1. Instabilidade genómica e envelhecimento

Sinalização Molecular

Envelhecimento

1. Instabilidade genómica e envelhecimento 1.1. função das sirtuínas

1.1. função das sirtuínas

2. A teoria mitocondrial do envelhecimento

3. Restrição calórica, sinalização celular e longevidade 3.1. função das sirtuínas

3.2. via da insulina-IGF-1, do TOR e da AMPK

Vítor Costa (vcosta@ibmc.up.pt)

Envelhecimento caracteriza-se

Envelhecimento caracteriza-se pela perda progressiva de

funções celulares diminuição diminuição da resposta a stress acumulação acumulação de danos moleculares



Suscetibilidade a doenças e probabilidade de morte

Envelhecimento Cronológico: fatores de risco aumentam com o tempo Glicosilação: glucose liga-se e inibe DNA, proteínas e lípidos Stress oxidativo: danos oxidativos DNA, proteínas e lípidos Instabilidade genómica Senescência replicativa

Senescência celular / Limite de Hayflick

Células perdem a capacidade de se dividir

• associado com o encurtamento dos telómeros Ageing studies

Senescência do organismo

Envelhecimento cronológico Add life to years, not

Senescência Replicativa

_{Leonard Hayflick e Paul Moorhead (1965):}

- fibroblastos embriónicos isolados de um indivíduo possuem um potencial proliferativo limitado in vitro

- essas células apenas são capazes de passar por um número pré-determinado de ciclos de crescimento e divisão

de ciclos de crescimento e divisão

_{Células senescentes permanecem metabolicamente ativas}

_{Associado ao encurtamento dos telómeros}

Fibroblastos embriónicos de rato (MEF) senescentes

 _{Antes da senescência, na 2ª} passagem.

 MEFs são fusiformes.  _{Antes da senescência, na 2ª}

passagem.

 MEFs são fusiformes.

 _{Após senescência, na 8ª passagem.}  _{MEFs ficam maiores e achatadas.}  _{Zonas azuis-esverdeadas indicam a}

expressão de beta-galactosidase associada a senescência

Telómeros

_{sequências repetitivas de DNA} não-codificante (milhares de repetições tandem do hexanucleótido TTAGGG, em mamíferos)

_{localizados nas extremidades dos}

cromossomas – funcionam para proteger os cromossomas de fusões entre

extremidades

Stewart and Weinberg (2006) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 531-557 extremidades

_{A diminuição dos telómeros abaixo de} certo comprimento pode provocar uma crise celular

_{Envelhecimento está associado a uma acumulação de danos no DNA,} provocados por:

- fatores endógenos (ex., ROS)

- fatores exógenos (ex., radiação, químicos, vírus)

_{Mutações em genes associados à reparação do DNA, supressores} Instabilidade genómica e envelhecimento

_{Mutações em genes associados à reparação do DNA, supressores} tumorais, estabilidade genómica ou manutenção dos telómeros levam a um envelhecimento acelerado

_{Longevidade tem sido associada a uma maior eficiência na reparação} do DNA

5 Helicases tipo RECQ no Homem: - RECQ1, BLM,WRN, RTS e RECQ5.

Deficiência Síndromes progeróides

BLM Bloom

WRN Werner

RTS Rothmund–Thomson

- Participam na reparação de quebras em dsDNA - Participam na reparação de quebras em dsDNA

- Deficiência resulta em deleções, translocações ou outras aberrações cromossomais - Síndromes caraterizados por elevada incidência de cancro

Síndrome de Werner

Sirtuínas

_{Histona deacetilases tipo III (HDACs)}

_{SIRT1 tem função importante na estabilidade genómica} Sirtuína Localização intracelular Substrato Função SIRT1 Núcleo e citoplasma Histona H4, NK-kB, p53, FOXO, PGC-1α, PPARγ, eNOS Sobrevivência, diferenciação, inflamação, metabolismo

Chung et al. (2010) Arch. Biochem. Biophys. 501, 79-90 eNOS

SIRT2 Citoplasma α_{-Tubulina, histona H4 Ciclo celular} SIRT3 Núcleo e

mitocôndria

Acetil-CoA sintetase Metabolismo SIRT4 Mitocôndria ADP-ribosil transferase Metabolismo

SIRT5 Mitocôndria Proteínas mitocondriais Função mitocondrial SIRT6 Núcleo ADP-ribosil transferase,

Histona H3

Reparação de DNA SIRT7 Núcleo RNA polimerase I Transcrição de rRNA

Caraterização de mecanismos celulares básicos conservados durante a evolução:

• replicação do DNA • recombinação • divisão celular

Organismos modelo (

S. cerevisiae

,

C. elegans

,

Drosophila

)

• divisão celular

• enrolamento de proteínas • transporte intracelular • metabolismo

compreensão de doenças

Curvas de sobrevivência em diferentes espécies

Man Mouse

S. cerevisiae(replicative) C. elegans

Seis-divisões

Alterações celulares durante o envelhecimento replicativo em leveduras

Células virgens: pequenas superfície suave Células mãe: grandes rugas/cicatrizes aparência granulada

Powell et al. (2000) Microbiol 146:1023-1034

Sirtuínas e estabilidade genómica

_{SIRT1 de mamíferos: ortólogo do Sir2 (silent information regulator 2) de} leveduras

_{Sir2 aumenta até 70% a longevidade em S. cerevisiae, Drosophila e C. elegans}

_{Proteínas deacetiladas por SIRT1 e Sir2:} - histonas

- proteínas envolvidas na reparação do DNA ou com função como sensores - proteínas envolvidas na reparação do DNA ou com função como sensores

Chen and Guarente (2007) TRENDS Mol. Med. 13, 64-71

Teoria da acumulação de danos oxidativos

O envelhecimento está relacionado com a acumulação de danos celulares

provocados por espécies reativas de oxigénioformadas pelo metabolismo normal das células

Denham Harman [1956]

_{Superexpressão de MnSOD aumenta a longevidade em Drosophila}

_{Várias manipulações genéticas aumentam a longevidade por um} mecanismo associado à indução da atividade de MnSOD

_{Superexpressão de uma catalase endereçada para a mitocôndria} aumenta a longevidade em ratos, diminuindo danos oxidativos, deleções no mtDNA e patologia associadas ao envelhecimento

ROS são tóxicas e causam senescência ou podem ter efeitos benéficos e promover longevidade?

Ratinhos transgénicos com atividade aumentada de MnSOD não têm maior longevidade e podem apresentar atrasos no desenvolvimento e fertilidade diminuída

Efeito hormesis de ROS

A deficiência em MnSOD aumenta a longevidade em C. elegans
A deficiência em catalase aumenta a longevidade em S. cerevisiae

A restrição calórica aumenta a longevidade por um mecanismo associado com o aumento do metabolismo mitocondrial e da produção de ROS N ív e is d e R O S Senescência Resposta adaptativa:

- reparação de danos celulares - indução de defesas celulares

Morte N ív e is d e R O S

- indução de defesas celulares

Proliferação, Diferenciação

ROS

ROS

Stress

Ageing Disease

Protein Oxidised protein Oxidised protein

Mitochondrial dysfunction

accumulation

Peptides / Aminoacids

Protein Oxidised protein

aggregates Oxidised protein repair Lysosomal protease 20S proteasome accumulation Envelhecimento Disfunções mitocondriais ROS Oxidação de proteínas Agregação de proteínas Danos no DNA ↓ ATP proteínas DNA Síndrome Metabólico Cancro Doenças Neurodegenerativas Senescência Apoptose

defesas antioxidantes

envelhecimento

danos oxidativos

Durante o envelhecimento replicativo, as proteína oxidadas

acumulam-se na célula mãe

radicais superóxido proteínas oxidadas mitocôndria Aguilaniu et al (2003) Science 99:1751-1753

Segregação de agregados de proteínas oxidadas durante citocinase

Chaperones (Hsp104) formam uma ponte entre agregados carbonilados e o citoesqueleto   passagem dos agregados para a célula filha

Erjavec et al. (2007) Genes Dev 21, 2410-2421

Transporte de mitocôndrias reduzidas para a célula filha (Sir2-dependente)

Nyström T. (2013) Curr Biol. 23:R1037-9

Deficiência na sirtuína Sir2 aumenta a transferência de mitocôndrias oxidadas da célula mãe para a célula filha

Nyström T. (2013) Curr Biol. 23:R1037-9

CCT (chaperonina)

 envolvida no enrolamento da actina  atividade regulada pela deacetilase Sir2

Lippuner et al. (2014) FEMS Microbiol Rev 38, 300

Resveratrol

 _{ativador da sirtuína Sir2 / SIRT1}  _{estimula a biogénese mitocondrial}

Folhas de gengibre usadas para revestir alimentos e bolos de arroz (mochi) - contêm resveratrol Centenários em Okinawa: 39.5 : 100 000 Restrição calórica (< 20% vs população Japonesa) Japaneses consumem menos ~ 1000 calorias/dia vs Americanos

Jeanne Calment (Francesa) faleceu aos 122 anos. O seu segredo?

 azeite

 vinho do porto

 chocolate (cerca de 1Kg/semana)  azeite

 vinho do porto

 chocolate (cerca de 1Kg/semana)

Envelhecimento

3. Restrição calórica, sinalização celular e longevidade 3. Restrição calórica, sinalização celular e longevidade 3.1. função das sirtuínas

Restrição calórica

Mary Crowell and Clive McCay (1934):

- Restrição calórica (RC) aumenta a longevidade em ratinhos

_{Redução moderada na ingestão de calorias}

_{Intervenção mais eficaz no aumento da longevidade em diversas espécies,} incluindo mamíferos

_{Também retarda ou reduz a incidência de doenças relacionadas com o} envelhecimento: cancro, diabetes e doenças cardiovasculares

Restrição calórica e função mitocondrial

 Aumento da respiração e nº mitocôndrias/célula

- requer eNOS: NO ativa SIRT1

- SIRT1 deacetila e ativa eNOS (feedback positivo)  _{SIRT1 deacetila PGC-1α}

- Peroxisome-proliferator-activated receptor γ coactivator 1α

- ativador transcricional de genes que codificam para proteínas mitocondriais Restrição calórica em ratinhos

 _{Resveratrol (ativador de SIRT1) estimula a biogénese mitocondrial}

Aumento de SIRT1, eNOS e nº mitocôndrias em biópsias musculares Restrição calórica no Homem (6 meses)

Biogénese mitocondrial e ROS

Função de SIRT1/Sir2 e via de recuperação de NAD+

Restrição calórica: -  respiração

_NAD+_/NADH

- Estimula a via de recuperação de NAD+

Dali-Yousef et al (2007) Annals Med. 39, 335-345

Ativação de SIRT1/Sir2

- Estimula a via de recuperação de NAD+

_{NAM (inibidor de SIRT1/Sir2)}

NAM: nicotinamida

NMN: nicotinamida mononucleótido NA: ácido nicotínico

Restrição

calórica e

Sirtuínas

Via do

Via da

insulina-

calórica e

sinalização

Via do

TOR

AMP

cinase

insulina-IGF-1

Dali-Yousef et al (2007) Annals Med. 39, 335-345

Genómica funcional: expressão genética global e envelhecimento

Restrição calórica ativa FOXO

IRS

PI3K

Insulina / IGF-1

IRS PI3K PDK1 _P AKT _P

P P P PDK1 Restrição Calórica AKT FOXO

Genes alvo Genes alvo

FOXO P Resposta a Stress Autofagia … AKT P P mTORC1 mTORC1

ROS

Mutações no recetor da insulina/IGF-1 ou proteínas ativadas nessa via (PI3K ou AKT) aumentam a longevidade e a resistência ao stress oxidativo.

Em centenários

Existe uma correlação entre longevidade e polimorfismos em genes que codificam para o recetor de IGF-1, a AKT e o FOXO.

TOR (Target of Rapamycin)

- Ser/Thr proteína cinase altamente conservada

- Regulador do crescimento e metabolismo – resposta a: _{fatores de crescimento (insulina, IGF-1)}

_{nutrientes (aminoácidos)} _{estado energético}

_{estado energético} _stress

- está presente em 2 complexos estrutural e funcionalmente distintos: mTORC1 e mTORC2

Proteólise dependente de ubiquitina Transcrição Síntese de proteínas Metabolismo mitocondrial

TOR inibe processos catabólicos TOR ativa processos anabólicos

Autofagia Degradação de mRNA Biogénese de ribossomas Transporte de nutrientes mTORC1:

• constituído por deptor, PRAS40, raptor, mLST8, mTORe TTI1-TEL2 • é sensível à rapamicina:

- composto isolado de bactérias do solo da Ilha da Páscoa

- forma um complexo com a proteína FKBP12 e liga-se diretamente ao mTORC1 - propriedades antibacterianas e antifúngicas

mTORC1

- ativa a síntese de proteínas via fosforilação de S6K e 4E-BP1 - inibe a autofagiavia fosforilação de ULK1 e ATG13

(componentes do complexo de iniciação da autofagia) Insulina / IGF-1 IRS PI3K PDK1 AKT P P P P P TSC1 TSC2

 _{Rheb: homólogo da Ras; ativa quando ligada a GTP}

 _{TSC (tuberous sclerosis complex): GAP (GTPase-activating protein) específica para o} Rheb

 _{4E-BP1 (eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) binding protein 1): quando fosforilada,} liberta eIF4E  liga-se a mRNAs e recruta o complexo de iniciação ribossomal  _{Rheb: homólogo da Ras; ativa quando ligada a GTP}

 _{TSC (tuberous sclerosis complex): GAP (GTPase-activating protein) específica para o} Rheb

 _{4E-BP1 (eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) binding protein 1): quando fosforilada,} liberta eIF4E  liga-se a mRNAs e recruta o complexo de iniciação ribossomal

P mTORC1 TSC2 Rheb S6K1 Autofagia 4E-BP1 P P P Síntese de proteínas GTP RhebGDP

Sinalização por aminoácidos para mTORC1

Jewell and Guan (2013) Trends Biochem Sci 38, 233-242

 _Rag:

- pequena GTPase ativada por aminoácidos específicos (ex., Leu) - recruta o mTORC1 para os lisossomas, onde é ativado pela Rheb

Regulação da autofagia pelo TORC1

A restrição calórica induz a autofagia via: - inibição do TORC1

- ativação de SIRT1 e FOXO

mTORC2:

• é constituído por Deptor, mLST8, Protor, Rictor, mSIN1, mTORe TTI1-TEL2 • é insensível à rapamicina

• associa-se a ribossomas por uma via ativada por PI3K, regulando: - o FOXO1 via fosforilação de Akt/PKB

- actina citoesqueleto através das proteínas PKCα, Rho GTPase e Ras Insulina / IGF-1 IRS PI3K PDK1 AKT P P P P P FOXO1 Ribossoma mTORC2 Longevidade Rho PKCα Ras Actina/citoesqueleto

Função da AMPK na regulação da autofagia

Roach P J (2011) Mol. Cell. Biol. 31, 3082-3084

 _{AMPKinibe o mTORC1 por 2 mecanismos:} - ativação da TSC1 por fosforilação numa Ser - fosforilação da Raptor

 _{AMPKativa a Atg1/ULK1}

Glucose Aminoácidos

AKT TSC1/2

AMPK

AMP

Sinalização por nutrientes e envelhecimento

FOXO TORC1 S6K PGC-1α Respostas ao stress Biogénese mitocondrial Autofagia

Envelhecimento

Glucose Aminoácidos AKT TSC1/2 AMPK AMP

Restrição calórica

Envelhecimento

Pathways to an

Healthy Ageing

Healthy Ageing