Dinâmica da IgA secretora específica na lágrima empacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por Toxoplasma gondii durante o primeiro trimestre da doença

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL. MIRELLE SOUZA LEÃO VASCONCELOS. “DINÂMICA DA IgA SECRETORA ESPECÍFICA NA LÁGRIMA EM PACIENTES PORTADORES DE UVEÍTE POSTERIOR ATIVA PRESUMIVELMENTE POR Toxoplasma gondii DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA DOENÇA.”. RECIFE - PE 2009.

(2) MIRELLE SOUZA LEÃO VASCONCELOS. “DINÂMICA DA IgA SECRETORA ESPECÍFICA NA LÁGRIMA EM PACIENTES PORTADORES DE UVEÍTE POSTERIOR ATIVA PRESUMIVELMENTE POR Toxoplasma gondii DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA DOENÇA.”. Dissertação apresentada ao colegiado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de mestre em Medicina Tropical. Área de Concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias.. Orientadora: Profª. Drª. Elizabeth Malagueño de Santana Co-orientadora: Profª. Drª. Maria Isabel Lynch de Moraes. RECIFE - PE 2009.

(3) Vasconcelos, Mirelle Souza Leão Dinâmica da IgA secretora específica na lágrima em pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por Toxoplasma gondii durante o primeiro trimestre da doença / Mirelle Souza Leão Vasconcelos. – Recife : O Autor, 2009. 88 folhas: il., fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Medicina Tropical, 2009.. Inclui bibliografia, anexos e apêndices. 1. Toxoplasmose ocular. 2. IgA secretora da lágrima. 3. Imunodiagnóstico ocular. I. Título.. 617.721.6 717.72. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). UFPE CCS2009-064.

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(5) DEDICO. Aos meus pais, Homero e Iranete, pelo exemplo de amor e doação, todas as minhas conquistas são graças a vocês. Aos meus irmãos, Millena e Hermann, pela atenção e carinho dispensados em todos os momentos. A Leuzinger pelo amor, carinho e compreensão..

(6) AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus pelo dom da vida e pela força nos momentos difíceis. Aos anjos especiais que tenho ao meu lado: Mainha, Painho, Millena e Hermann. Sempre presentes, atenciosos, amáveis e carinhosos durante toda minha vida, nos melhores e piores momentos, não deixando de estar comigo nessa nova etapa. À profª. Drª. Maria Isabel Lynch pela sua orientação, dedicação, carinho e atenção que vem de muito antes dessa dissertação. Por seu jeito doce de ensinar, por sua humildade e competência que tanto admiro. É um exemplo a ser seguido. À profª. Drª. Elizabeth Malagueño pela orientação e confiança em mim depositada na realização deste trabalho. À profª Silvana pelas sugestões e colaboração na elaboração da dissertação. À Narjara e Felipe por sempre estarem dispostos a ajudar nas horas mais complicadas nessa nossa fase de “mestrandos”. Aos meus irmãos Millena e Hermann, meu noivo Leuzinger, minhas amigas Maria Antonieta e Rafaela e ao meu cunhado Marco André que fizeram parte da “equipe de salvamento” nessa reta final de percalços. A todos os profissionais do laboratório de Imunologia Keizo Azami (LIKA), pelo estímulo e colaboração irrestrita, em especial à Narjara e aos estagiários Wheverton Ricardo e Rodrigo. Aos meus colegas, oftalmologistas e residentes, do serviço de oftalmologia do Hospital das Clinicas da Universidade Federal de Pernambuco e Serviço Oftalmológico de Pernambuco (SEOPE), que participaram deste trabalho, direta ou indiretamente..

(7) À Jupira Pinho e Walter Leite, funcionários da Secretaria do Departamento de Pósgraduação em Medicina Tropical pela presença, sempre solícita e gentil nestes anos de trabalho. A todos os colegas oftalmologistas, que, enviando seus pacientes, viabilizaram este estudo..

(8) “Confiar em Deus como se tudo dependesse Dele mas, entretanto, trabalhar como se tudo dependesse de nós”. Santo Inácio de Loyola.

(9) RESUMO O Toxoplasma gondii (T. gondii) é a principal causa de uveíte posterior e a retinocoroidite toxoplásmica é considerada a infecção mais comum da retina. Os testes sorológicos constituem uma importante ferramenta para o diagnóstico da toxoplasmose, porém na toxoplasmose ocular, geralmente não há correlação entre os níveis de anticorpos séricos e a sintomatologia ocular do paciente. Assim, nos casos do diagnóstico da doença ocular, os testes sorológicos pouco ajudam. Alguns estudos têm demonstrado que a quantificação de títulos de anticorpos no humor aquoso pode ser esclarecedora, todavia é um exame que necessita punção da câmara anterior, tratando-se de um procedimento invasivo. Porém, outros estudos concluíram que através da determinação da imunoglobulina A secretora (IgAs) anti-T. gondii na lágrima é possível diferenciar pacientes portadores de uveíte posterior ativa por toxoplasmose ocular de pacientes portadores de uveíte causadas por outras etiologias. O presente estudo objetivou avaliar a dinâmica da produção da IgAs anti-T .gondii na lágrima em pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii durante o primeiro trimestre da doença. Um total de 16 pacientes que apresentavam a forma clássica da doença ocular, ou seja, lesões de uveíte posterior ativa com lesão satélite cicatrizada, foram divididos em dois grupos em relação ao início da sintomatologia: grupo I (dia 0) e grupo II (dia 30). As coletas de lágrima foram feitas com intervalo de 15 em 15 dias e a última com 30 dias até completar o primeiro trimestre, totalizando seis amostras. A dosagem da IgG e IgM séricas foi feita pelo método de imunofluorescência descrita por Camargo (1964). Para pesquisa de IgAs anti-T. gondii na lágrima foi utilizado o método descrito por Lynch et al. (2004) e a dosagem pela técnica de enzima imunoensaio (ELISA). Todos os pacientes tiveram IgG sérica positiva e IgM sérica negativa. Exceto um, todos os pacientes apresentavam IgAs anti-T. gondii no dia 15°, começando a negativar após 60 dias do início dos sintomas. Os níveis do anticorpo assim como o perfil deste, foram diferentes para cada paciente. Não foi visto diferença estatisticamente significante entre os intervalos estudados. Houve reatividade também do olho sadio, que na sua maioria acompanhou a produção de IgAs dos olhos doentes. Podemos concluir que a dinâmica da IgA secretora anti-T. gondii na lágrima, no primeiro trimestre da doença ativa, ocorre de forma variável para cada indivíduo. Palavras-chave: toxoplasmose ocular; imunoglobulina A; lágrima; imunodiagnóstico..

(10) ABSTRACT Toxoplasma gondii (T.gondii) is the main cause of posterior uveitis and toxoplasmic retinochoroiditis is considered the most common infection of the retina. Serological tests are important tools for the diagnosis of toxoplasmosis, but in ocular toxoplasmosis, usually there is no correlation between levels of serum antibodies and eye symptoms in the patient. Thus, in the case of ocular toxoplasmosis, the serological tests are of little help. Some studies have shown that the quantification of antibodies in the aqueous humor can be enlightening, however they are tests that require puncture. of anterior chamber, this is an invasive. procedure. However, other studies have concluded that through the determination of the secretory immunoglobulin A (sIgA) anti-T.gondii in tears, it is possible to differentiate patients with active uveitis caused by toxoplasmosis, from patients with uveitis caused by other etiologies. This study aimed to evaluate the dynamics of the production of anti-sIgA T.gondii in tears in patients with posterior uveitis presumably by T.gondii active during the first quarter of the disease. Sixteen patients who had the classic form of eye disease, or lesions of posterior uveitis with active satellite lesion healed, were divided into two groups at the start of the symptoms: Group I (day 0) and group II (30th). Tears were collected every 15th day and the last sample with 30 days to complete the first quarter. The determination of IgG and IgM serum was done by the immunofluorescence method described by Camargo (1964). To search for tear anti T.gondii sIgA, was used the method described by Lynch et al. (2007) through technique of enzyme immunoassay (ELISA).. All patients had serum IgG positive and serum IgM negative. Except one, all the patients showed positive IgAs at the 15th. day Negativation was observed in few of them around the 60th day. Antibody levels so their profile was individually different although not statistically significant. No statistically significant difference was seen between the ranges studied. There was also reactivity of the healthy eye, which mostly followed the production of sIgA eye patients. We can conclude that the momentum of anti-secretory IgA T.gondii in tears in the first quarter of the active disease, occurs in a variable for each individual. Keywords: ocular toxoplasmosis; immunoglobulin A; tear; immunodiagnosis..

(11) LISTA DE TABELAS ARTIGO Tabela 1. Distribuição numérica e percentual por sexo, faixa etária e procedência dos portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii atendidos no HC da UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008. Tabela 2. Distribuição qualitativa numérica da reatividade da IgAs anti-T. gondii da lágrima nos olhos doentes, dos grupos 1 e 2*, de pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii atendidos no HC da UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008. Tabela 3. Médias, valor de “p” e desvio padrão dos níveis de absorbância da IgAs anti-T. gondii da lágrima nos olhos doentes e sadios, dos grupos 1 (A) e 2 (B), dos pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii atendidos no HC da UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008, de acordo com os dias que foram realizadas as coletas*. Tabela 4. Comparação entre as médias, valor de “p” e desvio padrão dos níveis de absorbância da IgAs anti-T. gondii da lágrima nos olhos doentes e sadios, entre os grupos 1 (A) e 2 (B), dos pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii atendidos no HC da UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008, relacionadas de acordo com o início dos sintomas*..

(12) LISTA DE ABREVIATURAS c.. capítulo. CCS. Centro de Ciências da Saúde. CEP. Comitê de Ética em Pesquisa. DNA. ácido desoxirribonucléico. EALT. tecido linfático associado ao olho. ELISA. Enzime-Linked Imunosorbent Assay. et al.. e outros. GALT. gut associated lymphoid tissue. HC. Hospital das Clinicas. IFA. imunofluorescência indireta. IgA. imunoglobulina A. IgAs. imunoglobulina A secretora. IgAp. imunoglobulina A dimérica. IgE. imunoglobulina E. IgG. imunoglobulina G. IgM. imunoglobulina M. INF. interferon. INFγ. interferon gama. IL-4. interleucina 4. IL-10. interleucina 10. IL-12. interleucina 12. ISAGA. Imununosorbent Agglutination Assay. LIKA. Laboratório de imunologia Keizo-Asami. MALT. mucosa associated lymphoid tissue. n.. número. nm. nanômetros. NO. óxido nítrico. NK. natural killer. p.. página. PCR. Polymerase Chain Reaction. PE. Pernambuco.

(13) SC. componente secretor. SIDA. Síndrome de imunodeficiência adquirida. T. gondii. Toxoplasma gondii. TGFα. fator transformador de crescimento. TGI. trato gastrointestinal. UFPE. Universidade Federal de Pernambuco. v.. volume. μL. microlitros. μm. micrômetro.

(14) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 15. 2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 18. 2.1 Aspectos gerais da toxoplasmose ........................................................................... 19. 2.2 Aspectos gerais da toxoplasmose ocular ................................................................ 20. 2.3 Aspectos imunológicos da toxoplasmose ............................................................... 21. 2.4 Aspectos imunológicos do olho ............................................................................... 23. 2.5 Diagnóstico da toxoplasmose .................................................................................. 26. 2.6 Diagnóstico da toxoplasmose ocular ...................................................................... 29. 3 QUESTÃO DA PESQUISA ....................................................................................... 32. 4 OBJETIVOS ............................................................................................................... 34. 4.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 35. 4.2 Objetivos específicos ............................................................................................... 35. 5 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................. 36. 5.1 Desenho do estudo ................................................................................................... 37. 5.2 Pacientes da pesquisa .............................................................................................. 37. 5.2.1 Critérios de inclusão ............................................................................................... 37. 5.2.2 Critérios de exclusão .............................................................................................. 37. 5.2.3 Formação dos grupos da pesquisa .......................................................................... 38. 5.3 Definição e categorização das variáveis ................................................................ 38. 5.3.1 Definição de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica ............................................................................................................................ 38. 5.3.2 Definição do teste de IgA secretora anti-T. gondii ................................................. 39. 5.3.3 Categorização das variáveis biológicas e sociais ................................................... 39. 5.3.3.1 Idade .................................................................................................................... 39. 5.3.3.2 Sexo ..................................................................................................................... 40. 5.3.3.3 Procedência ......................................................................................................... 40. 5.4 Método de coleta de dados ...................................................................................... 40. 5.4.1 Dados clínicos ........................................................................................................ 40. 5.4.2 Processamento dos dados ....................................................................................... 41. 5.5 Método de coleta das amostras .............................................................................. 41.

(15) 5.6 Análise laboratorial ................................................................................................. 42. 5.6.1 Determinação da IgA secretora anti-T. gondii ....................................................... 42. 5.6.2 Determinação de IgM e IgG anti-T. gondii no soro ............................................... 43. 5.7 Análises estatísticas ................................................................................................. 43. 5.8 Considerações éticas ................................................................................................ 43. 6 ARTIGO ...................................................................................................................... 44. ARTIGO: DINÂMICA DA IgA SECRETORA ESPECÍFICA NA LÁGRIMA EM PACIENTES PORTADORES DE UVEÍTE POSTERIOR ATIVA PRESUMIVELMENTE POR Toxoplasma gondii DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA DOENÇA ........................................................................................ 45. RESUMO ........................................................................................................................ 46. ABSTRACT .................................................................................................................... 46. 1. INTRODUÇÃO........................................................................................................... 47. 2. PACIENTES E MÉTODOS ........................................................................................ 48. 3. RESULTADOS............................................................................................................ 50. 4. DISCUSSÃO................................................................................................................ 52. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 55. TABELAS ....................................................................................................................... 58. FIGURA... ....................................................................................................................... 62. 7 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 63. 8 SUGESTÕES .............................................................................................................. 65. 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 67. 10 APÊNDICES ............................................................................................................. 76. APÊNDICE N° 1 – Questionário específico ................................................................ 77. APÊNDICE N° 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .......................... 81. 11 ANEXOS ................................................................................................................... 83. ANEXO N° 1 – Aprovação pela Comissão de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Pernambuco – CEP/CCS/UFPE. 84. ANEXO N° 2 – Instrução aos autores.......................................................................... 85.

(16) 15. 1 INTRODUÇÃO.

(17) 16. 1 INTRODUÇÃO.. Na atualidade, é aceito que o Toxoplasma gondii (T. gondii) constitui a principal causa de uveíte posterior, e a retinocoroidite toxoplásmica é considerada a infecção mais comum da retina (JAIN; UPPAL; METHA, 1998; HOLLAND; LEWIS; O’CONNOR, 2002). No Brasil, a toxoplasmose é responsável por aproximadamente 80% dos casos de uveíte (ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005). A lesão clássica da toxoplasmose ocular é uma retinocoroidite granulomatosa, focal e necrosante (HOGAN, 1958), podendo apresentar consideráveis variações nas formas clínicas, descritas na literatura como atípicas (SMITH; CUNNINGHAM, 2002; FARDEAU et al., 2002; LIEB et al., 2004), o que dificulta o seu diagnóstico. O diagnóstico laboratorial da toxoplasmose ocular é de fundamental importância, uma vez que há uma pluralidade de apresentações clínicas compatíveis com outras doenças. O diagnóstico definitivo depende da identificação do parasito nos líquidos orgânicos (KAWAZOE, 1988) ou através da identificação do DNA (ácido desoxirribonucléico) do mesmo em fluidos oculares ou secções da retina (KASUMI et al., 1996; JONES et al.2000). Os testes sorológicos constituem uma ferramenta significativa para o diagnóstico da toxoplasmose, todavia, na toxoplasmose ocular, geralmente não há correlação entre os níveis de anticorpos séricos e a sintomatologia ocular do paciente, sendo comum a ocorrência de títulos baixos de IgG. A pesquisa de IgM, na maioria das vezes, é negativa (ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005). Sendo assim, pode-se concluir que os testes sorológicos pouco ajudam no diagnóstico da doença ocular, principalmente nos casos de lesões atípicas. Alguns estudos têm demonstrado que a quantificação de títulos de anticorpos no humor aquoso pode ser esclarecedora (GARGEW et al., 2005; GARGEW; BOEHNKE, 2006), contudo, é um exame que necessita punção da câmara anterior, tratando-se de um procedimento invasivo. Também foi verificada a resposta imune das mucosas contra o T.gondii detectando IgA secretora (IgAs) específica na lágrima. Mack e Mcleod (1992) demonstraram que IgAs anti-T. gondii está presente no colostro de mulheres com infecção crônica e aguda, indicando que a infecção aguda efetivamente coincide com uma resposta imunitária das mucosas. Segundo Meek et al. (2000), as lágrimas de indivíduos cronicamente expostos apresentam anticorpos específicos IgAs anti-T.gondii. Em 2004, Lynch et al. verificaram a existência de intensa associação entre uveíte posterior ativa presumivelmente por T.gondii e IgAs específica na lágrima. Em 2007, esses.

(18) 17. mesmos autores concluíram que através da determinação da IgAs anti-T. gondii na lágrima é possível diferenciar pacientes portadores de uveíte posterior ativa por toxoplasmose ocular de pacientes portadores de uveíte causadas por outras etiologias. Deste modo, é possível diagnosticar pacientes com uveíte posterior ativa por toxoplasmose ocular através de um método não invasivo, de fácil execução e de baixo custo. Vale ressaltar, que não foram encontradas descrições na literatura consultada, no que diz respeito à dinâmica da imunoglobulina específica da lágrima. Assim sendo, justifica-se o presente estudo que tem como objetivo descrever o comportamento da IgAs específica anti-T. gondii na lágrima no período ativo e de resolução imediata da doença ocular, o que pode contribuir para definir adequadamente o estágio evolutivo da mesma..

(19) 18. 2 REVISÃO DA LITERATURA.

(20) 19. 2 REVISÃO DA LITERATURA.. 2.1 Aspectos gerais da toxoplasmose. O termo toxoplasmose é utilizado para descrever os aspectos clínicos ou patológicos de uma infecção parasitária, cujo agente etiológico é o T. gondii, desde uma infecção primária assintomática até persistência crônica do mesmo nos tecidos. O T. gondii pertence à classe Sporozoa. É um protozoário monoxênico e intracelular obrigatório, que mede de 2 a 5μm. Possui três formas evolutivas: taquizoíta, bradizoíta e esporozoíta (KAWAZOE, 1988). A forma taquizoíta apresenta rápida multiplicação e é responsável pela fase aguda da infecção. A forma bradizoíta é encontrada no interior de cistos teciduais, multiplica-se lentamente e é responsável pela forma crônica da infecção. A forma esporozoíta se desenvolve no esporocisto, dentro do oocisto, que é eliminado nas fezes dos felinos, únicos hospedeiros definitivos do parasito. Cada oocisto contém dois esporocistos, altamente infectantes para aves, mamíferos e o homem. Oocistos são formados somente no intestino dos felídeos sendo excretados pelas fezes por um período de 15 a 20 dias. Todas as formas evolutivas são infectantes, tanto para os hospedeiros definitivos, quanto para os hospedeiros intermediários (KASPER, 2002). Em geral, a transmissão ocorre pela via oral e pode ser atribuída à ingestão de oocistos maduros a partir do solo contaminado ou de bradizoítos na carne mal cozida. Hoje, sabe-se que a água é um importante meio de transmissão pelo transporte de oocistos. Há ainda a transmissão transplacentária, que é expressiva, pois um terço das mulheres que adquirem a infecção pelo T. gondii durante a gravidez transmitem o parasito para o feto (KASPER, 2002). Existem relatos também de transmissão através de transplantes, transfusões sanguíneas e acidentes com material de laboratório (MONTOYA; LIESENFELD, 2004). Após a ingestão de cistos teciduais contendo bradizoítos ou de oocistos contendo esporozoítos, os parasitos são liberados dos cistos por um processo digestivo. Os bradizoítos são resistentes ao efeito da pepsina e invadem o trato gastrointestinal (TGI) do hospedeiro. A partir do TGI, os parasitos disseminam-se para vários órgãos, como tecido linfático, musculatura esquelética, miocárdio, retina, placenta e sistema nervoso central (KASPER, 2002)..

(21) 20. A toxoplasmose é uma doença amplamente difundida em nosso meio e pode-se afirmar que essa zoonose apresenta uma distribuição universal. O T. gondii pode infectar diversos mamíferos e aves. Sua distribuição depende de fatores geográficos, idade da população e condições sócio-econômicas (KASPER, 2002; ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005). No homem, a doença pode se manifestar de duas formas: congênita e adquirida. A infecção adquirida após o nascimento pode ser assintomática, porém, com freqüência, resulta na persistência crônica de cistos nos tecidos do hospedeiro (KASPER, 2002). Pode ainda apresentar-se com sintomas similares a um resfriado comum (SILVEIRA et al., 1988) ou gerar quadros graves, especialmente em hospedeiros imunossuprimidos (GIRARD et al., 1997; LANJEWAR et al., 1998). A toxoplasmose congênita resulta da transferência transplacentária dos parasitos da mãe infectada para o feto, sendo a gravidade das seqüelas inversamente proporcional ao estágio da gestação (KASPER, 2002). Assim, pode-se classificar clinicamente a toxoplasmose em cinco categorias de infecção: adquirida em pacientes imunocompetentes, adquirida durante a gravidez, congênita, adquirida ou reativada em pacientes imunodeficientes e a infecção ocular. Cada categoria clínica nem sempre tem um quadro clínico exclusivo para toxoplasmose, sendo necessário diagnóstico diferencial (MONTOYA, 2002).. 2.2 Aspectos gerais da toxoplasmose ocular.. A toxoplasmose ocular é a principal causa de uveíte posterior no mundo e uma importante causa de perda da visão (MC CAMMEL et al., 1996; MONTOYA; REMINGTON, 1996; ROTHOVA et al., 1996) tanto em pacientes imunocompetentes como imunodeprimidos. Na Colômbia, a toxoplasmose ocular representa 4% das consultas oftalmológicas (VARELA, 1996). A prevalência da toxoplasmose ocular é variável entre as áreas estudadas. Nos Estados Unidos, é a principal causa de prejuízo visual, correspondendo entre 30 e 50% de todos os casos de uveíte posterior (ROBERTS; McLEOD, 1999). No Brasil, é responsável por aproximadamente 80% dos casos de uveíte (ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005). Os estados do Rio Grande do Sul, Paraná e Rio de Janeiro apresentam alta incidência de toxoplasmose ocular. Destaca-se que a cidade de Erechim, no Rio Grande do Sul, apresentou um índice elevado,.

(22) 21. alcançando 17,7% em uma população estudada de pouco mais de mil pessoas (GLASSNER et al., 1992). A toxoplasmose ocular pode ocorrer tanto na forma adquirida, como na congênita. Esta aparentemente é a mais frequente, podendo ser subdividida em forma neonatal, quando a lesão está presente ao nascimento, e a forma tardia, que pode acontecer em qualquer época da vida, em geral entre a segunda e terceira décadas. A toxoplasmose ocular adquirida pode ser subdividida em concomitante, quando ocorre junto com a doença sistêmica, e tardia, quando há um intervalo entre o acometimento sistêmico e ocular. (ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005) O T. gondii apresenta neurotropismo e por essa razão, a localização ocular inicial é a retina, alcançando a mesma pela circulação retiniana ou mais raramente, pela circulação coroidea (TABBARA, 1990). A proliferação de taquizoítos provoca necrose celular resultando em retinite necrosante, o que pode levar ao comprometimento das estruturas subjacentes, sendo chamadas de retinocoroidite toxoplásmica. A toxoplasmose ocular é uma doença de caráter recidivante. Estas recidivas podem ocorrer nas margens das lesões ou até mesmo em áreas longe do foco primário, que podem ser causadas pela liberação de parasitas dos cistos na retina, enquanto que a reação inflamatória (uveíte) e suas complicações associadas seriam respostas de hipersensibilidade aos antígenos do toxoplasma (O'CONNOR, 1970).. 2.3 Aspectos imunológicos da toxoplasmose.. A infecção pelo Toxoplasma provoca uma cascata de respostas imunes protetoras no hospedeiro, induzindo resposta celular e humoral. A infecção primária pelo Toxoplasma induz a resposta celular, a qual é considerada a principal defesa do hospedeiro contra o parasito. Durante esta fase, neutrófilos e macrófagos através da fagocitose e células natural killer (NK) através da citotoxicidade compõem a principal resposta do hospedeiro, como também a produção de INF-gama pelas células NK. Macrófagos e células dendríticas apresentam o antígeno às células T CD4+ e CD8+, induzindo uma resposta Th1 através da produção de IL12. O TNF-alfa e o óxido nítrico são produzidos por macrófagos ativados para atuarem na destruição do parasito. A resposta Th2 também participa da defesa do hospedeiro através da produção de IL-4 e IL-10 (CORREA et al., 2007; DAWSON et al., 2005). Este conjunto de ativações pode levar a morte do parasito. Quando o parasito não é fagocitado e entra no.

(23) 22. macrófago por penetração ativa, ele continuará a se replicar e esta replicação pode representar o mecanismo de transporte e disseminação para órgãos distantes. O Toxoplasma infecta todo tipo de células por meio de um processo ativo (KASPER, 2002). A sobrevida do taquizoíto é devida à formação de um vacúolo parasitóforo que o protege contra fusão lisossomal (SIBLEY et al., 1985). Os anticorpos são produzidos em resposta a infecção, os quais têm a capacidade de lisar os taquizoítos extracelulares através da ativação do Sistema Complemento. O aparecimento dos anticorpos traduz a resposta humoral à infecção recém adquirida (CAMARGO; LESER; LESER, 1977). Assim, ainda na vigência de parasitemia, é observado que nas primeiras semanas da primoinfecção, surgem anticorpos específicos representados pelos isotipos IgM, IgA, IgE e principalmente IgG, caracterizando o perfil da toxoplasmose recente. A IgG neste estágio apresenta baixa avidez (CAMARGO, 2001). Na evolução da infecção configura-se o perfil sorológico de transição, com níveis elevados de IgG, de avidez crescente. Os níveis dos anticorpos IgA, IgE e IgM vão decrescendo, podendo de forma ocasional, serem encontrados em baixos títulos. Progressivamente, esse quadro dá lugar ao perfil de infecção latente ou crônica, que se mantém por toda a vida com anticorpos IgG de baixos títulos e de alta avidez, podendo ainda ser encontrados resíduos de IgM. A transição do perfil sorológico de infecção recente para o perfil de infecção latente pode ter duração de semanas ou meses, dependendo do estado imunitário dos pacientes. Os anticorpos IgM nem sempre significam infecção ativa. (CAMARGO, 2001). A IgA específica no soro aparece, em regra geral, duas a quatro semanas após a primoinfecção, com pico em redor do segundo ou terceiro mês, desaparecendo após sete a nove meses. Pode ser encontrada elevada até um ano após a infecção se os métodos utilizados forem sensíveis (FRANCIS; JOYNSON, 1993). A IgA corresponde apenas 10 a 15% de todas as imunoglobulinas séricas, porém é a imunoglobulina que predomina nas secreções mucosas. A IgA é produzida pelos plasmócitos que migram para a porção subepitelial dos tecidos. A IgA produzida é secretada como um dímero, diferentemente da IgA sérica, que é monomérica. Esse dímero está ligado por uma proteína chamada cadeia J, que também é sintetizada pelos plasmócitos. Esse complexo constitui a IgA dimérica (IgAp). O transporte transepitelial é feito através de uma glicoproteína conhecida como “componente secretor”.

(24) 23. (SC), que é expresso no epitélio acinar, e possui alta afinidade com o complexo formado, permanecendo ligada formando a IgAs (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2007). Após a descoberta da produção de imunoglobulinas nas membranas mucosas por Little (1969), muitos estudos vêm evidenciando a presença de anticorpos de mucosa na saliva, fluidos intestinais, colostro e lágrima. Sen e Sarin (1979) demonstraram que a IgA secretora é a principal imunoglobulina produzida na mucosa ocular durante um processo de doença ocular. Esta imunoglobulina corresponde a 70% das proteínas secretadas na lágrima (BRANDTZAEG; JOHANSEN, 2005). Em 1990, Chardès et al. descreveram que as membranas mucosas do organismo são induzidas a produzir IgAs durante a infecção com os cistos de T. gondii. Estudos têm demonstrado que a IgAs está presente no colostro de mulheres com infecção crônica e aguda, indicando que a infecção aguda verdadeiramente coincide com uma resposta imunitária das mucosas (MACK; MCLEOD, 1992). Em 1994, foram identificadas IgG, IgM e IgA anti-T. gondii na saliva de pacientes com infecção aguda (HAJJER et al., 1994). Loyola et al. (1997) mostraram que a IgAs da saliva, diferentemente da IgG, reflete os níveis da IgA sérica. A presença de anticorpos IgG, IgM e IgA intraocular vem sendo relatada desde a década de 60 e, em alguns estudos, tem sido demonstrada sua síntese no próprio olho (TURUNEN, 1983; RISS, 1995; KLAREN, 1998).. 2.4 Aspectos imunológicos do olho.. A superfície ocular, do ponto de vista imunológico, é composta pela conjuntiva, glândula lacrimal e pelo sistema de drenagem lacrimal. Essas estruturas compõem o tecido linfático associado ao olho (EALT-eye associated lymphoid tissue), conhecido como o mais novo componente do sistema imune de mucosa (KNOP; KNOP, 2002; MEEK et al., 2003). Os linfócitos e plasmócitos formam a principal população de leucócitos na superfície ocular, constituindo o tecido linfóide que é distribuído por toda conjuntiva, principalmente na região tarsal. A superfície ocular apresenta características em comum com o sistema imune de mucosa: linfócitos T CD8+ em maior quantidade que linfócitos T CD4+ no epitélio (camada basal) e no nível da lâmina própria ocorre o inverso. Os plasmócitos, em geral, são.

(25) 24. encontrados na lâmina própria, onde principalmente é produzida a IgAs (KNOP; KNOP, 2000). Esta estrutura básica da conjuntiva se estende para todo sistema de drenagem lacrimal, como canalículo nasolacrimal, saco e ducto nasolacrimal (KNOP; KNOP, 2001; MEEK et al., 2003). Macrófagos, células dendríticas e mastócitos também são encontradas na conjuntiva e participam da imunidade da mucosa, juntamente com proteínas do sistema complemento. Os mastócitos atuam produzindo vários fatores, incluindo citocinas, que recrutam outros leucócitos e organizam a reação inflamatória contra destruição do patógeno.(STAHL et al., 2002) A glândula lacrimal está intimamente relacionada com a conjuntiva através de 10 a 12 ductos excretores. Apresenta uma maior quantidade de plasmócitos que linfócitos intraepiteliais. Os linfócitos T CD8+ são mais frequentes que os linfócitos T CD4+ na glândula, em contraste com a conjuntiva. O complexo IgAs (complexo secretor) formado é transportado por endocitose até a superfície apical onde, o componente secretor protege a imunoglobulina da ação das enzimas presentes no filme lacrimal e não fixa complemento (WIECZOREK et al., 1988; FRANKLIN; KENYON;TOMASI, 1973). Existem dois estimuladores do recrutamento da IgAs que permitem sua saída da glândula lagrimal: o fator transformador de crescimento alfa (TGFα), produzido pelas células T e macrófagos, e a interleucina-5 produzida pelos linfócitos T CD4+ ativados (DE LA TORRE; NUÑEZ, 2002). O filme lacrimal também contribui com a defesa imune da superfície mucosa ocular, apresentando vários componentes, entre os quais podemos citar diversas proteínas que possuem propriedades antiinflamatórias e antimicrobianas, como a lactoferrina, lisozima, fosfolipase A2 e IgAs. O filme lacrimal é produto do sistema secretor lacrimal, composto pela glândula lacrimal principal e acessórias, estas distribuídas na substância própria da conjuntiva. Ainda participam da produção do filme lacrimal, glândulas produtoras de lipídeos e células produtoras de mucina. A mucina também contribui para a proteção da superfície ocular, formando uma camada sobre o epitélio corneano resistente a degradação enzimática, limitando a adesão de microorganismos na córnea (SACK et al, 2005). Assim, este extenso componente do sistema imune de mucosas, o EALT, juntamente com uma rede de vasos linfáticos que drenam para os linfonodos pré-auriculares e submandibulares, representam o sistema de defesa da superfície ocular (KNOP; KNOP, 2002)..

(26) 25. Esse mecanismo imunológico, combinado com um ativo sistema fagocitário e de lisozimas no filme lacrimal, forma a primeira linha de defesa do bulbo ocular contra a invasão microbiana e estabelecimento de processos infecciosos dos quais, a IgA secretora parece ser o anticorpo mais importante (SETTIPANE; CONNEL; SHERMAN, 1965; JAN et al., 2002). Além da superfície ocular, existe o compartimento intraocular, que é composto por todas as estruturas intraoculares, juntamente com os fluidos intraoculares (humor aquoso e o vítreo), separados do sangue através de tight junctions (zônula ocludens) que se encontram entre as células epiteliais e endoteliais. Os capilares da circulação vascular retiniana e o epitélio pigmentar da retina contêm zônulas ocludens. Eles constituem uma efetiva barreira para moléculas solúveis e contribuem para constituição do humor aquoso e vítreo. Tanto a ausência de linfáticos intraoculares, quanto a barreira sanguínea ocular oferecem importante contribuição anatômica para a existência do imunoprivilégio (KAUFMAN; ALM, 2003; MEEK et al., 2003; KAPLAN, 2007). Diversos fatores condicionam o imunoprivilégio, como: receptores de superfície das células parenquimatosas oculares com função imunomodulatória, fatores imunomoduladores solúveis presentes no humor aquoso, regulação do sistema complemento dentro do olho, células apresentadoras de antígeno promotoras de tolerância antigênica e como já descrita, a barreira sanguínea ocular e a não convencional via linfática existente no olho (KAPLAN; NIEDERKORN, 2007). O imunoprivilégio depende da integridade anatômica de todas essas estruturas, e do adequado funcionamento bioquímico, que em conjunto minimizam o dano visual que pode ser causado pelas respostas imune celular principalmente, e humoral contra potenciais patógenos. Acreditava-se que o imunoprivilégio e a inflamação não podiam coexistir e que a inflamação intraocular o eliminaria. Porém, após vários estudos, sabe-se que o olho desenvolve múltiplos mecanismos compensatórios para mantê-lo. (MO; WANG; KAPLAN, 2007). O estímulo antigênico na mucosa ocular é semelhante à de outras mucosas. Os linfócitos após entrarem em contato com antígenos sofrem diferenciação em células efetoras com atividade celular ou humoral, sendo neste caso a IgAs mais frequente. Esses linfócitos ativados, através dos vasos linfáticos chegam à circulação sanguínea e, após contato com outras mucosas, retornam para circulação linfática, o que é chamado de recirculação linfocitária. Este fato caracteriza a superfície ocular como parte do tecido linfocitário associado de mucosa (MALT), o que pode esclarecer a presença de anticorpos na lágrima (McCLELLAN; FRACO; FRACS, 1997; KNOP; KNOP, 2007)..

(27) 26. Sapse et al. (1967) relataram que a aplicação de antígenos na conjuntiva resulta em produção local de células com memória específica que respondem a posteriores aplicações tópicas do mesmo antígeno. Experimentos mostram que animais imunizados por via sistêmica a um antígeno específico produzem anticorpos circulantes contra o antígeno, os quais podem ser recuperados no filme lacrimal. Pu et al. (1983) descreveram que a imunização intestinal não resulta em imunização conjuntival, porém parece estimular a conjuntiva através de células específicas com memória, que migram para os folículos linfáticos conjuntivais. Estudos realizados por Meek et al. (2000), em toxoplasmose ocular, concluíram que as lágrimas de muitos indivíduos cronicamente expostos apresentam anticorpos IgAs anti-T. gondii como resultado de respostas imunes passadas. Lynch et al. (2004) estudaram associação entre uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii e IgA secretora específica na lágrima, constatando que os pacientes com a doença tinham 18 vezes mais chances de apresentar IgA secretora da lágrima positiva quando comparado com os controles sadios. Assim, inibição da aderência de patógenos, neutralização de vírus, enzimas e toxinas, inibição da absorbância de antígenos, bem como diagnóstico de doenças oculares, são algumas das funções da IgAs. Porém, a dinâmica da produção desta imunoglobulina, frente ao T. gondii, em pacientes portadores de toxoplasmose ocular ainda não está bem esclarecida.. 2.5 Diagnóstico da toxoplasmose.. O diagnóstico laboratorial da toxoplasmose pode ser feito a partir de diversos métodos e baseados nas diferentes variedades clínicas que apresenta a partir da infecção pelo T gondii. O diagnóstico da toxoplasmose aguda pode ser definido por isolamento do parasito a partir do sangue ou de outros líquidos corporais, através da subinoculação da amostra na cavidade peritoneal de um camundongo. O isolamento do T gondii no líquido peritoneal reflete infecção aguda. É possível o isolamento do mesmo na biópsia de tecidos, porém a presença de cistos teciduais não deve ser interpretada como toxoplasmose aguda (KASPER, 2002). Na fase aguda da doença é possível detectar material antigênico do parasito ou complexo imune de antígenos parasitários no soro do paciente (VAN KNAPEN;.

(28) 27. PANGGABEN; VAN LEUSDEN, 1985). No entanto, pela transitoriedade e inconstância da antigenemia, é um método de pouco valor diagnóstico, tendo contudo boa sensibilidade nos casos de neurotoxoplasmose (FACHADO et al., 1994). Na fase crônica, o parasito pode ser encontrado de forma esporádica em cortes histológicos corados pela hematoxilina ou evidenciar antígenos por imuno-histoquímica, utilizando anticorpos específicos e marcação imunofluorescente ou imunoenzimática (CAMARGO, 2001). A utilização da PCR (“Polymerase Chain Reaction”) permite a identificação de segmentos característicos de ácidos nucléicos do parasito depois de ampliados pela reação em cadeia da polimerase. Ou seja, é um método utilizado para detectar o DNA do T. gondii nos fluidos corporais (sangue, líquido cerebroespinhal, humor aquoso, humor vítreo e lavado broncoalveolar) e tecidos. Para identificação do toxoplasma, também podem ser amplificados segmentos do DNA, que correspondem a diferentes genes, como P30, TRG1 e B1 ou DNA ribossomal (CAMARGO, 2001). Os procedimentos já mencionados possuem expressivo valor diagnóstico, porém são limitados por dificuldades encontradas no crescimento de parasitos in vivo ou na identificação de taquizoítos por métodos histológicos ou por frações proteicas no PCR (KASPER, 2002). Por estas razões, a pesquisa de anticorpos anti-T gondii utilizando os testes sorológicos transformaram-se num método rotineiro de diagnóstico. Descrito por Sabin e Feldman (1948), a reação do corante que leva seu nome, conhecido também como “dye test”, possui boa sensibilidade e especificidade. Mede principalmente anticorpos IgG, que geralmente aparecem uma a duas semanas após o início da infecção, apresentando pico entre a sexta e oitava semana, e diminuindo lentamente em um a dois anos (ANDERSON; REMINGTON, 1975). Os títulos, geralmente baixos, podem persistir por toda a vida. O teste é pouco usado por utilizar microorganismos vivos na reação. O teste de imunofluorescência indireta (IFA) permite a identificação de anticorpos IgG, IgM (REMINGTON; MILLER; BROWNLEE, 1968) e demais imunoglobulinas, sendo um método prático. Através dos soros reagentes são realizadas diluições crescentes, que após incubação com toxoplasmas fixados, são novamente incubadas com conjugado fluorescente e o resultado é fornecido pela maior diluição reagente (CAMARGO, 2001). Nos testes imunoenzimáticos (Enzime-Linked Imunosorbent Assay - ELISA), extratos ou frações antigênicas do toxoplasma fixados em placas inertes são incubados com diluições dos soros a testar. É adicionado o conjugado anti-anticorpo (IgG, IgM, IgA ou IgE) enzimático, que ao acrescer o substrato desenvolve cor nos casos positivos, cuja intensidade,.

(29) 28. lida no espectrofotômetro, é proporcional à quantidade de anticorpos no soro (CAMARGO, 2001). Através dos testes de Immunoblot a reatividade de anticorpos para diferentes componentes antigênicos do toxoplasma pode ser evidenciada. Tiras de nitrocelulose com esses componentes, distribuídos como bandas de pesos moleculares crescentes, são incubadas com soros ou outros líquidos orgânicos (líquor, humor aquoso). A reação é revelada por um conjugado imunoenzimático (anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA) que origina perfis de reatividade, que têm sido utilizados com fins diagnósticos, inclusive pela boa sensibilidade, que permite evidenciar reações contra bandas específicas, por vezes insuficientes para originar um sinal detectável em testes como ELISA (CAMARGO, 2001). A captura dos anticorpos IgM anti-toxoplasma pode ser confirmada pela aglutinação de suspensão de toxoplasmas, incubadas após o soro nas cavidades da placa, revestida por anticorpos anti-IgM. Este é o teste ISAGA (Imununosorbent Agglutination Assay), que possibilita a avaliação quantitativa dos graus de aglutinação resultantes. Também pode ser utilizado para identificação de anticorpos IgA e IgE (DESMONTS ; NAOT; REMINGTON, 1981) e considerado útil como um indicador de infecção recente (STEPICK-BIEK et al.,1990). Foi introduzido o teste de avidez do anticorpo IgG, no qual a ligação ao seu respectivo antígeno é avaliada pela maior ou menor facilidade da quebra da mesma (CAMARGO, 2001), utilizada para diferenciar infecção recente da crônica (LIESENFELD et al., 2001). Esse método se apóia no fato de que durante a infecção recente, os anticorpos fixam fracamente o antígeno (baixa avidez), enquanto na fase crônica da doença a fixação é forte (avidez alta). Estudos têm mostrado que os anticorpos de baixa afinidade podem persistir por meses após a infecção aguda, não sendo utilizados para diagnóstico de infecção recente (PELLOUX et al., 1998; COZON et al., 1998). Em sentido contrário, parece consenso que o teste de afinidade da IgG é de utilidade para descartar infecção recente (LIESENFELD et al., 2001). Foi realizado estudo que comparou o soro de 23 pacientes portadores de infecção por T. gondii recentemente adquirida com o soro de 19 pacientes portadores de toxoplasmose com até seis meses de duração, utilizando o teste de avidez da IgG. Concluíram que a baixa avidez da IgG nem sempre identifica um caso de infecção recente, mas IgG com avidez alta, pode excluir infecção primária com menos de cinco meses de evolução (PAUL, 1999)..

(30) 29. 2.6 Diagnóstico da toxoplasmose ocular.. Atualmente, o reconhecimento clínico das lesões fundoscópicas clássicas, aceitas como padrão ouro (GARGEW, 2005; LYNCH et al., 2008) constitui o principal elemento para o diagnóstico da retinocoroidite toxoplásmica. As lesões consideradas típicas são lesões cicatrizadas, de margens definidas, com graus variáveis de hipertrofia do epitélio pigmentar da retina e atrofia retinocoroidea, acompanhadas de uma lesão de corioretinite granulomatosa focal necrosante, isolada ou múltipla, associada com vitreíte, tendo presença ou não de vasculite dos vasos retinianos e comprometimento ou não das estruturas do pólo anterior. Porém, quando há ocorrência de lesões atípicas, o diagnóstico, nestes casos, torna-se mais difícil. Balansard et al. (2005) relataram que a retinocoroidite toxoplásmica pode simular a necrose retiniana aguda. Gargew et al. (2004) descreveram que a confirmação laboratorial em pacientes portadores do quadro clínico considerado padrão ouro foi feita numa proporção que varia de 50 a 80%, dependendo do centro envolvido, bem como do método utilizado na determinação dos anticorpos. Van der Venn e Polak (1980) relataram que muitos adultos da Europa continental, infectados pelo T gondii, apresentavam níveis de IgG insuficientes para diagnóstico de toxoplasmose ocular. Na toxoplasmose ocular, geralmente não há correlação entre os níveis de anticorpos séricos e a sintomatologia ocular do paciente. É comum a ocorrência de títulos baixos de IgG, e a pesquisa de IgM, na maioria das vezes é negativa (ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005). Entretanto, os testes sorológicos ainda são os mais utilizados. Nos casos de lesões atípicas, a sorologia negativa pode excluir a toxoplasmose, mas a IgG positiva faz apenas o diagnóstico presuntivo da doença, devido à alta prevalência de anticorpos na população. Nos casos em que o diagnóstico diferencial se impõe, a determinação dos títulos de IgG específica no humor aquoso pode fornecer esclarecimentos. Quando comparados os níveis de anticorpos no soro com os encontrados no humor aquoso, é possível definir se há produção intraocular de anticorpos, o que indica toxoplasmose ocular ativa. Isto constitui o Coeficiente de Goldmann-Wittmer (GOLDMANN; WITTMER, 1954), assim calculado:.

(31) 30. (Título de anticorpos no humor aquoso) x (IgG total no soro.) ÷ (Títulos de anticorpos no soro) x (IgG total no humor aquoso). O resultado maior que três é considerado evidência de produção de anticorpo intraocular. Para a realização desse exame é necessária a punção da câmara anterior para coleta de humor aquoso. Embora, a paracentese da câmara anterior do olho seja considerada um procedimento com baixo risco, trata-se de um método invasivo que não está isento de complicações, sendo algumas descritas na literatura, dentre as quais, a endoftalmite (HELBIG et al., 1995; CHEUNG; DURRANI; MURRAY, 2004). Em 1997, Bornard e Gottrau analisaram soro e humor aquoso de 90 pacientes, medindo o coeficiente de Goldmann-Wittmer, a fim de avaliar a produção local de anticorpos e confirmar o diagnóstico clínico de toxoplasmose ocular. O resultado foi positivo em 41.1% dos casos, incerto em 13.3% e negativo em 54.6% dos casos. No estudo realizado por Quentin e Reiber (1997) foram analisados o soro e o humor aquoso de pacientes portadores de uveíte grave com a técnica de ELISA. Nesta análise, os anticorpos intraoculares mostraram-se mais eficientes para diagnóstico da toxoplasmose ocular. Gargew et al. (1998) avaliaram o humor aquoso e soro de 27 pacientes através da dosagem de IgG, IgM, IgA e Coeficiente de Goldmann-Wittmer. A avidez também foi testada, bem como a detecção de DNA do toxoplasma por PCR. Encontraram sensibilidade de 41% para o índice de Goldmann-Wittmer, 28% para PCR, 22% para a determinação de IgA e 15% para avidez de IgG. Concluíram que nenhum dos métodos foi o suficientemente sensível para estabelecer o diagnóstico, mas a combinação dos quatro métodos atinge uma sensibilidade alta como para justificar a análise do humor aquoso como método rotineiro. Ronday et al. (1999) demonstraram que a dosagem da IgA intraocular aumenta a sensibilidade do diagnóstico de toxoplasmose ocular. Este estudo foi realizado com 155 pacientes portadores de uveíte e foram verificadas as concentrações de IgA no humor aquoso de anti-T.gondii IgG, IgA e DNA e no soro de IgG, IgA, IgM..

(32) 31. Outros estudos corroboram que a medida da IgA específica para T. gondii no humor aquoso pode contribuir para o diagnóstico da doença ocular (KATINA; OREFICE; MINEO, 1992; GARWEG ; JACQUIER; FLUCKIGER, 1998; GARWEG ; JACQUIER; BOEHNKE, 2000). Recentemente, Lynch et al. (2007) concluíram que através da determinação da IgA secretora anti-T. gondii na lágrima é possível diferenciar pacientes portadores de uveíte posterior ativa por toxoplasmose ocular de pacientes portadores de uveíte causada por outras etiologias. Cabe salientar que este teste apresentou uma sensibilidade de 65,9% e especificidade de 71,6% para diagnóstico da toxoplasmose ocular, sendo considerado válido, merecedor de destaque por ser um método não invasivo, de baixo custo e fácil realização, oferecendo ao oftalmologista clínico um parâmetro que pode reforçar a suspeita diagnóstica. Conhecer o comportamento do anticorpo durante a evolução da doença constitui outro elemento importante de apoio no manejo clinico da toxoplasmose ocular, razão que motivou a presente pesquisa..

(33) 32. 3 QUESTÃO DA PESQUISA.

(34) 33. 3 QUESTÃO DA PESQUISA. Qual é a dinâmica da IgA secretora específica na lágrima em pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica durante o primeiro trimestre da doença?.

(35) 34. 4 OBJETIVOS.

(36) 35. 4 OBJETIVOS. 4.1 Objetivo geral. -Descrever a dinâmica da IgA secretora específica na lágrima em pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica.. 4.2 Objetivos específicos. -Descrever os níveis de IgA secretora específica na lágrima nos portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica no momento do diagnóstico.. -Descrever os níveis de IgA secretora específica na lágrima nos portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica em diversos períodos após o diagnóstico clínico até o final do primeiro trimestre de acompanhamento..

(37) 36. 5 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS.

(38) 37. 5 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS. 5.1 Desenho do estudo.. Considerando que o objetivo do trabalho é descrever o comportamento da IgA secretora anti-toxoplasma na lágrima dos indivíduos portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica durante o primeiro trimestre, um estudo descritivo do tipo série de casos com componente prospectivo foi considerado o mais adequado, caracterizando-se pelo acompanhamento dos doentes selecionados através da dosagem da imunoglobulina em questão.. 5.2 Pacientes da pesquisa.. 5.2.1 Critérios de inclusão.. Foram definidos como pacientes da pesquisa os indivíduos portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica, maiores de 10 anos, atendidos no Hospital das Clínicas (HC), da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), provenientes do Estado de Pernambuco (PE), no período de janeiro a outubro de 2008.. 5.2.2 Critérios de exclusão.. Foram excluídos do estudo aqueles indivíduos que informaram fazer uso de imunossupressores ou corticóides nos últimos dois meses, bem como aqueles que referiam ser portadores de SIDA ou transplantados..

(39) 38. 5.2.3 Formação dos grupos da pesquisa.. Foram atendidos 16 pacientes que apresentavam a forma clássica da uveíte posterior presumivelmente por T. gondii. Os pacientes foram divididos em grupos de acordo com o início dos sintomas relacionados à doença em questão. Desses, 12 relataram aparecimento da sintomatologia com menos de três dias, sendo considerados como grupo 1. Os outros quatro pacientes relataram 30 dias do início da sintomatologia, sendo agrupados no grupo 2.. 5.3 Definição e categorização das variáveis.. 5.3.1 Definição de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica.. Uveíte é um termo utilizado para designar inflamação da úvea (TOLEDO; RITCHER, 2002). A úvea é a camada média vascular do olho, composta pela íris, corpo ciliar e coróide, protegida externamente pela córnea e esclera (VAUGHAN; ASBURY, 1982). A uveíte pode ser classificada de diversas maneiras, sendo as mais utilizadas as que fazem referência à localização anatômica das estruturas acometidas, ao comprometimento de um ou ambos os olhos (uni ou bilaterais) e ao agente etiopatogênico. Segundo a localização anatômica do processo inflamatório podem ser divididas em uveíte anterior, posterior, intermediária ou difusa. Uveíte anterior é aquela que aborda predominantemente o segmento anterior do olho: íris e o corpo ciliar. A uveíte posterior acomete retina e coróide, podendo ser focal ou multifocal. Intermediária é aquela que atinge primariamente o vítreo e retina periférica. A uveíte difusa afeta todos os segmentos do olho, causando freqüentemente significativa baixa visual. Em geral, segundo o agente etiológico, pode ser dito que há agentes infecciosos (bactérias, vírus, fungos, protozoários e helmintos), e não infecciosos, onde se incluem fenômenos imunológicos, traumáticos, tóxicos e síndromes mascaradas (MEIRA; ROCHA; ORÉFICE, 2005)..

(40) 39. A uveíte posterior pode se apresentar de várias formas clínicas, porém, no presente estudo só foi considerada a forma clássica, padrão-ouro, que pode ser definida pela presença de lesões cicatrizadas, de margens bem definidas, graus variáveis de hipertrofia do epitélio pigmentar da retina e atrofia retinocoroidea, acompanhadas de lesão satélite em atividade inflamatória e vitreíte, presença ou não de vasculite retiniana, com ou sem comprometimento das estruturas do pólo anterior ou do nervo óptico (STANFORD et al., 2002; GARWEG, 2005; ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005). Também foram utilizados parâmetros laboratoriais, como a presença, no exame sorológico, de IgM anti-T. gondii positiva (título de 1/16 ou maior) ou IgG anti- T. gondii positiva (título de 1/16 ou maior) pelo método de imunofluorescência (CAMARGO, 1964; ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005).. 5.3.2 Definição do teste de IgA secretora anti-T. gondii.. A presença na lágrima de IgA secretora anti-T. gondii, analisada por método imunoenzimático (ELISA), utilizando antígeno bruto da cepa RH de T. gondii, em níveis superiores aos definidos pelo ponto de corte, foi considerada como positiva ou indicativa de atividade da doença.. 5.3.3 Categorização das variáveis biológicas e sociais.. Observaram-se as variáveis biológicas idade e sexo, bem como procedência para caracterização da amostra.. 5.3.3.1 Idade.. A categorização dos grupos etários foi realizada de acordo com a distribuição descrita:.

(41) 40. 1 - de 10 a 19 2 - de 20 a 30 3 - de 31 a 40 4 - de 41ou mais. 5.3.3.2 Sexo.. 1- feminino 2- masculino. 5.3.3.3 Procedência.. Corresponde ao lugar onde o paciente registrou seu domicílio. Utilizou-se a classificação do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2006) que determina como área metropolitana a capital, Recife, e 14 municípios adjacentes. Foram considerados os 170 municípios restantes da Zona da Mata, Agreste e Sertão como interior de Pernambuco.. 1 - área metropolitana 2 - interior. 5.4 Método de coleta de dados.. 5.4.1 Dados clínicos.. Após anamnese e aferição da acuidade visual, foi realizado exame biomicroscópico, com lâmpada de fenda marca Zeiss®, das estruturas do pólo anterior, bem como porção.

(42) 41. anterior do vítreo. A biomicroscopia do vítreo e pólo posterior do globo ocular foi feita com lente de não contato, de 78 dioptrias. Foi realizada também oftalmoscopia binocular indireta com lente asférica de 20 dioptrias. Com os exames descritos, definiu-se o diagnóstico de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica. Os pacientes foram examinados, no mínimo, por dois oftalmologistas do setor de uveíte do HC/UFPE e, nos casos de discordância, por um terceiro oftalmologista.. 5.4.2 Processamento dos dados.. Para processamento dos dados elaborou-se um formulário específico para coleta dos dados, em consonância com os objetivos estabelecidos, o qual foi aplicado a todos os participantes do projeto que aceitaram participar voluntariamente do mesmo (APÊNDICE 1). Nesse protocolo foram anotadas as informações obtidas por meio da anamnese e do exame clínico, bem como os resultados dos exames laboratoriais e evolução do paciente.. 5.5 Método de coleta das amostras.. Após o exame clínico, foi realizada a coleta da amostra da lágrima utilizando fita de papel filtro nº. 4A, marca Toyo®, de 5.0cm de comprimento e 0,5cm de largura, previamente esterilizado. O papel foi dobrado 0.5cm antes da porção proximal, para ser inserido no terço externo da pálpebra inferior, sinalizando o extremo terminal, correspondente ao dedo do examinador. Tal precaução teve por objetivo facilitar a extração posterior da lágrima no laboratório. Quando a coluna de lágrima molhou no mínimo 3.0cm da fita de papel, a mesma foi retirada e colocada em papel não absorvente, sendo imediatamente refrigerada em reservatório apropriado para transporte. Todos os pacientes tiveram lágrimas coletadas de ambos os olhos separadamente, sendo especificado o olho comprometido na amostra de cada paciente. As amostras de lágrimas foram realizadas a partir do primeiro dia da consulta de cada paciente, seguindo um intervalo de 15 em 15 dias, junto ao acompanhamento clínico, sendo a.

(43) 42. última coleta realizada com intervalo de 30 dias. No total, foram seis coletas de amostras para cada paciente. Coleta da amostra de sangue: foi coletada uma amostra de 10ml de sangue venoso de todos os participantes no estudo, no laboratório do HC, para obtenção do soro, que foi congelado a -20º para posterior análise no laboratório do setor de Imunologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), o que foi utilizado para determinação de IgM e IgG anti-toxoplasma.. 5.6 Análise laboratorial.. As análises das amostras de lágrimas e soro foram efetuadas no setor de Imunologia do LIKA-UFPE. Foram realizadas dosagens de imunoglobulinas séricas específicas (IgM e IgG) e IgA secretora específica na lágrima.. 5.6.1 Determinação da IgA secretora anti-T. gondii.. A determinação da IgAs seguiu o que foi descrito por Lynch et al. (2004), na qual foi feita a preparação do antígeno, a partir da cepa RH do T. gondii mantida em camudongos Swiss, os quais tiveram o líquido ascítico submetido à centrifugação e posterior ruptura do parasita por congelamentos sucessivos, para obter extrato bruto de T. gondii, o que foi coletado e armazenado a -4ºC. Ensaio imunoenzimático (ELISA): para pesquisa dos anticorpos IgAs anti–T. gondii na lágrima, foi utilizado o ELISA como descrito por Lynch et al. (2004). Para leitura da densidade óptica foi utilizado leitor de ELISA BIORAD, com filtro de 492nm. Em todos os ensaios foram incluídas amostras de referência de três lágrimas controles negativos e três controles positivos, para controle da variação inter-ensaios. O valor do ponto de corte, para cada ensaio realizado, foi determinado pela média aritmética mais dois desvios padrões das densidades ópticas das amostras das lágrimas dos controles negativos..

(44) 43. A partir dos valores obtidos foram calculadas médias referentes a cada dia e grupo. Assim, os dados apresentados representam o valor das médias e desvio padrão de cada grupo tanto dos olhos doentes, quanto dos olhos sadios.. 5.6.2 Determinação de IgM e IgG anti-T. gondii no soro.. Para a determinação do nível de imunoglobulinas no soro, foi utilizado o método de imunofluorescência, segundo técnica descrita por Camargo em 1964.. 5.7 Análises estatísticas.. Foi realizada uma análise descritiva e a apresentação das variáveis estudadas foi feita através de tabelas. Para testar a suposição de normalidade dos dados foi aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov. Para análise entre grupos foram aplicados o teste t-Student (grupo 1) e o teste não-paramétrico de Mann-Whitney (grupo 2). Para a análise intragrupos foram aplicados os testes de Análise de Variância (ANOVA) para dados pareados (grupo 1) e o teste não-paramétrico de Friedman (grupo 2) (JEROLG, 1996). Nos testes estatísticos, foram considerados significativos valores de ρ<0,05. Os programas utilizados para obtenção dos cálculos estatísticos foram o Excel 2000 e o SPSS v8.0.. 5.8 Considerações éticas.. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde da UFPE – CEP/CCS/UFPE com o registro N° 387/07 (ANEXO 1). Os voluntários assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (APÊNDICE 2)..

(45) 44. 6 ARTIGO.

(46) 45. ARTIGO ORIGINAL. DINÂMICA DA IgA SECRETORA ESPECÍFICA NA LÁGRIMA EM PACIENTES PORTADORES DE UVEÍTE POSTERIOR ATIVA PRESUMIVELMENTE POR Toxoplasma gondii DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA DOENÇA.. DYNAMICS OF SPECIFIC SECRETORY IgA IN TEARS OF PATIENTS WITH ACTIVE POSTERIOR UVEITIS PRESUMABLY BY Toxoplasma gondii ALONG THE FIRST QUARTER OF THE DISEASE.. Mirelle Souza Leão Vasconcelos1 Luiz Felipe Lynch1 Narjara Tiane L. de Melo2 Silvana Ferreira2 Wheverton Ricardo C.do Nascimento2 Maria Isabel Lynch1 Elizabeth Malagueño2*. 1. Setor de Oftalmologia do Hospital das Clínicas (HC) - Universidade Federal de Pernambuco. (UFPE) – Brasil. 2. Setor de Imunologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Universidade Federal. de Pernambuco-LIKA/UFPE - Brasil.. *. Endereço para correspondência:. Elizabeth Malagueño de Santana Campus Universitário, Cidade Universitária, Recife-PE-Brasil. CEP: 50670-901. Tel.: + 55 81 2101 2515; Fax: + 55 81 2126 8485. E-mail: malagueno@nlink.com.br.