Rui Seabra Ferreira Junior

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VENENOS NATIVOE IRRADIADO COM COBALTO-60 DE SERPENTES Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu E Bothrops moojeni

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu, da Universidade Estadual Paulista – UNESP, para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais (Modalidade Biologia Tropical)

Orientador: Prof. Dr. Domingos Alves Meira Co-Orientador: Prof. Dr. Benedito Barraviera

Botucatu – SP 2003

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2 Objetivos 8

3 Material e Métodos 9

3.1 Material 9

3.1.1. Animais utilizados nos experimentos ₉

3.1.2. Peçonhas utilizadas nos experimentos ₉

3.1.3. Reagentes e fonte de irradiação 10

3.3 Métodos 10

3.2.1. Irradiação das peçonhas ₁₀

3.2.2. Atividade tóxica das peçonhas ₁₀

3.2.3. Processo de imunização dos camundongos ₁₁

3.2.4 Titulação dos anticorpos séricos produzidos ₁₁

3.2.5. Neutralização e potência do soro produzido ₁₃

3.2.5.1 Capacidade neutralizante “in vitro” do antiveneno nativo e irradiado ₁₃

3.2.5.2 Potência “in vitro” do antiveneno nativo e irradiado ₁₃

3.2.5.3 Capacidade neutralizante “in vivo” ₁₄

3.2.6. Avaliação clínica dos animais ₁₄

3.2.7. Análise estatística 14

4 Resultados 16

4.1 Método de ensaio imunoenzimático (ELISA) 16

4.1.1 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir de veneno nativo e irradiado de Crotalus durissus terrificus

16

4.1.2 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir de veneno nativo e irradiado de Bothrops jararaca

27

4.1.3 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir de veneno nativo e irradiado de Bothrops jararacussu

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6. Considerações finais ₁₀₅

7. Resumo ₁₀₆

8. Summary ₁₀₇

9. Referências bibliográficas ₁₀₈

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Trabalho desenvolvido nos Laboratórios do Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos - CEVAP Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, São Paulo e no Instituto de Pesquisa Energéticas e Nucleares – IPEN/CNEN

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Sonhei que estava andando na praia com o Senhor, E através do Céu, passavam cenas da minha vida. Para cada cena que passava, percebi pegadas na areia. Uma era minha e a outra do Senhor. Quando a última cena da minha vida passou diante de nós, Olhei para as pegadas na areia, Notei que, muitas vezes no caminho da minha vida, Havia apenas um par de pegadas na areia, Notei também que isso aconteceu Nos momentos mais difíceis da minha vida. (...) – Senhor, não compreendo... Por que nas horas em que eu mais necessitava Vós me deixastes? O Senhor respondeu: Meu filho, Eu te amo e jamais te deixaria Nas horas da tua prova e do teu sofrimento. Quando vistes na areia apenas um par de pegadas, Foi exatamente aí que Eu te carreguei em meus braços!

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À minha esposa, Ana Silvia, amor da minha vida, pelo incentivo durante esta fase e as minhas desculpas pelos atrasos e momentos ausentes.

Aos meus pais, Rui e Maria Emília, pela minha formação, caráter e incansável estímulo durante toda vida.

Aos meus irmãos, Milena e Danilo, pelo amor e confiança depositados em mim.

Ao meu avô, Joaquim Luís Neto (In memorian) por acreditar.

Ao meu sogro, Benedito e minha sogra, Silvia, pelo apoio e auxílio durante este período.

Aos meus cães, Alf (Bigodão), Estrelinha (Vaca), Dolly (Lula) e Kika (Chico Amigo) pelo ouvido amigo nas horas difíceis.

Não precisamos saber nem “como” nem “onde”, mas existe uma pergunta que todos nós devemos fazer sempre que começamos qualquer coisa: “Para que tenho que fazer isto?”.

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Vencedores nascem antes de qualquer vitória. Vencedores nascem da motivação, Nascem da dedicação e do esforço. Vencedores não nascem vencedores. Vencedores se tornam vencedores, Porque tiveram quem acreditasse neles, Torcesse por eles e lutasse por eles. Vencedores são todos aqueles que se preparam Para um dia vencer!

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O primeiro sintoma de que estamos matando nossos sonhos é a falta de tempo. As pessoas mais ocupadas têm tempo para tudo. As que não nada fazem estão sempre cansadas.

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É preciso não relaxar nunca, mesmo tendo chegado tão longe. Tudo que o mundo precisa são de exemplos, e não de opiniões.

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Dr. Rinaldo Pôncio Mendes, Prof. Dr. Benedito Barraviera, Prof. Dr. Paulo Câmara Marques Pereira e Prof. Dra. Lenice Rosário de Souza, pela enorme contribuição na minha formação.

Ao Prof. Dr. José Carlos Martinez, pelos ensinamentos transmitidos e discussões “estatísticas”.

À amiga Janaína Baptista Alves, pela paciência, participação e confiança. Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Magalhães Lopes, pelo incentivo e conselhos. Ao Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo, pelas sugestões e contribuições.

Ao Prof. Dr. Hélio Langoni, pelas primeiras orientações na minha carreira acadêmica.

Ao Dr. Patrick J. Spencer, pela amizade e prestação.

Aos amigos do CEVAP, Paulo, Marcos, Fernanda e Thomaz pelo total auxílio. À Fabiana Custódio e André Trombeta, pela disponibilidade constante cooperação diária.

À Heloísa Pardini, pela amizade e inglês sempre perfeito.

Aos amigos Camilo e Guilherme, pelo companheirismo e amizade Ao amigo Edmílson, pela atenção e dedicação.

Aos amigos Cláudio e Fábio, pela paciência durante este período.

Aos funcionários do CEVAP e do IPEN, pela atenção nos serviços prestados. Ao Biotério da UNESP, pela prontidão em fornecer os animais utilizados.

Aos funcionários da seção de Pós-Graduação da FMB, pelos auxílios prestados sempre com muita dedicação.

Aos funcionários da Biblioteca do Campus de Botucatu pela elaboração da ficha catalográfica.

Ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos – CEVAP / UNESP, em especial a Profa. Dra. Silvia Regina Sartori Barraviera pelo total apoio logístico para a realização deste trabalho.

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proteínas, peptídeos e em pequenas proporções carboidratos, lipídeos, nucleotídeos, aminoácidos e componentes orgânicos. Os principais componentes tóxicos são proteínas e enzimas, as quais estão diretamente relacionadas com a alimentação e defesa da serpente (2).

O tratamento adequado dos indivíduos acidentados por serpentes peçonhentas é um desafio que o homem tenta solucionar há muito tempo.

Assim, antes da descoberta do soro antiofídico, os indivíduos picados eram tratados por curandeiros que os submetiam a simpatias, aplicações de soluções preparadas a partir de um grande número de vegetais e álcool e também pelo uso de pedras porosas cuja função era de retirar o veneno contido na ferida (3).

Trabalhos desenvolvidos por Behring e Kitasato (1894) a partir da soroterapia contra difteria e tétano, mostraram que o soro dos animais “vacinados” contra a peçonha possuía também uma substância antitóxica capaz de neutralizar os efeitos do veneno e de transmitir imunidade passiva a outro animal não imunizado (4).

Ainda em 1894, Calmette, Phisalix e Bertrand, também demonstraram a possibilidade de transferência de resistência de um animal imunizado, para outro não imunizado conferindo proteção passiva às peçonhas (4).

Descoberta e estabelecida a possibilidade de animais serem imunizados contra o veneno ofídico, estava lançada a base da soroterapia aplicada ao tratamento das picadas por serpentes venenosas.

Segundo Vital Brazil (3), a partir desses resultados, Calmette propôs que o soro hiperimune, obtido a partir do veneno de uma determinada espécie de serpente, seria capaz de neutralizar o veneno de qualquer outra.

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inoculação do veneno, em cobaias e foi observado que os animais morriam no mesmo espaço de tempo que as testemunhas que não haviam recebido qualquer medicação (3). Como o soro havia sido preparado dois anos antes, Vital Brazil teve o cuidado de não tirar conclusões sobre a ineficiência na neutralização dos venenos das serpentes brasileiras.

Em maio de 1899, após nova experiência sem sucesso com o soro de Calmette, Vital Brazil resolveu testar o soro obtido de cães e cabritos, que ele havia imunizado utilizando veneno de jararacas e cascavéis. Observou que o soro destes animais conferia proteção específica para cada um destes venenos e que eles não apresentavam sintomas de envenenamento (5).

Em uma conferência na Escola de “Pharmácia” de São Paulo, Vital Brazil apresentou cientificamente os resultados de seus experimentos, tendo ainda descrito os sintomas provocados por mordeduras das serpentes brasileiras classificando o envenenamento em crotálico e botrópico. Dessa forma o soro específico para o tratamento de cada caso poderia ser escolhido (5).

Na seqüência dos experimentos, Vital Brazil constatou que, misturando os soros anticrotálico e antibotrópico em doses iguais, esta mistura conferia proteção tanto nos acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops quanto serpentes do gênero Crotalus. Isto possibilitava o tratamento quando não era conhecida a espécie de serpente causadora do acidente (5).

Outra constatação de Vital Brazil foi a de que, a quantidade de soro a ser utilizada deveria ser proporcional à quantidade de veneno inoculada (3).

No tratamento dos acidentes por picadas de serpentes são utilizados soros heterólogos obtidos a partir do plasma de animais, geralmente eqüídeos e ovinos, hiperimunizados com venenos de serpentes (6).

Os antivenenos preparados a partir de plasmas hiperimunizados de cavalos são considerados como o único tratamento específico para o envenenamento por serpentes no Brasil (7, 8).

Os adjuvantes que vêm sendo utilizados na hiperimunização de cavalos com bons resultados são o Adjuvante de Freund Completo e Incompleto, que são administrados respectivamente no primeiro e segundo inóculos e o alginato de sódio ou hidróxido de alumínio nos demais (9, 10).

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Para obtenção de plasmas hiperimunes antibotrópicos e anticrotálicos, os cavalos são inoculados com diversas doses de venenos dessecados que normalmente possuem atividade tóxica elevada. Com relativa freqüência são observadas reações locais e sistêmicas que podem levar, inclusive o animal à morte (13).

Segundo os mesmos autores, as reações locais e sistêmicas observadas nos cavalos foram consistentemente reduzidas ou ausentes, nos animais que receberam os venenos tratados com glutaraldeido quando comparadas com aquelas dos animais imunizados com venenos não tratados.

Por outro lado, o título de anticorpos no soro de todos os animais foi praticamente o mesmo, concluíndo-se, portanto, que o glutaraldeido reduziu a atividade tóxica dos venenos sem alterar a sua imunogenicidade.

A inoculação do veneno bruto fornece títulos elevados; entretanto, o veneno total é freqüentemente mal tolerado pelo animal. Como resultado, toxóides tem sido preparados por destoxicação biológica do veneno a qual preserva sua imunogenicidade (14).

O alto custo, tanto do cavalo como o da sua manutenção, estimula a pesquisa de esquemas de hiperimunização que visam obter títulos elevados de anticorpos específicos nesses animais a partir da imunização (15).

Os venenos podem perder a sua atividade tóxica, conservando, entretanto as suas características antigênicas e imunogênicas, com capacidade de quando introduzido num organismo, induzir a formação de anticorpos. Com a perda da fração tóxica este produto recebe o nome de anaveneno (16)ou toxóide (17).

Quanto às técnicas utilizadas para preparação de antivenenos, encontram-se inúmeros trabalhos em que foram utilizados agentes químicos e/ou físicos para tal propósito. Dentre os agentes químicos destacam-se: carboximetil-celulose (18); fotoxidação na presença de azul de metileno (19); agentes quelantes (20);

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Em alguns destes estudos, as toxinas obtidas ainda mantiveram certa toxicidade e apresentaram baixa imunogenicidade. Como exemplos podemos citar o estudo de Costa et al. (21), no qual foi comparada a ação imunogênica do veneno de Crotalus durissus terrificus destoxicado pelo tratamento com formaldeido e pela ação térmica, com o veneno nativo. Neste estudo os autores verificaram que o veneno submetido ao tratamento por calor ainda se apresentava tóxico e com baixa imunogenicidade quando comparado ao veneno submetido ao tratamento por formaldeido; e que, embora este último tenha apresentado bons resultados, ao final do esquema de imunização ele não foi tão eficiente quanto o veneno nativo. Entretanto, algumas metodologias mostraram-se bem sucedidas; como exemplos podemos citar os trabalhos de Daniel et al. (22), que obtiveram um toxóide com o tratamento do veneno crotálico pela iodação que se apresentou cerca de 100 vezes menos tóxico que o veneno não tratado e mantendo a imunogenicidade.

Rogero et al. (25), Nascimento et al. (26); Clissa et al. (27), trabalhando com a radiação gama, demonstraram que esta vem sendo bastante eficiente na atenuação de venenos ofídicos, sendo capaz de diminuir a toxicidade, sem alterar a imunogenicidade e sem adicionar nenhuma substância ao veneno.

A radiação gama, produzida por uma fonte de Cobalto-60, é uma radiação eletromagnética de alta energia associada à ausência de massa. Esta possui grande poder de penetração e capacidade de promover ionização e excitação no meio onde se propaga. Dentro do espectro eletromagnético, os raios cósmicos, a radiação gama e os raios X são classificados como radiações ionizantes (28).

Estas recebem este nome porque provocam ionizações, ou seja, ao atravessarem uma substância (tecido biológico ou qualquer outro tipo de matéria) têm a propriedade de arrancar elétrons, em geral da camada periférica dos átomos, resultando na formação de pares de íons, positivo e negativo. Estes tipos de radiações eletromagnéticas causam também excitações, processos nos quais os elétrons das camadas externas do átomo-alvo absorvem energia suficiente para atingir um estado energético mais elevado, permanecendo associados ao átomo e emitindo energia sob a forma de luz visível ou ultravioleta (29).

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(25), entre outros.

No Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN/CNEN-SP), com a crise na produção de soros antiofídicos instalada no país no início da década de 80, iniciaram-se os estudos sobre a radiação ionizante como ferramenta na destoxicação de venenos ofídicos. Entre os estudos realizados nos últimos quinze anos destacam-se os trabalhos de Murata (33); Nascimento (34); Murata et al. (35); Guarnieri (36); Souza-Filho et al. (37); Spencer (38); Andriani (39); Cardi (40); De Paula (41); Rogero et al. (25); Nascimento et al. (26); Clissa et al. (27); Boni-Mitake et al. (42), entre outros.

Todos estes experimentos têm sido avaliados pelas mais modernos técnicas imunobiológicas.

Historicamente, Theakston et al. (43) foram os primeiros pesquisadores a descreverem o uso da técnica imunoenzimática de ELISA para a detecção de veneno de serpentes e de anticorpos antivenenos, baseado no método duplo sanduíche, usando IgG fracionada na fase fixa em placa de microtitulação.

Barbosa et al. (44) consideram que o uso do teste de ELISA para determinar a potência de soros antiofídicos, produzidos em eqüinos, se mostram mais vantajosos em relação ao custo e reprodutibilidade quando comparado aos testes em camundongos.

Barraviera et al. (45) usaram a técnica de ELISA para detecção sensível e específica de níveis de antígenos e anticorpos no soro e líquido cerebroespinhal de pacientes picados por Crotalus durissus terrificus no Brasil.

Heneine et al. (46) relataram uma correlação significante entre a técnica de ELISA e a potência de antiveneno testada in vivo.

Durante as últimas duas décadas, diversos métodos de ELISA têm sido descritos em várias partes do mundo com diferentes intenções. Entretanto, estes novos métodos são similares ao desenvolvido por Theakston et al. (43).

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humanos provocados por animais peçonhentos (47).

O sistema de produção de antivenenos no Brasil vinha passando por uma crise desde o início dos anos 80s, que culminou em maio de 1986 com o óbito de uma criança, atribuído à “falta de soro”. Esta situação levou o Ministério da Saúde a implantar um Programa Nacional de Ofidismo na antiga Secretaria de Ações Básicas em Saúde. Tal programa é formado por grupos de Trabalho (GTs) composto por técnicos de diversas instituições científicas brasileiras, responsáveis por áreas específicas (47).

A instalação deste programa tornou obrigatória a notificação dos acidentes ofídicos ao Ministério da Saúde a partir de 1986, possibilitando assim estabelecer parâmetros quanto à ocorrência, mortalidade e evolução clínica dos acidentes, uma vez que estes possuem grande importância médica e epidemiológica no Brasil (48, 49).

Entre os quatro gêneros responsáveis por acidentes ofídicos no Brasil, as serpentes do gênero Bothrops causam o maior número de acidentes (88,3%), seguido pelas do gênero Crotalus (8,3%), Lachesis (2,7%) e Micrurus (0,7%) (48). Sendo assim, as serpentes pertencentes ao gênero Bothrops e Crotalus se destacam das demais por causarem o maior numero de acidentes (88%) e o maior índice de letalidade (72% nos casos não tratados com soro e 11% nos casos tratados) respectivamente, representando os envenenamentos ofídicos de maior gravidade em nosso meio.

A ocorrência dos acidentes ofídicos, que pode ser considerado um acidente de trabalho, está geralmente associada ao aumento da atividade do homem no campo. A maioria dos acidentes ocorre na região Sudeste com 43%, seguidos pelas regiões Nordeste (17%), Centro-Oeste (16%), Sul (15%) e Norte (9%) (49, 50).

Na região de Botucatu, o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da UNESP, atende em média 100 casos por ano de acidentes envolvendo animais peçonhentos. Entre os acidentes mais graves destacam-se os causados por serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus, que podem ser fatais na ausência de terapêutica precoce e adequada (51, 52).

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a um sério problema de Saúde Pública que exige do profissional competência, habilidade, rapidez e disponibilidade de soro para o tratamento adequado de seus pacientes. Além disso, os pesquisadores do mundo todo buscam alternativas para a produção de soro heterólogo que sejam mais baratas e menos traumáticas para os animais produtores.

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Os objetivos do presente trabalho foram:

1- Avaliar, acompanhar e comparar a resposta imune humoral de camundongos inoculados com veneno obtido de Crotalus durissus

terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni

na forma nativa e irradiada com 60Co, utilizando o ensaio imuno enzimático de ELISA;

2- Determinar e comparar a potência e a capacidade de neutralização do soro obtido dos camundongos inoculados com veneno de Crotalus

durissus terrificus, B. jararaca, B. jararacussu e B. moojeni na forma

nativa e irradiado com 60Co utilizando método “in vitro”;

3- Avaliar a imunidade obtida pelos camundongos inoculados com veneno nativo e irradiado com 60_{Co mediante desafio “in vivo” com veneno}

nativo de Crotalus durissus terrificus, B. jararaca, B. jararacussu e B.

moojeni, após o processo de hiperimunização;

4- Avaliar os efeitos colaterais nos camundongos inoculados com veneno nativo ou irradiado com 60Co obtido de Crotalus durissus terrificus, B.

jararaca, B. jararacussu e B. moojeni durante todo o processo de

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Foram utilizados camundongos Swiss, com peso entre 18-22 gramas, criados e mantidos no Biotério do Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, CEVAP-UNESP, no Campus de Botucatu, São Paulo.

Durante a realização dos experimentos, os animais foram mantidos em caixas de polipropileno com oito animais por caixa. Para a forração ou cama nas caixas foi utilizada maravalha de pinho. A alimentação e a água foram disponibilizadas ad libitum.

3.1.2. Peçonhas utilizadas nos experimentos

Foram utilizadas peçonhas obtidas de serpentes adultas das espécies

Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops

moojeni mantidas no serpentário do Centro de Estudos de Venenos e Animais

Peçonhentos (CEVAP), localizado na UNESP, Campus de Botucatu, São Paulo.

A extração do veneno foi realizada segundo metodologia desenvolvida pela equipe técnica do Laboratório de Extração de Venenos do CEVAP (1). Os venenos foram liofilizados após a extração e mantidos em freezer a -20 ºC.

Uma parte dos venenos foi submetida à radiação gama ionizante no Instituto de Pesquisa Energéticas e Nucleares – IPEN/CNEN-SP, localizado no campus da Universidade de São Paulo – USP, sendo denominado de veneno irradiado. A outra parte foi liofilizada e mantida em freezer a -20 ºC, sendo denominado veneno nativo (26).

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preparo das soluções foi utilizada água destilada.

A irradiação realizada foi feita por meio de uma fonte de 60Co (Gama Cell 220, Atomic Energy Agency of Canadá), disponível no Departamento de Aplicações de Técnicas Nucleares do IPEN/CNEN-SP.

3.2 Métodos

A metodologia empregada incluiu a irradiação das peçonhas, a atividade tóxica das peçonhas, o processo de imunização dos camundongos, a titulação dos anticorpos, a neutralização e a avaliação da potência do soro, a avaliação clínica dos animais e por fim a análise estatística.

3.2.1. Irradiação das peçonhas

Dos venenos liofilizados retiraram-se alíquotas de 2 mg que foram diluídas com solução salina acidificada (NaCl 150 mM, pH 3,0) alcançando a concentração final de 2mg/ml. A seguir, as amostras foram irradiadas com uma dose de 2000 Gy (taxa de dose 5,25 KGy/h) em uma fonte de 60_Co.

A irradiação das amostras ocorreu sempre na presença de oxigênio, na temperatura ambiente e de forma homogênea e ininterrupta (26).

3.2.2. Atividade tóxica das peçonhas

A determinação da toxicidade das amostras nativas foi realizada pelo cálculo da dose letal capaz de matar 50% dos animais do experimento (DL50), segundo

Spearman-Karber (54).

Os valores das DL50 dos venenos nativos utilizados neste experimento foram

previamente realizados pelo Instituto de Pesquisa Energéticas e Nucleares – IPEN/CNEN-SP, e descritos a seguir:

• Crotalus durissus terrificus : 0,148 µg/g de camundongo • Bothrops jararaca : 2,4 µg/g de camundongo

• Bothrops jararacussu: 4,4 µg/g de camundongo • Bothrops moojeni : 4,4 µg/g de camundongo

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Os inóculos ocorreram no dia um, utilizando Adjuvante Completo de Freund por via intradérmica; dia 15 utilizando Hidróxido de Alumínio por via subcutânea e nos dias 21, 30, 45 utilizando PBS por via intraperitonial.

3.2.3.2. Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni Os inóculos ocorreram no dia um, utilizando Adjuvante Completo de Freund por via intradérmica; dia 15 utilizando Adjuvante Incompleto de Freund por via subcutânea e nos dias 21, 30, 45 utilizando PBS por via intraperitonial.

O grupo controle recebeu inóculos nos mesmos dias somente com os adjuvantes.

Todos animais foram inoculados com 200 µl de uma solução contendo 100 µl do excipiente e 100 µl de uma mistura do respectivo veneno diluído em solução salina. O grupo controle recebeu 200 µl de uma solução contendo 100 µl do excipiente e 100 µl de solução salina.

Antes de cada inóculo, os animais foram sangrados pelo plexo retro-orbital, uma amostra de 100 µl de sangue foi retirado, o soro foi separado e feito um “pool” de cada grupo. O soro foi mantido congelado a – 20 o_C.

3.2.4 Titulação dos anticorpos séricos contra os venenos inoculados por meio do Ensaio imuno enzimático (Enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)

A- Reagentes

a) Placas de microtitulação Hemobag de 96 poços

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e) Soro IgG de carneiro anti-IgG de camundongo, conjugado com peroxidase (SIGMA®) f) Orto fenilenodiamina g) Água oxigenada h) Tampão citrato/fosfato 0,05M pH 5,0 i) Ácido cítrico 0,2M B- Procedimento

Foram sensibilizadas, por 12 horas a 4 oC em câmara úmida, placas plásticas de 96 poços com 100 µl por poço com uma solução de antígeno a 10 µg/ml (1µg/poço), diluídos em tampão carbonato/bicarbonato de sódio 0,05M e pH 9,6. A placa foi lavada 4 vezes com solução salina 0,15M contendo 0,05% de Tween 20®. Foram aplicados 200µl por poço de solução de bloqueio (5g de Molico® q.s.p. 100ml de PBST) e deixado por 1 hora a 37oC, em câmara úmida. Foram aplicados, nos poços, 100 µl de soro de camundongos previamente imunizados, diluídos a partir de 1/200 em solução de bloqueio e aplicadas na placa, em duplicata.

Após a incubação por 1 h a 37oC, em câmara úmida, as placas foram lavadas 4 vezes com PBST 0,15M, e iniciou-se a revelação com adição de 100µl de soro de carneiro anti IgG de camundongo conjugado com peroxidase (SIGMA®), diluído 1/2000 da fração aliquotada (Sigma), em solução de bloqueio; aplicou-se 100µl por poço. Após a incubação durante 1 hora a 37O_C,

em câmara úmida, as placas foram lavadas 4 vezes com PBST 0,15M.

A reação foi revelada pela adição de uma solução de OPD (O-phenylenediamine) 0,5mg/ml e H2O2 (30%) 0,5mg/ml em tampão citrato de

sódio/ácido cítrico (0,05M e pH 5,0); foram aplicadas 100µl por poço e deixadas durante 20 minutos, a temperatura ambiente, no escuro e então foi interrompida com a adição de 50µl (por poço) de ácido cítrico 0,2M.

A leitura de cada poço foi feita em leitor automático de microplaca (DYNATECH MR 4000®_{), utilizando-se filtro de comprimento de onda de}

450nm.

Todas as amostras de soro foram testadas em duplicata. O soro de animais não imunizados foi utilizado como controle.

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jararacussu e B. moojeni, no 60º dia após a primeira inoculação, uma alíquota

contendo 100 µl do “pool” de cada soro foi incubado com 100 µl de uma solução contendo quantidades de veneno nativo diluídos em PBS equivalentes a: 1, 3, 5, 10 e 15 DL50. A incubação foi feita em tubos tipo “eppendorf”

mantidos em estufa a 37 ºC, por um período de trinta minutos (55). Posteriormente, 200 µl de cada solução foram inoculados individualmente em quatro camundongos por via intraperitoneal. Para efeito de controle, foram inoculados em outros quatro camundongos 200 µl de uma solução contendo uma DL50 de veneno diluída em PBS para comprovação da sua toxicidade.

Outros quatro camundongos receberam apenas 100 µl de uma alíquota de soro diluída em 100 µl de PBS para avaliação da sua inocuidade. Após 24 e 48 horas a taxa de mortalidade foi registrada.

3.2.5.2 Avaliação da potência “in vitro” do antiveneno nativo e irradiado

Para a avaliação da potência dos soros obtidos dos camundongos inoculados com veneno nativo ou com veneno irradiado de serpentes das espécies Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, B. jararacussu e B.

moojeni, no 60º dia após a primeira inoculação, uma alíquota do “pool” de cada

soro foi diluída em PBS nas seguintes concentrações: 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, e 1:80. Uma alíquota de soro puro também foi incluída no teste. Uma alíquota de 100 µl de cada solução foi incubada com 100 µl de uma solução contendo cinco DL50 de veneno nativo diluído em PBS. A incubação foi feita em tubos

tipo “eppendorf” mantidos em estufa a 37 ºC, por um período de trinta minutos (55). Posteriormente, 200 µl de cada solução foram inoculados individualmente em quatro camundongos por via intraperitoneal. Para efeito de controle, foram inoculados em outros quatro camundongos 200 µl de uma solução contendo

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horas a taxa de mortalidade foi registrada.

A capacidade neutralizante do “pool” dos soros (em µg de toxina/ml de anti-soro) foi calculada conforme KAISER et al. (56), utilizando-se a seguinte equação:

Capacidade neutralizante da toxina (CNT) = (D – DL50) x 1 x 105 X (1/V50)

Sendo D = Dose total da toxina (µg/g); DL50 em µg/g; V50 = Volume

antiveneno que reduz a letalidade de 1 ml da solução de injeção da toxina a 50%. A letalidade de 50% significará que o antiveneno foi capaz de reduzir a dose efetiva para 1 DL50.

3.2.5.3 Avaliação da capacidade neutralizante “in vivo”

Ao final do processo de imunização, a fim de se verificar a capacidade neutralizante ”in vivo” dos anticorpos produzidos pelos animais, quatro camundongos de cada grupo foram pesados e desafiados individualmente com cinco DL50 do veneno nativo respectivo diluído em PBS. Cada animal recebeu

200 µl dessa solução via intraperitoneal. Após 24 e 48 horas a taxa de mortalidade foi registrada.

3.2.6. Avaliação clínica dos animais

Os animais foram observados durante todo o processo de hiperimunização. A presença de alterações locais na pele e/ou subcutâneo como edema, fístulas, abscessos e necroses, e o número de animais que vieram a óbito durante o processo foram relatados. Para isto, foi utilizada uma análise descritiva das observações.

3.2.7. Análise estatística

A análise estatística dos dados foi realizada por meio de Análise de Variância pelo teste de F de Snedecor, ao nível de 5% de significância (57). Este teste é indicado para se identificar diferenças entre médias populacionais,

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4.1. Método de Ensaio Imunoenzimático (ELISA)

4.1.1 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir de veneno nativo e irradiado de Crotalus durissus terrificus

As médias de densidades ópticas resultantes dos títulos de anticorpos obtidos pela inoculação de veneno nativo e veneno irradiado com 60_{Co e os}

resultados da análise estatística dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA) do “pool” de soro dos animais, nos diferentes momentos e diluições encontram-se nas Tabelas 01 a 05. Nas Figuras 01 a 05 estão representados graficamente os valores das médias de densidades ópticas, nos diferentes momentos e diluições, para os dois Grupos de animais, inoculados com veneno nativo e veneno irradiado com 60Co respectivamente.

(27)

I

0,00 0,0215 0,034 0,0735 0,1955 0,21

II

0,00 0,0185 0,0265 0,0625 0,127 0,2115

G I = G II; como FLinhas = 1,89 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %),

D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 34,16 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %)

Figura 01: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:200) de oito camundongos inoculados com veneno de Crotalus durissus terrificus nativo e irradiado com 60Co.

(28)

Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que não houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,89 < Fcrítico =

7,71);

2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 34,16 > Fcrítico = 6,39);

(29)

I

0,00 0,014 0,026 0,0595 0,129 0,167

II

0,00 0,011 0,0215 0,051 0,0895 0,1695

G I = G II; como FLinhas = 2,04 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).

D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 60,81 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).

(30)

7,71);

(31)

I

0,00 0,0031 0,02 0,0425 0,0945 0,134

II

0,00 0,0075 0,0125 0,033 0,073 0,141

(32)

7,71);

(33)

I

0,00 0,00 0,014 0,029 0,0685 0,121

II

0,00 0,00 0,004 0,018 0,035 0,1315

Figura 04: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:1600) de oito camundongos inoculados com veneno de Crotalus durissus terrificus nativo e irradiado com 60_Co.

(34)

7,71);

2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 29,34 > Fcrítico =

(35)

I

0,00

0,00 0,0085 0,0125 0,0405 0,089

II

0,00 0,00 0,002 0,014 0,0235 0,119

D0≠ D15≠ D21≠ D30≠ D45≠ D60; como FColunas = 23,91 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).

(36)

7,71);

(37)

diluições, para os dois Grupos de animais, inoculados com veneno nativo e veneno irradiado com 60Co respectivamente.

(38)

experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops

jararaca nativo (Grupo III) e irradiado com 60Co (Grupo IV).

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

III

0,00 0,1665 0,267 0,276 0,3435 0,365

IV

0,00 0,141 0,2285 0,261 0,3825 0,3825

G III = G IV; como FLinhas = 1,28 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).

Figura 06: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:200) de oito camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararaca nativo e irradiado com 60Co.

(39)

Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 155,03 > Fcrítico = 6,39);

(40)

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

III

0,00 0,0775 0,2415 0,2665 0,324 0,362

IV

0,00 0,0655 0,2155 0,2535 0,3685 0,3765

(41)

(42)

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

III

0,00 0,041 0,2165 0,256 0,32 0,3525

IV

0,00 0,0455 0,2045 0,249 0,3575 0,3755

(43)

(44)

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

III

0,00 0,019 0,197 0,2415 0,3145 0,341

IV

0,00 0,018 0,1725

0,2465 0,356 0,359

(45)

Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 49,64 > Fcrítico =

(46)

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

III

0,00 0,012 0,1345 0,209 0,308 0,332

IV

0,00 0,0105 0,1315 0,206 0,328 0,35

(47)

(48)

As médias de densidades ópticas resultantes dos títulos de anticorpos obtidos pela inoculação de veneno nativo e veneno irradiado com 60Co e os resultados da análise estatística dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA) do “pool” de soro dos animais, nos diferentes momentos e diluições encontram-se nas Tabelas 11 a 15. Nas Figuras 11 a 15 estão representados graficamente os valores das médias de densidades ópticas, nos diferentes momentos e diluições, para os dois Grupos de animais, inoculados com veneno nativo e veneno irradiado com 60Co respectivamente.

(49)

V

0,00 0,155 0,2135 0,245 0,3555 0,389

VI

0,00 0,107 0,244 0,251 0,475 0,3445

G V = G VI; como FLinhas = 2,81 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).

Figura 11: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:200) de oito camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararacussu nativo e irradiado com 60_Co.

(50)

7,71);

(51)

V

0,00 0,1125 0,202 0,2295 0,3405 0,3605

VI

0,00 0,0505 0,2145 0,231 0,3755 0,3355

(52)

7,71);

(53)

V

0,00 0,0595 0,1885 0,2215 0,3385 0,3475

VI

0,00 0,0265 0,1825 0,2225 0,3685 0,3325

(54)

7,71);

(55)

V

0,00 0,036 0,1725 0,215 0,339 0,3235

VI

0,00 0,0115 0,1695 0,205 0,3625 0,314

(56)

7,71);

(57)

V

0,00 0,0255 0,147 0,2015 0,28 0,313

VI

0,00 0,0045 0,1105 0,158 0,3555 0,296

Figura 15: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:3200) de oito camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararacussu nativo e irradiado com 60Co.

(58)

7,71);

2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de Snedecor, na diluição de 1:3200, mostrou que houve diferença estatística nível de 5% de significância (FCalculado = 27,52 > Fcrítico = 6,39);

(59)

diluições, para os dois Grupos de animais, inoculados com veneno nativo e veneno irradiado com 60Co respectivamente.

(60)

moojeni nativo (Grupo VII) e irradiado com 60Co (Grupo VIII).

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

VII

0,00 0,1055 0,186 0,1965 0,3705 0,3705

VIII

0,00 0,061 0,178 0,203 0,3775

0,3885

G VII = G VIII; como FLinhas = 1,49 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).

Figura 16: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:200) de oito camundongos inoculados com veneno de Bothrops moojeni nativo e irradiado com 60Co.

(61)

(62)

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

VII

0,00 0,065 0,1745 0,1935 0,3505 0,357

VIII

0,00 0,031 0,1405

0,1835 0,362 0,371

Figura 17: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:400) de oito camundongos inoculados com veneno de Bothrops moojeni nativo e irradiado com 60_Co.

(63)

Snedecor, na diluição de 1:400, mostrou que houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 134,81 > Fcrítico = 6,39).

(64)

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

VII

0,00 0,035 0,154 0,1665 0,339 0,3555

VIII

0,00 0,014 0,0955 0,158 0,338 0,3545

(65)

(66)

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

VII

0,00 0,0195 0,132 0,147 0,323 0,3475

VIII

0,00 0,009 0,0745 0,14 0,3261 0,345

Figura 19: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:1600) de oito camundongos inoculados com veneno de Bothrops moojeni nativo e irradiado com 60_Co.

(67)

(68)

Dias (D)

Grupos

(G)

0 15 21 30 45 60

VII

0,00 0,012 0,106 0,1135

0,3085 0,33

VIII

0,00 0,006 0,0395 0,11 0,3095 0,3365

(69)

(70)

As Tabelas 21 a 24 apresentam as médias de densidades ópticas resultantes da diluição dos títulos de anticorpos obtidos pela inoculação de veneno nativo e veneno irradiado com 60Co e os resultados da análise estatística dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA) do “pool” de soro dos animais no 60º dia após a primeira inoculação.

As Figuras 21 a 24 representam graficamente os valores das médias de densidades ópticas resultantes da diluição dos títulos de anticorpos obtidos do “pool” de soro dos animais pela inoculação de veneno nativo e veneno irradiado com 60Copara os dois Grupos de animais no 60º dia após a primeira inoculação.

(71)

1:256

0,01

_0,0115

1:128

0,019

_0,0215

1:64

_0,082

_0,067

1:32

_0,089

_0,119

1:16

_0,121

_0,1315

1:8

_0,134

_0,141

1:4

_0,167

0,1695

Diluições (D) x 10

2

1:2

_0,21

0,2115

Tabela 21:

Distribuição dos valores das médias das de

nsidades ópticas (450 nm) obtidas por ensaio

imunoenzimático indireto (ELISA), real

izados em “pool” de soros do 60º dia

após a primeira inoculação, diluídos

de 1:200 a 1:204800, de oito

camundongos, com veneno de

Crotalus durissus terrificus

irradiado com

60

Co (Grupo II).

Grupos

(G)

I

_II

G I = G II; c omo FLinhas = 2,36 < Fcrítico = 4,96 (α = 5 % ). D1:2 ≠ D1:4 ≠ D1:8 ≠ D1:16 ≠ D1:32 ≠ D1:64 ≠ D 1:1 28 ≠ D1:256 ≠ D1:512 ≠ D1:1024 ≠ D1:2048 com o FColunas = 202 ,8 6 > F crítico = 2,98 (α =

(72)

Figura 21:

Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtid

os por ensaio imunoenzimá

tico indireto (ELISA) em

“pool” de soros do 60º dia apó

s a pr

imei

ra inoculação, diluídos de 1:200

a 1:204800, de oito camundongos inoculados

com veneno de

Crotalus durissus terrificus

nativo e irradiado com

(73)

diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 202,86 >

(74)

1:2048

0,052

0,0955

1:1024

0,101

0,1305

1:512

0,106

_0,2025

1:256

0,178

0,299

1:128

_0,2495

_0,3195

1:64

_0,2835

0,33

1:32

_0,332

0,35

1:16

_0,341

_0,359

1:8

0,3525

0,3755

1:4

_0,362

0,3765

Diluições (D) x 10

2

1:2

_0,365

0,3825

Tabela 22:

Distri

buição dos valores das médias das dens

idades ópticas (450 nm) obtidas por ensaio

imunoenzimático indireto (ELISA

), realizados em “pool” de soros do 60º di

a após a primeira inoculação

, diluídos de

1:200 a 1:204800, de oito

camundongos, com veneno de

Bothrops jararaca

nativo (Grupo III) e irradi

ado com

(Grupo IV

).

Grupos

(G)

III

IV

G II I ≠ G IV ; co mo FLinhas = 17 ,4 2 > F crítico = 4, 96 ( α = 5 % ). D1:2 ≠ D1:4 ≠ D1:8 ≠ D1:16 ≠ D1:32 ≠ D1:64 ≠ D 1:1 28 ≠ D1:256 ≠ D1:512 ≠ D1:1024 ≠ D1:2048 com o FColunas = 36, 82 > F crítico = 2,98 (α = 5 % ), . ( D x10 2)

(75)

Figura 22:

Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtid

os por ensaio imunoenzimá

“pool” de soros do 60º dia apó

s a pr

imei

ra inoculação, diluídos de 1:200

a 1:204800, de oito camundongos inoculados

com veneno de

Both

rops jararaca

nativo e irradiado com

(76)

Snedecor, mostrou que houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 17,42 > Fcrítico = 4,96);

2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes diluições (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024; 1:2048), realizada pelo teste F de Snedecor, mostrou que houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 36,82 >

(77)

1:256

_0,0845

0,211

1:128

_0,1195

_0,2665

1:64

_0,1545

_0,2765

1:32

_0,313

_0,296

1:16

_0,3235

_0,314

1:8

0,3475

0,3325

1:4

0,3605

0,3355

Diluições (D) x 10

2

1:2

_0,389

0,3445

Tabela 23:

Distri

buição dos valores das médias das dens

idades ópticas (450 nm) obtidas por ensaio

imunoenzimático indireto (ELISA

), realizados em “pool” de soros do 60º di

a após a primeira inoculação

1:200 a 1:204800, de oito

camundongos, com veneno de

Bothrops jararacussu

nativo (Grupo V) e irradiado com

60

Co (Grupo VI).

Grupos

(G)

V

VI

G V = G VI; co m o FLinhas = 4,33 < F crítico = 4, 96 ( α = 5 %) . D1:2 ≠ D1:4 ≠ D1:8 ≠ D1:16 ≠ D1:32 ≠ D1:64 ≠ D 1:1 28 ≠ D1:256 ≠ D1:512 ≠ D1:1024 ≠ D1:2048 com o FColunas = 11, 48 > F crítico = 2,98 (α = 5 %

(78)

Figura 23:

Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtid

os por ensaio imunoenzimá

tico indireto (ELISA) em

“pool” de soros do 60º dia apó

s a pr

imei

ra inoculação, diluídos de 1:200

a 1:204800, de oito camundongos inoculados

com veneno de

Both

rops jararacussu

nativo e irradiado com

(79)

diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 11,48 >

(80)

1:2048

0,024

0,025

1:1024

0,0385

0,0465

1:512

0,079

0,087

1:256

_0,1175

0,122

1:128

0,168

_0,1875

1:64

_0,2345

_0,3185

1:32

0,33

_0,3365

1:16

_0,3475

_0,345

1:8

0,3555

0,3545

1:4

_0,357

_0,371

Diluições (D) x 10

2

1:2

0,3705

0,3775

Tabela 24:

Distribui

ção dos valores das médias das densidades

ópticas (450 nm) obtidas

por ensaio imunoenzimático

indireto (ELISA), realizados em “pool”

de

soros do 60º dia após a primeira inoc

ula

ção, diluídos de 1:200 a 1:204800,

de oito camundongos, com veneno de

Bot

h

rops moojeni

nativo (Grupo VII) e irradiado com

60

Co (Grupo VIII).

Grupos

(G)

VII

VIII

G VI I = G VI II ; com o FLinhas = 3 ,45 < Fcrítico = 4,96 (α = 5 % ). D1:2 ≠ D1:4 ≠ D1:8 ≠ D1:16 ≠ D1:32 ≠ D1:64 ≠ D 1:1 28 ≠ D1:256 ≠ D1:512 ≠ D1:1024 ≠ D1:2048 com o FColunas = 132 ,7 2 > F crítico = 2,98 (α = 5 % ) (Dx10 2)

(81)

Figura 24:

Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtid

os por ensaio imunoenzimá

“pool” de soros do 60º dia apó

s a pr

imei

ra inoculação, diluídos de 1:200

a 1:204800, de oito camundongos inoculados

com veneno de

Bothrops mooj

eni

nativo e irradiado com

(82)

de Snedecor, mostrou que não houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 3,45 < Fcrítico = 4,96);

2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes diluições (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024; 1:2048), realizada pelo teste F de Snedecor, mostrou que houve diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 132,72 >

(83)

Crotalus durissus terrificus, por exemplo, o cálculo foi realizado da seguinte

maneira:

CNA = (0,74 – 0,148) x 1 x 105 x (1/100)

CNA = 592 µg de veneno/ml de soro

Para um camundongo de 20 g, por exemplo, uma DL50 do veneno de

Crotalus durissus terrificus é 2,96 µg de veneno. Portanto, 592/2,96 = 200 DL50.

Sendo assim, o soro antiveneno nativo de Crotalus durissus terrificus foi capaz de neutralizar cerca de 592 µg de veneno por ml de soro, o equivalente a 200 DL50

(84)

capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno crotálico, obtidos no 60º dia após a primeira inoculação dos dois grupos inoculados com veneno nativo e irradiado com 60Co, estão representados nas Tabelas 25 e 26 respectivamente.

Tabela 25: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Crotálico obtidos no 60º dia após a primeira inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno nativo, inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do veneno nativo.

Observações

mortos / vivos

Soro

(µl)

Veneno

DL

50

24 horas

48 horas

Mortalidade

(%)

100 1 0:4 0:4 0

100 3 0:4 0:4 0

100 5 2:2 2:2 50

100 10 4:0 4:0 100

100 15 4:0 4:0 100

100 --- 0:4 0:4

0 ---- 1 4:0 4:0 100

Tabela 26: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Crotálico obtidos no 60º dia após a primeira inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno irradiado com 60_{Co, inoculados}

via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do veneno nativo.

Observações

mortos / vivos

Soro

(µl)

Veneno

DL

50

24 horas

48 horas

Mortalidade

(%)

100 1 0:4 0:4 0

100 3 0:4 0:4 0

100 5 1:3 1:3 25

100 10 3:1 3:1 75

100 15 4:0 4:0 100

100 --- 0:4 0:4

0 ---- 1 4:0 4:0 100

(85)

nativo.

Observações

mortos / vivos

Soro

(µl)

Veneno

DL

50

24 horas

48 horas

Mortalidade

(%)

100 1 0:4 0:4 0

100 3 0:4 0:4 0

100 5 1:3 1:3 25

100 10 4:0 4:0 100

100 15 4:0 4:0 100

100 --- 0:4 0:4

0 ---- 1 4:0 4:0 100

Tabela 28: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Bothrops jararaca obtidos no 60º dia após a primeira inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno irradiado com

60_{Co, inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL}

50 do veneno nativo.

Observações

mortos / vivos

Soro

(µl)

Veneno

DL

50

24 horas

48 horas

Mortalidade

(%)

100 1 0:4 0:4 0

100 3 0:4 0:4 0

100 5 1:3 1:3 25

100 10 4:0

4:0

100 100 15 4:0 4:0 100

100 --- 0:4 0:4 0

---- 1 4:0 4:0 100

(86)

inoculados com veneno nativo e irradiado com 60Co, estão representados nas Tabelas 29 e 30 respectivamente.

Tabela 29: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Bothrops jararacussu obtidos no 60º dia após a primeira inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno nativo, inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do veneno

nativo.

Tabela 30: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Bothrops jararacussu obtidos no 60º dia após a primeira inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno irradiado com

60_{Co, inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL}

50 do veneno nativo.

Observações

mortos / vivos

Soro

(µl)

Veneno

DL

50

24 horas

48 horas

Mortalidade

(%)

100 1 0:4 0:4 0

100 3 0:4 0:4 0

100 5 2:2 2:2 50

100 10 3:1 3:1 75

100 15 4:0 4:0 100

100 --- 0:4 0:4 0

---- 1 4:0 4:0 100

Observações

mortos / vivos

Soro

(µl)

Veneno

DL

50