Recebido para publicação em 23/03/2006 Aceito para publicação em 07/11/2006
Efeito do ANA e BAP na calogênese e organogênese de Pfaffia tuberosa (Spreng.)
Hicken
FLORES, R.; NICOLOSO, F.T.
Departamento de Biologia, Centro de Ciências Naturais e Exatas (CCNE), UFSM, 97105-900. Santa Maria, RS. E-mail: nicoloso@base.ufsm.br
RESUMO: Segmentos nodais de Pfaffia tuberosa foram cultivados em meio MS suplementado com ANA (5; 10; 20 e 30 M) e BAP (0; 1 e 10 M). Após 35 dias de cultivo, calos foram obtidos em todos os tratamentos testados. O aumento da concentração de ANA favoreceu o crescimento de calos friáveis, bem como a área do explante coberta por calo. Por outro lado, o aumento da concentração do ANA e a presença do BAP reduziram a regeneração de brotos axilares e de raízes nos calos. A formação de brotos adventícios não foi observada, o que pode ser devido ao uso de concentrações muito elevadas de ANA e BAP no meio.
Palavras-chave: Amaranthaceae, ginseng brasileiro, cultivo in vitro
ABSTRACT: Effect of ANA and BAP on calogenesis and organogenesis of Pfaffia tuberosa (Spreng.) Hicken. Nodal segments of Pfaffia tuberosa were cultivated in MS medium supplemented with NAA (5; 10; 20 and 30 M) and BAP (0; 1 and 10 M). After 35 days of cultivation, calluses were obtained in all tested treatments. The increase of NAA concentration favored the growth of friable calluses, as well as the explant area covered by the callus. On the other hand, the increase of NAA concentration and the presence of BAP reduced the regeneration of axilary shoots and roots on calluses. Adventitious shoots formation were not observed, which could be related to the high concentration of NAA and BAP in the medium.
Key words: Amaranthaceae, Brazilian ginseng, in vitro culture
Atualmente existe uma grande busca por fitoterápicos ou suplementos alimentares que aumentem a resistência do organismo humano frente ao estresse físico e/ou mental. Neste sentido, estudos fitoquímicos têm revelado a presença de compostos medicinais com efeitos adaptógenos (aumento da resistência frente ao estresse) em algumas espécies de Pfaffia (Amaranthaceae), conhecidas como ginseng brasileiro, as quais já são utilizadas pela indústria farmacêutica.
A Pfaffia tuberosa é uma planta herbácea encontrada em vários Estados do Brasil e países vizinhos (Smith & Downs, 1972). Algumas substâncias com propriedades medicinais foram isoladas nas raízes de P. tuberosa, como as saponinas triterpênicas e os ecdisteróides, destacando-se o ácido oleanólico e ecdisterona, respectivamente (Nishimoto et al., 1986).
O cultivo de calos, células e órgãos in vitro
tem sido uma alternativa viável para o estudo e a produção de metabólitos secundários (Kollávorá et al., 2004; Arikat et al., 2004; Oksman-Caldentey & Inzé, 2004). Em geral, o método mais utilizado para o estudo da produção de metabólitos é o cultivo de células em suspensão (Botta et al., 2001). Para isso, faz-se necessário determinar protocolos eficientes para a indução e manutenção de calos friáveis. Vários grupos de produtos naturais importantes para as indústrias farmacêuticas e de alimentos já foram isolados a partir de células em suspensão (Kollávorá et al., 2004; Oksman-Caldentey & Inzé, 2004). Adicionalmente, a constatação de que ocorrem modificações no teor de compostos de acordo com o grau de diferenciação dos tecidos, levou ao desenvolvimento de um grande número de pesquisas com o intuito de estudar a viabilidade de produção de compostos em calos com diferentes características, principalmente no que diz respeito à consistência e
ao potencial morfogênico. Vieira et al. (1995), trabalhando com Gomphrena macrocephala (Amaranthaceae), relacionaram calos com características diferentes quanto à consistência, organogênese e presença de betalaína com a capacidade de produção de frutanos in vitro. Calos de Gomphrena globosa possuem potencial para a produção de vários metabólitos in vitro, inclusive compostos não observados na planta mãe (Andre et al., 2003). Kusakari et al. (2000) relatam que não foram encontradas saponinas em calos de Bupleurum falcatum, enquanto que nas raízes adventícias formadas nos calos, estes compostos foram detectados, sugerindo que a diferenciação celular foi necessária para a biossíntese desses metabólitos. Em Ecballium elaterium, Toker et al. (2003) obtiveram altos teores de cucurbitacina B em calos oriundos de segmentos nodais cultivados em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) com 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA).
Em espécies pertencentes à família Amarantaceae, o ANA e o BAP têm sido utilizados na indução de calos e regeneração de plantas in vitro (Mercier et al., 1992; Vieira et al., 1995; Bennici et al., 1997). Contudo, não há relatos sobre o efeito de fitoreguladores na calogênese e morfogênese em P. tuberosa. Em função disso, este trabalho teve como objetivo verificar o efeito de concentrações de ANA e BAP no estabelecimento de calos e no potencial morfogênico de segmentos nodais, tendo em vista o fornecimento de subsídios para futuros trabalhos quanto à produção de metabólitos secundários in vitro.
O ensaio foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia Vegetal do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil.
Plantas nativas de P. tuberosa, coletadas no município de São Pedro do Sul (RS, Brasil), foram desinfestadas e multiplicadas in vitro conforme metodologia proposta por Flores et al. (2006). Plantas homogêneas, com 30 dias de idade, foram utilizadas como material vegetal. Utilizaram-se como explantes segmentos nodais (com 1 cm e contendo duas gemas axilares), os quais foram cultivados nos sais e vitaminas de MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido de 100 mg L-1 de mio-inositol, 30 g L-1 de
sacarose e de 6 g L-1 ágar. O meio de cultura foi
suplementado com quatro concentrações (5; 10; 20 e 30 M) de ANA combinadas com três concentrações (0; 1 e 10 M) de BAP, em esquema fatorial 4x3. O pH do meio foi ajustado para 5,9 e autoclavado a 120ºC e 1,0 atm de pressão, durante 20 minutos. Os explantes foram inoculados na posição horizontal, em frascos (100 mL) contendo 20 mL de meio, onde se colocaram cinco explantes/frasco. O material foi incubado no escuro, em sala de crescimento, com
temperatura de 25±2°C, durante dez dias. Posteriormente, foram expostos a condições de luminosidade fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas-frias, com intensidade de 35 mol m-2s-1 e
fotoperíodo de 16 horas.
As avaliações foram realizadas aos 35 dias de cultivo, considerando-se as seguintes variáveis:
a) Calogênese: percentagem de formação de calo, intensidade de calo formado, área dos explantes cobertas com calo e características dos calos (no que diz respeito à consistência, textura e coloração). Para a variável intensidade de calo, utilizou-se uma escala de 1 a 4, onde: 1= ausência de calo ; 2= calo com pequeno tamanho (<1 cm); 3= médio tamanho (1-1,5 cm) e 4= calo grande (>1,5 cm) conforme proposto por Tao et al. (1998). Na avaliação da área de calo, considerou-se que os explantes apresentavam 25, 50, 75 e 100% da área coberta com calos, conforme Lameira et al. (1997).
b) Organogênese: frequência de regeneração de brotos axilares e de raízes e frequência de regeneração de brotos adventícios. A avaliação da organogênese indireta de brotos foi realizada semanalmente até 60 dias de cultivo.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente ao acaso com cinco repetições, sendo cada unidade experimental composta por um frasco com cinco explantes. Os dados foram submetidos à análise da variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey, com =0,01, utilizando-se o pacote estatístico SANEST (Sistema de Análise Estatística) (Zonta & Machado, 1984). Os resultados expressos em percentagem foram transformados segundo arco seno raiz quadrada de (X/100), onde X é o valor percentual obtido. A variável intensidade de calo foi transformada segundo logaritmo de (X+1), onde X é o valor obtido.
Os segmentos nodais de P. tuberosa mostraram-se muito responsivos in vitro. Após 35 dias de cultivo, verificou-se a formação de calos em todos os tratamentos, o que corrobora com os resultados obtidos para outras espécies de Amaranthaceae (Vieira et al., 1995). George (1996) complementa que, juntamente com o 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), o ANA é uma das auxinas mais utilizadas na formação de calos.
A proliferação dos calos foi favorecida na presença de 20-30 M de ANA e 1 M BAP, demostrando a importância da interação entre esses fitoreguladores na formação de calos de P. tuberosa (Tabela 1).
Estudos preliminares conduzidos com esta espécie mostraram que não há formação de calos quando os segmentos nodais são cultivados em meio MS isentos de ANA (Flores et al., 2006). De fato, as auxinas são muito utilizadas para promover o crescimento de calos, porém as citocininas também
TABELA 1. Efeito de concentrações de ANA e BAP na intensidade de calogênese em segmentos nodais de P. tuberosa, após 35 dias in vitro.
*Médias seguidas de mesma letra minúscula não diferem significativamente quanto as concentrações de ANA e maiúsculas quanto às concentrações de BAP, pelo teste de Tukey ( =0,01).
desempenham um papel importante na calogênese. Em Gomphrena officinallis (Amaranthaceae), o BAP e o ANA foram eficazes na formação de calos a partir de segmentos nodais. Contudo, ao contrário do observado em P. tuberosa, não houve formação de calos em meio suplementado apenas com ANA (Mercier et al., 1992).
Semelhante ao encontrado para o crescimento dos calos, observou-se um incremento na área dos calos conforme o aumento da concentração de ANA no meio (Tabela 2). As concentrações de BAP, bem como a interação entre BAP e ANA não afetaram de forma significativa a área de calo.
TABELA 2. Efeito de concentrações de ANA na percentagem da área do explante coberta por calos em segmentos nodais de P. tuberosa, após 35 dias de cultivo in vitro.
*Médias seguidas de mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Tukey ( =0,01).
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As concentrações ideais de ANA para o estabelecimento de calos variam muito de acordo com o genótipo, explantes e interação com outros fitoreguladores. Em P. tuberosa, melhores resultados, no que diz respeito à calogênese, foram registrados com 20-30 M de ANA e 1 M de BAP. Contudo, mesmo na concentração mais elevada de ANA apenas cerca de 75% da área do explante foi coberta por calo (Tabela 2). Desta forma, sugere-se o estudo de concentrações mais elevadas dessa auxina, haja visto que o ideal é a obtenção de uma combinação hormonal que favoreça o crescimento do calo como um todo, ou seja, que os tecidos do calo apresentem alta capacidade de crescimento. Em Amaranthus, o
crescimento dos calos foi favorecido em meio acrescido de 5,4 M de ANA juntamente com 4,4 ou 13,3 M de BAP, contudo o teor hormonal ideal para a proliferação dos calos variou entre as espécies e linhagens estudadas (Bennici et al., 1997).
Os calos, de maneira geral, apresentaram consistência predominantemente friável, textura irregular e coloração variando entre albino e branco, o que concorda com as observações de Narayanaswamy (1977). Além disso, constatou-se que o uso de concentrações elevadas de BAP (10 M) e de ANA (10-30 M) induziu o aparecimento de áreas amareladas mais compactas nos calos ao invés de áreas brancas. Por outro lado, Brown & Charwood (1990) relataram que, de modo geral, o aumento da concentração de auxina promove um incremento na formação de calos friáveis, enquanto que concentrações mais reduzidas promovem um aumento na frequência de calos compactos. No entanto, além do tipo e concentração de auxina, a consistência dos calos também é influenciada por outros fatores, como a concentração de citocinina, tipo de explante e, sobretudo, pelo genótipo (Remotti & Löffler, 1995). Todos estes fatores devem ser levados em consideração durante a otimização de protocolos que tenham como propósito a produção de calos friáveis. Semelhante ao observado neste ensaio, concentrações reduzidas de ANA e BAP induziram a formação de calos friáveis em explantes de Gomphrena officinalis (Mercier et al., 1992). O ANA também foi eficiente na indução e crescimento de calos friáveis em carqueja amarga (Silva et al., 2001). Por outro lado, Vieira et al. (1995) trabalhando com a indução e caracterização de calos em Gomphrena macrocephala, obtiveram calos compactos em segmentos nodais cultivados em meio MS suplementado com 2,7 M de ANA e 4,4 M de BAP. Observou-se o desenvolvimento de brotos a partir das gemas axilares presentes nos explantes apenas nos tratamentos isentos de BAP. Adicionalmente, constatou-se uma redução na percentagem de calos com brotos axilares com o aumento da concentração de ANA (Tabela 3). Estes resultados estão de acordo com os obtidos em G. officinalis, onde apenas baixas concentrações de ANA são indicadas para a proliferação de brotos axilares, porém ao contrário do observado em P. tuberosa, o BAP foi essencial para regeneração (Mercier et al., 1992).
De forma semelhante ao observado na regeneração dos brotos, a formação de raízes foi influenciada negativamente pelo aumento das concentrações de ANA e de BAP. Além disso, independente das concentrações de ANA, o BAP na concentração de 10 M inibiu completamente a formação de raízes (Tabela 3). O ANA, juntamente com o BAP, também induziu calos rizogênicos em
Malus (Morales et al., 1999) e Alocasia (Thao et al., 2003).
A indução de organogênese em calos é um aspecto importante no cultivo in vitro de plantas medicinais, uma vez que, em algumas espécies, raízes e/ou brotos adventícios são capazes de sintetizar compostos de interesse em maior quantidade quando comparado com outros métodos de cultivo (Kollávorá et al., 2004; Oksman-caldentey & Inzé, 2004).
Em geral, as concentrações de ANA e BAP induziram calos de pequeno tamanho (Tabelas 1 e 2), o que indica que novas combinações entre
TABELA 3. Percentagem média de regeneração de brotos axilares e de raízes adventícias em calos cultivados em meio MS acrescido de concentrações de ANA e BAP, após 35 dias de cultivo.
*Médias seguidas de mesma letra minúscula não diferem quanto às concentrações de ANA e maiúsculas quanto às concentrações de BAP, pelo teste de Tukey ( =0,01).
fitoreguladores devem ser testadas no sentido de maximizar a proliferação celular em P. tuberosa. Por outro lado, em outros exemplares de amarantáceas,
como Amaranthus e Gomphrena, baixas
concentrações de ANA e o BAP têm sido utilizados com eficiência na indução de calos (Mercier et al., 1992; Vieira et al., 1995; Bennici et al., 1997).
Apesar das altas concentrações de ANA favorecerem o crescimento dos calos, houve uma redução significativa no potencial morfogênico dos mesmos. Isto indica que, em P. tuberosa, essa auxina não é indicada quando se tem como propósito a indução simultânea de calos e de organogênese.
Este efeito do ANA na regeneração pode ser devido ao uso de concentrações muito elevadas deste fitoregulador, pois em G. officinalis, a presença do ANA em concentrações superiores a 0,5 M inibiu a regeneração (Mercier et al., 1992). O efeito negativo do ANA na organogênese também foi observado em G. macrocephala (Vieira et al., 1995) e em outras espécies (Flores et al., 2003). Kumar & Mathur (2004) estudaram o efeito do ANA e o BAP na instabilidade genética de calos de Pisum sativum e constataram que as concentrações 5,37 e 10,74 M de ANA induziram aberrações cromossômicas, as quais resultaram em uma baixa frequência de regeneração. Adicionalmente, ficou evidente o efeito negativo do BAP no desenvolvimento de brotos axilares e na regeneração de raízes nos calos de P. tuberosa. A inibição do desenvolvimento de raízes na presença de BAP já foi observado em muitas espécies (George, 1996). Porém, o BAP é uma citocinina muito utilizada para induzir a proliferação de brotações in vitro (Morales et al., 1999). Além disso, Litz & Gray (1992) relataram que, na maioria das espécies, há um sinergismo entre ANA e BAP na organogênese. Em G. officinallis (Mercier et al., 1992) e em Amaranthus cruentus (Bennici et al., 1997), a produção de brotações axilares foi intensificada em meios contendo ANA e BAP.
As concentrações de ANA e BAP utilizadas neste ensaio não favoreceram a regeneração de
brotos adventícios a partir dos calos de P. tuberosa. Já em Amaranthus, o uso do ANA juntamente com o BAP induziu uma frequência de 54% de calos regenerativos (Bennici et al., 1997) e em Cuminum, esses fitoreguladores foram essenciais para a organogênese indireta, obtendo-se 91% de regeneração (Ebrahimie et al., 2003). O ANA e o BAP também foram utilizados para promover a regeneração de brotos em Paspalum (Kaur & Kothari, 2004).
No caso da P. tuberosa, os resultados permitiram concluir que o aumento da concentração de ANA favorece o crescimento de calos friáveis, porém reduz a organogênese. Além disso, o BAP inibe a regeneração de brotos axilares e raízes. No entanto, sabe-se que competência morfogenética é um fenômeno complexo influenciado não apenas pelos fitoreguladores, mas por fatores inerentes ao genótipo, idade e tipo de explante.
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