina – 4000; riboflavina – 800; tiamina HCL – 500; ácido fólico – 200; biotina – 40; cianocobalamina – 3; dl-α - tocoferol – 6 700; sacarose – q.s.p. 1000. *Acrescida de 1% de colesterol SIGMA® _{Fatores de conversão: proteínas 4 kcal/g, lipídios 9 kcal/g, açúcares 4 kcal/g.}

4.4 - Parâmetros fisiológicos e bioquímicos

4.4.1 - Cálculo do Índice de Lee

O índice de Lee foi calculado a partir da relação entre a raiz cúbica do peso corporal e o comprimento naso-anal do animal [3_{Peso (g)/CNA(cm)] (BERNARDIS, PETERSON, 1968).} Este índice de Lee para o rato/camundongo equivale ao índice de massa corporal (IMC) para humanos.

4.4.2 - Teste de tolerância a glicose

(32)

23 4.4.3 - Teste de tolerância a insulina

O teste de tolerância à insulina (TTI) foi realizado com os animais na última semana do experimento, após 8 horas de jejum. Este teste mensura a sensibilidade à insulina utilizando a constante do desaparecimento da glicose como índice do metabolismo da glicose mediado pela insulina.

A glicemia foi mensurada em jejum tempos zero (basal), em seguida foi injetado por via subcutânea 1U/kg de massa corporal de insulina Regular da marca Humulin® e mediu-se a glicemia nos tempos 30, 60, 90 e 120 minutos utilizando-se um glicosímetro e fitas para glicemia da marca Accu-check Active®.

4.4.4 - Avaliação de Colesterol total, triglicerídeos, HDL e lipídeos totais

Foram dosados os níveis séricos de colesterol total, triglicerídeos (TG) e HDL dos animais antes e 30 dias após a infecção. No tecido hepático foram dosados os níveis de lipídeos totais pelo método de Folch, 1957. As determinações de colesterol total, TG e HDL foram realizadas baseando no método enzimático colorimétrico e utilizando os Kits enzimático s colesterol total, TG e HDL Liquiform, da Labtest.

4.5 - Sorologia convencional

Foi realizada a dosagem de TNF, IL-10, Leptina, CCL2 (MCP-1) e CCL5 (RANTES) do plasma desses animais, pelo método imunoenzimático de ELISA. Foram utilizados Kits da

R&D Systems ® e Preprotech ®.

Em microplacas de alta sensibilidade foram adicionados 100ul de anticorpo monoclona l contra a proteína (ou peptídeo) a ser dosada, diluídos em PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino - BSA (SIGMA), sendo estas placas incubadas por 12 horas à temperatura ambiente. Anticorpos não adsorvidos pelas placas foram descartados, por inversão e sucessivas lavagens em PBS-Tween e as placas bloqueadas com 300ul/poço de uma solução contendo

(33)

24 Os anticorpos secundários, após os poços serem devidamente lavados, foram diluídos em PBS-BSA 0.1% e incubados por duas horas à temperatura ambiente. Finalmente, 100ul de estreptoavidina ligada à peroxidase na diluição de 1:4000 em PBS-BSA 0.1% foram adicionados à placa e a mesma foi incubada por 30 minutos, em abrigo da luz.

Após a lavagem das placas foram adicionados 100µl/poço da mistura 1:1 do reagente de coloração A (H2O2) e do reagente de coloração B (tetrametilbenzidina). Após 20 minutos de incubação em ausência de luz, a reação foi bloqueada adicionando-se 50 µl/poço de H2SO4 2N. A leitura da intensidade de coloração foi realizada em leitor de ELISA (Microplate Reader,

model 680 BioRad) utilizando-se o comprimento de onda de 450nm.

4.6 - Histologia

Para a mensuração do infiltrado inflamatório e dos parasitos teciduais (ninhos de amastigota), o tecido (coração, fígado e tecido adiposo) foi processado e avaliado através de histologia convencional. De forma geral, os tecidos foram fixados em formalina 10%, posteriormente, passaram por uma série de desidratação em concentrações crescentes de etanol, clareado em xilol e infiltrado em parafina plástica (Paraplast) a 56º C.

Para evidenciar do infiltrado inflamatório, fragmentos de tecido foram corados pela Hematoxilina/Eosina (HE). Os cortes foram colocados em dois banhos de xilol, cada um com a duração de 10 minutos foi realizada então a hidratação com a sequência de banho em álcool absoluto e soluções alcoólicas de 90%, 80% e 70%, cada um por 5 minutos, corados por Hematoxilina por 10 minutos. Posteriormente, lavados em água corrente e diferenciado s rapidamente em álcool acidulado, novamente lavados em água corrente e corados pela Eosina durante um minuto. Após esta etapa os cortes foram lavados em água corrente por um minuto e passados por dois banhos de álcool absoluto, cada um com a duração de 10 segundos. Posteriormente, foram levados até a estufa de 56°C para secagem e, após este período, foram montadas as lâminas com auxílio de Entellan® (Merck KgaA, Darmstadt, Alemanha).

Posteriormente foi realizada a quantificação da inflamação na área do tecido. Todos os núcleos celulares presentes no fragmento foram quantificados em 20 imagens (campos) aleatórios (área total percorrida igual a 1,49 x 106_µm2_{). As imagens visualizadas pela objetiva} de 40X foram digitalizadas através da microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite,

(34)

25 Para análise da esteatose no fígado foi utilizado um método semi-quantitativo padronizado por Brunt e colaboradores 1999. A degeneração lipídica foi classificada de acordo com a quantidade de lipídeo dos adipócitos. O grau de esteatose vesicular foi determinado em 10 grades, onde classificou-se de 0 a 4, a porcentagem de hepatócitos envolvidos na biópsia (0, nada; 1, 10%; 2 de 10 a 33%; 3 de 33 a 66%; 4 acima de 66%).

4.7 - Zimografia e Western blotting

4.7.1 - Preparo do homogenato dos tecidos

Os tecidos (fígado e coração) dos camundongos foram pulverizados em nitrogênio líquido (-165 ºC). Em seguida, foram pesados e homogeneizados (na proporção de 100mg/400µL) em tampão RIPA(Radio-Immunoprecipitation Assay), acrescido de coquetel

inibidor de protease (1:1000) a 4ºC. Após a centrifugação (10 min, 10.000g), o sobrenadante foi coletado e usado para dosagem de proteinas. A concentração proteica foi determinada utilizando-se uma curva padrão de albumina segundo método de Lowry (LOWRY et al. 1951), utilizando-se o programa Microsoft Excel. A mesma quantidade de proteina total foi usada para

Western blotting e Zimografia (30 µg/poço).

4.7.2 – SDS-PAGE e Western blotting

Após obter a concentração proteica, acrescentou- se o volume necessário para um total

de 30 μg de proteína para cada amostra (de acordo com cálculos realizados para cada amostra), o tampão RIPA (150 mM NaCl, 1.0% IGEPAL® CA-630, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1%

SDS, and 50 mM Tris, pH 8.0) e tampão de amostra para SDS-PAGE [TrisHCl 0,125M pH 6,8,

SDS 4% (w/v), glicerol 20% (v/v), β-mercaptoetanol 0,1M e azul de bromofenol 0,02% (w/v)]. Antes da aplicação no gel (SDS-PAGE 8%) em placas de 1,5 mm, as amostras foram fervidas a 95ºC por dois minutos no banho seco, para desnaturação das proteínas, desenovelando-as completamente, a fim de facilitar a separação das mesmas durante a corrida eletroforética. Um

volume de 10 μL do marcador padrão de massa molecular (BLUeye Prestained Protein Ladder - Genedirex) foi utilizado em todas as corridas. A corrida da eletroforese foi realizada durante

(35)

26 transferência Mini Trans-Blot Cell (BioRad) em tampão Tris-HCl (25 mM), glicina (92 mM),

metanol (20%) e SDS (0,1%). A transferência foi realizada a 350 mA (mili-Ampéres) durante uma hora. Depois de transferir as proteinas para as membranas, estas foram mantidas em solução de bloqueio [5% de leite em pó desnatado em TBST 1X (Tris HCl pH 7,6 (1 mM), NaCl (5 M) e 1 mL de Tween 20)] por uma hora. As membranas foram então incubadas em

solução do anticorpo primário monoclonal anti-MMP-2 (Millipore MAB3308) (1:1000),

GAPDH (2118 Cellular Signaling) (1:5000), por uma hora, seguido pela incubação em solução do anticorpo secundário Goat Anti-Mouse IgG-HRP CLC554002 (Cedarlane) (1:5000) ou Goat

AntiRabbit IgG-HRP CLCC42007 (Cedarlane) (1:10000) por uma hora. A diluição dos

anticorpos foi realizada em solução de bloqueio e a incubação em temperatura ambiente, com leve agitação em plataforma agitadora. A visualização das bandas se fez empregando o substrato quimioluminescente ECL (Amersham, EUA) e de filmes de raios-x ultra-sensíve is (Kodak e Fujifilm). Os filmes de auto-radiografia foram expostos às membranas e revelados utilizando protocolos de tempo já previamente padronizados no laboratório de farmacologia da

University of Alberta, sendo que todos os procedimentos foram realizados em sala escura.

4.7.3 - Zimografia

As zimografias foram executadas segundo protocolo previamente descrito por SUNG e colaboradores, 2007. Utilizou-se gel de poliacrilamida SDS-PAGE a 8% contendo gelatina do tipo A de pele suína (Sigma Chem. Co, St. Louis, Mo. EUA ou gelatina padrão comercial) na concentração de 2 mg/mL e os géis de entrada poliacrilamida 5% (p/v) empregando-se placas de 0,75mm. Após obter a concentração proteica, se acrescentou o volume necessário para um

total de 30 μg de proteina para cada amostra (de acordo com cálculos realizados para cada

amostra), o tampão RIPA e tampão de amostra para SDS-PAGE. Antes da aplicação no gel as mesmas foram aquecidas por dois minutos a 37ºC banho úmido. Um volume de 10 μL do marcador padrão de massa molecular (BLUeye Prestained Protein Ladder – Genedirex) foi

utilizado em todas as corridas. A corrida da eletroforese foi realizada durante 120 minutos a 100 V no mesmo sistema utilizado para o western blotting. Após a eletroforese os géis foram

cuidadosamente lavados 3 vezes em 2.5% Triton X-100 para total remoção do SDS seguido de

(36)

27 descorante (4% metanol, 8% ácido acético e água). A atividade gelatinolítica foi visualizada por bandas não marcadas em um fundo azul representando áreas de proteólise no substrato de proteina.

4.7.4 - Densitometria de bandas

A análise das bandas nos géis da Zimografia e da revelação da membrana no experimento de Western Blotting foram quantificadas com auxílio do software Quantity One

(BioRad) utilizando uma estação de captura de imagem (Carestream 4000 MM Pro Image Station) e do software ImageJ versão 1.32j de domínio público http://rsb.info.nih.gov.ij/ onde

a densidade óptica de cada banda foi detectada. Foi utilizado como parâmetro para análise o volume ajustado das bandas, diminuído do background. Inicialmente o sistema de análise

calcula a média dos valores de densidade óptica para a região delimitada pelo operador. Esta região deve ter uma área suficiente para abrigar todas as bandas (uma de cada vez) visíveis no filme, não devendo ser alterada, quando se passa a analisar outra banda.

4.8 - Análise estatística

Todos os dados foram submetidos ao teste de normalidade Kolmogorov–Smirno v. Parâmetros com distribuição normal foram analisados pelo teste de análise de variânc ia univariada (ANOVA) e o teste de Tukey foi usado posteriormente para determinar as diferenças

entre os grupos. Para as variáveis que não apresentarem distribuição normal foi realizado o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn’s para determinação das diferenças entre grupos.

(37)

28 5 - Resultados

Os animais que receberam a dieta hiperlipídica (DH) apresentaram aumento de massa corporal na 11ª e 12ª semana de dieta, em comparação aos animais dos grupos que receberam dieta convencional (Figura 4). Também, após este período, houve redução da massados anima is submetidos à DH e infectados com o T. cruzi. A partir da 17ª semana de dieta o grupo que

recebeu dieta convencional e foi infectado possuíam massa corporal menor daqueles submetidos a DH também infectados. Sendo este último grupo diferente de seu controle não infectado. Não houve diferença entre os grupos que receberam dieta convencional, sendo eles infectados ou não. Houve oscilação de massa corporal nos grupos submetidas a DH infectados ou não à partir da 10ª semana, enquanto que nos grupos que ingeriram a dieta convencional isto não ocorreu, havendo manutenção da mesma massa corporal.

Figura 4. Massa corporal. Média da massa corporal dos animais vinculados aos grupos submetidos às dietas hiperlipídica e convencional, infectados ou não pelo T. cruzi, durante 22 semanas de dieta. Teste OneWay ANOVA

(Tuk eytest), P<0,05.

0 4 8 ₁₂ ₁₆ ₂₀ ₂₄

12 16 20 24 28 32 36

Semanas

M

as

sa

c

o

rp

o

ra

l (

g

)

Dieta hiperlipidica

Dieta hiperlipidica Infectado Dieta convencional infectado Dieta convencional

*

* *

(38)

29 Em relação ao Índice de Lee, cálculo que estima o índice de massa corporal em ratos/camundongos (Figura 5), o grupo que recebeu a DH não infectado apresentou elevação em comparação aos demais grupos na fase aguda, sendo este representado na Figura 5A. Quando comparamos este índice nas duas fases da infecção, todos os grupos apresentaram elevação na fase crônica, exceto o grupo que recebeu a DH sem infecção que apresentou menores valores nesta fase em relação ao seu controle.

A) B)

Figura 5. Índice de Lee. Relação entre a raiz cúbica do peso corporal e o comprimento naso -anal do animal (g/cm3_{), (dieta hiperlipídica e convencional) infectados ou não pelo}_{T. cruzi}_{, durante as fases aguda (}_A_{) e crônica}

(B). Os dados acima foram apresentados como média +/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Tuk ey test),

sendo significativo o p<0.05. Letras diferentes significam diferença entre os grupos. 275

300 325 350 375

Dieta convencional Dieta hiperlipídica

a a b a Ín di ce d e Le e (g /c m 3 ) Aguda 275 300 325 350 375 ___________ ___________

(39)

30 A ingestão diária das diferentes dietas variou entre os grupos. Foi observada maior ingestão nos grupos que receberam a dieta convencional até a 8ª semana, ao contrário do grupo submetido à DH que apresentou menor ingestão até esta semana. Após a infecção, a partir da 9ª semana, observou-se uma queda na ingestão dos animais infectados para ambas as dietas, em relação seus respectivos controles não infectados (Figura 6). Após a 13a _{semana de dieta o} consumo se normaliza, só havendo diferença entre os grupos na 22ª semana de dieta.

Figura 6. Ingestão alimentar. Média da ingestão alimentar semanal por animal (dieta hiperlipídica e convencional) infectados ou não pelo Trypanosoma cruzi, durante 22 semanas de dieta. OneWay ANOVA

(Tuk eytest), P<0,05.

Os animais que receberam a dieta hiperlipídica apresentaram maior parasitemia, com níveis significativos de parasitos circulantes no sangue e pico da parasitemia à partir do 17º dia de infecção, como pode ser evidenciado na Figura 7.

0 4 8 ₁₂ ₁₆ ₂₀ ₂₄

5 10 15 20 25

Dieta convencional Dieta convencional infectado

Dieta hiperlipidica Dieta hiperlipidica Infectado

Semanas

In

g

es

tã

o

p

o

r

an

im

al

(

g

/d

ia

)

*

(40)

31

10 20 30 40 50

0 100 200 300 400 500

Dieta convencional

Dieta hiperlipidica

*

* *

*

* * *

*

Dias após infecção

P

ar

as

it

o

s

em

0

.1

m

L

d

e

sa

n

g

u

e(

x1

0

3 )

Figura 7. Curva de parasitemia. Média da parasitemia dos grupos (dieta convencional e hiperlipídica) em animais infectados com 5x103_{formas tripomastigotas da cepa VL-10 do}_{Trypanosoma cruzi,}_{durante as fases}

aguda e crônica da infecção OneWay ANOVA (Bonferroni), P<0,05.

(41)

32 Figura 8. Taxa de sobrevivência. Porcentagem da sobrevivência entre os grupos (dieta convencional e hiperlipídica) em animais infectados com 5x103_{formas tripomastigotas da cepa VL-10 do}_{Trypanosoma cruzi}_–

Teste OneWay ANOVA (tuk eytest), P<0,05.

O teste de tolerância oral a glicose (TTG), também conhecido como curva de tolerância glicose ou curva glicêmica é um método de referência para o diagnóstico do diabetes mellitus

e da hipoglicemia (Figura 9). Na fase aguda, todos os animais apresentaram pico máximo de glicemia após 30 minutos de inoculação, contudo os animais submetidos à DH apresentaram um pico glicêmico maior (234 mg/dL) em comparação aos animais que receberam a dieta convencional (206 mg/dL), seguido de uma diminuição gradual do mesmo (Figura 9 A). No teste de tolerância à glicose também foi observada diferença nos tempos 0 e 30 minutos após a administração da glicose. Na fase crônica, nos tempos 0 (basal) o grupo que recebeu a dieta hiperlipídica infectado pelo T. cruzi apresentou maiores valores em relação aos demais grupos.

Adicionalmente, no tempo 90 este mesmo grupo apresentou diferença em relação ao grupo que recebeu dieta convencional infectado (Figura 9 B).

10 12 14 16 18 20 22

60 70 80 90 100

Sem anas

Ta

xa

d

e

so

br

ev

iv

ên

ci

a

(%

)

Dieta convencional

Dieta convencional infectado Dieta hiperlipidica

(42)

33 A)

B)

Figura 9. Teste de tolerância oral a glicose (TTG). Média da glicemia avaliada nos grupos de animais submetidos às dietas convencional e hiperlipídica infectados ou não pelo T. cruzi após ingestão de 2g/kg de

D-glicose nas fases aguda (A) e crônica (B). Os dados acima foram apresentados como média +/- SEM e analisados

por TwoWay ANOVA (Bonferroni) sendo significativo o p<0.05*.

No teste de tolerância a insulina ou resistência periférica à insulina (Figura 10), na fase aguda, verificou-se diferença nos tempos 0, 60, 90 e 120 mostrando que a velocidade de decaimento da glicose foi significativamente maior nos animais submetidos a DH e infectados (Figura 10A). Na fase crônica, este mesmo grupo apresentou diferença nos tempos 30, 90 e 120

0 ₃₀ ₆₀ ₉₀

120 100 150 200 250

Tempo (minutos)

Dieta convencional

Dieta convencional infectado

Dieta hiperlipídica

Dieta hiperlipidica Infectado

Gl ic o se T T G (m g /d L )

*

Aguda

*

0 ₃₀ ₆₀ ₉₀

(43)

34 com elevação dos níveis, em relação ao grupo infectado que recebeu a dieta convenciona l (Figura 10 B).

A)

B)

Figura 10. Teste de tolerância a insulina (TTI). Média da glicemia avaliada nos grupos de animais submetidos às dietas convencional e hiperlipídica infectados ou não pelo T. cruzi nas fases aguda (A) e crônica (B). Os dados

acima foram apresentados como média +/- SEM e analisados por TwoWay ANOVA (Bonferroni), sendo

significativo o p<0.05*.

0 ₃₀ ₆₀ ₉₀

120 50 100 150 200

Tempo (minutos)

Gl ic o s e T T I (m g /d L )

*

Aguda

*

Dieta convencional

Dieta convencional infectado

Dieta hiperlipídica

Dieta hiperlipidica Infectado

0 ₃₀ ₆₀ ₉₀

(44)

35 Na avaliação do colesterol total na fase aguda (Figura 11 A), os animais infectados pelo

T. cruzi apresentaram maiores valores em comparação aos camundongos submetidos à dieta

convencional, sendo maiores nos animais que receberam a DH. Na fase crônica apenas os animais que receberam a dieta hiperlipídica e infectados apresentaram maiores valores de colesterol total (Figura 11 B). Para o colesterol HDL, o grupo submetido a DH em comparação aos que receberam a dieta convencional, mostrou -se elevado na fase aguda (Figura 11 C), em relação a fase crônica os animais que receberam DH e foram infectados apresentaram maiores valores (Figura 11 D). Em contrapartida, os animais que receberam dieta convenciona l apresentaram valores elevados de triglicerídeos na fase aguda (Figura 11 E), sendo este parâmetro mais pronunciado nos animais infectados. Adicionalmente, o mesmo perfil foi encontrado na fase crônica (Figura 11 F).

Ao se avaliar os lipídeos totais hepáticos na fase aguda, observou-se uma elevação desse parâmetro nos animais submetidos à DH, com menores níveis nos grupos que receberam dieta convencional (Figura 12 A). Na fase crônica, os animais submetidos a DH obtiveram maiores valores (Figura 12 B).

Na análise de citocinas plasmáticas, pode-se observar que na fase aguda a produção de TNF (Figura 13 A), IL-10 (Figura 13 C) apresentou-se elevada nos animais infectados, estando apenas o TNF elevado em função da dieta dos animais. Os níveis de leptina (Figura 13 E) apresentaram-se reduzidos em presença da infecção quando comparada aos seus respectivos controles não infectados. A mesma não apresentou diferença em função das diferentes dietas avaliadas. Na fase crônica, observou-se níveis elevados de TNF no plasma dos anima is submetidos a DH não infectados em relação àqueles submetidos a dieta convencional também não infectados. No entanto os animais submetidos a DH infectados obtiveram menores valores (Figura 13 B). Na avaliação da IL-10 (Figura 13 D) e leptina (Figura 13 F) não foi observado diferença entre os grupos nesta fase.

(45)

36 A) B)

C) D)

E) F)

Figura 11 - Colesterol total, HDL e triglicerídeos. Média dos níveis lipídicos plasmáticos nas fases aguda e crônica respectivamente, de colesterol total (A, B), HDL (C, D) e triglicerídeos (E, F) em animais submetidos à dieta convencional ou hiperlipídica, infectados ou não pelo T. cruzi. Os dados acima foram apresentados como média +/- SEM

e analisados por OneWay ANOVA (Tuk ey test), sendo significativo o p<0.05. Letras diferentes significam diferença entre

os grupos. 0 20 40 60 80 100

a a,b b a,b H D L C o le st er o l ( m g /d L ) Aguda 0 50 100 150 200

a,b b a a,b T ri g lic er id eo s (m g /d L ) Aguda 0 50 100 150 200 ___________ ___________

a,b b a a Crônica T ri g lic er íd eo s (m g /d L ) 0 20 40 60 80 100 * ___________ ___________

b a a a Crônica HD L c o le st er o l ( m g /d l) 0 50 100 150 200 ___________ ___________

(46)

37 A)

B)

Figura 12. Avaliação de lipídeos totais hepáticos. Média dos lipídeos totais hepáticos no fígado dos grupos (dieta convencional e hiperlipídica) em animais infectados ou não pelo Trypanosoma cruzi nas fases aguda (A) e crônica (B).

Os dados acima foram apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Tuk eytest), sendo

significativo o p<0.05. Letras diferentes significam diferença entre os grupos .

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08 Dieta hiperlipídica

Dieta convencional

b,c

Aguda

a

a,b

c

b

T. cruzi

L

ip

íd

eo

s

to

ta

is

(

m

g

)

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08 ___________

___________

Dieta convencional Dieta hiperlipídica

(47)

38 A) B)

C) D)

E) F)

Figura 13. Síntese TNF, IL-10 e Leptina plasmáticos. Os ensaios imunoenzimáticos foram realizados no plasma para avaliação nas fases aguda e crônica respectivamente, as citocinas TNF (A, B), IL-10 (C, D) e leptina (E, F) em animais submetidos à dieta convencional e hiperlipídica, infectados ou não pelo Trypanosoma cruzi.Os dados acima

foram apresentados como média +/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Tuk eytest), sendo significativo o p<0.05.

Letras diferentes significam diferença entre os grupos. 0

1 2 3 4

Le pt in a (n g/ m L) a b a b Aguda 0 200 400 600

IL -1 0 (n g /m L ) _a,b a b b Aguda 0 100 200 300 400

Dieta Convencional Dieta Hiperlipídica

TN F (ng /mL) a a b c Aguda 0 1 2 3 4 5 ___________ ___________

Le pt in a (n g/ m L) Crônica 0 100 200 300 400 ___________ ___________

b b a,b a T. cruzi Crônica TNF ( ng /m L) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 ___________ ___________

(48)

39 A) B)

C) D)

Figura 14. Síntese das quimiocinas CCL2 e CCL5 plasmáticos. Ensaios imunoenzimáticos foram realizados no plasma para avaliação nas fases aguda e crônica respectivamente, as citocinas CCL2 (A, B) e CCL5 (C, D) em animais submetidos à dieta convencional e hiperlipídica, infectados ou não pelo Trypanosoma cruzi.Os dados acima foram

apresentados como média +/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Tuk ey test), sendo significativo o p<0.05.

Letras diferentes significam diferença entre os grupos.

0 20 40 60 80 100

Dieta convencional Dieta hiperlipídica

a b a b b a,b CC L 2 (n g /m L ) Aguda 0 500 1000 1500

Dieta convencional Dieta hiperlipídica

a b a b

b b CC L 5 (n g /m L ) Aguda 0 2 4 6 8 10 ___________ ___________ Dieta convencional Dieta hiperlipídica

a a b a,b CC L2 ( ng /m L) Crônica 0 1 2 3 4 ___________ ___________

(49)

40 A análise histopatológica dos tecidos cardíacos dos animais submetidos à dieta convencional ou hiperlipídica, infectados ou não pelo T. cruzi foi realizada utilizando-se a

coloração H&E (Figura 15). A fase aguda da infecção revelou maior infiltrado inflamató rio, sem a presença aparente de ninhos de amastigota nos animais submetidos a ambas as dietas. Ao se avaliar os animais não infectados, aqueles que receberam a DH apresentaram elevação na quantidade de núcleos celulares (Figura 15 C), em relação àqueles que receberam dieta convencional (Figura 15 A). Assim, a infecção pelo T. cruzi foi capaz de elevar o infiltrado

inflamatório nos animais submetidos à DH (Figura 15 D) e convencional (Figura 15 B), em comparação aos seus respectivos controles não infectados. Na análise da fase crônica, o grupo de animais submetidos à dieta convencional e DH, não infectados, (Figura 15 E) apresentaram aspecto histológico cardíaco compatível com o padrão de normalidade, (Figura 14 G). Ao contrário, animais infectados e submetidos tanto à dieta convencional (Figura 15 F) quanto DH (Figura 15 H) apresentaram pequenos focos inflamatórios multifocais discretos no tecido cardíaco. O número de núcleos presentes no coração dos animais infectados foi maior quando comparado aos seus respectivos controles não infectados na fase aguda (Figura 16 A). Não houve diferença na quantificação dos núcleos entre os animais infectados ou não que receberam a DH e a dieta convencional na fase crônica (Figura 16 B).

O aspecto do tecido hepático foi verificado para análise de infiltrado inflamatório e esteatose (Figura 17). Na fase aguda, o fígado dos animais não infectados, apresentou menor presença de núcleos celulares quando associado à DH à DH (Figura 17 B) e comparado ao mesmo órgão nos animais que receberam a dieta convencional (Figura 17 A). Já nos anima is infectados houve maior presença de núcleos inflamatórios associada à dieta convencio na l (Figura 16 C) em comparação aos camundongos alimentados com DH (Figura 17 D). Na fase crônica, os animais não infectados, submetidos à dieta convencional (Figura 17 E) apresentaram aspecto compatível com a normalidade, enquanto aqueles submetidos à DH apresentaram degeneração hidrópica com processo inflamatório multifocal polimorfonuclear (Figura 17 G). Em relação aos grupos infectados pelo T. cruzi, animais alimentados com a dieta convencio na l