UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICOPROTEÍNA OBTIDA POR CULTIVO SUBMERSO DE FUNGOS
Mestrado em Biotecnologia e Qualidade Alimentar
João Carlos Pereira Guimarães
Orientação: Professora Doutora Guilhermina Marques
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICOPROTEÍNA OBTIDA POR CULTIVO SUBMERSO DE FUNGOS
Mestrado em Biotecnologia e Qualidade Alimentar
João Carlos Pereira Guimarães
Orientação: Professora Doutora Guilhermina Marques
Composição do Júri: Presidente: _______________________________________________ Arguente: _______________________________________________ Orientadora: _______________________________________________ VILA REAL, 2015
Este trabalho foi expressamente elaborado como dissertação original para o efeito de obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia e Qualidade Alimentar.
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Agradecimentos
Este espaço é dedicado àqueles que deram a sua contribuição para que esta dissertação fosse realizada. A todos eles deixo aqui o meu sincero agradecimento.
Um agradecimento especial À Professora Doutora Guilhermina Marques, que aceitou a orientação deste trabalho, pelos seus ensinamentos prestados, pelas críticas e sugestões relevantes feitas durante a orientação, pela disponibilidade para me ensinar e pela sua paciência. Por me mostrar como se pode ser determinado e corajoso. A sua ajuda foi imprescindível.
Ao Professor Doutor Fernando Nunes, pela atenção e disponibilidade dos equipamentos e laboratórios, assim como do seu conhecimento, sem os quais não seria possível a realização deste trabalho assim como o incremento do meu conhecimento.
Ao Professor Doutor Miguel Rodrigues, por toda a sua disponibilidade de tempo e recursos, determinantes na concretização deste estudo.
Ao André Lemos por toda a assistência disponibilizada durante o trabalho experimental e ajuda em cada situação imprevista.
À Ana Abraão, por toda a ajuda prestada durante a componente prática.
À Magda, pelo seu incomensurável amor e carinho, por me mostrar o caminho do que posso ser, por acreditar na possibilidade da renovação, por me apoiar de uma forma inimaginável, pela pessoa maravilhosa que é e por me fazer feliz.
Aos meus pais e irmão pelo apoio incondicional e por me terem ensinado aspectos inerentes à formação do indivíduo.
A todos os meus amigos, em especial, ao Francisco e Sara, por todos os momentos passados e futuros, estiveram e estarão sempre comigo, um ponto fixo no universo.
Ao Lav Sharma, pelo apoio prestado durante a execução de todo o trabalho prático e
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ÍNDICE
Lista de abreviaturas ... iii
Índice de Quadros ... v
Índice de Figuras ...vi
Resumo ... vii
Abstract ... ix
1. Introdução ... 1
2. Revisão Bibliográfica ... 4
2.1 Importância de uma alimentação saudável ... 5
2.2 Fungos ... 7
2.3 Single-Cell Protein ... 8
2.4 Micoproteína ... 9
2.5 QuornTM ... 9
2.6 Fungos como alimentos funcionais ... 12
2.7 Fungos como alimentos nutracêuticos ... 13
2.8 Exopolissacarídeos Fúngicos ... 14
2.9 Propriedades nutricionais e nutracêuticas de Pleurotus ostreatus e Pleurotus citrinopileatus ... 18
2.10 Vantagens do cultivo submerso ... 22
2.11 Valorização de subprodutos da indústria agro-alimentar ... 22
3. TRABALHO EXPERIMENTAL ... 24
3.1 Fungos em estudo e produção de inóculos ... 25
3.2 Produção de biomassa e elaboração de protótipos ... 25
3.2.1 Metodologia para meio de cultura ... 25
3.2.2 Separação da biomassa fúngica e meio de cultura ... 27
3.2.3 Mistura da biomassa com aditivos... 27
3.2.4 Cozimento a vapor e congelação ... 27
3.3 Isolamento, purificação e quantificação dos exopolissacarídeos (EPS) solúveis em água 28 3.3.1 Precipitação em etanol ... 28
3.3.3 Solubilização do precipitado ... 28
3.3.4 Quantificação dos açúcares ... 29
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3.4 Análises nutricionais ... 29
3.4.1 Determinação da matéria seca ... 29
3.4.2 Determinação da matéria orgânica ... 30
3.4.3 Determinação da proteína bruta ... 30
3.4.4 Determinação da gordura bruta ... 30
3.4.5 Determinação da fibra alimentar total ... 31
a. Digestão enzimática ... 31
b. Filtração e lavagem ... 32
c. Secagem do resíduo e pesagem ... 32
d. Determinação da proteína e da cinza da amostra ... 32
e. Cálculo do teor de fibra alimentar total ... 33
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 34 4.1 Produção de biomassa ... 35 4.2 Análises nutricionais ... 41 4.3 Produção de EPS ... 44 5. CONCLUSÕES ... 48 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 51
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LISTA DE ABREVIATURAS
ADN – Ácido desoxirribonucleico ARN – Ácido ribonucleico
CFIA – Canadian Food Inspection Agency DALY – Disability-adjusted life year EPS – Exopolissacarídeo
FAO – Food and Agriculture Organization FT – Fibra total
LDL – Low density lipoprotein PDA – Potato dextrose agar PDB – Potato Dextrose Broth PVT – Proteína vegetal texturizada SCP – Single Cell Protein
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ÍNDICE DE QUADROS
Quadro 1 Comparação nutricional entre diferentes alimentos utilizados como fornecedores de proteína na alimentação humana (Wiebe, 2002). ... 9 Quadro 2 Origem, tipo e bioactividades de alguns polissacáridos isolados de fungos (Zhang et al., 2007). ... 16 Quadro 3 Composição nutricional de Pleurotus ostreatus (Manzi et al., 2001). ... 19 Quadro 4 Composição em aminoácidos do micélio de Pleurotus ostreatus var. ‘Florida’ (Hadar e Cohen-Arazi, 1986). ... 20 Quadro 5 Valores nutricionais para as espécies de cogumelos Agaricus bisporus,
Pleurotus ostreatus) e Lentinula edodes (Furlani e Godoy, 2007; (*) Loss, 2009). ... 21
Quadro 6 Peso fresco de biomassa em gramas por 100 ml de meio de cultura, aos 21 dias de crescimento. ... 36 Quadro 7 Valores nutricionais obtidos no crescimento de biomassa (21 dias) para as espécies Pleurotus ostreatus e Pleurotus citrinopileatus ... 41 Quadro 8 Produção e composição química de EPS (%) das espécies Pleurotus ostreatus, Pleurotus citrinopileatus e Fusarium venenatum ... 44
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Taxas atribuídas de DALY para os factores de risco relacionados com a dieta. OMS, 2004 ... 6 Figura 2 Produção anual de cogumelos e trufas. FAO, 2014. ... 6 Figura 3 Estrutura vegetativa dos fungos e formação de cogumelos. ... 7 Figura 4 Representação do processo de produção de micoproteína a partir da espécie
Fusarium venenatum (ATCC PTA-2684) (Wiebe, 2002). ... 10
Figura 5 Representação de um fermentador contínuo de pressão cíclico QuornTM utilizado para a produção de micoproteína (Wiebe, 2004). ... 11 Figura 6 Produção de biomassa de Pleurotus ostreatus em Erlenmeyer. ... 35 Figura 7 Separação de fases com recurso a filtro de papel. ... 37 Figura 8 Protótipo alimentar com base na biomassa de Pleurotus ostreatus após fritura. ... 39 Figura 9 Processo de produção de protótipos alimentares a partir de biomassa fúngica. ... 40
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RESUMO
A sociedade preocupa-se cada vez mais com a saúde e procura alimentos que além de fornecerem o valor nutricional também contêm propriedades benéficas para a saúde como melhoramento da qualidade de vida ou prevenção de doenças. Os cogumelos além de conterem um teor nutricional equilibrado também contêm compostos bioactivos, podendo actuar como alimentos funcionais e/ou nutracêuticos. A utilização de Single Cell Protein e micoproteína na alimentação ainda não dispõe da aplicabilidade e utilização por parte das indústrias e consumidores sendo para isso necessário mais conhecimento correspondente ao seu potencial.
Neste trabalho foi avaliada a composição nutricional das espécies comestíveis de fungos Pleurotus ostreatus e Pleurotus citrinopileatus. Com vista ao seu potencial na alimentação compararam-se os resultados com a espécie Fusarium venenatum ATCC PTA-2684 utilizada na produção de micoproteína para alimentação humana, comercializada em vários países. Foram ainda determinados os valores dos exopolissacarídeos (EPS) fúngicos presentes no meio de cultura dado ser outro produto de interesse biotecnológico resultante do cultivo de fungos para a produção de micoproteína em cultivo submerso. Formularam-se protótipos alimentares com o objectivo de testar a utilização de biomassa a partir de fungos para utilização na alimentação e um possível método de produção contemplando a segurança alimentar e conservação.
Aos 21 dias a espécie que produziu maior quantidade de biomassa, em peso fresco, foi Pleurotus ostreatus. Nutricionalmente as espécies Pleurotus ostreatus e Pleurotus citrinopileatus podem ser uma boa fonte proteica (23,3% e 24,5% respectivamente) com valores equivalentes a cogumelos da mesma espécie e contendo vantagens em termos de redução significativa no tempo de produção dos fungos em cultivo submerso. É relatado para a espécie Fusarium venenatum valores na ordem dos 14,0%. Em termos de fibra alimentar obtiveram-se valores na ordem dos 70% para a espécie Pleurotus ostreatus e 41% para a espécie Pleurotus citrinopileatus enquanto para Fusarium venenatum é relatado valores na ordem dos 5%. Na produção de EPS obtiveram-se valores superiores para a espécie Pleurotus ostreatus aos 14 dias de crescimento (total de 49,6%) ocorrendo uma diminuição aos 21 dias, enquanto para Pleurotus citrinopileatus (total de 42,7%) e Fusarium venenatum (37,8%) foi superior aos 30 dias.
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Palavras-chave: Single Cell Protein; micoproteína; exopolissacarídeos; cultivo submerso.
ix
ABSTRACT
Society is increasingly concerned with health and looking for foods with health benefits beyond the nutritional value they provide, such as improving quality of life or disease prevention.
Mushrooms, in addition to a balanced nutritional content, also have bioactive compounds, which can give functional or nutraceutical properties when consumed. The use of Single Cell Protein and micoprotein still lacks the applicability and use by industries and consumers, being necessary more knowledge to access their potential. In this work the nutritional composition of the edible species of fungi Pleurotus ostreatus and Pleurotus citrinopileatus was evaluated. With a view to the supply the micoprotein potential we compared the results with the species Fusarium venenatum ATCC PTA-2684 used to produce micoprotein for human consumption, commercially available in several countries. Fungal exopolysaccharide present in the culture medium were also determined, since they are other product with biotechnological applications, which are obtained in the fungal cultivation for mycoprotein production in submerged culture conditions. Food prototypes were formulated with the aim of testing the use of fungal biomass for use in food and a possible method for producing considering food safety and preserving.
At 21 days the specie that produces larger amount of biomass, fresh weight, was Pleurotus ostreatus. Nutritionally the species Pleurotus ostreatus and Pleurotus citrinopileatus may be a good protein source (23,3% and 24,5% respectively) with equivalent amounts to mushrooms of the same species, containing advantages in terms of significant reduction in fungal production time in submerged cultures. It is indicated
for the specie Fusarium venenatum values in the order of 14.0%. Regarding dietary
fiber were obtained values of 70% for Pleurotus ostreatus and 41% for Pleurotus citrinopileatus as to Fusarium venenatum is reported values in the order of 5%. In EPS production were obtained higher values for Pleurotus ostreatus specie at 14 days of growth (total of 49,6%) occurring a reduction at 21 days, while for Pleurotus citrinopileatus (total 42.7%) and Fusarium venenatum (37.8%) were higher at 30 days.
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Keywords: Single Cell Protein; micoprotein; exopolysaccharides; submerged cultivation.
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Introdução
O aumento da população e o aumento dos preços das matérias-primas e das fontes de proteína tradicionais levam a que surjam alternativas na alimentação provenientes de fontes proteicas mais baratas, que não exigem campos agrícolas ou um longo período de produção. A sociedade tem cada vez mais a preocupação com um estilo de vida saudável, estando esta inerentemente ligada à alimentação, aumentando assim a procura por alimentos benéficos à saúde. Doenças como a obesidade, problemas cardiovasculares, colesterol, hipertensão, entre outras, são cada vez mais doenças associadas a um ritmo de vida agitado e à má alimentação. Por outro lado nota-se também um aumento no consumo de alimentos que não permitam apenas uma boa e correcta nutrição, mas que o seu consumo providencie algum tipo de propriedade funcional ou nutracêutica, melhorando a saúde do consumidor, por exemplo, actividade pré-biótica (Synytsya et al., 2009) ou antioxidante (Schmidt et al., 2014).
O consumo de cogumelos é conhecido desde o início da civilização em todo o mundo. Os cogumelos são um produto saudável e equilibrado nutricionalmente, fornecem entre 19-35% de proteínas, teor muito baixo em gorduras, contendo vitaminas como B1, B2, C e D e com alto teor em fibra (Synytsya et al., 2009). Além do valor nutricional, alguns cogumelos têm também propriedades funcionais e/ou nutracêuticas, tendo sido isolados vários compostos do corpo frutífero, micélio e meio de cultura como terpenos, esteróis, fenóis, alcalóides e nucleótidos com efeitos biológicos promissores, como o lentinano que confere actividade antitumoral, anti-cancerígena e antiviral. A espécie Lentinula edodes contém lentinacina e lenticina (Çaglarirmak, 2007), enquanto a espécie Pleurotus ostreatus contém lovastatina, ambos com propriedades de redução do colesterol. Neste âmbito, o consumo de cogumelos comestíveis tem aumentado, assim como o interesse no conhecimento dos seus compostos bioactivos.
A acumulação de resíduos agrícolas e industriais é cada vez mais um problema devido às suas quantidades, causando uma enorme perda de potenciais constituintes nutricionais, para além dos impactos no meio ambiente (Yabaya e Ado 2008). A utilização de substratos alternativos, provenientes de resíduos, para a produção de biomassa fúngica e para a produção de cogumelos é empregue e cada vez mais estudada como forma de redução de custos, aumento da sustentabilidade agro-industrial e
3 responsabilidade social (Gern, 2005; Assi et al., 2007; Petre e Petre, 2008; Sales-Campos et al., 2008).
Neste sentido, este trabalho teve como objetivos: 1) Avaliação nutricional das espécies comestíveis de fungos Pleurotus ostreatus e Pleurotus citrinopileatus; 2) Comparação com a espécie Fusarium venenatum (ATCC PTA-2684) utilizada na produção de micoproteína para alimentação humana; 3) Determinação dos exopolissacarídeos fúngicos presentes no meio de cultura; 4) Formulação de protótipo alimentar a partir de biomassa fúngica.
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2.1 IMPORTÂNCIA DE UMA ALIMENTAÇÃO SAUDÁVEL
Uma alimentação saudável é fundamental para o crescimento, desenvolvimento e manutenção do organismo de forma apropriada. O consumo de alimentos nas proporções adequadas e de forma variada é de elevada importância para evitar excessos ou carências alimentares. Vários estudos têm indicado a importância do consumo diário de alimentos vegetais integrais, como legumes, frutas, grãos, nozes e sementes, com características nutricionais comuns, baixo consumo de energia e alto teor em fibras e micronutrientes (Kennedy et al., 2008).
De acordo com o último relatório dos riscos para a saúde mundial da Organização Mundial de Saúde (OMS) em 2004, a hipertensão arterial é o principal factor de risco para a mortalidade, responsável por 13% das mortes em todo o mundo (Gil-Ramirez et al., 2011), estando sinalizados outros factores responsáveis por mais de metade das mortes por doenças cardíacas, a principal causa de morte no mundo, como a baixa ingestão de frutas e legumes, falta de exercício (5.5%), consumo de álcool (3.8%) e tabaco (8.7%), elevado índice de massa corporal (4.8%), colesterol elevado (4.5%) e glicemia alta (5.8%). A obesidade é o quinto risco principal de mortalidade, sendo responsável por 7% das mortes em todo o mundo. Devido a estas doenças a população tem uma vida desajustada por incapacidade, traduzida na figura 1 por incapacidade ajustada aos anos de vida (“disability-adjusted life year”, DALY). Estes riscos podem ser reduzidos ou eliminados através de uma alimentação equilibrada e saudável.
6 A produção de cogumelos tem vindo a aumentar gradualmente (Fig. 2). Este aumento pode ser explicado não só pelo aumento populacional mas principalmente pela demanda por alimentos nutritivos e capazes de reduzir o risco de doenças.
Figura 2 Produção anual de cogumelos e trufas. FAO, 2014. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 M ilh õ es d e t o n e la d as África América Ásia Europa Mundial
Figura 1Taxas atribuídas de DALY para os factores de risco relacionados com a dieta. OMS, 2004
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2.2 FUNGOS
Os fungos são organismos eucariotas heterotróficos apresentando dois tipos de morfologia: microrganismos unicelulares (leveduras) ou organismos multicelulares (fungos filamentosos). Obtêm a sua energia a partir da oxidação de compostos orgânicos ricos em carbono, absorvendo os nutrientes necessários para seu desenvolvimento a partir do ambiente sobre o qual crescem (Alcamo, 2000). Constituem um grupo muito diversificado no que diz respeito à forma, estrutura e capacidade metabólica. Podem ser saprófitas (decompositores de substratos orgânicos através da produção de enzimas), parasitas facultativos ou biotróficos, ou ainda simbióticos (Santos, 2012). O seu crescimento é afectado por factores físicos e químicos, como a temperatura, humidade, pH, concentração de oxigénio, macro e micronutrientes, fontes de carbono, entre outros.
Os fungos têm como substância de reserva o glicogénio, não sintetizam clorofila, não possuem celulose na sua parede celular, são constituídos por células de paredes rígidas mas flexíveis em que o principal constituinte é a quitina (polímero da N-acetil-D-glucosamina com ligações β→(1-4)), formando hifas, podendo estas serem septadas ou cenocíticas. As hifas organizam-se em filamentos e constituem o micélio, responsável por todas as funções vegetativas (Silva, 2008). Os cogumelos, também conhecidos por esporocarpos ou carpóforos, são os corpos frutíferos dos fungos.
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2.3 SINGLE-CELL PROTEIN
O uso de microrganismos na alimentação humana ou animal advém de há muito tempo. Alimentos como bebidas alcoólicas, queijos, iogurtes, molho de soja, entre outros, são consumidos juntamente com a biomassa microbiana responsável pela sua produção (Pogaku et al., 2009). Single Cell Protein (SCP) refere-se às células desidratadas de microrganismos, tais como leveduras, bactérias, fungos e microalgas cultivadas em sistemas de cultura de grande escala para utilização como fontes de proteína na alimentação humana ou animal (Humphrey, 1975; Mascarenhas e Inamdar, 1996; Ghorai et al., 2009; Jaganmohan et al., 2013). A produção de SCP pode ser efectuada por diferentes microrganismos em resíduos agrícolas e/ou industriais, reaproveitando estes e permitindo uma melhor eficiência a nível ambiental, existindo vários estudos da produção de SCP por utilização de resíduos (Humphrey et al., 1977; Mascarenhas e Inamdar, 1996; Zheng et al., 2005; Palheta et al., 2011; Rettore et al., 2011; Duprat 2012; Jaganmohan et al., 2013). As condições de crescimento da biomassa influenciam significativamente as características nutricionais do produto final, sendo necessária a optimização destas, como pH, temperatura, fonte de azoto, minerais em diferentes concentrações, quantidade do inóculo, fonte de carbono, concentração de oxigénio dissolvido, entre outros (Alam, 2010; Alves, 2010). Apesar dos promissores benefícios resultantes da utilização de SCP na alimentação humana e animal, que se estendem
desde um adequado e benéfico fornecimento nutricional, pois contém todos os
aminoácidos essenciais e não essenciais nas proporções correctas, comparativamente a outros alimentos e rações (Khan et al., 2012); reduzidos custos económicos; reaproveitamento de matérias-primas, bioremediação pela utilização de matérias-primas
com pouco ou nenhum aproveitamento (Dinis et al., 2009; Dashtban et al., 2010; Pinto
et al., 2012), esta tecnologia ainda não corresponde às espectativas e potencialidades da mesma. Este rápido crescimento de microrganismos com capacidade de utilização de matérias-primas de baixo custo como fontes de carbono e energia tem potencial para ser explorado na suplementação de proteína alimentar.
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2.4 MICOPROTEÍNA
Micoproteína é a proteína existente na biomassa produzida a partir da fermentação produção de fungos, sendo possível a formulação de produtos alimentares com qualidades organolépticas semelhantes à carne. Além da elevada capacidade proteica que permite ser um bom substituto de produtos animais, apresenta também maior teor em fibra que os produtos de origem animal. Devido a este teor em fibra, a micoproteína apresenta propriedades tecnológicas que podem ser utilizadas na formulação de produtos, resultando em alimentos com textura modificada e/ou um aumento da estabilidade destes durante as fases de produção e armazenamento (Wiebe, 2004; Ahangi et al., 2008).
Quadro 1 Comparação nutricional entre diferentes alimentos utilizados como fornecedores de proteína na alimentação humana (Wiebe, 2002).
Por 100 g Unidades Pedaços de
Quorn Pedaços de frango sem pele Bife de vaca Tofu Tempeh Energia Kcals 92.0 119.0 160.0 76.0 193.0 Proteína g 14.0 21.4 20.8 8.1 18.6 Hidratos de Carbono g 1.8 0.0 0.0 1.9 9.4 Gordura g 3.2 3.1 7.8 4.8 10.8 Fibra g 4.8 0.0 0.0 0.3 4.3 2.5 QUORNTM
Este é um produto alimentar produzido a partir de biomassa fúngica, resultado do crescimento micelail da espécie Fusarium venenatum (originalmente identificado como Fusarium graminearum). Originalmente o produto era liofilizado e vendido em pó como um produto com elevado valor proteico. No entanto, com o desenvolvimento da indústria desenvolveram-se métodos para melhoramento das qualidades organolépticas sendo actualmente vendido como um substituto da carne na alimentação.
O processo contínuo de produção, a uma taxa de diluição elevada, é visto como o mais económico para produção de matéria de biomassa (Pirt, 1975). Inicialmente o crescimento era controlado pelo nutriente limitante glucose, estando todos os outros em
10 excesso, de modo a que a taxa de crescimento específico pudesse ser ajustada para o crescimento de biomassa. Actualmente o processo é controlado pela taxa de evolução de
CO2, permitindo ajustamentos mais frequentes e precisos na taxa de fluxo. O meio de
cultura é definido, com base em glicose e amónia (e suplementado com biotina), sendo mantido a 28-30 ºC e pH 6 (Wiebe, 2002).
Figura 4 Representação do processo de produção de micoproteína a partir da espécie Fusarium
venenatum (ATCC PTA-2684) (Wiebe, 2002).
Após produção, a biomassa é sujeita a um processo de redução de ácidos nucleicos através da temperatura, 64-65 ºC durante 20 a 30 minutos (Moore e Chiu, 2001; Wiebe, 2002). Este processo de redução de ácidos nucleicos é essencial para a segurança do produto na alimentação, pois rompe os ribossomas, activa ARNases que degradam o
11 ARN celular dos nucleótidos que se difundem para fora das células. Sem este tratamento, ocorre o consumo de purinas em excesso que são metabolizadas em ácido úrico insolúvel, provocando doenças como pedras nos rins ou gota (Ahangi et al.,
2008). O tratamento térmico provoca uma redução a cerca de 1%, estando o limite
definido pela OMS de 2% na alimentação humana. Com este tratamento ocorre a perda de algum teor proteico assim como de outros elementos e cerca de 30% do peso seco é perdido. Após este tratamento, separa-se a biomassa da parte líquida por centrifugação, obtendo-se uma pasta contendo mais de 20% (p/v) de sólidos, sendo a biomassa denominada de micoproteína, que se pode combinar com diversos agentes de ligação, especiarias e aromatizantes. A parte líquida é concentrada e utilizada como agente aromatizante (Wiebe, 2002). Através do processo de extrusão vários produtos podem ser formulados com o valor nutricional inerente dos fungos e com baixo teor de gordura, baixo teor calórico e sem colesterol (Trinci, 1994; Griffen et al., 1997; Wiebe, 2004; Ghorai et al., 2009).
Figura 5 Representação de um fermentador contínuo de pressão cíclico QuornTM utilizado para a produção de micoproteína (Wiebe, 2004).
QuornTM está disponível comercialmente para consumo no Reino Unido desde 1985,
tendo uma boa comparação com outros produtos como carne, proteína vegetal texturizada (PVT’s a partir de farinha de soja), em termos de aparência, textura, aroma e sabor (McIlveen et al., 1999; Rodger, 2001). Apesar das diferentes estratégias de
12 mercado adoptadas nos diferentes países, onde entretanto se tornou disponível, a recepção por parte do consumidor não é tão elevada como acontece por parte de outros produtos, daí que actualmente os produtos micoproteicos sejam mais comercializados como uma escolha alimentar saudável em vez de um produto vegetariano. Tem sido sugerido que a micoproteína pode ser utilizada na produção de cereais de pequeno-almoço e snacks, ou possa ser adicionada a iogurtes e gelados como substituta de gordura (Rodger, 2001). Parte da difícil aceitação por parte do consumidor deve-se a casos de reacção alérgica alimentar e/ou intolerância, estimando-se 1 em cada 100.000 a 200.000 consumidores passíveis de reacção alérgica a estes produtos. Alguns países não aprovam a sua comercialização, como o Canadá pela Canadian Food Inspection Agency (CFIA).
2.6 FUNGOS COMO ALIMENTOS FUNCIONAIS
Os alimentos funcionais são aqueles que, para além de cumprir as funções nutritivas básicas têm propriedades no organismo relativas ao papel metabólico ou fisiológico que o nutriente ou não nutriente tem no crescimento, desenvolvimento, manutenção da saúde e outras funções normais do organismo humano, desde que consumido regularmente. Estes alimentos podem possuir compostos bioactivos, benéficos para a saúde, contribuindo para uma vida mais prolongada e para o bem-estar pessoal, através da prevenção de doenças cardiovasculares, cancro, diabetes e osteoporose. Com o aumento da informação requerida e educação dos consumidores, estes procuram perceber as características dos alimentos consumidos e quais os benefícios que advêm destes, denotando-se um crescente interesse nas implicações que os alimentos têm na saúde e qual o seu papel na prevenção de doenças e melhoramento da saúde, além da composição nutricional base que os alimentos fornecem. Estando o mercado dependente dos interesses dos consumidores denota-se um aumento na procura de alimentos que conferem benefícios para a saúde sendo imprescindível a relação entre o alimento ou ingrediente com doença ou condição relacionada à saúde. Das substâncias que conferem propriedades funcionais aos alimentos, destacam-se os compostos fenólicos e as fibras (Loss, 2009).
Actualmente, os compostos funcionais com maior importância e mais frequentemente utilizados são os pré-bióticos, os probióticos, os antioxidantes, as vitaminas e o cálcio.
13 Tem sido concedida prioridade à produção de probióticos, pré-bióticos e extracção de compostos antioxidantes a partir de materiais vegetais. A procura crescente pelos alimentos funcionais pode ser explicada pelo aumento dos custos dos serviços de saúde, pelo aumento da esperança média de vida e pelo desejo da população idosa em procurar alternativas que possam melhorar a qualidade dos seus últimos anos de vida (Sales, 2012) e pela capacidade de compreensão de como a alimentação afecta a prevenção de uma doença ou a melhoria da saúde (Myeong et al., 2010).
2.7
FUNGOS COMO ALIMENTOS NUTRACÊUTICOSDiversos estudos atribuem aos fungos e cogumelos actividades terapêuticas como hipertensiva, hipoglicémica, alérgica, viral, tumoral, bacteriana, anti-trombocítica, antifúngica, hipocolesterómica, anti-inflamatória, indução da actividade imunológica, antioxidante. (Yang et al., 2002; Urben, 2004; Çaglarirmak, 2007; Loss, 2009; Gil-Ramirez et al., 2011; Santos, 2012).
As paredes celulares dos fungos e cogumelos são constituídas maioritariamente por glicoproteínas e polissacarídeos, principalmente glucanas e quitina, sendo as β-glucanas cerca de metade da parede celular fúngica (Seviour et al., 1992; Klis et al., 2001; McIntosh et al., 2005). Estes polissacarídeos apresentam todas as características nutricionais de uma fibra dietética, isto é, não são digeríveis pelas enzimas do tracto gastrointestinal superior (Cheung, 1996). Os benefícios do consumo de fibra alimentar na alimentação estão bem documentados, apresentando uma acção benéfica no que diz respeito ao tempo de trânsito intestinal, prevenção e tratamento da obstipação, cancro colorectal, doença coronária e diabetes (Mendeloff, 1987; Harig, l989; McIntyre et al., 1993; Cassidy et al., 1994), actuação como pré-biótico estimulando o crescimento da microflora intestinal benéfica e desenvolvimento da viscosidade no intestino, relacionada com o controlo do metabolismo da glucose e dos lípidos (Roediger, l980; Mendeloff, 1987; Mortensen et al., 1988; Wiele et al., 2004; Parnell e Reimer, 2012; Jakobsdottir et al., 2014). Os cogumelos comestíveis são boas fontes de fitoesteróis, como ergosterol (Ricardo, 2013) ou fungisterol e outros derivados que estão presentes nos cogumelos pois são compostos constituintes das membranas das hifas, tendo propriedade hipocolesterómica (Gil-Ramirez et al., 2011).
14 A bioactividade dos fungos basidiomicetas foi confirmada em 1957 (Lucas 1957) sendo estudada intensivamente a partir daí. Numerosos estudos demonstraram que as propriedades anti-cancerígenas de compostos biologicamente activos isolados de cogumelos são maioritariamente atribuídos aos polissacarídeos (Mizuno 1996; Mizuno 1999; Reshetnikov et al., 2001; Wasser 2002; Zhou et al., 2007).
2.8 EXOPOLISSACARÍDEOS FÚNGICOS
Os exopolissacarídeos (EPS) são definidos como polissacarídeos extracelulares, produzidos por alguns fungos e bactérias, os quais são encontrados ligados à superfície das células ou são excretados para o meio, sendo a sua recuperação, purificação e caracterização química simples (Seviour et al., 1992; Sousa 2009; Cardoso, 2011). Os EPS microbianos são conhecidos pelas suas propriedades espessantes, gelificantes e emulsificantes, tendo sido estudados em maior quantidade os EPS produzidos por bactérias e fungos (Mahapatra e Banerjee, 2013). Algum do carbono assimilado pelos fungos é usado na biossíntese de material celular. Estes materiais podem incluir constituintes da parede celular (quitina), polissacarídeos de armazenamento (glicogénio), e uma grande variedade de outros metabolitos. Muitos destes compostos são polissacarídeos que não estão envolvidos directamente no fornecimento de energia, no entanto, fazem parte dos componentes estruturais da parede celular (Zhang et al., 2006). Uma das aplicações destes biopolímeros é na saúde humana, por exemplo, um exopolissacarídeo produzido pela espécie Ganoderma lucidum, contém actividade imunoestimuladora e propriedades anti-tumorais (Fraga et al., 2014). Vários estudos em polissacarídeos fúngicos têm-se concentrado nas suas propriedades anti-cancerígenas. Podem ainda ser utilizados no controlo da formação de leucócitos (efeito anti-inflamatório), no tratamento da artrite reumatóide, na síntese de antigénios para produção de anticorpos, na protecção contra danos oxidativos no ADN e em cosméticos como agentes de hidratação da pele. Estes polissacarídeos, indirectamente, interagem também com lipoproteínas de baixa densidade, o que resulta na eliminação da fracção lipídica do sangue (Chen e Seviour 2007), sendo um factor importante para a redução do colesterol LDL, através da actuação na microflora intestinal e viscosidade no intestino. As glucanas representam um amplo grupo de polissacarídeos
anti-15 cancerígenos, e são indicadas também como efectivas no tratamento de infecções microbianas, hipercolesterolemia e diabetes.
As moléculas das glucanas são compostas por outros monossacáridos para além da glucose. Os cogumelos possuem usualmente glucanas contendo arabinose, manose, fucose, galactose, xilose, ácido glucorónico e também glucose (Wasser 2002). Estas glucanas são moléculas lineares ou ramificadas tendo uma cadeia principal composta por α ou β ligações de glucose, tendo algumas destas cadeias laterais em diferentes posições (Gorin e Barreto-Berger, 1983; Zhang et al., 2007).
As propriedades físicas e fisiológicas dos polissacarídeos são determinadas pelas diferenças químicas tais como: composição de monossacarídeos, tipo de ligação glicosídica e grau de ramificação. Grandes variações no grau de ramificação destes polímeros podem afectar a sua solubilidade em água e consequentemente o seu tratamento e purificação, aplicabilidade e propriedades biológicas. Os EPS fúngicos são constituídos principalmente por β-D-glucose (Zhang et al., 2007), essencialmente (1-3) ou (1-6)-β-D-glucanas. A composição do meio e as condições de cultura interferem
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Quadro 2 Origem, tipo e bioactividades de alguns polissacáridos isolados de fungos (Zhang et al., 2007).
Fungo de origem Origem dos polissacáridos Tipo de polissacáridos Bioactividade principal
Pleurotus tuber-regium Esclerócio e micélio β-D-glucanas Hepato protetor, anti-cancro mamário
Ganoderma lucidum Cogumelo e meio de cultura Heteroglicanas, manoglucanas, glicopeptídeos
Hiperglicemia, imunomodelador, tumor, antioxidante, anti-envelhecimento
Auricularia auricula-judae Cogumelo Glucanas Hiperglicemia, imunomodelador, anti-tumoral, anti-inflamatório, anti-radioactividade
Schizophyllum commune Micélio Glucanas, esquizofilano Anti-tumoral
Hericum erinaceus Micélio e cogumelo Heteroglicanas, hétero glicopeptídeos Imunomodelador, anti-tumoral, anti-hiperglicemia
Lentinus edodes Meio de cultura e cogumelo Manoglucanas, complexo polissacárido-proteína, glucanas, lentinanas Imunomodelador, anti-tumoral, anti-viral Sclerotinia Sclerotiorum
Esclerócio Glucanas, escleroglucana Anti-tumor Trametes versicolar Cogumelo, meio de cultura e
micélio
Heteroglicana, glicopeptídeo, Krestin (PSK)
Imunomodelador, anti-tumoral, radioactividade, anti-hiperglicemia, anti-inflamatório Grifola frondosa Cogumelo Proteoglucana, glucana,
galactomanana, heteroglicana, grilolan
Imunomodelador, anti-tumoral, anti-viral, hepato protetor Inonotus obliquus Cogumelo e micélio Glucana Anti-tumoral, imunomodelador Agaricus blazei Cogumelo e micélio Glucana, heteroglicana,
proteína-glucano, complexo proteína glucomanana
Anti-tumoral
Flammulina velutipes Cogumelo e micélio complexo proteína glucana, glicoproteína
Anti-tumoral, anti-inflamatório, anti-viral, imunomodelador Ganoderma applanatum Cogumelo Glucana Anti-tumoral
Polyporus umbellatus Micélio Glucana Anti-tumoral, imunomodelador Clitopilus caespitosus Cogumelo Glucana Anti-tumoral
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Fungo de origem Origem dos polissacáridos Tipo de polissacáridos Bioactividade principal
Trametes robiniophila Micélio Proteoglucana Imunomodelador, hepato protetor, anti-cancerígeno Tremella fuciformes Cogumelo, meio de cultura e
micélio
Heteroglucana Anti-hiperlipidemia,
hiperglicemia, imunomodelador, anti-tumoral, anti-decrepitude Tremella aurantialba Cogumelo e micélio Heteroglucana Imunomodelador, hiperglicemia Pleurotus ostreatus Cogumelo Glucoproteína Anti-tumoral, hiperglicemia,
antioxidante
Morchella esculenta Cogumelo Heteroglucana Hiperglicemia, anti-tumoral Omphalia lapidescens Cogumelo Glucana Anti-inflamatório,
imunomodelador Phellinus linteus Cogumelo Glucana Anti-tumoral Armillaria tabescens Micélio Heteroglucana Anti-tumoral
Dictyophora indusiata Cogumelo Heteroglucana, manana, glucana Anti-tumoral, hiperlipidemia Peziza vericulosa Proteoglucana, glucana Imunomodelador, anti-tumoral Tricholoma mongolium Glucana Anti-tumoral
Cordyceps sp. Glucana, heteroglucana Anti-tumoral, imunomodelador, anti-tumoral, hiperglicemia
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2.9
PROPRIEDADES NUTRICIONAIS E NUTRACÊUTICAS DE PLEUROTUS OSTREATUS E PLEUROTUS CITRINOPILEATUSSob o ponto de vista nutricional, os cogumelos comestíveis do género Pleurotus apresentam elevado conteúdo proteico quando comparados à maioria dos vegetais (Bano e Rajarathnam, 1988). Os cogumelos representam uma importante fonte de aminoácidos, podendo conter todos os essenciais e não essenciais, além de conter minerais, como cálcio, potássio, iodo, fósforo, magnésio, ferro e também vitaminas, como tiamina, riboflavina, niacina, ácido ascórbico e outras do complexo B, quitina, compostos fenólicos totais (Manzi et al., 2004). No entanto, a composição química, assim como o aroma e sabor, variam de acordo com a espécie, o substrato utilizado no seu cultivo, o tempo de desenvolvimento, as condições ambientais, a técnica de colheita aplicada e do processamento pós-colheita (Duprat, 2012).
Pleurotus ostreatus é dos fungos comestíveis mais importantes na Europa. Sendo o segundo cogumelo cultivado, em termos de produção, para fins alimentares, é consumido em praticamente todo o mundo (Deepalakshmi e Mirunalini, 2014). Tem um crescimento rápido e apresenta propriedades lenhinolíticas, podendo assim ser utilizados resíduos lenhinocelulósicos no seu crescimento (Platt et al., 1984) e utilizados no pré-tratamento de meios lenhinocelulósicos para hidrólise enzimática (Patil et al., 2010), na biorremediação (Souza e Rosado 2009; Javaid et al., 2011), na bioconversão (Ortega et al., 1992), no tratamento de águas ruças (Olivieri et al., 2006), produção de antioxidantes (Jayakumar et al., 2009; Patra et al., 2013; Ricardo 2013; Vieira et al., 2013) e na produção de compostos medicinais e farmacêuticos (Tong et al., 2009; Ricardo 2013; Facchini et al., 2014), nomeadamente lovastatina, a primeira do género a ser produzida industrialmente e que alcançou uma utilização diversificada, tendo como principal função a inibição da formação de colesterol (Alarcón et al., 2003; Lisec et al, 2012). Outros estudos confirmaram que esta espécie ou seus extractos contém compostos com potencial atividade hipocolesterómica (Gil-Ramirez et al., 2011).
19
Quadro 3 Composição nutricional de Pleurotus ostreatus (Manzi et al., 2001).
Nutriente Composição por 100g
Matéria seca 8-12 Proteína 11-35 Cinzas 6-9 Gordura 2-6 Hidratos de carbono 47-82 Fibra dietética 22-51
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Quadro 4 Composição em aminoácidos do micélio de Pleurotus ostreatus var. ‘Florida’ (Hadar
e Cohen-Arazi, 1986).
Furlani e Godoy (2007) avaliaram a composição centesimal, o teor de ácido ascórbico, a fibra alimentar e o fósforo das espécies de cogumelos Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes. Estes autores verificaram que estes alimentos possuem características nutricionais excelentes, pois apresentam alto teor de proteínas e fibras alimentares, além de conterem baixo teor de lípidos. Há uma considerável quantidade de fósforo, mas os valores de ácido ascórbico não são expressivos para considerá-los fonte dessa vitamina. O quadro 5 apresenta os resultados obtidos. Loss (2009) realizou análise
Aminoácidos mg/g (peso seco) Micélio Ácido aspártico 27.6 Treonina 7.8 Serina 8.0 Ácido glutâmico 18.1 Prolina 6.5 Glicina 7.7 Alanina 12.3 Cisteína 13.4 Valina 2.8 Metionina 5.9 Isoleucina 11.0 Leucina 3.0 Tirosina 6.4 Fenilalanina 10.4 Histidina 19.0 Lisina 8.9 Arginina 9.9
21 de caracterização do produto obtido (Pleurotus ostreatus) após realização de teste, que avaliou o aproveitamento de resíduos da cadeia produtiva do milho para cultivo de
cogumelos comestíveis.
Quadro 5 Valores nutricionais para as espécies de cogumelos Agaricus bisporus, Pleurotus
ostreatus) e Lentinula edodes (Furlani e Godoy, 2007; (*) Loss, 2009).
Análise realizada Agaricus bisporus Lentinula edodes Pleurotus ostreatus Pleurotus ostreatus (*)
Teor de sólidos totais
(%) (base húmida) 8.00 + 1.07 8.39 + 1.62 9.23 + 1.71 - Teor de hidratos de carbono (%) (base seca) 54.12 + 7.42 69.58 + 2.05 65.82 + 7.86 65.76 + 0.17 Teor de proteínas (%) (base seca) 28.45 + 7.25 18.98 + 1.16 22.22 + 6.37 13.5 + 0.60 Teor de lípidos (%) (base seca) 5.42 + 1.37 4.39 + 1.30 4.30 + 1.01 1.00 + 0.30 Teor de cinzas (%) (base seca) 11.98 + 1.54 7.04 + 1.24 7.65 + 1.20 4.56 + 0.30 Teor de fibra alimentar
(%) (base seca) 20.44 + 2.34 41.92 + 4.57 39.62 + 13.12 34.6 + 0.08 Teor de ácido ascórbico (mg.100 g-1) (base húmida) 6.30 + 1.34 7.19 + 1.55 6.50 + 0.72 - Teor de fósforo (mg.100 g-1) (base húmida) 113.3 + 22.5 89.4 + 23.7 109.7 + 59.0 -
O cogumelo Pleurotus citrinopileatus é conhecido como cogumelo ostra dourado. Tem
igualmente propriedades lenhinolíticas, podendo ser utilizados materiais
lenhinocelulósicos no seu crescimento (Singh e Singh, 2011). Contém abundância em minerais e aminoácidos essenciais, é uma fonte de antioxidantes (Lee et al., 2007) e tem sido também estudado pelas suas propriedades no tratamento da hiperglicemia (Hu et al., 2006). Os polissacarídeos hidrossolúveis desta espécie possuem actividade anti-tumoral (Zhang et al., 1994) e anti-genotoxicidade (Wang et al., 2005), entre outras (Chen et al., 2009). Têm sido conduzidos estudos na extracção e identificação de glucanas com potenciais aplicações medicinais (Liu et al., 2012). O micélio desta
22 espécie pode ser utilizado como aromatizante e alimento assim como na formulação de alimentos nutracêuticos e funcionais (Lee et al., 2007).
Os fungos do género Pleurotus são excelentes produtores de biomassa, sendo dos mais cultivados devido às suas reduzidas exigências nas condições de cultivo e elevada eficiência biológica (Campos et al., 2010).
2.10 VANTAGENS DO CULTIVO SUBMERSO
O cultivo submerso de microrganismos permite um leque de processos industriais que de outra forma seriam mais morosos, caros ou mesmo incompatíveis de realizar para uma produção intensiva. O sistema de crescimento de fluxo contínuo é dos mais rentáveis com elevadas taxas de produtividade, isto devido à possibilidade de se controlar e adaptar as condições do meio ao crescimento do microrganismo. O crescimento ocorre em meio submerso, podendo as condições permanecerem constantes durante toda a fase de produção, ou serem alteradas se o crescimento de determinado microrganismo tiver diferentes fases de produção. Este processo permite um crescimento alargado de biomassa com elevada produtividade e eficiência (Papaspyridi et al., 2010), uma melhor dispersão dos microrganismos pelo meio, possibilidade de agitação, o fornecimento do oxigénio em doses controladas no meio e um maior controlo da qualidade do produto (Zhou et al., 2014). A separação da biomassa e do meio de cultura a jusante dos processos é relativamente fácil assim como o tratamento dos efluentes resultantes (Trinci, 1994). Esta metodologia requer menos tempo e espaço do que o tradicional cultivo de macrofungos para a produção de frutificações. No entanto, esta biotecnologia ainda não está desenvolvida ao seu máximo potencial (Ghorai et al., 2009).
2.11 VALORIZAÇÃO DE SUBPRODUTOS DA INDÚSTRIA AGRO-ALIMENTAR
Com o desenvolvimento da indústria agro-alimentar, o escoamento de resíduos e subprodutos ganha cada vez mais importância, surgindo a necessidade de arranjar alternativas viáveis para o reaproveitamento dos mesmos, uma vez que a sua destruição acarreta, na maioria dos casos, problemas ambientais (Aghajanzadeh-Golshani et al.,
23 2010). Cada vez mais se tem criado sinergias no sentido de cooperação industrial e reaproveitamento de subprodutos industriais, como exemplo, o aumento de eco-parques industriais, possibilitando a partilha ou reaproveitamento de recursos, matérias-primas secundárias, o que se traduz num melhoramento económico de uma indústria assim como também um melhoramento a nível ambiental, moral e social. As empresas industriais já não consideram os seus resíduos como um desperdício, mas sim como uma nova matéria-prima para outros processos, capaz de gerar capital ao invés de ser uma fonte de despesas adicionais (Sales, 2012). Existe um número elevado de subprodutos na indústria agro-alimentar com a capacidade de serem transformados em matéria-prima para o crescimento fúngico e que têm vindo a ser investigados (Tavares et al., 2005; Sales-Campos, 2008; Loss, 2009; Patil et al., 2010; Singh e Singh, 2011; Duprat, 2012).
Em Portugal, a reutilização de subprodutos para outras indústrias também tem vindo a aumentar, no entanto, ainda não se faz a uma escala generalizada, visto que muitos pequenos industriais ainda não efectuam a valorização dos seus subprodutos traduzindo-se numa perda de capital e aumento dos riscos ambientais. Com o melhoramento do processo de utilização da matéria-prima bruta de origem vegetal, ao mesmo tempo em que se reduzem os impactos sobre o meio ambiente e as pressões sobre os recursos naturais, amplia-se a sustentabilidade socio-económica gerando oportunidades de trabalho e aumento da receita (Assi et al., 2007).
Neste trabalho, resíduos da indústria da transformação da batata foram utilizados como matéria-prima para o crescimento de biomassa fúngica, nomeadamente, casca de batata, com o objectivo de valorizar subprodutos desta indústria.
24
25
3.1 FUNGOS EM ESTUDO E PRODUÇÃO DE INÓCULOS
A cultura micelial do fungo Pleurotus ostreatus (UF 21400) obteve-se a partir de um corpo frutificado recolhido em Vila Real e a cultura micelial do fungo Pleurotus citrinopileatus obteve-se a partir de um corpo frutificado adquirido comercialmente. Ambas as culturas mantêm-se em colecção no Laboratório de Micologia e Microbiologia Aplicada da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.
A cultura de Fusarium venenatum A3/5 (ATCC PTA-2684) foi adquirida ao banco de culturas American Type Culture Collection (ATCC).
Inicialmente o meio de cultura de manutenção da espécie Fusarium venenatum foi o Potato Dextrose Agar (PDA) com extrato de malte a 5% de acordo com as especificações. Posteriormente alterou-se para Potato Dextrose Agar (PDA) e este foi também o meio de cultura utilizado para multiplicação das culturas.
A esterilização do meio foi efectuada no autoclave a 121 °C durante 15 min a 1,2 atm, deixando-se arrefecer até 45 °C e distribuído por placas de Petri. A inoculação com as culturas referidas foi efectuada à chama e em câmara de fluxo laminar com recurso a um bisturi esterilizado.
3.2 PRODUÇÃO DE BIOMASSA E ELABORAÇÃO DE PROTÓTIPOS
3.2.1 METODOLOGIA PARA MEIO DE CULTURA
A primeira fase deste trabalho considerou a produção em Erlenmeyer, fazendo-se variar o meio de cultura, com a posterior inoculação:
1. Erlenmeyers de 250 ml contendo 100 ml do meio de cultura composto por 27 g de Potato Dextrose Broth (PDB) em 1000 ml de água destilada. A inoculação foi efectuada com a espécie Pleurotus ostreatus. Colocou-se a 25 ºC com uma agitação de 120 rpm.
2. Erlenmeyers de 250 ml contendo 100 ml do meio de cultura composto por 27 g de PDB em 1000 ml água destilada e 5 g de extracto de levedura. A inoculação foi efectuada com a espécie Pleurotus ostreatus. Colocou-se a 25 ºC com uma agitação de 120 rpm.
3. Erlenmeyers de 250 ml contendo 100 ml do meio de cultura composto por 27 g de PDB em 1000 ml água destilada e 5 g de extracto de malte. A inoculação foi
26 efectuada com a espécie Pleurotus ostreatus. Colocou-se a 25 ºC com uma agitação de 120 rpm.
4. Erlenmeyers de 250 ml contendo 100 ml do meio de cultura composto por 27 g de PDB em 1000 ml água destilada e 5 g de extracto de levedura. A inoculação foi efectuada com as espécies Pleurotus ostreatus, Pleurotus citrinopileatus e Fusarium venenatum. Colocaram-se a diferentes temperaturas e agitações: 22 ºC, 25 ºC e 28 ºC, a 120 rpm e 150 rpm.
5. Preparou-se o meio de cultura com casca de batata obtida comercialmente, tendo em vista avaliar a possibilidade de aproveitar este subproduto da indústria das batatas fritas. As cascas de batata foram lavadas com água 5 vezes e ferveu-se 200 g num litro de água durante 1 h. A parte líquida foi separada da sólida através de filtração e adicionou-se 5 g de extracto de levedura e dextrose 20 g/l. Corrigiu-se o pH até 7. Esterilizou-se a parte líquida no autoclave a 121 °C durante 15 min a 1,2 atm. A cultura micelail foi realizada em Erlenmeyers de 250 ml contendo 100 ml do meio de cultura composto pelo preparado de casca. A inoculação foi efectuada com a espécie Pleurotus ostreatus. Colocou-se a 25 ºC com uma agitação de 150 rpm.
6. Com o objectivo de obter micélio corado, preparou-se o meio de cultura o meio de cultura descrito no ponto 5. adicionado de 50 g de beterraba. A parte líquida foi separada da sólida através de filtração. A beterraba foi liquidificada e adicionada à parte líquida. Adicionou-se 5 g de extracto de levedura e dextrose 20 g/l. Corrigiu-se o pH até 7. Esterilizou-se a parte líquida por autoclave 121 °C durante 15 min a 1,2 atm. O crescimento micelial foi realizado em Erlenmeyers de 250 ml contendo 100 ml do meio de cultura. A inoculação foi efectuada com a espécie Pleurotus ostreatus. Colocou-se a 25 ºC com uma agitação de 150 rpm.
7. Preparou-se o meio de cultura descrito no ponto 6 mas com 300 g de cascas de batatas. A inoculação foi efectuada com a espécie Pleurotus ostreatus. Colocou-se a 25 ºC com uma agitação de 150 rpm.
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3.2.2 SEPARAÇÃO DA BIOMASSA FÚNGICA E MEIO DE CULTURA
A separação da biomassa e do líquido de crescimento foi efectuada por filtração por recurso a filtro de papel e de seguida utilizou-se filtração com bomba de vácuo utilizando um filtro de fibra de vidro. A parte líquida foi congelada para posterior análise de EPS.
3.2.3 MISTURA DA BIOMASSA COM ADITIVOS
Para formulação de protótipos alimentares adicionaram-se vários aditivos à biomassa micelial filtrada em diferentes proporções, seguindo-se a mistura até uma pasta homogénea:
A. A 10 g de biomassa adicionou-se farinha de trigo em quantidades crescentes de 2 g, 3g, 4 g, 5 g, 6 g e 7 g.
B. A 10 g de biomassa adicionou-se amido de milho em quantidades crescentes de 2 g, 3g, 4 g, 5 g, 6 g e 7 g.
C. A 10 g de biomassa adicionou-se 5 g de farinha de trigo e pectina comercial em quantidades crescentes de 1 ml, 2 ml e 3 ml.
D. A 10 g de biomassa adicionou-se 5 g de farinha de trigo, 2 ml de pectina e albumina (142g/l) (clara em pó gentilmente fornecida pela empresa INDUXTRA) em quantidades crescentes de 1 ml, 2 ml e 3 ml.
3.2.4 COZIMENTO A VAPOR E CONGELAÇÃO
Após a mistura elaboraram-se os protótipos manualmente ou com recurso a formas e efectuou-se o cozimento a vapor das amostras durante 20 min. Após este tempo congelaram-se as amostras para posterior análise.
28
3.3 ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS EXOPOLISSACARÍDEOS
(EPS) SOLÚVEIS EM ÁGUA
O isolamento e purificação dos exopolissacarídeos presentes no líquido de crescimento, efectuado neste trabalho incidiram, exclusivamente, nos polissacarídeos solúveis em água, visto estes estarem presentes em maior concentração.
3.3.1 PRECIPITAÇÃO EM ETANOL
A 100 ml de líquido de crescimento foi adicionado 400 ml de etanol a 96%, perfazendo 80% (v/v), lentamente e com agitação (Tavares et al., 2005). A solução ficou em repouso durante a noite a 4 °C, obtendo-se o resíduo insolúvel em etanol.
3.3.2 PRECIPITAÇÃO POR EVAPORAÇÃO DE ÁGUA
Após o repouso, a solução foi centrifugada a 12000 rpm durante 10 min a 4 °C. De seguida o sobrenadante foi retirado e concentrado num evaporador rotativo a 40 °C até se atingir ¼ do seu volume inicial. Sempre que se verificou um precipitado a evaporação foi parada e o precipitado novamente separado por centrifugação. O sobrenadante resultante era novamente concentrado.
3.3.3 SOLUBILIZAÇÃO DO PRECIPITADO
O precipitado obtido por centrifugação foi solubilizado por água destilada à temperatura ambiente. Os precipitados foram dialisados contra água destilada (12 mudas de água). O remanescente da diálise foi congelado e liofilizado.
As amostras liofilizadas anteriormente foram solubilizadas numa solução de ácido
sulfúrico (H2SO4) a 72% com agitação à temperatura ambiente por 3 horas com um
ciclo de 30 em 30 min. Após este período adicionou-se 4 ml de água ultra pura e colocaram-se num bloco de aquecimento a 100 ºC durante 2 horas e meia. Após arrefecimento adicionou-se a solução padrão interno (1mg/ml de 2-desoxi-D-glucose).
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3.3.4 QUANTIFICAÇÃO DOS AÇÚCARES
Para a quantificação dos açúcares foram preparadas soluções padrão de fucose, ramnose, glucosamina, arabinose, galactose, glucose, manose, ácido galacturónico e ácido glucurónico, individualmente, com uma concentração de 10 mg/ml. As soluções padrão de trabalho foram obtidas por medição de volumes que variaram entre 25 e 250 µl para os padrões de açúcares e de 500 µl para o padrão interno (1mg/ml de 2-desoxi-D-glucose). Perfez-se o volume de 4900 mg com água ultrapura. A composição dos padrões foi obtida por aleatorização da sua composição.
A quantificação dos açúcares nas amostras foi obtida pela técnica do padrão interno.
3.3.5 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
A análise foi efectuada por cromatografia de alta performance de troca aniónica com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD, ICS-3000, Dionex). A separação foi realizada com uma coluna CarboPac PA-20 (150 mm x 3 mm) com uma pré-coluna CarboPac PA20 (Dionex) usando uma eluição isocrática com uma solução de NaOH a
10 mM contendo 2 mMBa(OH)2 e NaOH 10 mM contendo 1 CH3COONa. O eluente foi
mantido sob azoto, para reduzir a acumulação de carbonato e contaminação biológica. O volume de injecção foi 5µl G, a taxa de fluxo foi de 0,3 ml/min e a temperatura da coluna foi mantida a 35 ºC durante a corrida.
3.4 ANÁLISES NUTRICIONAIS
3.4.1 DETERMINAÇÃO DA MATÉRIA SECA
Pesou-se 2,5 g de amostra para uma cápsula de porcelana (que foi anteriormente colocada em estufa a 105 ºC, arrefecida em excicador e posteriormente pesada). De seguida secou-se o resíduo na estufa a 105 ºC e deixou-se, pelo menos 6 h. Levou-se ao excicador, deixando arrefecer e pesou-se a cápsula mais resíduo seco. O procedimento foi efectuado em duplicado.
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3.4.2 DETERMINAÇÃO DA MATÉRIA ORGÂNICA
Levou-se a cápsula mais resíduo seco à mufla a 550 ºC, durante 3 h, para obtermos a cinza. Levou-se a cinza à estufa a 105 ºC e deixou-se pelo menos 6 h. O procedimento foi efectuado em duplicado.
3.4.3 DETERMINAÇÃO DA PROTEÍNA BRUTA
Para a determinação da proteína bruta, foi utilizado o método do aparelho KJELTEC SYSTEM 1026 Destilling Unit. Preparação das soluções de NaOH (hidróxido de sódio)
40%; H3BO3 (ácido bórico) 4%; H2SO4 (ácido sulfúrico) 0,1 N.
Pesou-se em duplicado 0.2g de amostra moída (1mm), seca (em estufa, com circulação forçada de ar a 65 ºC) para tubos. Juntou-se a pastilha de 99,9% de sulfato de potássio e
0,1% de selénio e 5 ml de H2SO4 p.a. e agitou-se. Levou-se ao digestor durante 1 h a
420 ºC. Deixou-se arrefecer. Após o arrefecimento destilou-se durante cerca de 4
min/20 seg. onde se adicionou H2O destilada, NaOH 40% H3BO3 4%. Titulou-se com
H2SO4 0.1 N.
(Volume da titulação- Branco)* Normalidade do ácido * 1.4* 6,25 Toma * %MS
3.4.4 DETERMINAÇÃO DA GORDURA BRUTA
Para a determinação da gordura bruta foi utilizado o aparelho Soxtec System HT (TECATOR). A uma temperatura de 110 ºC ligou-se o sistema de refrigeração. Pesou-se em duplicado 3g de amostra moída (1mm), Pesou-seca (em estufa, com circulação forçada de ar a 65 ºC) para os cartuchos, colocando sobre a amostra algodão hidrófilo. Arrefeceram-se e pesaram-se os alumínios e adicionou-se, a cada um deles, 50 ml de éter de petróleo e colocaram-se nos devidos suportes. Durante 25 min, os cartuchos foram embebidos no éter de petróleo na posição de “BOILING” e posteriormente no “RISING” durante 30 min. Para a recuperação do éter fecharam-se as torneiras, abriu-se
31 o ar e evaporou-se entre 5 a 10 min. Retirou-se o suporte com os cartuchos e o éter recuperado. Colocaram-se os alumínios na estufa a 105 ºC durante a noite. Arrefeceram-se no excicador e pesaram-Arrefeceram-se.
Teor de gordura % (MS) = ((P1-P2)/ P*%MS)*100
(P = peso da amostra; P1 = Peso do alumínio + gordura após a secagem; P2 = Peso do alumínio)
3.4.5 DETERMINAÇÃO DA FIBRA ALIMENTAR TOTAL
A determinação do teor de fibra alimentar total foi realizada tendo por base o método AOAC 985.29 (enzimático-gravimétrico), resultante do descrito por Prosky et al., (1985).
a. DIGESTÃO ENZIMÁTICA
Pesou-se, em duplicado, 1 g de amostra seca e moída (entre 0,3 a 0,5 mm), com aproximação de 0,1 mg, ao qual se adicionou 50 ml de tampão fosfato (pH 6,0). Adicionou-se 50 µl de α-amilase termoestável. Os copos são tapados com folha de alumínio e colocados num banho-maria a uma temperatura entre os 95 ºC a 100 ºC durante 30 min, com agitação a cada 5 min. Após arrefecimento, até à temperatura ambiente, procedeu-se ao ajuste do valor de pH a 7,5 ±0,2 por adição da solução de NaOH 0,275N e adicionou-se 100 µl da solução de protease previamente preparada (100 µl de uma solução a 5% (p/v) de protease em tampão fosfato). Taparam-se novamente os copos com folha de alumínio e incubou-se durante 30 min a 60 ºC com agitação contínua. Arrefeceu-se a solução, adicionou-se 10 ml da solução de HCL (0,325N) e mediu-se o pH, ajustando-se de modo ao pH final ser de 4,4-4,6. Adicionou-se 200 µl de amiloglucosidaAdicionou-se, taparam-Adicionou-se os copos com folha de alumínio e incubou-Adicionou-se durante 30 min a 60 ºC, com agitação contínua. Adicionou-se 280 ml de etanol 95% pré-aquecido a 60 ºC e deixou-se precipitar à temperatura ambiente durante 60 min.
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b. FILTRAÇÃO E LAVAGEM
Pesou-se, com aproximação de 0,1 mg, um cadinho de placa filtrante com porosidade 2, previamente lavado e incinerado em mufla durante 1 h a 525 ºC, contendo cerca de 0,5 g de Celite (após a colocação da Celite os cadinhos foram secos em estufa a 105 ºC durante 2 h e tomado o peso após este tempo). Redistribuiu-se a Celite no cadinho com etanol a 78%. Aplicou-se vácuo, com o auxílio de uma bomba de vácuo, de modo a secar a Celite sobre a placa porosa do cadinho. Mantendo-se o vácuo, transferiu-se quantitativamente o precipitado da digestão enzimática da amostra para o cadinho. O resíduo resultante da filtração foi sucessivamente lavado com 3 porções de 20 ml de etanol a 78%, 2 porções de etanol a 95% e 2 porções de 10 ml de acetona.
c. SECAGEM DO RESÍDUO E PESAGEM
Procedeu-se à secagem do resíduo contido no cadinho em estufa a 105 ºC até massa constante. Após arrefecimento em excicador, pesou-se o cadinho com o resíduo e a Celite, com aproximação de 0,1 mg, para determinar a massa do resíduo.
d. DETERMINAÇÃO DA PROTEÍNA E DA CINZA DA AMOSTRA
A determinação da proteína foi efectuada num dos resíduos dos duplicados de cada amostra pelo método de Kjeldahl, AOAC 978.04 (1999), utilizando 6,25 como factor de conversão do teor em proteína.
O outro resíduo dos duplicados de cada amostra foi utilizado na determinação das cinzas, para o que foi incinerado em mufla a 525 ºC durante 5h, posteriormente seco em excicador e pesado com aproximação de 0,1 mg.
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e. CÁLCULO DO TEOR DE FIBRA ALIMENTAR TOTAL
O teor de fibra alimentar total (FT) referente à matéria seca foi calculado de acordo com a seguinte expressão:
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4.1 PRODUÇÃO DE BIOMASSA
No presente trabalho foram estudados diferentes meios de cultura para produção de biomassa por Pleurotus ostreatus, Pleurotus citrinopileatus e Fusarium venenatum, recorrendo a balões Erlenmeyers (figura 6).
Figura 6 Produção de biomassa de Pleurotus ostreatus em Erlenmeyer.
Após uma fase inicial de verificação do melhor meio de cultura 1, 2 e 3 para o crescimento micelial, verificou-se que o meio de cultura 2, com a fonte de azoto fornecido pelo extracto de levedura, foi o melhor produtor de biomassa, verificando-se uma colonização completa do meio de cultura por volta do dia 10. Assim fizeram-se novas produções com a variação da temperatura e agitação de modo a testar quais as condições mais favoráveis para a produção de biomassa (meio de cultura 4). Também de referir que o meio de cultura sugerido para o Fusarium venenatum pelo banco de culturas onde foi adquirido (ATCC) não foi aquele onde se obteve maior crescimento micelial, pelo que o seu crescimento posterior para as posteriores análises foi no meio de cultura 4 (suplementado com 5 g de extracto de levedura). Relativamente ao crescimento no meio de cultura 4 verificou-se que as espécies Pleurotus ostreatus e Pleurotus citrinopileatus têm um crescimento micelial superior aos 25 ºC, sendo inferior aos 22 ºC e aos 28 ºC. Para a espécie Fusarium venenatum notou-se um crescimento inferior aos 22 ºC, tendo-se obtido um crescimento semelhante às temperaturas de 25 ºC e 28 ºC. Em relação à agitação, independentemente da
