MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
ATIVIDADE ESPECÍFICA DO EXTRATO BRUTO E
ESTABILIDADE A DIFERENTES TEMPERATURAS E
VALORES DE Ph DE XILANASES EXTRACELULARES
BACTERIANAS
CARLOS RODOLFO SAMPAIO
SÃO CRISTOVÃO
2013
ATIVIDADE ESPECÍFICA DO EXTRATO BRUTO E ESTABILIDADE A
DIFERENTES TEMPERATURAS E VALORES DE pH DE XILANASES
EXTRACELULARES BACTERIANAS
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia na área de concentração Biotecnologia em Recursos Naturais.
Orientador
Dr. Marcelo Ferreira Fernandes
Co-Orientadora
Dra. Érika Cristina Teixeira dos Anjos
SÃO CRISTOVÃO
SERGIPE – BRASIL
ATIVIDADE ESPECÍFICA DO EXTRATO BRUTO E ESTABILIDADE A
DIFERENTES TEMPERATURAS E VALORES DE pH DE XILANASES
EXTRACELULARES BACTERIANAS
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia na área de concentração Biotecnologia em Recursos Naturais.
APROVADA em 27 de fevereiro de 2013
Dra. Francine Ferreira Padilha – Universidade Tiradentes
Dra. – Dionéia Evangelista Cesar – Universidade Federal de Juiz de Fora
Dr. Marcelo Ferreira Fernandes Embrapa Tabuleiros Costeiros
(Orientador)
Dra. Érika Cristina Teixeira dos Anjos (Co-Orientadora)
SÃO CRISTOVÃO SERGIPE – BRASIL
Dedico este trabalho à minha esposa, Adely Amaly, cujo apoio, incentivo e compreensão me dão forças para trilhar novos caminhos.
A Deus, acima de tudo, pois nenhum obstáculo é grande demais quando confiamos nele.
À minha esposa, cujo amor e apoio incondicionais só me fortalecem e me trazem a certeza de uma vida repleta de realizações e felicidade.
À minha mãe, não só pelo dom da vida, mas também pelo incentivo constante e dedicação em todos os momentos.
À Universidade Federal de Sergipe, em especial ao Colégio de Aplicação, pela oportunidade que me foi dada em realizar e concluir este curso e por me proporcionar cada vez mais o prazer em dizer que sou professor!
À Embrapa Tabuleiros Costeiros, pela estrutura e apoio técnico-científico, sem os quais a pesquisa não poderia ter sido realizada.
Aos professores do Núcleo de Pós-Graduação em Biotecnologia, em especial à professora Dra. Roberta Pereira Miranda Fernandes, pelos conhecimentos transmitidos, dedicação e pela ajuda e disposição em todos os momentos da realização deste trabalho.
Ao professor Dr. Marcelo Ferreira Fernandes, pela orientação, incentivo constante, dedicação e ensinamentos, que me fizeram ser um profissional sempre em busca da superação de meus limites.
À Dra. Érika Cristina Teixeira dos Anjos, cuja simplicidade e orientação foram fundamentais nesse caminho e cuja paciência e atenção sempre transmitiam calma e serenidade em todos os momentos.
Ao amigo Alexander Frost, por todo o apoio nos trabalhos realizados na Universidade Federal de Sergipe.
Aos amigos do Mestrado, em especial Tarsízio, Jadson, Álvaro e Rosi, que transformaram as exaustivas horas de estudo em momentos de descontração e diversão.
A todos os meus colegas de laboratório, que se transformaram em verdadeiros amigos que levarei para sempre em minha vida: Ana Carolina, Clívia Andrade, Daniele Teles, Maria José Bryanne, João Soares, Ísis Bruna, Marcelo Resende, Larissa Freitas, Thaís de Jesus, Vera Araújo, Rafaela Bezerra, João Lima e Yasmim Bomfim. Vocês são os melhores!
LISTA DE FIGURAS i LISTA DE TABELAS ii RESUMO iii ABSTRACT iv 1. INTRODUÇÃO 01 2. REFERENCIAL TEÓRICO 03 3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Caracterização, conservação e reativação dos isolados de bactérias avaliados
09
3.2. Avaliação da atividade xilanolítica em meio sólido 09
3.3. Avaliação da relação entre atividade de xilanases bacterianas e as condições de isolamento dos mesmos
10
3.4. Preparo do extrato bruto da xilanase 11
3.5. Atividade da xilanase nos extratos proteicos brutos dos isolados 11
3.6. Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade das xilanases 12
3.7. Efeito do pH sobre a estabilidade das xilanases 13
3.8. Atividade de celulase no extrato proteico 13
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 14
5. CONCLUSÕES 23
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Atividade de xilanase de isolados de bactérias expressa como a
relação entre os diâmetros do halo de atividade da enzima e da colônia da bactéria (Relação H:C) em meio solução salina mineral com xilana como única fonte de carbono.
15
Figura 2. Comparações das relações dos diâmetros de halos de atividade
de xilanase e de colônias (Relação H:C) de bactérias de acordo com os solos de origem (a), meios de cultura (b), agentes solidificante (c); diluições do inóculo (d), métodos de plaqueamento (e) e tempo de incubação (f) utilizados no isolamento, e quanto à raridade de cultivo (g)
17
Figura 3. Atividade específica de xilanases em extratos brutos de nove
isolados de bactérias do solo, em reação de atividade com incubação a 50 oC
19
Figura 4. Respostas das atividades relativas de xilanases em extratos
brutos dos isolados TC99 (a), TC119 (b) e TC21 (c) a temperaturas de incubação durante a reação
20
Figura 5. Estabilidade da atividade de xilanases do extrato bruto dos
isolados TC21 e TC119 em função do tempo de pré-incubação a 60 oC
21
Figura 6. Estabilidade da atividade de xilanases do extrato bruto dos
isolados TC99 (a), TC119 (b) e TC21 (c) em função da
pré-incubação nos pHs 4,0, 5,5 e 8,0, por 24 h a 4oC
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Caracterização dos isolados bacterianos com formação de halos de atividade de xilanase quanto à afiliação taxonômica baseada no DNAr 16 S, raridade de cultivo, solo de origem e métodos empregados no isolamentoRESUMO
SAMPAIO, Carlos Rodolfo. Atividade específica do extrato bruto e estabilidade a diferentes temperaturas e valores de pH de xilanases extracelulares bacterianas. Sergipe: UFS, 2013. 38p. (Dissertação – Mestrado em Biotecnologia)
Resumo – As xilanases apresentam papel relevante como biocatalisadores de diferentes
processos agroindustriais, como a sacarificação de resíduos vegetais para a produção de etanol e o clareamento de polpas de madeira para a produção de celulose. Em escala industrial, estes processos podem requerer pH e, ou, temperatura extremos, os quais demandam enzimas compatíveis com estas condições. A maioria das enzimas disponíveis ou com potencial comercial é sintetizada de fungos ou de bactérias pertencentes a poucos gêneros. A avaliação de bactérias de isolamento raro constitui-se em estratégia importante para ampliar a diversidade de xilanases e suas potencialidades em termos de atividade, estabilidade e aplicação tecnológica. O objetivo deste trabalho foi avaliar uma coleção de bactérias do solo de isolamento comum e raro quanto à atividade de xilanases e caracterizar estas enzimas quanto à estabilidade a condições contrastantes de temperatura e pH. A coleção analisada é composta de 120 isolados com representantes de seis filos e foi submetida à seleção quanto à atividade de xilanases em culturas puras e no extrato proteico extracelular (EPE). Para a avaliação das culturas, utilizou-se como critério de seleção a relação entre os diâmetros de halos de hidrólise de xilana e das colônias em meio sólido
(relação H:C), incubado a 30 oC por até 14 dias. Os efeitos de diferentes fontes de variação
da fase de isolamento destas bactérias (solo de origem, meio de cultura, agente solidificante, diluição do inóculo e método de plaqueamento e tempo de incubação até surgimento de colônias) e do grupo de isolamento bacteriano (raro ou comum) sobre a frequência de isolados com alta atividade de xilanase foram avaliados com base na relação H:C. EPEs foram obtidos em meios líquidos contendo xilana inoculados com os onze isolados com maiores relações H:C. Os extratos foram avaliados quanto à atividade
específica de xilanases a 50 oC, por 1 h. Os extratos dos três isolados com maior potencial
de atividade sob esta condição foram avaliados quanto à temperatura ótima de atividade, estabilidade de atividade a 60 oC e a valores de pH 4,0, 5,5 e 8,0. Vinte e dois isolados (25%), incluindo oito de isolamento raro, apresentaram atividade de xilanase nas condições avaliadas, sendo encontrada uma alta variabilidade (>230%) entre estes isolados. Nenhum fator de isolamento ou a condição de isolado raro ou comum foram associadas à eficiência de atividade de xilanases em meio sólido. Alta variabilidade de atividade específica de xilanases nos EPEs também foi encontrada entre os isolados (1500%), com destaque para dois de cultivo raro (TC119 e TC21), da classe Alfaproteobacteria, e um de cultivo comum (TC99), da família Ralstoniaceae. As xilanases extracelulares de TC119 e TC21
apresentaram elevada atividade relativa em temperaturas de até 70 oC e foram pouco
sensíveis ao pH na faixa de 4,0 a 8,0; entretanto, as de TC99 apresentaram temperatura
ótima de 40 oC, baixa estabilidade a temperatura e pH. Xilanases extracelulares de TC119
não apresentaram atividade celulolítica. Bactérias do solo de isolamento raro apresentam alto potencial como fonte de xilanases extracelulares adaptadas a condições extremas de pH e temperatura requeridas em processos agroindustriais.
Palavras-Chave: clareamento de polpa Kraft, diversidade microbiana, sacarificação, viável não-cultivável, enzimas termoestáveis.
Comitê de Orientação: Dr. Marcelo Ferreira Fernandes – Embrapa Tabuleiros Costeiros
(Orientador) e Dra. Érika Cristina Teixeira dos Anjos Brandão – Embrapa Tabuleiros
ABSTRACT
SAMPAIO, Carlos Rodolfo. Specific activity of the raw extract and stability at different temperatures and pH values of bacterial extracellular xylanases. Sergipe: UFS, 2013. 38 p. (Dissertation – MS Biotechnology)
Xylanases have an important role as biocatalysts in different agroindustrial processes, such as saccharification of plant residues for the production of ethanol and bleaching of wood pulp for the production of pulp. On an industrial scale, these processes may require extreme pH or temperature, which require enzymes compatible with these conditions. Most enzymes available or showing commercial potential is synthesized by fungi or bacteria belonging to a few genera. Evaluation of rare isolation bacteria is an important strategy to expand the diversity of xylanases and their potential in terms of activity, stability and technological application. The aim of this study was to evaluate a collection of common and rare isolation soil bacteria regarding to xylanase activity and characterize the stability conditions of temperature and pH. The analyzed collection consists of 120 isolates with representatives from six phyla that were subjected to screening for xylanase activity in pure cultures and in the extracellular proteic extract (EPE). The ratio between the halos diameters of xylan hydrolysis and in the colonies on solid medium (ratio H:C), incubated at 30 ° C for up to 14 days, was used for the evaluation of cultures as a selection criteria. The effects of different sources of variation in the bacteria isolation stage (original soil, culture medium, solidifying agent, inoculum dilution and plating method and incubation time to colony appearance) and the group of bacterial isolation (rare or common) on the frequency of isolates with high xylanase activity were evaluated based on the ratio H:C. EPEs were obtained in liquid media containing xylan inoculated with the eleven isolates with highest ratios H:C. The extracts were evaluated for the specific xylanase activity at 50 °C for 1 h. Extracts of the three isolates with the highest potential for activity under this condition were evaluated for optimum activity, stability, activity at 60 oC and at pH 4.0, 5.5 and 8.0. Twenty-two isolates (25%), including eight from rare isolation, showed xylanase activity under the conditions evaluated, and found a high variability (> 230%) between these isolates. No isolation factor or rare or common isolation condition were associated with efficiency of xylanase activity in solid medium. High variability in specific xylanase activity in EPEs was also found among isolates (1500%), highlighting two rare isolates (TC119 and TC21), from Alfaproteobacteria class, and one common isolate (TC99), from Ralstoniaceae family. Extracellular xylanases from
TC21 and TC119 showed high relative activity at temperatures up to 70 oC and were
insensitive to pH in the range 4.0 to 8.0; however, TC99 isolate showed optimum temperature at 40 °C and low stability to temperature and pH. Extracellular xylanases from TC119 showed no cellulolytic activity. Rare isolation soil bacteria show high potential as a source of extracellular xylanases adapted to extreme pH and temperature conditions, which are required in agroindustrial processes.
Key words: Kraft pulp bleaching, microbial diversity, saccharification, non-culturable viable, thermostable enzymes.
Guidance Committee: Dr. Marcelo Ferreira Fernandes – Embrapa Tabuleiros Costeiros
(Major Professor) and Dr. Érika Cristina Teixeira dos Anjos – Embrapa Tabuleiros Costeiros (Co-Major Professor)
1. INTRODUÇÃO
Apesar da imensa diversidade genética dos micro-organismos, estima-se que menos de 10% desses tenham sido descritos e caracterizados e, dentre estes, menos de 1% das bactérias e arqueas existentes sejam conhecidas. Métodos moleculares e técnicas de cultivo alternativas desenvolvidas ao longo da última década são fundamentais para possibilitar a exploração do potencial biotecnológico destes organismos. Em função de sua versatilidade metabólica e adaptação a ambientes físico-químicos contrastantes, bactérias são fontes potenciais de enzimas para múltiplas finalidades de relevância econômica e adaptadas a condições extremas de atividade requeridas em muitos processos industriais.
Juntamente com celulases e pectinases, as xilanases contabilizam 20% do mercado mundial de enzimas. Xilanases são exploradas principalmente no processo Kraft para remoção de ligninocarboidratos da polpa de madeiras na indústria de celulose e papel. Outros processos importantes incluem a bioconversão de materiais lignocelulósicos em etanol de segunda geração, clarificação de sucos, detergentes e surfactantes.
A biomassa lignocelulósica é constituída por polímeros de celulose, hemiceluloses, pectina e lignina e corresponde à parede celular das células vegetais. Essa biomassa, que inclui resíduos agrícolas, como o bagaço e a palha de cana-de-açúcar, poderia ser melhor aproveitada para a geração de biocombustíveis, como o etanol, especialmente no Brasil. O país é mundialmente reconhecido como líder na produção e eficiência da indústria canavieira, o que o torna um grande produtor de material lignocelulósico, cujo destino é, na maioria das vezes, inapropriado, tornando-se poluente. Dessa maneira, a substituição da gasolina pelo etanol seria ideal não somente pela possibilidade de se utilizar uma fonte de energia ecologicamente sustentável e de potencial produção no país, mas também como alternativa à utilização de derivados do petróleo, possibilitando uma redução nas emissões de CO2.
Porém, as bioconversões industriais de lignocelulose requerem a aplicação de temperaturas elevadas e condições ácidas ou, às vezes, básicas para quebrar a lignina e solubilizar a celulose e as hemiceluloses para permitir a hidrólise enzimática, limitando os organismos que podem ser utilizados no processo. Além disso, os próprios micro-organismos são geralmente utilizados como fonte de enzimas nesses processos, cuja eficiência poderia ser aumentada através do uso de enzimas purificadas.
Além da degradação de biomassa lignocelulósica, as xilanases exercem um papel fundamental na indústria de polpa e papel, pois a hidrólise da xilana facilita a liberação da
lignina a partir da polpa e reduz o uso do cloro como agente de branqueamento. Durante o processo de branqueamento da polpa kraft é gerado um volume elevado de efluente rico em matéria orgânica e contaminantes, como compostos organoclorados, devido ao uso de produtos químicos baseados nesse elemento. A indústria tem procurado novos processos a fim de minimizar o impacto desses efluentes no ambiente e o uso de xilanases tem facilitado a implementação industrial de tratamentos de biobranqueamento capazes de reduzir a contaminação ambiental. Além disso, o cozimento da polpa e o processo de delignificação ocorrem em pH alcalino e alta temperatura, o que tem incentivado a pesquisa por enzimas capazes de suportar estas condições, facilitando o seu uso industrial. O uso de xilanases alcalinas e termoestáveis no branqueamento da polpa é capaz de reduzir a necessidade de ajustes de pH e temperatura, oferecendo vantagens técnicas e econômicas ao processo.
Portanto, um dos maiores interesses industriais nos processos envolvendo a utilização de enzimas, seja na produção de etanol ou da polpa de papel, é a utilização de biocatalisadores que possam trabalhar eficientemente e com baixo custo em altas temperaturas e em condições variadas de pH. Daí a importância da caracterização das xilanases, em especial de novos isolados, para que se conheçam suas propriedades de atividade ótima e de estabilidade em diferentes valores de pH e temperatura, permitindo avaliar o seu potencial de aplicação industrial.
O objetivo deste trabalho foi caracterizar isolados de bactérias do solo de cultivos comum e raro quanto à atividade específica de xilanases no extrato bruto das culturas e quanto à estabilidade desta atividade em diferentes temperaturas e valores de pH.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
Os micro-organismos apresentam uma imensa diversidade genética, exercendo funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas e atuando ainda como componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoquímicos (MYERS, 1996). Porém, apesar de sua grande importância na manutenção da biosfera, estima-se que menos de 10% desses seres existentes no planeta tenham sido descritos e caracterizados e, dentre estes, menos de 1% das bactérias e arqueas existentes sejam conhecidas (CANHOS & MANFIO, 2001).
Sabe-se que dos 61 filos de bactérias existentes, 31 não têm representantes cultiváveis (HUGENHOLTZ et al., 2009). Mais de 99% das bactérias de amostras ambientais permanecem "não-cultivadas" e a maioria desses micro-organismos encontrados no solo são insuficientemente estudados devido à raridade de seu isolamento em estudos de cultivo (DAVIS et al., 2005). Um dos motivos para essa dificuldade é o uso de métodos padrões em laboratório, que acabam subestimando a diversidade das complexas comunidades bacterianas (VARTOUKIAN et al., 2010). Ainda de acordo com Vartoukian (2010), atualmente métodos moleculares são utilizados para caracterizar culturas independentes dessas comunidades associadas a diversos tipos de hábitats. Apesar disso, o potencial biotecnológico de bactérias não cultivadas ainda está longe de ser totalmente explorado (WANG et al., 2009).
De acordo com Colwell (1997), os benefícios científicos esperados de um maior conhecimento sobre a diversidade microbiana são extensos, permitindo uma melhor compreensão das funções exercidas pelas comunidades microbianas nos ambientes terrestres e o conhecimento das suas interações com outros componentes da biodiversidade. Os benefícios econômicos e estratégicos estão relacionados com a descoberta de micro-organismos potencialmente exploráveis nos processos biotecnológicos para a produção de novos antibióticos e agentes terapêuticos, produtos químicos, enzimas e polímeros para aplicações industriais e tecnológicas, além da otimização da capacidade microbiana para a fertilização dos solos e despoluição das águas, dentre inúmeras outras (COLWELL, 1997).
Dentre os micro-organismos pouco explorados, destacam-se aqueles pertencentes à microbiota do solo, cuja diversidade é considerada extremamente elevada, variando entre os diferentes tipos e condições dos solos, com o número de células procarióticas podendo variar de 4 x 106 a 2 x 109 g-1 de solo (WHITMAN et al., 1998). Os componentes da
microbiota são dotados de um imenso potencial biotecnológico, produzindo diversas enzimas, o qual tem sido explorado comercialmente ao longo dos anos (JAYANI et al., 2005). Essa diversidade microbiana ainda não explorada representa uma vasta fonte de novas atividades enzimáticas, as quais têm ganhado destaque dentro do cenário biotecnológico devido à ampla variedade de classes enzimáticas encontradas e suas mais diversas funções biológicas e possíveis aplicações industriais (HANDELSMAN, 2004).
Diversas classes de enzimas têm sido usadas em uma grande variedade de processos na indústria de celulose (xilanases, lacases e peroxidases), na produção de etanol (xilanases e celulases), na produção de ração animal (xilanases), como aditivo de detergentes e sabões (xilanases, proteases e celulases), no processamento industrial do amido (α-amilase, glucose isomerase), na clarificação de sucos (xilanases e pectinases) e surgem como alternativas de interesse em outros bioprocessos, como o de síntese orgânica (proteases, oxidorredutases) e no setor de diagnóstico e no tratamento de resíduos (HAKI & RAKSHIT, 2006; COLOMBATTO et al., 2004). Dentre estas diversas classes, destacam-se também as lipases, cuja utilização como aditivos em detergentes ainda representa a maior aplicação industrial destas enzimas (KIRK et al., 2002), sendo usadas também na indústria de papel e celulose, no desenvolvimento de aromas em queijos e derivados, bebidas alcoólicas, achocolatados e sobremesas, pela hidrólise seletiva de triacilgliceróis e liberação de ácidos graxos, e até mesmo em processos de tratamento de efluentes (JAEGER & REETZ, 1998).
Sabe-se que mais de 500 tipos de enzimas são utilizadas em 50 aplicações biotecnológicas em diversos segmentos econômicos. O mercado mundial de enzimas de interesse industrial foi de U$ 3,3 bilhões de dólares em 2010, devendo chegar a 4,4 bilhões de dólares em 2015, com previsão de crescimento anual de 6% para os próximos cinco anos, (COMPANHIA E MERCADOS, 2011). Daí, a procura por enzimas com novas aplicações industriais, ou que apresentem maior eficiência que aquelas correntemente em uso (MARRS et al., 1999).
O Brasil tem importado a maior parte das enzimas que utiliza, embora apresente um enorme potencial para produzi-las. Essa potencialidade é evidenciada pela grande diversidade biológica, ainda pouco explorada, que serviria como fonte para a obtenção de novos organismos produtores de enzimas de interesse industrial e pela abundância de matéria orgânica em forma de resíduos agrícolas, como a palha de arroz ou o bagaço de cana, que constituem substrato de baixo custo para as fermentações (BON et al., 2008). Dentre estas enzimas de interesse, destacam-se as que catalisam a conversão de biomassa lignocelulósica.
Além disso, a caracterização das enzimas é um passo importante para que se conheçam suas propriedades de atividade ótima de atuação e de estabilidade em diferentes valores de pH e temperatura, o que permite avaliar o seu potencial de aplicação nesses diferentes processos (KASHYAP et al., 2001). Vários destes são realizados usando-se as próprias células como fonte de enzimas, mas sua eficiência pode ser aumentada através do uso de enzimas isoladas e purificadas (MOHANA et al., 2008).
Análises de tendências de mercado revelaram que as xilanases, juntamente com as celulases e pectinases, são responsáveis por 20% do mercado mundial de enzimas (POLIZELI et al., 2005).
As hemiceluloses são polissacarídeos não-celulósicos, de baixo peso molecular, encontrados juntamente com a celulose em tecidos de plantas e cujo principal componente é a xilana (TIMELL, 1967). Este carboidrato é o segundo biopolímero mais abundante após a celulose e o principal polissacarídeo hemicelulósico encontrado na parede celular vegetal, correspondendo aproximadamente a um percentual de 10 a 35% da biomassa seca total em angiospermas e de 10 a 15% em gimnospermas (PULS, 1997).
As xilanas são polissacarídeos heterogêneos que consistem de uma cadeia principal de resíduos de D-xilopiranosil unidos por ligações β-1,4-glicosídicas e que frequentemente carregam acetil, arabinosil e glucuronosil como substituintes (BIELY, 1985). Ela se localiza principalmente na parede celular secundária, formando uma interface entre a lignina e os outros polissacarídeos. Dependendo de sua origem biológica, uma ou mais isoformas de endo-1,4-β-xilosidase (1,4-β-D-xilano-hidrolase. EC 3.2.1.8) clivam a xilana aleatoriamente em suas ligações 1,4 em pequenos fragmentos, como xilotriose e xilobiose. Já a β-xilosidase (β-D-xilosídeo-xilohidrolase EC 3.2.1-37) hidrolisa a xilobiose e pequenos xilo-oligossacarídeos em regiões não-redutoras até xilose. Endo-xilanases, os maiores componentes do sistema xilanolítico de micro-organismos, têm sua ação facilitada por enzimas acessórias que removem as ramificações da cadeia do xilano, como a α-L-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, acetilxilano esterase e ácido felúrico esterase, entre outras (COLLINS et al., 2005).
As xilanases são classificadas em duas famílias, 10 e 11, de acordo com a similaridade das sequências de aminoácidos de seus domínios catalíticos em grupos hidrofóbicos (HENRISSAT, 1991). Além disso, existem evidências de que a xilana e resíduos fenólicos de lignina estejam unidos por ligações covalentes e de que pontes de hidrogênio e forças de Van der Waals unem estes polissacarídeos à cadeia de celulose (FERREIRA FILHO, 1994).
Essa classe de enzimas é produzida por diversos organismos, como bactérias, algas, fungos, protozoários, gastrópodes e artrópodes (DEKKER & RICHARDS, 1976). A maior
parte das bactérias e fungos secretam xilanases extracelulares,
que atuam sobre o material hemicelulósico para liberar xilose como um produto final diretamente assimilável, permitindo que os organismos cresçam de forma heterotrófica utilizando a xilana. Dentre as bactérias, Actinobacteria e Frimicutes da família Bacillaceae são relacionados como os principais produtores de enzimas industrialmente importantes envolvidas na degradação lignocelulósica (NASCIMENTO et al., 2002; NAGAR et al., 2012). Condições fisico-químicas extremas podem afetar altamente a eficiência de enzimas extracelulares. Em geral, a temperatura e o pH são os dois fatores principais a interferir na estabilidade de enzimas extracelulares. Por exemplo, xilanases da família Xyl-11 apresentam um pH ótimo altamente variável, de 2 a 9. A maioria dos fungos que excretam a Xyl-11 são acidófilos, mas os de origem bacteriana não possuem pH ótimo abaixo de 5,5 (PAES et al., 2012). A temperatura é outro fator físico-químico que afeta a estabilidade de uma enzima extracelular. Um aumento na temperatura além do ótimo desestabiliza as ligações covalentes (pontes de hidrogênio, interações de van der Walls) (PAES et al., 2012). A família 10 das xilanases tem sido isolada de vários organismos termofílicos e hipertermofílicos, incluindo Thermotoga sp (WINTERHALTER et al., 1995), Rhodothermus
marinus (ABOU-HACHEM et al., 2003), Bacillus stearothermophilus (KHASIN et al., 1993). A família 10 da xilanase, XynA, do isolado Thermotoga sp. strain FjSS3-B.1 é uma das mais termoestáveis com temperatura ótima aparente de 105°C e uma halflife de 90 minutos em 95°C (SIMPSON et al., 1991).
Em várias aplicações industriais, como no processo de branqueamento da polpa kraft, a polpa de entrada tem alta temperatura e pH alcalino, tornando-se necessária a busca por xilanases termoestáveis e com estabilidade alcalina (SHARMA & BAJAJ, 2005). Khandeparkar e Bhosle (2007) ressaltam que na produção de polpa kraft, a hemicelulase e a lignina são dissolvidas e parcialmente degradadas durante o processo de aquecimento. Numa fase subsequente do processo, o pH desce bruscamente devido à liberação de cadeias laterais da xilana e esta precipita, ocorrendo reabsorção da lignina nas microfibrilas celulósicas, que ficam com uma coloração escura. Para a retirada dessa coloração, processos de branqueamento são utilizados com a consequente formação de compostos organoclorados, que são prejudiciais ao ambiente. As xilanases clivam a xilana que reprecipitou, causando a dissociação do complexo lignina-celulose, reduzindo o conteúdo de lignina. Essas enzimas, então, promovem a remoção da xilana ligada ao complexo lignina– carboidrato, facilitando a lixiviação da lignina (NIEHAUS et al., 1999). Esse processo facilita o branqueamento e diminui a liberação dos produtos tóxicos organoclorados
(KHANDEPARKAR & BHOSLE, 2007). Além disso, o tratamento do material com xilanase na fase de pré-cozimento da polpa ajuda a desorganizar a estrutura da parede celular, facilitando, também, as etapas iniciais do processo (NIEHAUS et al., 1999).
Durante esse processo de produção de polpa, vários micro-organismos, como diversas espécies de fungos, por exemplo, frequentemente secretam não somente xilanases, mas também celulases, as quais podem afetar adversamente a qualidade da polpa (CHRISTOV et al., 1999). Vários Bacillus sp. são conhecidos por secretar altas taxas de xilanases extracelulares livres de atividade de celulase ou com fraca atividade (NAGAR et al., 2012). Apesar de existirem métodos de separação e purificação de xilanases a fim de se evitar a atividade contaminante da celulase, ou da utilização de organismos geneticamente alterados para a produção exclusiva de xilanases, o interesse industrial é no isolamento de micro-organismos de ocorrência natural que sejam produtores de xilanases livres da atividade de celulase, a fim de facilitar o processo, evitando a contaminação (BALAKRISHNAN et al., 1992).
Pelo fato de a madeira usada para produção de polpa ser tratada a altas temperaturas (cerca de 70 °C) e em pH alcalino (cerca de 9,0), a etapa enzimática subseqüente requer enzimas termoestáveis, com alta estabilidade e atividade em pH alcalino. Além disso, é necessário que o preparado enzimático seja livre de celulases, para evitar a degradação das fibras de celulose. Outras características de grande importância requeridas para as xilanases neste processo são a alta atividade, para reduzir o custo, e baixo peso molecular, para facilitar sua difusão na polpa (TECHAPUN et al., 2003).
Portanto, na indústria de papel, a utilização de xilanases representa uma importante melhoria tecnológica na medida em que promove o aumento do efeito de branqueamento de reagentes químicos e diminui a produção de poluentes durante o branqueamento (AMIN, 2006). De acordo com o autor, o resultado da hidrólise enzimática da xilana é uma polpa com maior brilho ou uma diminuição no uso de produtos químicos que seriam necessários para que se atingisse esse brilho.
O incremento de novas tecnologias no setor agrícola desencadeou um aumento na obtenção de produtos e subprodutos ricos em biomassa lignocelulósica, como o bagaço da cana-de-açúcar (SILVA, 2010). Este autor ressalta ainda que o uso desse subproduto vem sendo amplamente estudado para a produção de biocombustível de fonte renovável, representando uma importante alternativa para o aumento da produção de etanol. Com a moagem da cana-de-açúcar para a extração do caldo de cana, geram-se grandes quantidades de bagaço que são, normalmente, utilizados para a produção de vapor e eletricidade em processos de pouca eficiência, devido à inexistência de aplicações mais
atraentes para o material. Apesar desta aplicação, entre 10% e 15% do bagaço não possui uma destinação apropriada, tornando-se poluente (CASTRO, 2006). Como tanto o bagaço quanto a palha de cana-de-açúcar são materiais lignocelulósicos, eles poderiam ser melhor aproveitados para a geração de biocombustíveis. Com isso, o uso de enzimas na degradação da biomassa lignocelulósica para a produção de etanol de segunda geração não só contribuiria ainda mais com a liderança do país no setor sucroalcooeiro, mas também refletiria na mesma medida em sua responsabilidade social e ambiental. O tratamento desse material com micro-organismos produtores de enzimas hidrolíticas tem sido apontado como uma forma de facilitar processos subsequentes de conversão da celulose e hemiceluloses em açúcares fermentáveis destinados à bioconversão em etanol e outros produtos de interesse comercial (AMIRTA et al., 2006).
De acordo com Rodrigues e Ortiz (2006), hoje a indústria canavieira brasileira encontra-se em novo ciclo de expansão, com expectativas de crescimento sem precedentes da produção tanto de açúcar como de etanol. Ao grande e consolidado mercado interno, somam-se as novas forças de expansão da produção representadas pelos motores bicombustíveis e pelo mercado internacional, hoje caracterizado pela ascensão dos preços
do petróleo, pelos compromissos de redução das emissões de CO2 e pela queda nos
subsídios agrícolas para o açúcar.
Nesse contexto, a Biotecnologia se apresenta como uma importante ferramenta, através da utilização de celulases e xilanases de micro-organismos para a degradação de materiais lignocelulósicos na produção de etanol de segunda geração.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Caracterização, conservação e reativação dos isolados de bactérias avaliados Cento e vinte isolados de bactérias de solo pertencentes à coleção do Laboratório de Microbiologia do Solo da Embrapa Tabuleiros Costeiros foram avaliados quanto à atividade xilanolítica in vitro. Os isolados foram obtidos de amostras de solo coletadas sob mata secundária ou cultivadas com milho e guandu, utilizando-se os meios de cultura VL55 (SAIT et al., 2002), com xilana como única fonte de C, e ágar nutriente na concentração original ou diluído 10, 100 e 1000 vezes. Todos os meios foram solidificados com ágar ou gelana e plaqueados com inóculos com diluições de 106 e 107 em solução salina. A incubação foi
realizada a 30 oC por três meses, ao longo dos quais as placas foram inspecionadas e os
isolamentos realizados a partir das novas colônias surgidas no período. Com base nas sequências parciais do DNAr 16S, estes isolados pertencem a seis filos distintos, cuja contribuição percentual em termo de representantes da coleção decresce de acordo com a seguinte ordem: Actinobacteria (35%), Firmicutes (34%), Proteobacteria (28%), Acidobacteria, Chloroflexi e Deinococcus-Thermus (menos de 1% cada) (CAVALCANTE, 2012). A análise filogenética desta sequência, seguindo metodologia utilizada por Joseph et al. (2003), indicou que 42 isolados (34%) foram classificados como de isolamento raro, por pertencerem a grupos com nível hierárquico equivalente a família até então sem representantes cultivados.
Os isolados foram mantidos em estoque em glicerol 50% armazenados a -20 °C. Previamente aos testes deste estudo, as bactérias foram reativadas em meios de cultura líquidos, com composição idêntica aos dos meios utilizados no isolamento e incubados (32 °C) no escuro até a observação da turvação do meio. Posteriormente, as culturas reativadas foram inoculadas por meio de estrias compostas nos respectivos meios sólidos de isolamento para verificação da pureza.
3.2. Avaliação da atividade xilanolítica em meio sólido
Os isolados foram inoculados em Erlenmeyers de 50 ml contendo 20 ml de solução salina mineral (MSS) com xilana como única fonte de carbono (BAJAJ & SINGH, 2010). Esta
solução é composta por 1% de NH4NO3, 0,5% de KH2PO4, 0,1% de MgSO4.7H2O, 0,01% de
isolados encontraram-se no início da fase exponencial, detectada pela turvação inicial do meio, realizaram-se testes da produção de xilanase em meio MSS sólido contendo xilana como única fonte de carbono (0,5%). Para isso, um volume de 2 mL da cultura líquida foi centrifugado (14000 rpm, 5 minutos) e lavado duas vezes com solução salina (NaCl 0,85%, p/v). Em seguida, as densidades óticas (DO) das suspensões celulares foram ajustadas para 0,7 a 500 nm em espectrofotômetro. Uma alíquota de 10 μL foi depositada no centro de placas de Petri contendo MSS, solidificada com ágar (2%) ou gelana (1%), utilizando-se
placas em triplicatas para cada isolado. As placas foram incubadas 30 oC (± 2oC) por sete
dias, no escuro, e por mais sete dias, caso a formação de colônias não fosse observada no primeiro período. Os isolados cujas colônias não foram visíveis no período de 14 dias foram desconsiderados para as etapas posteriores. A atividade da xilanase in vitro foi avaliada pela medição, com uma régua, dos diâmetros de halos claros observados nos meios de cultura, os quais são formados pela hidrólise da xilana pelas enzimas excretadas pela colônia e difundidas através do meio sólido. Para aumentar o contraste entre a zona de clareamento do halo e o meio com xilana não-hidrolisada, adicionou-se vermelho Congo a 0,1% na superfície do meio (SHARMA & BAJAJ, 2005). Para cada halo foram realizadas duas medições perpendiculares entre si. Essas medidas foram feitas no dia do teste com o vermelho Congo e sete dias após a realização deste. O diâmetro das colônias também foi medido nas mesmas datas de avaliação dos halos. A seleção dos isolados com maior atividade foi realizada utilizando-se como critério a relação entre os diâmetros dos halos de atividade e das colônias (Relação H:C), considerando-se ambas as datas de avaliação.
3.3. Avaliação da relação entre atividade de xilanases bacterianas e as condições de isolamento dos mesmos
Para testar a hipótese de que os procedimentos utilizados no isolamento das bactérias (CAVALCANTE, 2012) resultam em culturas com diferentes atividades de xilanase, o efeito de diferentes fatores de isolamento bacteriano sobre as relações H:C dos isolados foi avaliado conforme descrito a seguir. Teste t (p < 0,05) foi empregado para comparação de médias de isolados obtidos de diferentes solos (agrícola versus florestal), agentes solidificantes do meio de cultura (agar versus gelana), diluição do inóculo utilizada no plaqueamento (10-6 versus 10-7), método de plaqueamento (“pour-plate” versus placa espalhada). Para a comparação das médias de H:C dos isolados entre as datas de incubação até surgimento da colônia e entre os meios de cultura, empregou-se o procedimento de Bonferroni (p < 0,05). O teste t também foi empregado para testar a
hipótese de diferença na atividade de xilanase entre as bactérias da coleção classificadas como de isolamento raro e comum.
3.4. Preparo do extrato bruto da xilanase
Os isolados selecionados no item 3.2 foram crescidos no meio MSS com xilana (0,5%) e incubados a 32 °C até a observação do início da turvação do meio. Este meio foi filtrado em filtro de nitrocelulose Millipore (porosidade de 0,22 µm), o qual foi mantido a uma
temperatura de -20 °C até o momento da análise.
O teor de proteínas totais nestes extratos foi determinado pelo método de Bradford (1976), conforme protocolo descrito pelo fabricante do reagente para detecção de proteínas na faixa de 8 a 80 µg ml-1 (Bio-Rad). Soluções de albumina sérica bovina (BSA) com concentrações conhecidas foram utilizadas como padrão.
3.5. Atividade da xilanase nos extratos proteicos brutos dos isolados
A atividade enzimática foi determinada de acordo com modificações do método de Schinner e Von Mersi (1990), proposto para avaliação da atividade de xilanases em extratos de solo. De acordo com o método original, os açúcares redutores formados durante a incubação dos extratos na presença de xilana (1,2% em tampão acetato 2M, pH 5,5), a 50
o
C, por 24 h, são quantificados colorimetricamente após reação com o hexacianeto férrico de potássio, sob condições específicas, utilizando-se glicose como padrão. Neste estudo, o período de incubação foi reduzido para 1 h, mantendo-se as demais condições idênticas às do método original. Em função dos baixos teores proteicos obtidos nos extratos celulares sob as condições empregadas para o cultivo das bactérias, este método foi escolhido em substituição ao método do ácido dinitrosalicílico (MILLER, 1959), tradicionalmente empregado, por apresentar uma sensibilidade cerca de 200 vezes maior na detecção de açúcares redutores (SCHINNER & VON MERSI, 1990). Para estas análises, alíquotas de 100 μL de cada filtrado foram adicionadas a 3 mL do tampão acetato e 3 mL de tampão com xilana em tubos de ensaio, que foram incubados a 50 oC, por 1 h, em triplicatas. Para os controles, a adição do filtrado deu-se após o período de incubação. Para a quantificação dos açúcares redutores, alíquotas de 100 μL foram pipetadas em tubos de ensaio e o volume
completado para 1 ml com água destilada. Foram adicionados, 1 mL do reagente A (16 g L-1
L-1 de hexacianeto férrico de potássio). Os tubos de ensaio foram vedados e colocados em
banho-maria a 100 oC, por 15 min. Após esse período, os conteúdos dos tubos foram
resfriados rapidamente em banho de água fria, por aproximadamente 5 min, e adicionados de 5 mL do reagente C (1,5 g L-1 de sulfato férrico de amônio, 1,0 g L-1 de dodecil sulfato de sódio e 4,2 mL L-1 de ácido sulfúrico concentrado). Após estabilização da cor por 1 h, à temperatura ambiente, foi feita a leitura da absorvância em espectrofotômetro a 690 nm para a determinação da formação de açúcares redutores. Uma curva padrão com concentrações
conhecidas de açúcar redutor na forma de glicose (0 a 18 µg glicose ml-1) foi utilizada para
conversão da absorvância em quantidade de produto formado pela reação. As reações para detecção dos açúcares redutores foram realizadas em duplicatas.
A atividade específica das xilanases extracelulares foi determinada pela relação entre a velocidade de formação de açúcares redutores e a concentração de proteínas totais no filtrado, e expressa em µg de açúcar redutor min-1 mg-1 de proteína.
3.6. Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade das xilanases
Selecionaram-se os três isolados com maiores atividades específicas no ensaio anterior para a determinação da temperatura ótima de atividade e termoestabilidade das xilanases. A quantificação da atividade nas duas determinações foi realizada pelo método de SCHINNER e VON MERSI (1990), do mesmo modo descrito no item anterior. Para o ensaio de temperatura ótima de atividade, a incubação dos extratos proteicos foi realizada em temperaturas variando de 30 a 80 oC, com incremento de 10 oC. Os resultados foram apresentados em atividade relativa, expressa pela percentagem de atividade específica sob cada temperatura em relação à máxima atividade específica observada entre as seis temperaturas de incubação. Para a determinação da estabilidade enzimática à temperatura, 100 µL de extrato foram adicionados a tubos de ensaio contendo 3 ml de tampão acetato sem xilana e incubados por 2, 4 e 6 h, a 60 oC. Após cada um destes períodos de incubação, adicionaram-se 3 ml de tampão acetato com xilana (1,2%) ao conteúdos dos frascos e procedeu-se a incubação para determinação da atividade residual de xilanases a 50 oC, por 1 h. A determinação dos açúcares redutores formados foi realizada conforme
descrito anteriormente. A atividade específica de xilanases a 50 oC, sem a pré-incubação a
60 oC, foi utilizada como controle, sendo as atividades após 2, 4 e 6 h de pré-incubação expressas como percentagem deste controle.
3.7. Efeito do pH sobre a estabilidade das xilanases
Os três isolados selecionados no item 3.4 foram testados quanto à estabilidade de xilanases a valores de pH de 4,0, 5,5 e 8,0. Para isto, 250 µL de extratos foram incubados por 24 h, a 4 oC, em 750 µL de tampão McIlvaine (McILVAINE, 1921), ajustados para os valores de pH citados. Após este período, alíquotas de 100 µL foram submetidas à incubação a 50 oC, em 3 mL de tampão acetato e 3 ml de tampão acetato com xilana (1,2%), por 1 h, e os teores de açúcares redutores formados pela atividade residual das xilanases quantificados conforme descrito anteriormente. Para os brancos, alíquotas de 100 µL dos filtrados pré-incubados sob os diferentes valores de pH foram adicionados imediatamente antes das reações para determinação de açúcares redutores. A atividade específica residual máxima entre os três valores de pH testados foi utilizada como referência, e os resultados expressos em atividade relativa (percentagem da atividade de referência).
3.8. Atividade de celulase no extrato proteico
Para o isolado com maior atividade específica de xilanase no item 3.4, foi realizada a atividade de celulases no extrato proteico obtido após incubação em meio com xilana como única fonte de carbono. Esta atividade foi determinada pelo método de Schinner e Von Mersi (1990), substituindo-se a xilana por CM-celulose dissódica (7 g L-1 de tampão acetato 2M, pH 5,5). Os procedimentos para leitura das amostras e da curva padrão seguiram a metodologia descrita nos itens anteriores.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 120 isolados avaliados, 114 (95% do total) apresentaram crescimento em meio com xilana como única fonte de carbono. Apesar desta frequência elevada, apenas 22 isolados (25% do total) foram capazes de expressar atividade de xilanase, detectada pela formação de halos claros ao redor das colônias neste meio, nas condições testadas (Figura 1). Esta discrepância pode estar associada a contaminações por glicose e arabinose livres na xilana de madeira de faia utilizada, que seriam utilizadas como fonte de carbono para permitir o crescimento inicial das colônias sem atividade de xilanase. Embora cinquenta bactérias da coleção tenham sido isoladas em meio VL55, o qual possui diversos fatores nutricionais, especialmente vitaminas, a maioria destas bactérias apresentou-se metabolicamente versátil em termos nutricionais, apresentando crescimento em meio MSS, cuja composição possui apenas sais minerais e xilana como fonte de carbono.
Das 22 bactérias que apresentaram halo de atividade de xilanase nas condições testadas, vinte apresentaram crescimento até os sete dias de incubação, e apenas duas (TC14C e TC9D), entre sete e 14 dias. Quanto à data de detecção da atividade de xilanases, todas as bactérias, com exceção do isolado TC97, apresentaram halo na primeira data de avaliação da atividade (Figura 1a).
Observou-se alta variabilidade entre isolados quanto à capacidade de expressão de xilanases nas condições avaliadas, independentemente das datas de avaliação da atividade desta enzima (Figura 1). Na primeira data de avaliação, a relação H:C variou de 1,44 a 4,26, entre os isolados TC89 e TC21, respectivamente. Esta variação correspondeu a 3,7 vezes o desvio padrão (D.P.) observado entre os isolados da coleção e a um incremento de 290% entre os isolados de mínima e máxima H:C. Para a segunda data os valores de H:C variaram entre 1,44 a 4,73, para TC89 e TC92 (Figura 1b), o que correspondeu a 3,4 vezes o D.P. entre isolados e a um incremento de 230% entre os de mínima e máxima H:C.
A ordem dos isolados quanto a relação H:C diferiu entre a primeira e a segunda datas de avaliação (Figura 1). Vários trabalhos já observaram a expressão gênica tardia em isolados bacterianos, como estudos com genes de nodulação nodC e nodW e do gene nopP em Bradyrhizobium japonicum, que provavelmente atuam na infecção das raízes da soja (BORTOLAN et al., 2009), ou na expressão gênica de Enterococcus como resposta a diferentes condições ambientais (CARLOS, 2008), que revelaram diferenças de ativação da maquinaria de expressão gênica em resposta ao meio.
Estas alterações foram caracterizadas pela formação de halo por TC97 apenas na segunda data de avaliação, e pelo incremento na relação H:C entre as duas datas para algumas bactérias, especialmente para TC119, TC66, TC92, TC13B e TC99. Esta defasagem entre a formação da colônia e a expressão da atividade de xilanases pode estar relacionada a mecanismos de repressão catabólica, no qual um açúcar de mais fácil assimilação reprime a expressão de genes envolvidos na utilização de polímeros de estrutura mais complexa, como já foi demonstrado para o fungo Trichoderma reesei (MACH et al., 1996) e em Bacillus stearothermophilus e Bacillus subtilis (CHO e CHOI, 1999).
Figura 1. Atividade de xilanase de isolados de bactérias expressa como a relação entre os diâmetros do halo de atividade da enzima e da colônia da bactéria (Relação H:C) em meio solução salina mineral com xilana como única fonte de carbono. Para cada isolado a relação H:C foi avaliada aos 0 dias (a) e aos 7 dias (b) após a observação do crescimento das colônias. Para detalhes sobre a identificação dos isolados, consultar Tabela 1. Nomes entre aspas indicam famílias com as quais os isolados apresentaram máxima similaridade na sequência do DNAr 16S, embora não se afiliem às mesmas. As barras de erro representam ± 1 D.P. da média de H:C entre todos os isolados.
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 TC21 " P hyll oba ct eria ce ae " TC67 B ac il lac ea e TC83 B ac il lac ea e TC10C Ac idobac te ria ce ae TC49 " Mi croc oc ca ce ae " TC79 S tr eptom yc etac ea e TC137 B ra dyrhiz obi ac ea e TC99 Ra lst onia ce ae TC 6B Stre pt om yc etace ae TC14C C aul oba cter ac ea e TC 88 " R hi zob ia ce ae" TC123 " B ac il la ce ae " TC 13 B M ic rom on os po ra cea e TC92 " P hyll oba ct eria ce ae " TC106 B ac il lac ea e TC9D "M icr omonos pora ce ae " TC72 " B ac il la ce ae " TC66 B ur kholder iac ea e TC38 B ac il lac ea e TC119 " Methyloba cter iac ea e" TC89 B ac il lac ea e R elaç ão H:C Isolados (Famílias) 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 TC92 " P hyll oba ct eria ce ae " TC67 B ac il lac ea e TC 99 R als ton ia ce ae TC21 " P hyll oba ct eria ce ae " TC13B M ic romonospor ac ea e TC119 " Methyloba cter iac ea e" TC79 S tr eptom yc etac ea e TC66 B ur kholder iac ea e TC83 B ac il lac ea e TC123 " B ac il la ce ae " TC6B S tre pt omyc etac ea e TC10C Ac idobac te ria ce ae TC49 " Mi croc oc ca ce ae " TC137 B ra dyrhiz obi ac ea e TC97 M ethyl oba cte ria ce ae TC14C C aul oba cter ac ea e TC88 " R hiz obi ac ea e" TC106 B ac il lac ea e TC9D "M icr omonos pora ce ae " TC72 " B ac il la ce ae " TC38 B ac il lac ea e TC89 B ac il lac ea e R elaç ão H:C Isolados (Famílias) (b) (a)
Não se observou uma relação entre eficiência de atividade de xilanases e a afiliação taxonômica dos isolados em termos de filos ou famílias (Figura 1). No entanto, em número de representantes por família, observou-se uma dominância de isolados de Bacillaceae na condição testada (23% dos isolados). Esta observação está em consonância com o fato de esta família ser a mais extensivamente estudada e relatada como de potencial para a produção de xilanases (UCHINO & NAKANE, 1981; KAMBLE & JADHAV, 2012). Além disto, dois representantes de isolamento raro, TC123 e TC72, pertencentes ao filo Firmicutes, apresentaram atividade de xilanase.
Quanto ao número de representantes por filo, observou-se uma alta frequência de Proteobacteria (43%), especialmente da classe Alfa (33%), com atividade xilanolítica. É amplo o relato de representantes deste filo como produtores de xilanase (REIS et al., 2001; MOHANA et al., 2008; WANG et al., 2010). Isolados das famílias Phyllobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae, Caulobacteriaceae, Rhizobiaceae e Methylobacteriaceae, além de quatro representantes de isolamento raro, da classe Alfa, e Ralstoniaceae e Burkholderiaceae, da classe Beta, foram observados.
Isolados xilanolíticos do filo Actinobacteria também apresentaram alta frequência (25%), sendo identificados como das famílias Micrococcaceae, Streptomycetaceae e Micromonosporaceae. Há vários estudos sobre a degradação enzimática da xilana neste filo, em especial do gênero Streptomyces, tais como Streptomyces matensis DW67 (YAN et al., 2009), Streptomyces cyaneus SN32 (NINAWE et al., 2008), Streptomyces sp. (SIMKHADA, 2012) e Streptomyces rameus L2001 (LI et al., 2012). O isolado TC10C (Acidobacteria) foi um dos xilanolíticos mais ativos nas condições do teste em meio sólido. Embora considerado um filo de difícil cultivo, a atividade de xilanases no espaço periplasmático de Acidobacterium capsulatum, também pertencente a este filo, já foi anteriormente relatada (INAGAKI et al., 1998).
Nenhuma das variações nos métodos de isolamento, nem diferenças entre isolados quanto à condição de raridade de isolamento (Tabela 1), impactaram a eficiência de atividade de xilanase avaliada pela relação H:C, nas condições testadas (Figura 2). É interessante ressaltar que, embora o meio VL55 (SAIT et al., 2002), usado por Cavalcante (2012) para a obtenção desta coleção, apresente em sua composição apenas a xilana como fonte de carbono, ele não apresentou melhor desempenho em termos de obtenção de isolados com maior atividade de xilanase do que o ágar nutriente original ou diluído 10 ou 100 vezes.
Figura 2. Comparações das relações dos diâmetros de halos de atividade de xilanase e de colônias (Relação H:C) de bactérias de acordo com os solos de origem (a), meios de cultura (b), agentes solidificante (c); diluições do inóculo (d), métodos de plaqueamento (e) e tempo de incubação (f) utilizados no isolamento, e quanto à raridade de cultivo (g). Valores de n indicam o número de isolados incluídos em cada uma das classes dos fatores comparadas. Diferenças de médias entre as classes comparadas não foram significativas (p > 0,05) não foram observadas para nenhum dos fatores analisados. Para identificação dos isolados incluídos em cada classe de fatores, consultar Tabela 1. Apenas isolados com halos formados na primeira data de avaliação da atividade de xilanases foram incluídos nas análises.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 0 20 40 60 80 R el a çã o H :C
Tempo de incuba çã o pa ra surgimento de colônia (dia s) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 PE (n=9) PP (n=10) R el a çã o H :C
Método de pla quea mento 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Aga r (n=8) Gela na (n=11) R el a çã o H :C
Agente solidifica nte
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 AN (n=6) AN 1:10 (n=4) AN 1:100 (n=3) VL (n=6) R el a çã o H :C Meio de cultura 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 10-6 (n=13) 10-7 (n=6) R el a çã o H :C Diluiçã o do inóculo 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Solo Agrícola (n=7) Solo de Ma ta (n=12)
R el a çã o H :C Solo de origem 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 comum (n=12) ra ro (n=7) R el a çã o H :C Isola mento (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g)
Tabela 1. Caracterização dos isolados bacterianos com formação de halos de atividade de xilanase quanto à afiliação taxonômica baseada no DNAr 16 S, raridade de cultivo, solo de origem e métodos empregados no isolamento
Isolados Filo Família1 Espécie com máxima similaridade no 16S DNAr Raridade de isolamento2 Solo de origem3
Diluição do
inóculo4 Meio de cultura5 Agente solidificante Método de plaqueamento6
Surgimento da colônia (dias) TC10C Acidobacteria Acidobacteriaceae Edaphobacter aggregans (98%) Comum SF D6 VL Gelana PE 7 TC13B Actinobacteria Micromonosporaceae Micromonospora sp. (98%) Comum SF D6 AN Gelana PE 4 TC49 Actinobacteria “Micrococcaceae” Arthrobacter sp. (99%) Raro SF D6 AN1:10 Gelana PP 4 TC6B Actinobacteria Streptomycetaceae Streptomyces djakartensis (98%) Comum SF D6 AN Ágar PE 7 TC79 Actinobacteria Streptomycetaceae Streptomyces albospinus (98%) Comum SF D6 AN Ágar PE 4 TC9D Actinobacteria “Micromonosporaceae” Planosporangium sp.(93%) Raro SF D6 VL Ágar PE 21 TC106 Firmicutes Bacillaceae Bacillus sp (99%) Comum SF D6 AN1:100 Ágar PE 7
TC123 Firmicutes “Bacillaceae” Bacillus sp.(99%) Raro SF D6 VL Gelana PP 7
TC38 Firmicutes Bacillaceae Bacillus subtilis (99%) Comum SF D7 AN1:10 Gelana PP 14 TC67 Firmicutes Bacillaceae Bacillus subtili (96%)s Comum SF D7 AN Ágar PP 7 TC72 Firmicutes “Bacillaceae” Bacillus cereus (98%) Raro SA D6 AN1:10 Gelana PE 4 TC83 Firmicutes Bacillaceae Bacillus subtilis (99%) Comum SA D6 AN1:100 Ágar PP 7 TC89 Firmicutes Bacillaceae Bacillus safensis (99%) Comum SA D6 AN1:100 Ágar PP 4 TC119 Proteobacteria “Methylobacteriaceae” Methylobacterium sp. (99%) Raro SA D6 VL Gelana PP 4 TC137 Proteobacteria Bradyrhizobiaceae Bradyrhizobium genosp.(99%) Comum SA D7 VL Ágar PE 63 TC14C Proteobacteria Caulobacteraceae Phenylobacterium sp. (97%) Comum SF D7 VL Gelana PE 21 TC21 Proteobacteria “Phyllobacteriaceae” Mesorhizobium sp. (97%) Raro SF D6 VL Gelana PP 14 TC66 Proteobacteria Burkholderiaceae Ralstonia pickettii (95%) Comum SF D6 VL Gelana PE 14 TC88 Proteobacteria “Rhizobiaceae” Rhizobium miluonense (96%) Raro SA D7 AN Ágar PP 7 TC92 Proteobacteria “Phyllobacteriaceae” Phyllobacterium trifolii (95%) Raro SA D7 AN Gelana PP 4 TC97 Proteobacteria Methylobacteriaceae Methylobacterium isbiliense (94%) Comum SA D6 AN Gelana PE 4 TC99 Proteobacteria Ralstoniaceae Ralstonia sp. (99%) Comum SF D7 AN1:10 Gelana PE 28 1
Nomes entre aspas indicam famílias com as quais os isolados apresentaram máxima similaridade na sequência do DNAr 16S, embora não se afiliem às mesmas.
2
De acordo com metodologia de Joseph et al. (2003);
3
SF: solo sob mata secundária; SA: solo sob cultivo agrícola;
4 Plaqueamento de 100 μL de diluição 10-6
(D6) e 10-7 (D7);
5
VL: VL55 (Sait et al., 2002); AN, AN1:10 e AN1:100: ágar nutrientes sem diluição, diluído 10 e 100x, respectivamente;
6
Onze isolados que apresentaram as maiores relações H:C, considerando-se as duas datas de avaliação desta variável, foram testados quanto à atividade das xilanases no filtrado extracelular. Destes, nove apresentaram atividade nas condições avaliadas (Figura 3). A perda de atividade das xilanases do filtrado de TC83 e TC10C pode estar associada à baixa estabilidade das enzimas destes organismos nas condições mais drásticas de
temperatura deste teste (50 oC), comparativamente ao do método em placa (30 oC). Além
disto, o período mais curto de incubação das enzimas na presença de xilana (1 h), comparativamente ao utilizado para o teste em meio sólido com as bactérias (até 14 dias), pode ter sido limitante para a detecção da atividade destas enzimas.
Figura 3. Atividade específica de xilanases em extratos brutos de nove isolados de bactérias do solo,
em reação de atividade com incubação a 50 oC. Barras de erro correspondem a ± 1 D.P. da média de
atividade específica de todos estes isolados. Para detalhes dos códigos dos isolados, consultar Tabela 1.
Do mesmo modo que observado para a relação H:C, uma elevada variabilidade na atividade específica de xilanases do filtrado extracelular a 50 oC foi encontrada entre os
isolados, com o valor mínimo (158 µg açúcar redutor mg-1 proteína min-1) sendo obtido para
o TC6B, com elevada similaridade com Streptomyces djakartensis, e o maior (2565 µg açúcar redutor mg-1 proteína min-1) para um isolado de cultivo raro, TC119, pertencente à classe Alfaproteobacteria (Figura 3). Embora espécies de Bacillus e Streptomyces sejam reportadas como as principais fontes de xilanases para uso comercial, apenas um isolado de cada um destes gêneros (TC67 e TC6B) foi obtido dentre aqueles com alta atividade do filtrado sob as condições testadas, após as etapas de seleção. Interessantemente, a atividade específica destes dois isolados correspondeu a apenas 6 a 10% da obtida para os três isolados de maior eficiência (TC119, TC99 e TC21), neste estudo. Ressalta-se ainda
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 TC6B TC67 TC137 TC92 TC97 TC13B TC21 TC99 TC119 A ti vi d ad e es pe cí fi ca ( μ g d e gl ic os e m g -1 d e pr ot eí na m in -1) Isolados
que 18 isolados de Bacillus e 10 de Streptomyces foram testados neste estudo. Além disto, outra Actinobcateria, TC13B, afiliada à família Micromonosporaceae, apresentou uma atividade 650% maior que a observada pelo Streptomyces TC6B.
Dentre os três melhores isolados, dois, TC119 e TC21, pertencem a grupos hierarquicamente equivalentes a famílias para os quais representantes cultivados não eram anteriormente conhecidos (CAVALCANTE, 2012). Respectivamente, estes isolados afiliaram-se mais proximamente às famílias Methylobacteriaceae e Phyllobacteriaceae, ambas Alfaproteobacterias. Embora TC119 não seja afiliado a Methylobacteriaceae, este isolado apresenta capacidade de crescimento em metanol como única fonte de carbono, característica típica de representantes desta família.
Os três isolados com maior atividade de xilanase nos filtrados extracelulares apresentaram perfis de resposta à temperatura bastante contrastantes entre si (Figura 4). TC99, afiliado a Ralstoniaceae, apresentou temperatura ótima de atividade de xilanase a 40
oC, com acentuada queda após este valor (Figura 4a). Embora TC119 também tenha
apresentado ótimo de atividade neste mesmo valor de temperatura, a atividade do filtrado
manteve-se relativamente elevada (cerca de 60% do máximo), até 70 oC, com queda brusca
sendo observada após este valor. O ótimo de temperatura para a atividade de xilanases de
TC21 foi de 60 oC, com queda acentuada acima desta temperatura. No entanto, ressalta-se
as xilanases deste isolado apresentaram ainda cerca de 35% de atividade após incubação a 80 oC, por 1 h. A literatura reporta que Bacillus spp. são micro-organismos notadamente produtores de altos níveis de atividade de xilanase em pH alcalino e temperatura elevada (SUBRAMANIYAN et al., 2001). Takahashi et al. (2000) purificaram uma xilanase de baixo
peso molecular a partir de Bacillus sp. e determinaram uma atividade ótima a 70 oC e uma
atuação enzimática em uma ampla variação de pH.
Figura 4. Respostas das atividades relativas de xilanases em extratos brutos dos isolados TC99 (a), TC119 (b) e TC21 (c) a temperaturas de incubação durante a reação. Para cada isolado a atividade máxima de reação foi considerada como 100%.
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 30 40 50 60 70 80 A ti vi d ad e re la ti va ( % ) Temperatura (oC) 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 30 40 50 60 70 80 A ti vi d ad e re la ti va (% ) Temperatura (oC) 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 30 40 50 60 70 80 A ti vi d ad e re la ti va ( % ) Temperatura (oC) (a) (b) (c)
As xilanases do filtrado de TC21 apresentaram-se ainda altamente estáveis à
temperatura de 60 oC, com queda de apenas 20% da atividade após 6 h de incubação
(Figura 5). Por outro lado, as xilanases de TC119 apresentaram-se menos termoestáveis,
com reduções de 55% da atividade após 2 h de incubação a 60 oC.
Figura 5. Estabilidade da atividade de xilanases do extrato bruto dos isolados TC21 e TC119 em
função do tempo de pré-incubação a 60 oC.
Com relação à estabilidade de pH, os perfis de resposta da atividade das xilanases também diferiram entre os três isolados (Figura 6). TC99 apresentou-se sensível tanto às condições mais ácidas (pH 4,0) quanto à mais alcalina (pH 8,0). De modo oposto, TC119 e TC21 foram altamente estáveis aos valores contrastantes de pH analisados. Para ambos os casos, em comparação ao pH ótimo (5,5), alterações não foram observadas em pH 4,0, e reduções sob pH 8,0 foram pouco acentuadas (< 25% de decréscimo) após 24 h de incubação.
No processo de branqueamento de polpa de madeira na indústria de celulose, a etapa enzimática requer o uso de enzimas com alta estabilidade em temperaturas e pH
elevados (GOMES et al., 2007). Valores de temperatura de 70 oC e pH 9,0 são comumente
encontrados nestes processos (TECHAPUN et al., 2003). Deste modo, o isolado TC99 apresenta baixo potencial para esta finalidade. Enzimas de última geração comercializadas para o branqueamento de polpas de madeira têm apresentado elevada atividade em temperaturas de até 90 oC e pH de até 9,0, e períodos de 20 min para finalização das reações, de acordo com o fabricante (Verenium Corporation, San Diego, CA). As xilanases dos filtrados brutos de TC119 e TC21 apresentam perfis de temperatura e pH de atividade
similares ou superiores à da marca comercial Luminase®-PB100 de uma destas enzimas
(Endo-1,4-β glucanase (EC 3.2.1.4), que possui faixa de atividade entre 40 a 70 oC e pH de
5,0 a 8,0. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 A ti vi d ad e re la ti va ( % ) Tempo de pré-incubação a 60oC (h) TC21 TC119
Figura 6. Estabilidade da atividade de xilanases do extrato bruto dos isolados TC99 (a), TC119 (b) e
TC21 (c) em função da pré-incubação nos pHs 4,0, 5,5 e 8,0, por 24 h a 4oC.
Além do alto potencial de atividade de xilanases de TC119 nas condições de temperatura e pH do processo de branqueamento de polpas, estas enzimas não apresentaram atividade de celulase quando incubadas na presença de carboximetil-celulase após 1 h de incubação a 50oC. A ausência de atividade de celulase em xilanases é uma característica de grande importância para a indústria de papel, já que esta atividade pode comprometer a estrutura das fibras celulósicas (CHRISTOV et al., 1999).
Durante a produção de etanol de 2ª geração, o pH ótimo utilizado na fase de fermentação pode variar devido aos diferentes meios de fermentação empregados, condições de cultivo ou ainda diferentes cepas, sendo ideal determinar a melhor faixa de pH para um determinado processo fermentativo (DU PREEZ, 1994). Estudos relatam a queda de pH do meio em função desse processo em vários organismos (CABRAL et al., 2009).
Além disso, temperaturas em torno de 55 oC são comumente alcançadas (OLOFSSON et
al., 2008). Neste sentido, as enzimas de TC119 e TC21 também apresentam potencial de uso nestes processos, já que apresentaram alta atividade nestas condições.
Apesar de características muito importantes para o uso industrial de xilanases terem sido encontradas nos extratos extracelulares de alguns isolados avaliados, etapas posteriores de pesquisa necessitam ser realizadas para possibilitar o uso biotecnológico destas xilanases. Estas etapas incluem a separação, caracterização molecular e confirmação da atividade e estabilidade a temperatura e pH de cada uma das enzimas componentes do complexo xilanolítico dos extratos, otimização das condições de produção destas enzimas pelas bactérias em fermentação em estado sólido e submersa, determinação das estruturas proteicas e amplificação e clonagem dos genes relacionados.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4,0 5,5 8,0 A ti vi d ad e re la ti va ( % ) pH de pré-incubação (a) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4,0 5,5 8,0 A ti vi d ad e re la ti va ( % ) pH de pré-incubação (b) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4,0 5,5 8,0 A ti vi d ad e re la ti va ( % ) pH de pré-incubação (c)
