EQUINE ENDOMETRITIS. FUNGI AND BACTERIA
Amaral, M.G.1, C.A. Pimentel2, M. Meireles2, S.M. Fiala1, R. Schramm2, E.G. Xavier2 e M. Mendonça2
1Departamento de Morfologia. Instituto de Biologia. Universidade Federal de Pelotas. Avenida Duque de Caxias nº 250. Fragata. Pelotas, RS. Brasil. CEP: 96030-002. E-mail: amaral@ufpel.tche.br
2Faculdade de Medicina Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. Campus Capão do Leão s/nº. Pelotas, RS. Brasil. CEP: 96.010-900.
PALAVRASCHAVEADICIONAIS
Éguas. Infertilidade.
ADDITIONALKEYWORDS
Mare. Infertility.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi estudar a ocorrência de fungos e bactérias no endométrio de éguas e sua associação com alterações inflamatórias. As amostras foram coletadas de duas populações: frigorífico, representado por éguas cujo histórico de infertilidade era desconhecido (N= 481) e campo, representa-do por éguas que permaneceram vazias após uma estação reprodutiva (N= 103). A coleta do material para cultura micológica e bacteriológica das amostras do matadouro era realizada através de uma incisão com bisturi, na serosa uterina flambada por onde eram introduzidos dois swabs: um para cultura bacteriológica e outro para cultura micológica. A coleta do material de éguas subférteis (campo) era rea-lizada pela introdução do swab protegido com a mão enluvada, no útero através da cérvix. Para exame histológico em ambos grupos, era coletado um fragmento do endométrio, o qual era fixado em solução de Bouin durante 24 h, para ser processado e corado pelas técnicas de hematoxilina-eosina (H.E.), ácido periódico de Schiff (PAS) e Gomori-prata. Os swabs eram semeados em placas de agar sangue,
Mac Conkey e agar Sabouraud para pesquisa microbiológica. Os dados foram submetidos à análise descritiva de freqüência, tabulação cruzada e χ2. As culturas para fungos, bactérias e as alterações inflamatórias foram agrupados em duas categorias: positivas ou negativas. Os gêneros Penicilium (35,4%), Aspergillus (20,3%) e Candida (13,9%) foram encontra-das com maior freqüência. Em 65,9% (385/ 584) das amostras examinadas verificou-se inflamação endometrial. Em 15,2% dos casos houve crescimento de fungos com alteração inflamatória do endométrio, sem crescimento de bactérias, e em 13,3% das endometrites em que não cresceu fungo foram isoladas bactérias. Nas amostras do frigorífico, houve alteração inflamatória do endométrio em 280 de 452 amostras (61,9%). Nas amostras de cam-po foram verificados três casos de crescimento de fungo (Candida spp.) sem o crescimento de bactérias; todas as amostras positivas para fungo, apresentaram inflamação endometrial; em duas foram identificadas leveduras no corte histológico. Isto sugere a patogenicidade da
SUMMARY
The objective of this work was to study the frequency of fungi and bacteria in uterine cultures and its association with inflammatory lesions in the endometrium. Samples were collected from two populations: abattoir (mares without known history of fertility N= 481 samples); barren mares (mares open after at least one breeding season N= 103 samples). Two swabs were collected for microbiological investigation: one for bacteria and the other for fungus. From abattoir material, swabs were introduced into the uterine cavity after sterilization of the uterine serosa by means of a heated spatula blade. In the barren mares, samples were collected with swabs in a gloved protected hand through the vagina and cervix. Samples were collected for histology, in abattoir material by opening uterine cavity with scissors and with a Yeoman biopsy punch from live barren mares. The samples were fixed in Bouin solution for 24 h and processed and stained with HE, PAS and Gomori-silver. Swabs were placed in blood agar, Mac Conkey and Sabouraud agar. Data were subjected to descriptive analysis, cross tabulation and χ2. For cross tabulation analysis, bacteriological and fungal culture and inflammation results were recorded as positive or negative. The genus Penicilium (35.4%), Aspergillus (20.3%) and Candida (13.9%) were the most frequently found. The frequency of endometrites in the examined all samples was 65.9% (385/ 584). In uterine samples with endometrites, 15.2 % had growth of fungus without bacteria and in 13.3% had growth of bacteria without fungus. Endometritis without growth of bacteria and fungus were found in 61.9% of the samples (280/ 452). In barren mares, three cases Candida spp. were isolated; all showed inflammatory lesions; there was no bacterial growth in all three cases and in two, yeast were seen in the tissue sections. This fact strongly suggests the patogenicity of
Candida spp. The PAS stain was more sensitivity
to identify fungal endometritis than HE and Silver (p<0.05). It can be concluded that fungal endometritis occur and are associated with
infertility, however a large proportion of cases of endometritis are not associated with fungal or bacterial growth.
INTRODUÇÃO
Endometrites bacterianas foram documentadas com relativa freqüência por Conboy (1978); Vaz et al. (1979); Langoni et al. (1999); Watson (2000), no entanto endometrites micóticas são mais raramente estudadas por razões diversas: segundo Pycock (1999), as endometrites fúngicas não são tão facilmente diagnosticadas comparados com as bacterianas; o cultivo de fungos é mais laborioso do que o cultivo de bactérias porque necessita de um tempo maior de incubação descrito por Lacaz et al. (1984); segundo a bibliografia (Culling et al., 1985) o diagnóstico histológico de fungos requer o uso de colorações específicas para identificação das formas fúngicas e o custo total dos exames é mais elevado do que em uma endometrite bacteriana. Dos poucos relatos de fungos no útero de éguas no Brasil, Langoni et
al. (1999), destacam a importância de
se levar em consideração os aspectos clínicos e histológicos do trato genital além da simples cultura microbiológica. O objetivo deste trabalho foi verifi-car a freqüência de fungos e de bactérias e sua associação com alterações inflamatórias no endométrio de éguas.
MATERIAL E MÉTODOS A pesquisa foi conduzida em éguas (584 amostras) procedentes de duas
populações: éguas de matadouro sem raça definida, porém com biotipo pre-dominantemente da raça Crioula e sem informação sobre a fertilidade, (481 animais) e éguas, que permaneceram vazias por pelo menos uma temporada reprodutiva (103 éguas da raça PSI). No material de matadouro, a coleta do swab era feita após flambar uma espátula e esterilizar por calor a serosa no local da incisão. Nas amostras de campo, o swab era introduzido no úte-ro por via vaginal, púte-rotegido com a mão com uma luva plástica virada do lado avesso, de maneira que o swab não entrasse em contato com a mucosa vaginal. Durante a coleta do material, faziam-se movimentos rotatórios com o swab a fim de retirar material sufi-ciente para as culturas. Logo em se-guida, o material era analisado nos laboratórios de bacteriologia e mico-logia. Para a cultura, os meios utiliza-dos foram: agar sangue, Mac Conkey para cultura bacteriana e agar Sabou-raud dextrose com cloranfenicol para cultura micológica. Nas amostras que apresentaram crescimento bacteriano após 24-48 horas, foi utilizada técnica de coloração de Gram para avaliar a morfologia destes microorganismos, sugerida por Vaz et al. (1979); Ricketts
et al. (1993); Quinn et al. (1994). A
cultura micológica foi mantida a tem-peratura ambiente, de uma semana a quinze dias para a primeira leitura. Quando o crescimento era observado, realizava-se a leitura macroscópica da morfologia das colônias do fungo e logo após era retirado um fragmento da colônia que foi corado com lactofenol azul de algodão, em seguida, o material era colocado entre lâmina e lamínula e então era realizada a análise
micros-cópica em aumento de 100 a 400X, para uma possível identificação da espécie do fungo. Para a identificação específica, utilizou-se a técnica do cul-tivo em lâmina descrita por Riddel (1950).
Nas amostras de campo, um frag-mento do endométrio era coletado com auxilio de uma pinça Yeoman, enquanto que nas amostras de matadouro, o fragmento era coletado com auxilio de uma tesoura após a abertura e exame macroscópico do útero. Logo após a coleta, o fragmento era fixado em solução de Bouin por 24 h, segundo Kenney (1978), Doig et al. (1981), processado e corado pelas técnicas: hematoxilina e eosina (H.E.), ácido periódico de Schiff (PAS) e impregna-do pela prata (técnica de Gomori metenamina-prata). A coloração de H.E. foi usada para observar a presença ou não de inflamação e nas lâminas coradas pelo PAS e nas impregnações pela metenamina-prata era pesquisada a presença de fungos sob a forma de leveduras e hifas, uma vez que as leveduras e hifas são PAS positivas e se impregnam pela prata descreveu Culling et al. (1985).
Para fins de análise os resultados foram agrupados em 2 classes:
0= negativo: ausência de cresci-mento nas culturas bacteriológicas e micológicas, ou de formas fúngicas na histologia.
1= positivo: presença de cresci-mento nas culturas bacteriológicas e micológicas, ou de formas fúngicas na histologia.
No estudo histológico o escore inflamatório= 0, foi usado quando não era observada a presença inflamação. O escore= 1, foi usado quando
cé-lulas inflamatórias estavam presentes sob a forma difusa, intensa ou disseminada no lúmen ou no estrato esponjoso e ou compacto, represen-tando uma infiltração média ou grande, bem como quando se apresentavam focos no estrato compacto podendo ou não invadir o estrato esponjoso.
Os dados foram submetidos à análise descritiva, tabulação cruzada e χ2.
RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram isolados fungos em 79 das 584 amostras analisadas (13,5%), isto é, as culturas micológicas foram posi-tivas para fungos em 76 de 481 amostras de frigorífico (15,8%) e em 3 (2,9%) das 103 amostras de campo. Em seis (7,6%) amostras houve crescimento de hifas e fungos não esporulados (FNE), cuja identificação do gênero e da espécie não foi possível. Poucos relatos de éguas de cria, infectadas por leveduras têm sido pu-blicados na literatura internacional, os exemplos são Zafracas (1975), Dascanio et al. (2001) bem como, Langoni et al. (1999) em estudos rea-lizados no Brasil. Um dos possíveis motivos é a falta de estudos dirigidos para a pesquisa de fungos em animais inférteis, provavelmente devido à de-mora do crescimento das culturas fúngicas, necessidade de colorações histológicas específicas, custo das dro-gas antifúngicas e o longo período de tratamento com antifúngicos. Os gêneros de fungos verificados neste trabalho (tabela I), estão de acordo com as observações de Dascanio et
al. (2001), com exceção do gênero Mucor, que apesar de ter ocorrido em
apenas um caso neste trabalho, não foi encontrado pelo autor citado.
Langoni et al. (1999), utilizando amostras de secreção uterina em cul-tura de Agar-sangue e citologia endometrial, isolaram Candida
albi-cans em 2,2% (7/317) das amostras e
este agente pôde ser detectado em 85,7% (6/7) dos casos através do exame citológico, sugerindo que um número mais amplo de fungos poderia ter sido isolado, se fosse utilizado um meio específico e seletivo para a cultu-ra de fungos, o que é o caso do Agar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol como foi descrito por Lacaz (1984) e realizado neste trabalho. Em alguns casos, no presen-te estudo, a presença de fungos não estava relacionada à inflamação (9,9%). O simples achado destes microorganismos (fungos), sem a utilização de técnicas que comprovem a existência de lesões histológicas, não deve servir como único meio para o
Tabela I. Freqüência de gêneros de fungos
isolados em nas culturas de frigorífico e campo. (Frequency of fungus isolated in culture from abattoir and barren mares).
Crescimento total N % %1 dos fungos Penicilium spp. 28 35,4 71,4 Aspergillus spp. 16 20,3 87,5 Candida spp. 11 13,9 72,7 Rizopus spp. 7 8,9 71,4 Rodothorula spp. 6 7,6 66,7 Hifas + FNE 6 7,6 83,3 Cladosporium spp. 4 5,1 75,0 Mucor spp. 1 1,3 0,0 1Associada à inflamação.
diagnóstico. Segundo Kenney (1978), nem sempre que a cultura revela a presença de Candida albicans, a sua presença é observada no exame histológico. Em alguns casos pode haver uma contaminação superficial ocasional do endométrio, seguida por eliminação espontânea do agente. Em outras ocasiões, ocorre infecção com invasão mais profunda causada pela filamentização da Candida spp., o que reforça a necessidade de se pesquisar o agente não apenas em culturas, porém na histologia.
Segundo Pycock (1999), o prognós-tico para a fertilidade subseqüente de éguas com endometrite micótica é de reservado a desfavorável. Neste trabalho as três éguas que apresen-taram Candida spp., permaneceram vazias na temporada seguinte ao diag-nóstico da infecção. Este resultado ressalta a importância dos fungos na infertilidade, especificamente tendo como exemplo, a Candida spp., única observada nas éguas de campo e associada à inflamação. Este aspecto contraria outros autores que consi-deram a Candida spp. um agente saprófita, pois uma vez que estes fungos são encontrados em tecidos normais e no útero de éguas férteis. No entanto, fatores imunodepressores tais como stress, velhice, etc, podem causar um ambiente favorável ao desenvolvimento da Candida spp. e subseqüentemente levar a uma inflamação endometrial e infertilidade.
Watson (2000) verificou que tanto os agentes bacterianos como as leveduras geralmente são isoladas em éguas com histórico de infertilidade, e também em situações onde os meca-nismos de defesa imunológicos estejam
comprometidos. Em pacientes vítimas de câncer (imunodeprimidos) há uma tendência a infecções fúngicas que se estabelecem com a progressão do processo de imunossupressão citado por Alvarez Gasca et al. (1998).
O gênero Aspergillus foi o que apresentou maior associação com endometrite 87,5% (14/16), seguido do gênero Cladosporium 75% (3/4) e o gênero Candida 72,7% (8/11) (tabela
I). Nas amostras coletadas
verificou-se o crescimento de verificou-sete gêneros de fungos, sendo o gênero Penicillium o mais freqüente (28 das 79 amostras – 35,4%). O gênero Aspergillus foi o segundo em freqüência, 16/79 amostras (20,3%) (tabela I).
Inflamação esteve presente em 65,9% das amostras (385/584), e em 12,7% casos (10/79), verificou-se associação entre isolamento de fungo e alteração inflamatória do endométrio
(tabela II).
Dentre as éguas que apresentaram endometrite, houve crescimento de fungo em apenas 15,0% (58/385); quando foram omitidos os 55 casos de crescimento de bactéria.
Alguns autores como Zafracas (1975); Blue (1983) e Bain (1966) verificaram ocorrência de fungos em éguas apenas na cultura microbiológica. Zafracas (1975), utilizou o muco cervi-cal de éguas pós-parto e éguas vazias durante o cio, como material para cultu-ra, buscando verificar a presença de fungos, sem o uso do exame histológico ou citológico, o que não evidencia associação de fungos com inflamação. Kenney (1978) considera sem valor o crescimento de microorganismos quando não há alteração inflamatória confirmada pela citologia ou histologia.
Apesar de o exame histológico apre-sentar um custo mais elevado e ser mais demorado quando comparado à citologia; o exame histológico parece ser mais útil porque, se utilizando desta técnica, a presença de fungo pode ser identificada e as infecções profundas poderão ser diagnosticadas quando se observam alterações inflamatórias ao redor das hifas, deve-se salientar que na citologia somente células do lúmen são consideradas.
Coutinho da Silva et al. (2000), utilizando a técnica de impregnação pela prata considerou a mesma supe-rior ao PAS. Neste estudo, a identi-ficação de fungos através da técnica do PAS esteve associada ao cresci-mento em cultura micológica em 55,7% dos casos (44/79), enquanto que a téc-nica de Gomori-prata identificou fungos na histologia em 45,6% (36/79) das amostras com cultura positiva (p<0,05). Em dois dos três casos onde foi obser-vado o crescimento de leveduras de
Candida spp. houve associação com
inflamação e estas foram identificadas nos cortes histológicos corados por PAS. Nas lâminas coradas por H.E. e nas impregnadas pela prata as leveduras não foram identificadas. Quando estas éguas foram cobertas
continuaram vazias, o que demonstra a possível participação desse agente na infertilidade dessas éguas.
A maior eficácia da técnica histoquímica de coloração pelo PAS na detecção de formas fúngicas se deve à composição química da parede celular, que é basicamente composta por polissacarídeos (hexoses e hexosa-minas) e ainda apresenta como princi-pal polissacarídeo compondo a parede celular a quitina, N-acetil glicosamina explica Culling et al. (1985). A técnica de Gomori (impregnação pela prata) é específica somente para um ou poucos constituintes químicos da parede celu-lar cita Culling et al. (1985).
A participação de bactérias tem sido muito estudada nos casos de endometrites em éguas por Conboy (1978), Vaz (1979); Langoni et al. (1999), Pycock (1999) e Watson (2000). Quanto à freqüência do crescimento bacteriano nas amostras, foram Streptococcus β hemolítico em 47,2% (26/55) e Escherichia coli 40% (22/55) (tabela III). A presença destes agentes bacterianos associados à inflamação endometrial, está de acordo com o documentado na bibliografia, ou seja, predominância de
Streptococcus β hemolítico e
Esche-Tabela II. Associação entre crescimento de fungos, bactérias e inflamação em endométrios
de éguas. (Association between growth of fungus, bacteria and inflammation in the mares endometrium). Inflamação (-) Inflamação (+) Neutrófilos Total
N % N % N % N %
Crescimento de fungos 69 87,3 10 12,7 10 14,5 79 100
Crescimento de bactérias 42 76,4 13 23,6 13 23,4 55 100
Sem crescimento de fungos 67 13,3 438 86,7 0 0 505 100
richia coli. Em um estudo direcionado
à raça Crioula, Fiala (1999), relatou o crescimento bacteriano em 30,6% (31/ 101) das amostras, onde os agentes mais freqüentes foram o Streptococcus β hemolítico em 15,8% e a Escherichia
coli em 8,9%. Essa predominância de Escherichia coli nos casos de éguas
inférteis indica, possivelmente, conta-minação fecal sugere Carter et al. (1995) que pode estar associada ao mau fechamento vulvar e a uma maior manipulação do trato genital durante os processos terapêuticos visando res-taurar a fertilidade.
Os agentes considerados venéreos e mais patogênicos como
Pseudo-monas spp. e Klebsiella spp.
ocorre-ram com menor freqüências de acordo com o que já havia sido documentado por Caslick (1937); Conboy (1978); Vaz et al. (1979). Neste estudo 66,7% das amostras em que houve cresci-mento de Klebsiella spp. (tabela IV) apresentaram neutrófilos na histologia. Langoni et al. (1999), verificou que 81% (379/468) das amostras com crescimento bacteriano apresentaram citologia positiva, enquanto que em 19% (89/468) houve crescimento bacteriano, porém este não esteve
associado à inflamação. Langoni et al. (1999), diagnosticou a inflamação endometrial através da citologia enquanto que neste trabalho foi diag-nosticado pela histologia.
Troedsson et al. (1995), definiram éguas suscetíveis como aquelas que têm seus mecanismos de defesa com-prometidos e sofrem de endometrite por organismos que, normalmente, não são patogênicos (oportunistas), tal como o Streptococcus β hemolítico. Hughes e Loy (1969) destacaram que apesar da importância do Streptococcus β hemolítico nas endometrites, esse é um agente que faz parte da flora nor-mal da pele dos eqüinos, e só se estabelece quando houver uma defi-ciência no sistema imunológico da égua. As alterações inflamatórias sem o crescimento bacteriano (87,9%)
(tabela II) podem ser resultantes de
agentes irritantes (urovagina, pneu-movagina, traumas durante o parto) ou agentes infecciosos cuja infecção tenha desaparecido, mas permanecido o processo inflamatório, uma vez que outros autores citam outras causas para endometrites, além dos fungos, bactérias (Bain, 1966; Conboy, 1978; Langoni et al., 1999; Pycock, 1999;
Tabela III. Freqüência do crescimento bacteriano nas amostras. (Frequency of the bacterial growth in the samples).
Crescimento bacteriano N % Frigorífico % Campo %
Streptococcus β hemolítico 26 47,2 24 61,5 2 12,4 Escherichia coli 22 40,0 13 33,4 9 56,3 Staphylococcus spp. 3 5,5 2 5,1 1 6,3 Klebsiella spp. 3 5,5 0,0 0,0 3 18,7 Actinobacillus spp. 1 1,8 0,0 0,0 1 6,3 Total 55 100,0 39 100,0 16 100,0
Watson, 2000), como a pneumovagina e urovagina (Asbury, 1982). Zafracas (1975), observou que 75% (12/16) das éguas que apresentaram pneumova-gina eram portadoras de Candida spp.; enquanto que Collins (1964), encontrou esse mesmo fungo em 1,97% (20/1015) das éguas.
Hinrichs et al. (1988), relataram que apenas 31% de 48 éguas com endometrite clínica ou com achados histológicos de endometrite, apresen-taram crescimento de bactérias. Este fato sugere que outras causas podem ser as responsáveis pela inflamação, como, por exemplo, os fungos que neste trabalho estiveram associados à inflamação histológica em 12,7%
(tabela II). Como também, Doig
(1981), relatou 18% (5/28) de culturas positivas associadas à presença de inflamação. Em 87,9% (465/529) das éguas com alterações inflamatórias no endométrio não houve crescimento de fungos e 86,7% (438/505) (tabela II) das éguas com o mesmo tipo de alteração no endométrio não houve crescimento de bactérias. Este achado sugere que estas éguas, por apresen-tarem histórico de infertilidade, possam
apresentar urovagina ou, pneumova-gina. Além disso, estes endométrios podem ter sido tratados com drogas irritantes que poderiam ter provocado uma inflamação conforme sugere Asbury (1982). Outra possibilidade é que essas éguas tenham eliminado o agente por seus mecanismos de defesa, porém o processo inflamatório ainda tivesse persistindo.
Embora não tenha sido possível re-lacionar um maior número de fungos nas amostras de campo (éguas com histórico de infertilidade) foi possível estabelecer uma associação entre a identificação de fungos e inflamação no endométrio. Muitos casos de endometrites verificados histolo-gicamente, não foram acompanhados de isolamento em culturas microbio-lógicas, evidenciando que outros agen-tes estejam participando ou seriam apenas mononucleares indicando croni-cidade e cura.
Uma quantidade maior de cresci-mento bacteriano (15,5% vs 8,1%) foi observada nas éguas que apresentavam problemas de infertilidade, em compa-ração às éguas de frigorífico. Foram isolados fungos em 76 das 481 amostras obtidas em frigorífico (15,8%), enquanto que foram detectados fungos em apenas 3 de 103 amostras (2,9%), das éguas com histórico de subfer-tilidade. Era esperada maior freqüência de alterações inflamatórias nas éguas de campo, por se tratarem de éguas com histórico de subfertilidade; entre-tanto, as éguas que normalmente, são enviadas para o frigorífico são animais de descarte, e que muitas vezes podem não estar reproduzindo adequadamente ou serem éguas velhas e suas defesas naturais contra os processos
inflama-Tabela IV. Associação do crescimento
bacteriano e inflamação nas amostras.
(Association of the bacterial growth and inflammation in the samples).
C. bacteriano N Inflamação % Streptococcus β hemolítico 26 9 34,6 Escherichia coli 22 4 18,2 Klebsiella spp. 3 2 66,7 Total 51 15 29,4
tórios podem se encontrar reduzidas. Percentagem semelhante a esta (60,9%) já havia sido do documentada em éguas de matadouro por Hammes
et al. (1997).
Existem inflamações do endométrio, causadas por fungos associados à
infertilidade. O isolamento microbioló-gico do agente não é suficiente para o diagnóstico da endometrite fúngica, sendo o exame histopatológico funda-mental para o diagnóstico. A técnica histologia do PAS foi a mais eficaz para o diagnóstico definitivo.
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