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ELIZÂNGELA SOUTO DE OLIVEIRA
REGULAÇÃO ADRENÉRGICA DO CRONOTROPISMO ATRIAL
DURANTE O DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL DO RATO
CAMPINAS
2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
ELIZÂNGELA SOUTO DE OLIVEIRA
REGULAÇÃO ADRENÉRGICA DO CRONOTROPISMO ATRIAL
DURANTE O DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL DO RATO
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestra em farmacologia.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Rosana Almada Bassani
Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado defendida pela aluna Elizângela Souto de Oliveira, e orientada pela Profa. Dra. Rosana Almada Bassani. _______________________________
Assinatura da Orientadora
CAMPINAS
2015
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RESUMO
Importantes ajustes cardiovasculares dependentes de estimulação adrenérgica do coração ocorrem no período perinatal. O objetivo deste trabalho foi estudar a resposta cronotrópica a catecolaminas em ratos imaturos, com foco em mecanismos intrínsecos e extrínsecos à via de transdução -adrenérgica. Foi determinada a resposta cronotrópica a tiramina (TIR), isoproterenol (ISO), noradrenalina (NA), forskolin (FSK) e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) em átrios direitos de ratos de 0-23 dias de idade e adultos. No mesmo tecido, foram quantificados os níveis de mRNA de diversas proteínas pela técnica de reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR). Os principais resultados foram: a) a resposta cronotrópica máxima (Rmax) a TIR e NA exógena mostrou-se deprimida em átrios de ratos
de 0-2 dias, enquanto a sensibilidade aos agonistas reduziu-se com o amadurecimento; b) o bloqueio do transportador neuronal de catecolaminas por desipramina foi menos efetivo em causar desvio à esquerda na curva concentração-efeito nos átrios de animais imaturos, e aboliu as diferenças de sensibilidade (mas não de Rmax) à NA; c) a inibição do
transportador extraneuronal de monoaminas não modificou o pD2 do ISO em átrios de
animais imaturos, os níveis de mRNA para este transportador foram ~30% daqueles em adultos; d) apesar da redução da Rmax à NA em neonatos, não houve diferença na Rmax a
ISO, FSK e IBMX entre as diferentes idades; e) o bloqueio de adrenoceptores β2 com
ICI118,551 reduziu Rmax e pD2 do ISO apenas nos átrios de ratos imaturos, indicando
contribuição deste subtipo de receptores apenas nos primeiros dias após o nascimento; f) a expressão de adrenoceptores β2, Gi, Gs e adenilato ciclase (isoforma 1) foi maior em
átrios de animais imaturos, enquanto aquela de adrenoceptores β1 foi semelhante em todos
os grupos etários. Conclui-se que os componentes pós-receptor desta via de sinalização já estão presentes no neonato, embora tenha sido detectada aparente imaturidade no acoplamento de adrenoceptores β1. Entretanto, foram identificados mecanismos
compensatórios, tais como a participação de adrenoceptores β2 e menor remoção neuronal
e extraneuronal de catecolaminas.
Palavras-chave: catecolaminas, receptores adrenérgicos beta, átrios do coração, crescimento e desenvolvimento
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ABSTRACT
Important cardiovascular adjustments that depend on the adrenergic regulation of the cardiac function occur during the perinatal period. The goal of this work was to study the chronotropic responsiveness to catecholamines in immature rats, focusing on mechanisms intrinsic and extrinsic to the β-adrenergic signaling pathway. The chronotropic response to tyramine (TYR), isoproterenol (ISO), norepinephrine (NE), forskolin (FSK), and 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) was determined in right atria isolated from 0-23 day-old and adults rats. In the same tissue, mRNA levels of relevant proteins were quantified by real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The main results were: a) the maximum chronotropic response (Rmax) to TYR and to exogenous NE were lower in rigth atria from 0-2day-old rats, while the sensitivity to the agonists decreased during development; b) inhibition of neuronal norepinephrine transporter by desipramine was less effective at shifting the concentration-effect curve to the left in immature animals, and abolished the differences in sensitivity (but not in Rmax) to NE. c) inhibition of the extraneuronal monoamine transporter did not changed the ISO pD2 in atria from immature animals, in which the mRNA levels for this transporter were ~ 30% of those in adults; d) despite the lower Rmax to NE in neonates, the Rmax to ISO, FSK and IBMX was comparable among ages; e) β2-adrenoceptor blockade
with ICI118,551 reduced Rmax and ISO pD2 only in atria from immature rats, indicating contribution of this receptor subtype only in the first days after birth; f) β2-adrenoceptor, Gi,
Gs and adenylate cyclase (isoform 1) transcript levels were greater in the atria of immature
animals, while that of β1-adrenoceptor was similar in all age groups. In conclusion,
post-receptor components of this signaling pathway seem to already be mature in newborns, although an apparent immaturity in β1-adrenoceptor coupling was detected. However,
compensatory mechanisms were identified, such as the participation of β2-adrenoceptor and
weaker neuronal and extraneuronal catecholamine removal.
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SUMÁRIO
DEDICATÓRIA XIII
AGRADECIMENTOS XV
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS XIX
LISTA DE FIGURAS XXI
LISTA DE TABELAS XXIII
1. INTRODUÇÃO 01
2. OBJETIVOS 08
3. MATERIAL E MÉTODOS 09
3.1 Animais 09
3.2 Soluções e Fármacos 09
3.3 Átrio direito isolado 10
3.4 Curvas concentração-efeito (CCE) aos agonistas 11 3.5 Pré-tratamento in vitro para desnervação e bloqueio dos sistemas neuronal e extraneuronal de captação de catecolaminas 11
3.6 Bloqueio de adrenoceptroes β2 12
3.7 Determinação dos níveis de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) 12
3.8 Análise Estatística 15
4. RESULTADOS 16
4.1 Resposta cronotrópica atrial à tiramina 16
4.2 Resposta cronotrópica atrial às catecolaminas 17 4.2.1 Resposta à noradrenalina e captação neuronal de catecolaminas 17 4.2.2 Resposta ao isoproterenol e captação extraneuronal de
catecolaminas 21
4.3 Influência do bloqueio de receptores adrenérgicos β2 sobre a
reatividade atrial ao isoproterenol 24
4.4 Resposta cronotrópica atrial ao forskolin 26
4.5 Resposta cronotrópica atrial à 3-isobuti-1-metixantina 27 4.6 Níveis atriais de mensagem genética para proteínas atriais envolvidas
na sinalização β –adrenérgica 28
5. DISCUSSÃO 30
xii
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 36
ANEXOS – Certificados de aprovação do protocolo experimental pela
xiii
Dedico esse trabalho ao meu filho Lucas,
que mesmo sem entender me fez valente.
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço à minha orientadora e amiga, Profa. Dra. Rosana Almada Bassani, por ser exemplo de profissional, por me apoiar desde meu ingresso no mundo da ciência e me incentivar a continuar nesse caminho difícil, mas gratificante que é a pesquisa.
Agradeço também ao Prof. Dr. José Wilson Magalhães Bassani, diretor do Centro de Engenharia Biomédica (CEB), local onde foi realizado esse trabalho e por quem tenho profunda admiração.
Ao Prof. Dr. Kleber Gomes Franchini, que gentilmente cedeu o Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) para a realização dos experimentos de biologia molecular. Agradeço a todos os profissionais desse laboratório, em especial à Dra. Ana Helena Macedo Pereira e Dr. Alisson Campos Cardoso, por me ensinarem tão pacientemente a técnica de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).
A todos funcionários, alunos e estagiários do CEB, por todo companheirismo e amizade ao longo desses anos. Em especial, agradeço a Rubia Franchi, que iniciou esse trabalho, aos estagiários que passaram pelo Laboratório de Apoio à Pesquisa, aos funcionários da Área de Pesquisa e Desenvolvimento, que me auxiliaram grandemente, e aos amigos Jair Trapé Goulart, Natália Ferreira Oshiyama, Adriana Chaves Cavalcanti e Prof. Dr. Pedro Xavier de Oliveira, que colaboraram com críticas e sugestões diretas ou indiretas ao trabalho.
Ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia, da Faculdade de Ciências Médicas (FCM), especialmente aos professores e colegas do Departamento de Farmacologia.
Por fim, mas não menos importante, a toda minha família. Aos meus pais, Jair e Marta por todo esforço que fizeram para que eu estudasse, à minha irmã Héllen, por me incentivar. Ao meu marido Helder Von Ah e toda sua família, por entenderem e me apoiarem nesse momento, e ao meu filho Lucas, por toda compreensão e carinho.
xvii
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas, graças a Deus, não sou o que era antes”. (Martin Luther King)
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
6-OHDA 6-hidroxidopamina
AC adenilato ciclase
ACh Acetilcolina
Adr Adrenalina
AR receptor adrenérgico
Bpm batimentos por minutos
cAMP monofosfato cíclico de 3´-5´- adenosina CCE curva concentração – efeito
cDNA cadeia de ácido desoxiribonucleico complementar
CEB Centro de Engenharia Biomédica
CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica CNPEM Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais COMT catecol-O-metil-transferase
DMI Desipramina
EC50 valor da concentração molar do agonista que produz uma
resposta igual a 50% da máxima
EMT transportador extraneuronal de monoaminas
EPM erro padrão da média
FE frequência espontânea
Fin frequência espontânea antes da aplicação do agonista
Fmax frequência espontânea máxima
FSK Forskolin
GAPDH gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
Gi subunidade α da proteína G que inibe a atividade catalítica da adenilato ciclase
GLU Glutathiona
Gs subunidade α da proteína G que estimula a atividade catalítica da
adenilato ciclase
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Canais HCN Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels
IBMX 3-isobutil-1-metilxantina ICaL Corrente de cálcio tipo L
ICaT Corrente de cálcio tipo T
If Corrente de entrada de cátions monovalentes ativada por
hiperpolarização
IK corrente de retificação tardia de K+
INCX Corrente do trocador Na+/ Ca2+
ISSO Isoproterenol
KH solução de Krebs-Henseleit
LNBio Laboratório Nacional de Biociências
MAO monoamina–oxidase
mRNA ácido ribonucléico mensageiro
NA Noradrenalina
NAV nodo atrioventricular
NET transportador neuronal de noradrenalina
NSA nodo sinoatrial
PA potencial de ação
PBZ Fenoxibenzamina
pD2 logaritmo negativo da concentração do agonista que evoca uma
resposta igual à metade da máxima
PDE fosfodiesterase
PKA quinase de proteína dependente de cAMP Proteína G proteína ligante de nucleotídeos de guanina
qRT-PCR reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real Rmax resposta cronotrópica máxima ao agonista
RNA ácido ribonucleico
TIR tiramina
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
Vm potencial de membrana
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1: Via de transdução β adrenérgica e colinérgica (receptor m2) ... 04
Figura 4.1: Resposta cronotrópica à tiramina (TIR), obtida em átrios direitos isolados de ratos imaturos e adultos. ... 16 Figura 4.2: Resposta cronotrópica à noradrenalina (NA) obtidas em átrios direitos isolados de ratos imaturos e adultos. ... 17 Figura 4.3: Resposta cronotrópica à noradrenalina (NA), obtidas em átrios direitos isolados de ratos de 0-2 dias (A), 5-7 dias (B) e adultos (C) antes e depois bloqueio da captação neuronal com desipramina (DMI). D: curvas após o bloqueio da captação neuronal em todas as idades. ... 20 Figura 4.4: Resposta cronotrópica ao isoproterenol (ISO) obtidas em átrios direitos isolados de ratos imaturos e adultos. ... 22 Figura 4.5: Resposta cronotrópica ao isoproterenol (ISO), obtida em átrios direitos isolados de ratos de 0-2 dias (A), 5-7 dias(B) e adultos (C) antes e depois do tratamento com 6-hidroxidopamina e bloqueio da captação extraneuronal com fenoxibenzamina (PBZ). D: curvas após o bloqueio da captação extraneuronal em todas as idades... 23 Figura 4.6: Respostas cronotrópicas ao isoproterenol na ausência (controle) ou presença de 0,1 µM ICI 118,551 (bloqueador seletivo para AR2) obtidas em átrios direitos isolados de ratos de 0-2 dias (A), 5-7 dias (B) e adultos (C). ... 25 Figura 4.7: Resposta cronotrópica ao forskolin (FSK). A: Resposta expressa em batimentos por minuto (bpm) e B: Resposta expressa como porcentagem da resposta máxima (% Rmax) de cada grupo etário, para melhor evidenciar as variações de sensibilidade. ... 27 Figura 4.8: Respostas cronotrópicas à 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) em átrio direito de ratos em desenvolvimento. A: Resposta expressa em batimentos por minuto (bpm) e B: Resposta expressa como porcentagem da resposta máxima (% Rmax) de cada grupo etário, para melhor evidenciar as variações de sensibilidade. ... 28 Figura 4.9: Gráficos representativos da quantificação relativa em átrios direitos de ratos em desenvolvimento, dos transcritos que codificam as seguintes proteínas: A- receptores adrenérgicosβ1 (ADRB1), B- receptores adrenérgicosβ2 (ADRB2), C- sub-unidade αs da
proteína G estimulatória da adenilatociclase (GNAS), D- sub-unidade αi da proteína G
inibitória da adenilatociclase (RGi), E- isoforma 1 da adenilatociclase (ADCY1) e F - transportador extraneuronal de monoaminas (EMT) ... 29
xxiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1: Sequência de nucleotídeos dos primers utilizados para avaliar o nível de expressão genética de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), receptor adrenérgico β1 (ADRB1), receptor adrenérgico β2 (ADRB2), sub-unidade αs da proteína G
estimulatória de adenilatociclase (GNAS), sub-unidade αi da proteína G inibitória da
adenilatociclase (RGi), isoforma 1 da adenilatociclase (ADCY1) e transportador extraneuronal de monoaminas (EMT). ... 13 Tabela 4.1: Resposta cronotrópica à tiramina obtida em átrios direitos isolados de ratos imaturos e adultos... 16 Tabela 4.2: Resposta cronotrópica à noradrenalina obtida em átrios direitos isolados de ratos imaturos e adultos. ... 17 Tabela 4.3: Resposta cronotrópica à noradrenalina em átrios direitos isolados de ratos imaturos e adultos, antes (controle) e após desnervação adrenérgica seguida de inibição dos sistemas de captação neuronal e extraneuronal com fenoxibenzamina e desipramina (DMI), respectivamente. ... 19 Tabela 4.4: Resposta cronotrópica ao isoproterenol obtida em átrios direitos isolados de ratos imaturos e adultos. ... 21 Tabela 4.5: Resposta cronotrópica ao isoproterenol em átrios direitos isolados de ratos imaturos e adultos não sujeitos a tratamento in vitro (Controle) e após desnervação adrenérgica seguida de inibição do sistema de captação extraneuronal com fenoxibenzamina (PBZ). ... 23 Tabela 4.6: Resposta cronotrópica ao isoproterenol na ausência (controle) e na presença do antagonista seletivo para AR2, ICI 118,551 (0,1 µM) em átrio direito de ratos em
desenvolvimento. ... 24 Tabela 4.7: Resposta cronotrópica ao forskolin obtida em átrios direitos isolados de ratos imaturos e adultos. ... 26 Tabela 4.8: Resposta cronotrópica à 3-isobutil-1-metilxantina em átrio direito de ratos em desenvolvimento. ... 27
1 1. INTRODUÇÃO
O débito cardíaco é definido como o volume de sangue ejetado pelo ventrículo (direito ou esquerdo) em uma dada unidade de tempo, e pode ser calculado como o produto do volume ejetado numa única contração (volume sistólico) e a frequência cardíaca. Sendo assim, os valores assumidos por essas duas variáveis exercem grande influência sobre o fluxo de sangue para os tecidos (1, 2).
A atividade rítmica espontânea do coração se deve à existência de células especializadas na geração e condução rápida da atividade elétrica. O marca-passo primário do coração, o nodo sinoatrial (NSA), é formado por um conjunto de células autoexcitáveis localizado na junção entre a veia cava superior e o átrio direito. A atividade elétrica iniciada no NSA é propagada para o miocárdio atrial, chegando até o nodo atrioventricular (NAV), de onde é conduzida para o septo interventricular através do feixe de His, e, posteriormente, da rede de fibras de Purkinje, a qual conduz a atividade elétrica por toda a parede ventricular (3,4). Nas células miocárdicas, o potencial de ação (PA) dispara os eventos que levam à contração celular, promovendo o aumento da concentração citosólica de Ca2+ (5).
A geração do automatismo cardíaco no NSA envolve diversas correntes iônicas através de canais dependentes do potencial de membrana (Vm), que promovem
despolarização durante a diástole e levam Vm ao limiar de ativação da corrente de cálcio do
tipo L(ICa,L), responsável pela fase de despolarização do PA das células marca-passo.
Participam da despolarização diastólica, que se inicia ao final da fase de repolarização do PA, a corrente de entrada de cátions monovalentes ativada por hiperpolarização (If), a
corrente de Ca2+ do tipo T (ICa,T), e a corrente de entrada de Na+ gerada pelo efluxo de Ca2+
pelo trocador Na+/Ca2+ (INCX). Esta última corrente é dependente da liberação de Ca2+ do
retículo sarcoplasmático durante a diástole. Além disso, a inativação dos canais que medeiam a corrente de retificação tardia de K+ (I
K) tem influência sobre a frequência
espontânea dessas células, já que determina a duração do PA e o nível máximo de Vm
diastólico (5,6).
Mesmo sendo o coração capaz de atividade eletromecânica independente do sistema nervoso, a regulação neural pode afetar a força de contração e a frequência cardíacas por meio da interação de neurotransmissores com receptores presentes na membrana dos miócitos. A eferência autonômica controla o coração por fibras simpáticas e parassimpáticas (7).
2
A ativação do ramo parassimpático (vagal) leva à liberação de acetilcolina (ACh) nas terminações pós-ganglionares. Os principais receptores cardíacos que medeiam a ação da ACh são os receptores colinérgicos muscarínicos do tipo m2, que estão acoplados a um
tipo de proteína ligante de nucleotídeos de guanina (proteína G), cuja subunidade α é do tipo inibitória (Gi), pois inibe a atividade da adenilato ciclase (AC). Portanto, a ativação desses receptores causa diminuição da taxa de síntese de monofosfato cíclico de 3´-5´-adenosina (cAMP), o que resulta em redução da atividade de quinase de proteína dependente de cAMP (PKA) e, consequentemente, da fosforilação dos substratos desta, como, por exemplo, os canais de cálcio do tipo L e dos canais que medeiam IK. Com isto,
há redução de ICaL e prolongamento da inativação de IK nas células do NSA. Além disso, o
menor nível de cAMP induz um desvio da curva de ativação dos canais HCN (que conduzem If) para potenciais menos negativos. Estas alterações, em conjunto, reduzem a
taxa de despolarização diastólica das células do NSA e, portanto, sua frequência espontânea de disparo (efeito cronotrópico negativo). Além de afetar a síntese de cAMP, a ativação de receptores colinérgicos m2 também pode induzir uma corrente de fundo (IK(ACh))
através de canais de K+ com retificação de entrada, cuja abertura é dependente de sua
interação com a subunidade da proteína G acoplada ao receptor m2. Esta corrente se
contrapõe às correntes que promovem a despolarização diastólica, contribuindo para o efeito cronotrópico negativo da ACh (8,9). Uma versão simplificada das cascatas de sinalização dos principais mediadores autonômicos está apresentada na Figura 1.1.
A ativação de fibras pós-ganglionares adrenérgicas (simpáticas) que inervam o NSA leva à liberação de noradrenalina (NA) das terminações nervosas. O aumento de atividade da eferência simpática também pode levar à liberação de adrenalina (Adr) pelas células cromafins da medula adrenal. A Adr se difunde para capilares sanguíneos e atinge seus tecidos-alvos pela circulação, constituindo-se em um neurohormônio. A NA e a Adr são catecolaminas, sintetizadas a partir do aminoácido tirosina pela ação da enzima tirosina hidroxilase (10).
As catecolaminas se ligam aos receptores adrenérgicos (AR) dos tipos α e β, acoplados a diferentes sistemas efetores. A primeira classificação dos tipos de AR foi proposta por Ahlquist (11): o tipo α seria ativado por agonistas com ordem de potência NA> Adr>> isoproterenol (ISO), enquanto que, para AR do tipo β, a ordem seria ISO> NA ≈ Adr. O efeito cronotrópico das catecolaminas no coração é mediado majoritariamente por ARβ (11).
3
Lands et al. (12), em 1967, propuseram uma subdivisão para os ARβ, classificando-os em β1 e β2 de acordo com a potência relativa de catecolaminas e sua
afinidade por antagonistas. O AR β1, identificado nos tecidos cardíaco e adiposo de
mamíferos, a ordem de potência seria ISO>Adr =NA, enquanto que em AR β2, localizados
na musculatura lisa da traquéia e de alguns vasos sanguíneos, a ordem de potência seria ISO>Adr>NA. Àquela época, acreditava-se que houvesse somente um subtipo de receptor em cada órgão. Mas, em 1972, Carlsson et al.(13), apresentaram evidência de que ambos os subtipos de ARβ coexistiam no coração de gato.
No átrio direito de rato, ARβ1 e β2 perfazem 67% e 33%, respectivamente, da
população de ARβ (14), proporções semelhantes às encontradas no átrio direito de coração humano (15). Há também estudos que evidenciam a existência de ARβ3 no coração
(16,17,18), porém catecolaminas têm menor potência nestes receptores do que nos demais subtipos, e o efeito cronotrópico da estimulação seletiva de ARβ3 cardíacos é modesto (19).
Assim como os receptores colinérgicos m2, os AR β1 eβ2 são acoplados a
proteínas G, cuja conformação é alterada em resposta à ocupação do receptor por um agonista. Esta alteração se traduz em sua ligação com trifosfato de guanosina (GTP) e dissociação de sua subunidade . Há diferentes isoformas desta subunidade: AR β1 eβ2 se
acoplam com proteínas G que contêm a subunidade s (Gs), enquanto ARβ2, além de Gs,
também pode, em certas circunstâncias, se acoplar a proteínas G contendo i (Gi), de modo
semelhante a receptores m2 (Figura 1.1). Ambos os tipos de subunidade migram e
interagem com a enzima AC, estimulando (s) ou inibindo (i) sua atividade catalítica, i.e.,
a síntese de cAMP. Este nucleotídeo atua como um mensageiro intracelular difusível, capaz de interagir com a subunidade regulatória da PKA, levando à ativação da enzima. Como já mencionado, a PKA fosforila diversos substratos, modificando assim sua função. Além disso, a interação do cAMP com os canais HCN modifica a dependência de tensão de sua ativação, de modo que a abertura dos canais passa a ocorrer a valores mais negativos de Vm, e If se desenvolve mais precocemente, o que aumenta a taxa de despolarização
diastólica das células do NSA (20). De um modo geral, o efeito cronotrópico positivo das catecolaminas resulta de modificações das propriedades biofísicas dos canais iônicos que medeiam correntes que participam da geração do automatismo (21, 22). Além disso, há evidência de que o aumento da mobilização de Ca2+ em resposta à estimulação β
4
Figura 1.1: Via de transdução β adrenérgica (Adr β1 e β2) e colinérgica muscarínica (receptor m2). A
ligação do agonista (catecolamina - CA) ao receptor adrenérgico β1 acoplado à proteína G
estimulatória (Gs) ativa a adenilato ciclase (AC), promovendo o aumento da síntese de cAMP, que
por sua vez age diretamente no canal HCN e se liga à subunidade regulatória da quinase de proteína dependente de cAMP (PKA), ativando-a. A PKA fosforila (P) diversos substratos, entre eles os canais reponsáveis pela corrente de cálcio tipo L (ICaL) e corrente de potássio (IK). O agonista acetilcolina
(ACh) se liga ao receptor muscarínico do tipo 2 (m2) acoplado à proteína G inibitória (Gi), que inibe
a ação da AC levando à diminuição dos níveis citosólicos de cAMP. Receptores adrenérgicos β2 se
acoplam a Gs, mas podem se acoplar também a Gi.
A ação das catecolaminas é limitada pela degradação do cAMP pelas fosfodiesterases (PDE) e pela remoção de grupos fosfato incorporados aos diversos substratos da PKA por ação das fosfatases (25, 26). Além destes mecanism os, contribui para terminar a ação das catecolaminas a sua remoção do meio extracelular por meio dos sistemas de captação 1 e 2 (neuronal e extraneuronal, respectivamente). Estes transportadores transferem as catecolaminas para o interior da célula, onde elas são degradadas por enzimas específicas, e diferem entre si em sua localização e cinética (27, 28, 29). O transportador localizado nas membranas neuronais (transportador de noradrenalina, NET) tem atividade dependente do gradiente eletroquímico transmem brana do Na+, tem maior afinidade para NA do que Adr, e não transporta ISO (agonista sintético
em ARβ, não seletivo para subtipos). Após o transporte, o neurotransmissor é metabolizado por ação da monoamino-oxidase (MAO; 30, 31). O principal substrato para o transportador extraneuronal de monoaminas (EMT) é o ISO, e a Adr é captada para o interior de células não neuronais (inclusive células cardíacas) preferencialmente à NA, onde as catecolaminas são inativadas pela enzima catecol-O-metil-transferase (COMT; 32, 33).
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Importantes ajustes circulatórios ocorrem ao nascimento, quando cessa a circulação feto-materno-placentária e os pulmões começam a funcionar. Esses ajustes causam não só a brusca ativação da circulação pelo circuito pulmonar, como também o fechamento funcional do forâmen oval no septo interatrial e do ducto arterioso, o qual, no feto, desvia a maior parte do sangue ejetado pelo ventrículo direito para a aorta. Por outro lado, a substituição do leito placentário de baixa resistência e de shunts vasculares por circuitos de resistência mais alta, bem como o rápido crescimento corporal no período neonatal, implica em progressivo aumento da carga circulatória e dem anda metabólica sistêmica (34, 35). Como resultado, maiores valores de pressão intraventricular são requeridos para o bombeamento adequado do sangue, o que, em parte, é obtido por meio do maior retorno venoso após o nascimento. Ocorre, então, hipertrofia ventricular, mais pronunciada no ventrículo esquerdo, cujo bombeamento se dá contra uma resistência vascular que aumenta marcante e progressivamente (36, 37). Além disso, outras funções passam a desempenhar um importante papel na sobrevivência, como a alimentação ativa e digestão, o aumento da motricidade decorrente do desenvolvimento neuro-muscular, e a termogênese, que requerem alterações circulatórias de suporte. O aumento da demanda circulatória e metabólica é acompanhado por um pico perinatal da concentração de catecolaminas circulantes, que é de grande importância para a realização dos ajustes necessários (38).
Durante o desenvolvimento pós-natal de mamíferos, há profundas alterações morfofuncionais nos miócitos cardíacos. Pouco tempo após o nascimento, o ciclo de proliferação celular é fortemente suprimido, e ocorre diferenciação terminal dos miócitos, caracterizada por alongamento das células, grande aumento do volume celular, desenvolvimento organelar e modificações da citoarquitetura. Alterações ontogenéticas da transcrição de diversos genes levam a variações na abundância e tipo de isoformas de proteínas, o que causa mudanças nas funções elétrica, contrátil e metabólica de células cardíacas (39, 40, 41). Em ratos, por exemplo, o volume celular dos miócitos ventriculares aumenta cerca de 25 vezes e o número de miócitos cresce em 3 a 4 vezes do nascimento até 2 meses de idade (42, 43). Dowell (44) observou que a atividade da AC e da guanilato ciclase, assim como os níveis de monofosfato cíclico de guanosina (cGMP), é maior em corações de ratos neonatos do que de adultos, porém os níveis de cAMP são similares.
Além das mudanças ontogenéticas inerentes ao tecido cardíaco, há também diferenças relativas à inervação regulatória do coração no período pós -natal. No rato, a maturação da inervação simpática e parassimpática do coração só se completa após o
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nascimento, sendo que a segunda precede a primeira (45, 46, 47). A inervação adrenérgica cardíaca no rato só atinge um padrão semelhante ao adulto em torno da 2ª ou 3ª semana de vida pós-natal (48, 49). Os ARα e β estão presentes no miocárdio de ratos ao nascimento, porém a resposta inotrópica positiva à NA ou ao ISO ainda é menor que em adultos, atingindo valores próximos aos de adultos entre a segunda e terceira semanas de vida (46, 50). A estimulação catecolaminérgica tem grande relevância para a manutenção da frequência cardíaca basal logo após o nascimento (34, 51). Shigenobu et al. (52) mostraram que o átrio direito do rato só responde à tiramina (TIR, agonista simpatomimético de ação indireta que libera a NA presente nas vesículas das terminações nervosas) a partir do 17º dia de vida fetal, o que indica que estoques mobilizáveis de catecolaminas já estão presentes antes do nascimento.
Além da inervação adrenérgica cardíaca ser imatura ao nascimento, também têm sido descritas alterações dependentes da idade no desenvolvimento do sistema de recepção-transdução da sinalização adrenérgica nas células cardíacas, que acontece, em grande parte, após o nascimento (38, 49). Embora haja um número considerável de estudos abordando células miocárdicas, há pouca informação com relação à função cronotrópica. A maior parte dos dados disponíveis na literatura limita-se à avaliação da resposta cronotrópica a catecolaminas, e os resultados encontrados são bastante discordantes. Por exemplo, Nukari-Siltovuori (53) encontrou uma redução na resposta cronotrópica máxima tanto ao ISO quanto à NA em átrio direitos de ratos durante os 9 primeiros dias de idade, em comparação com átrios de ratos adultos. Vlk (54) também relatou aumento com o amadurecimento da resposta cronotrópica positiva à estimulação química e elétrica das terminações que inervam o NSA. Já Standen (55) observou que a resposta cronotrópica máxima à NA, ISO e TIR em átrios direitos de ratos neonatos e adultos não foi estatisticamente diferente. Alguns autores descrevem supersensibilidade às catecolaminas em células sinoatriais isoladas de coelho (56) e cultura de células sinoatriais de rato (57) imaturos. Por outro lado, Seidler & Slotkin (58) relataram subsensibilidade ao efeito cronotrópico do ISO in vivo, em ratos de 4 a 11 dias em comparação a ratos adultos, sem diferença da resposta cronotrópica máxima.
Como se pode ver, embora os estudos prévios citados tenham avaliado a reatividade cronotrópica de átrios direitos a agonistas adrenérgicos, os resultados relatados são consideravelmente controversos, e, na maior parte dos trabalhos, não foram analisados possíveis fatores que pudessem ser responsáveis pelas diferenças observadas, sejam eles pós-juncionais ou decorrentes de variações em mecanismos de remoção de catecolaminas
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da biofase. Sendo assim, o presente trabalho visa estudar a resposta cronotrópica atrial do rato à estimulação de AR, que medeiam esta resposta no NSA, bem como mecanismos envolvidos na geração dessa resposta. Um conhecimento melhor sobre a regulação adrenérgica da frequência cardíaca durante o desenvolvimento pós-natal pode contribuir para melhor entendimento da eficiência dos mecanismos fisiológicos de regulação do débito cardíaco no neonato, bem como das consequências de terapias farmacológicas relacionadas ao sistema de transdução -adrenérgica aplicadas no período perinatal.
8 2. OBJETIVOS
Objetivo geral:
Analisar a reatividade cronotrópica a agonistas da via -adrenérgica em átrios direitos isolados de ratos imaturos, estabelecendo comparação com padrões de resposta em animais adultos e buscando melhor entendimento da regulação adrenérgica dessa função no indivíduo em desenvolvimento.
Objetivos específicos:
a) Analisar eficácia aparente e potência de agonistas de AR;
b) investigar a influência de mecanismos de remoção de catecolaminas sobre a sensibilidade do tecido a agonistas;
c) investigar componentes da cascata de sinalização -adrenégica distais aos AR;
d) avaliar o nível de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) para proteínas envolvidas direta ou indiretamente na via de sinalização -adrenérgica.
9 3. MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos farmacológicos foram realizados no Laboratório de Pesquisa Cardiovascular do Centro de Engenharia Biomédica (CEB) da UNICAMP, e a análise de biologia molecular foi conduzida no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), Campinas, SP.
3.1 – Animais
Foram utilizados ratos Wistar nascidos no Biotério do CEB, bem como provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP, mantidos sob temperatura e ciclo de iluminação (12 h) controlados. Os animais nascidos no CEB foram obtidos por acasalamento programado, e a idade do animal foi contada a partir do dia de seu nascimento (dia zero). Os animais com idade até 23 dias permaneceram com as mães até o momento de sua utilização. Os animais adultos tiveram livre acesso a água e ração. Foi realizada eutanásia por exsanguinação após decapitação (até 23 dias de idade) ou após concussão cerebral ou anestesia profunda por inalação de isoflurano (adultos).
Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Instituto de Biologia da UNICAMP (protocolos no.1182-1, 1515-1, 1735-1(A), 1737-1515-1, 2086-1(A), 2088-1(D), 2490-1(E), 2491-1(A), 2587-1(D), 2588-1(A), 2941-1(B), 2942-1(C) e 3009-1(B).
3.2 - Soluções e Fármacos
As soluções foram preparadas com água ultrafiltrada tipo I (Easypure UF, Barnstead International, Dubuque, IA, EUA) com resistividade > 18 MΩ. Os sais utilizados foram de padrão analítico.
Os experimentos farmacológicos foram realizados com preparações atriais incubadas em solução de Krebs-Henseleit (KH), com a seguinte composição: 115 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, 11 mM glicose,
pH 7.4 sob borbulhamento com 95% O2 e 5% CO2 (carbogênio). Durante o tratamento com
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composição similar à solução KH, exceto pela remoção de NaHCO3 e adição de 60 M
glutathiona (GLU) e 2 mM ácido ascórbico, para minimizar a oxidação do fármaco. As soluções estoques de catecolaminas (cloridrato de isoproterenol, ISO; e bitartarato de noradrenalina, NA) foram preparadas na concentração de 20 mM em água ultrapura à qual foram adicionados 2 mM ácido ascórbico e armazenadas a -20 ºC por, no máximo, 2 semanas. Também foi utilizada água ultrapura como solvente das soluções estoques de tiramina (TIR, 20 mM), hidrobrometo de 6-OHDA (10 mM), GLU (10 mM), cloridrato de fenoxibenzamina (PBZ, 10 mM), desipramina (DMI, 5 mM) e ICI118,551 (ICI, 10 mM). Soluções armazenadas a -20 ºC, e a solução de 6-OHDA pelo prazo máximo de 1 semana. Usou-se dimetilsulfóxido como solvente das soluções estoques de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX, 10 mM) e forskolin (FSK, 20 mM), a primeira mantida a -20 ºC, e a segunda, a 4º C. As soluções estoques foram diluídas imediatamente antes do uso, e as soluções de trabalho foram mantidas em banho de gelo.
Exceto por FSK e PBZ, que foram obtidos da Calbiochem (San Diego, CA, EUA), os outros fármacos foram adquiridos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
3.3. Átrio Direito Isolado
O coração foi dissecado e imerso em solução KH carbogenada para remoção do excesso de sangue, e, a seguir, colocado em uma placa de Petri contendo a mesma solução. O átrio direito foi dissecado e montado em banho para órgão isolado contendo solução KH, mantida a 36,5 ± 0,5º C e gaseificada com carbogênio. Em ratos com idade entre 0 e 5 dias, ambos os átrios foram utilizados para permitir um registro confiável das contrações.
A preparação foi presa pelas extremidades da aurícula, por meio de um gancho de aço inoxidável fixado a um suporte, e, por meio de um gancho ligado a um fio de algodão, a um transdutor isométrico de força (MLT0202, Panlab, Cornellã, BCN, Espanha) acoplado a um amplificador e ao sistema PowerLab 400™ de aquisição de dados (software versão 4.0, AD Instruments, Castle Hill, Austrália). A frequência espontânea da preparação (FE) foi determinada a partir do registro das contrações (59). A pré-carga aplicada variou de 50 (neonatos) a 500 mgf (adultos), dependendo da massa da preparação. Antes do início do experimento, observou-se um período de estabilização de 30-45 min.
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3.4. Curvas Concentração-Efeito (CCE) aos Agonistas
Após o período de estabilização ou pré-tratamento, foram determinadas CCEs por aumento cumulativo e logarítmico da concentração molar dos agonistas (NA, ISO, TIR, FSK e IBMX). A cada concentração, aguardou-se pelo menos 2 min para estabilização da resposta.
A relação entre a resposta cronotrópica (R, i.e., incremento da FE), e o logaritmo da concentração molar do agonista ([A]) foi descrita por:
R= 𝑀𝑖𝑛+(𝑀𝑎𝑥−𝑀𝑖𝑛)
1 + 10 (log EC50 – [A]) 𝑛
(Eq.1)
onde Min e Max são os valores de FE basal medido antes da adição do agonista, e máximo na presença de alta concentração do agonista, respectivamente. A diferença entre Max e Min foi considerada como a resposta máxima (Rmax) da preparação;
EC50 é o valor de [A] que produz uma resposta igual a 50% de Rmax; e n é o coeficiente de
Hill, considerado igual a 1, o que resultou em ajuste não linear satisfatório (R2> 0,95) em
todos os casos.
3.5. Pré-Tratamento In Vitro para Desnervação e Bloqueio dos Sistemas Neuronal e Extraneuronal de Captação de Catecolaminas
Para se investigar o efeito do bloqueio dos sistemas de captação de catecolaminas, idealmente deve-se obter 2 CCEs, uma na ausência e outra na presença do bloqueador. No entanto, em preparações de animais imaturos, foi observado que, mesmo após um longo período de lavagem após a primeira CCE, a FE permanecia elevada. Em apenas poucos casos (e.g., quando NA foi o agonista) foi possível utilizar a mesma preparação, embora o valor basal de FE da segunda CCE ainda tenha sido superior àquele registrado antes do início da primeira. Neste caso, após a obtenção da primeira CCE, a preparação foi lavada repetidas vezes e deixada se recuperar por 1 h antes do início do pré-tratamento que precedeu o bloqueio dos sistemas de captação. Nas demais
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preparações (e.g., quando ISO foi o agonista), o pré-tratamento foi iniciado logo após o período de estabilização inicial.
Como o átrio isolado contém terminações nervosas adrenérgicas, a liberação espontânea de catecolaminas na presença de bloqueadores dos sistemas de captação, presentes nas membranas neuronais e extraneuronais, pode elevar consideravelmente a concentração desses neurotransmissores na região juncional, causando considerável aumento da FE basal. Para minimizar este problema, pode-se proceder à desnervação adrenérgica previamente ao tratamento com esses bloqueadores (59, 60, 61). Para este fim, utilizou-se o tratamento in vitro com 6-OHDA, que é captado pelas terminações adrenérgicas e posteriormente causa depleção do neurotransmissor das terminações (62).
Os átrios foram incubados por 10 min com a solução de desnervação contendo 36 M 6-OHDA (63). Após a remoção do fármaco, a preparação foi lavada a cada 15 minutos com solução KH por 1 h. A seguir, procedeu-se ao tratamento com 10 M PBZ por 15 min, para bloqueio irreversível de adrenoceptores α, receptores colinérgicos muscarínicos e serotoninérgicos, e do sistema de captação extraneuronal de catecolaminas, seguido de repetida lavagem da preparação com KH por 30 min. Quando o agonista foi ISO, a CCE foi determinada após estabilização da FE, o que ocorreu cerca de 15 min após a última lavagem. Quando NA foi usada como agonista, foi necessário também bloquear o sistema de captação neuronal, sua principal via de remoção da biofase. Para isto 0,1 M DMI foram adicionados ao banho após estabilização da FE, e 15 min depois, procedeu-se à adição de NA, como descrito em Bassani e Bassani (64).
3.6. Bloqueio de Adrenoceptores 2
Em átrios direitos de ratos de 0-2 dias, 5-7 dias e adultos, foram obtidas CCEs ao ISO na presença de 0.1 M do antagonista seletivo de adrenoceptores 2 ICI (65), que
foi adicionado ao meio de incubação 40 min antes do início da adição do agonista.
3.7. Determinação dos Níveis de Ácido Ribonucleico Mensageiro (mRNA) por Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR)
Foram determinados os níveis relativos dos transcritos de mRNA para as seguintes proteínas: ARβ1 (ADRB1), ARβ2 (ADRB2), sub-unidade αs da proteína G
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estimulatória da adenilato ciclase (GNAS), sub-unidade αi da proteína G inibitória da
adenilato ciclase (RGi), isoforma 1 da adenilato ciclase (ADCY1) e transportador extraneuronal de monoaminas (EMT). Os primers utilizados (Tabela 3.1) foram projetados pelo Dr. Alisson Campos Cardoso (LNBio) com o programa: Primer Express (Perkin Elmer, Life Sciences), e sintetizados pela Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, EUA).
Átrios direitos de ratos de 0-2 dias, 5-7 dias e adultos foram dissecados, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e mantidos a -80° C até o momento da extração de ácido ribonucleico (RNA) total, descrita a seguir. Foram analisadas 5-6 amostras em cada grupo. Cada amostra consistiu de um pool de 10 átrios para o grupo neonato (0-2 dias), um pool de 8 átrios para o grupo de 1 semana de idade, e 1 átrio direito para o grupo adulto.
Tabela 3.1. Sequência de nucleotídeos dos primers utilizados para avaliar o nível de expressão genética de gliceraldeído-3-fos fato desidrogenase (GAPDH), receptor adrenérgico β1 (ADRB1),
receptor adrenérgico β2 (ADRB2), sub-unidade αs da proteína G estimulatória de adenilato ciclase
(GNAS), sub-unidade αi da proteína G inibitória da adenilato ciclase (RGi), isoforma 1 da adenilat o
ciclase (ADCY1) e transportador extraneuronal de monoaminas (EMT). Em todos os casos, as sequências foram projetadas a partir daquelas relatadas para genes em Rattus norvergicus.NCB I:
National Center For Biotechnology Information, F: forward. R: reverse.
Primer NCBI - Sequência genética de
referência
Sequência
GAPDH NM_017008.3 (F) 5’- GGC ATT GCT CTC AAT GAC AA -3’
(R) 5’- AGG GTG CAG GGA ACT TTA TT -3’
ADRB1 NM_012701.1 (F) 5’- GCATCATCATGGGTGTGTTCA-3’ (R) 5’- CCAGCCAGTTGAAGAAGACG-3’ ADRB2 NM_012492.2 (F) 5’-GCAGTGGATCGCTATGTTGC-3’ (R) 5’-AGGTAAGGCCCGACACAATC-3’ GNAS NM_021845.5 (F) 5’- AGCAAGAACCTTTGGAAGCC-3’ (R) 5’- ATGGGCTCATTGTTAGACGG-3’ RGi NM_031035.3 (F) 5’- ACGTCATCATCAAGAACAACCT-3’ (R) 5’- TCCTCACAGGTAGTGGGGAG-3’ ADCY1 NM_001107239.1 (F) 5’-AAGCATGTTGAACGGGAACA-3’ (R) 5’-AGCCCAAATAAGGTAGCCAG-3’ EMT NM_019230.1 (F) 5’- CCCAACGACATTACGGAACT-3’ (R) 5’- TCAGAGGCAGTTCTAGCCAT-3’
O tecido foi pulverizado em nitrogênio líquido, e amostras de aproximadamente 50mg do tecido foram homogeneizadas em 1 ml do reagente TRIzol (Invitrogen, Life Technologies Corporation, Carlsbad,CA, EUA). A seguir, o material foi incubado por 5 min à temperatura ambiente, e posteriormente centrifugado por 10 min a 12000 rpm a 4º C. O
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sobrenadante foi transferido para outro tubo, ao qual foram acrescentados 0,2 ml de clorofórmio, seguindo-se incubação por mais 5 min à temperatura ambiente, e centrifugação por 10 min a 12000 rpm a 4ºC. A fase aquosa resultante deste processo foi transferida para outro tubo, ao qual se adicionou 0,5 ml de álcool isopropílico. As amostras foram novamente incubadas à temperatura ambiente por 10 min e centrifugadas por 10 min a 12000 rpm e 4 ˚C. Após remoção do sobrenadante, o pellet de RNA foi lavado com 1 ml de etanol 75%. Esta suspensão foi centrifugada por 5 min a 7500 rpm e 4 ˚C. Após secagem do pellet, o RNA foi ressuspendido em água livre de RNAse e as amostras foram incubadas por 10 min a 55-60 ºC.
As cadeias de ácido desoxirribonucleico complementares às de RNA da amostra (DNA complementar ou cDNA) foram sintetizadas a partir do RNA total por transcrição reversa com a enzima SuperScript II (Invitrogen, Life Technologies Carlsbad, CA, EUA). Foi adicionado, para cada 2 μg de RNA, 1 μl de primer Oligo(dT) (Invitrogen, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EUA), e o volume foi completado para 12 μl com água ultra-pura estéril. As amostras foram incubadas a 70 ˚C por 5 min, e, em seguida, resfriadas em gelo. Foram então adicionados os seguintes reagentes: 4 μl 5X Reaction Buffer; 2 μl ditiotreitol (DTT) 0,1 M; 1 μl dnTPmix 10 mM; 1 μl SuperScript II. As amostras foram incubadas por 120 min a 42º C. A enzima foi inativada por aquecimento das amostras a 70 ˚C por 15 min.
Para realizar os experimentos de qRT-PCR, foi utilizado o indicador SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). Cada tubo de amostra (volume final de 12 μl) continha 18 ng de cDNA, cada primer específico a uma concentração de 400 nM (exceto para o primer ADRB2 cuja concentração utilizada foi de 600 nM). Cada amostra foi analisada em triplicata em um sistema MX3000P (Stratagene, La Jolla, CA, EUA). As condições da PCR foram: 95 º C por 10 min (1 ciclo); 95 ºC durante 30 s, 55-57 º C por 45 s e 72 ºC durante 30 s (35 ciclos); 95º C por 1 min; 55º C por 30 s e 95º C durante 30 s (1 ciclo). Os resultados foram analisados pelo método CT comparativo (User Bulletin n º 2, Perkin Elmer Life Sciences). Os valores das leituras obtidas para os diferentes produtos genéticos foram comparados com os valores para o GAPDH determinados na mesma amostra (controle interno) e uma das amostras controle (Adulto 1) foi usada como normalizador.
Todo o procedimento para a realização desses experimentos foi executado sob a orientação e acompanhamento da Dra. Ana Helena Macedo Pereira, do LNBio.
15 3.8. Análise Estatística
Os dados estão apresentados como médias ± erro-padrão da média (EPM). Os valores de EC50 foram convertidos para seu logaritmo negativo (pD2), que apresenta
distribuição normal (66). Para comparação estatística, utilizou-se análise de variância mono ou bifatorial para amostras pareadas ou não pareadas, seguida de teste de Bonferroni para comparação das médias. Significância estatística foi considerada para valores de p< 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software Prism versão 4 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).
16 4. RESULTADOS
4.1. Resposta Cronotrópica Atrial à Tiramina
A TIR é um agonista simpatomimético de ação indireta, isto é, ela induz a liberação dos estoques endógenos de catecolaminas, principalmente NA (67). A inervação adrenérgica cardíaca é imatura ao nascimento e atinge o padrão apresentado por ratos adultos por volta da 2ª ou 3ª semana de vida pós-natal (68, 69). Portanto, a resposta a este agonista pode ser um indicador dos estoques endógenos de catecolaminas. Os dados das CCEs à TIR estão apresentados na Tabela 4.1 e Figura 4.1.
Tabela 4.1: Resposta cronotrópica à tiramina obtida em átrios direitos isolados de ratos imaturos e
adultos. Os valores estão apresentados como média ± erro padrão da média. O número de preparações estudadas (n) está apresentado entre parênteses. Fin: valor da frequência espontânea, em batimentos por minuto (bpm), antes da aplicação do agonista; Rmax: resposta máxima ao agonista; pD2: logaritmo negativo da concentração molar do agonista que evoca uma resposta igual
à metade de Rmax. Todos os parâmetros foram obtidos por ajuste não linear. * p< 0,05 vs. grupo adulto (teste de Bonferroni).
Idade n Fin (bpm) Rmax (bpm) pD2
0-2 dias 6 268 + 8* 139 + 14* 6,032 + 0,177* 5-7 dias 11 282 + 13* 167 + 7 5,755 + 0,118* Adulto 5 210 + 7 208 + 28 5,042 + 0,122 -7 -6 -5 -4 0 50 100 150 200 0-2 dias 5-7 dias adulto A log [TYR] (M) R e s p o s ta Cr o n o tr ó p ic a ( b p m ) -7 -6 -5 -4 0 20 40 60 80 100 B log [TYR] (M) R e s p o s ta Cr o n o tr ó p ic a (% R M a x)
Figura 4.1: Resposta cronotrópica à tiramina (TIR), obtida em átrios direitos isolados de ratos
imaturos e adultos. A: Resposta expressa em batimentos por minuto (bpm); B: Resposta expressa como porcentagem da resposta máxima (% Rmax), para melhor evidenciar as variações de sensibilidade. Os pontos indicam as médias e erro padrão. Os parâmetros das curvas estão apresentados na Tabela 4.1. Observe o gradual aumento da resposta máxima ao agonista com o amadurecimento.
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Neste grupo, a Fin foi significativamente maior em átrio direito de ratos imaturos (p<0.001). No entanto, efeitos dependentes da idade foram observados para Rmax (p<0.02) e pD2 (p<0.001). A Rmax sofreu progressivo aumento com o amadurecimento do animal, e,
em átrio direito de ratos de 0-2 dias, correspondeu a 67% da Rmax apresentada no grupo adulto (Tabela 4.1 e Figura 4.1A). A sensibilidade ao agonista, avaliada pelo valor pD2, por
outro lado, diminuiu com o amadurecimento do animal (Tabela 4.1 e Figura 4.1B).
4.2. Resposta Cronotrópica Atrial às Catecolaminas
4.2.1 – Resposta à Noradrenalina e Captação Neuronal de Catecolaminas Os resultados apresentados na Tabela 4.2 e Figura 4.2 apontam a presença de modificações ontogenéticas da reatividade cronotrópica do átrio direito de rato à NA, um agonista que atua preferencialmente em ARα e β1. Observou-se que não houve variação
significativa da Fin com a idade (p>0.60, análise de variância monofatorial). No entanto, efeitos dependentes da idade foram observados para Rmax (p<0.05) e pD2 (p< 0.001).
Tabela 4.2: Resposta cronotrópica à noradrenalina obtida em átrios direitos isolados de ratos
imaturos e adultos. A apresentação dos dados, unidades e abreviaturas são os mesmos da Tabela 4.1. * p< 0,05 vs. grupo adulto (teste de Bonferroni).
Idade n Fin (bpm) Rmax (bpm) pD2
0-2 dias 7 240 +13 94+16 * 7,229 +0,089 * 3-4 dias 7 217 +14 122 +14 7,415 + 0,141 * 5-7 dias 7 236 + 20 166 +15 6,915 +0,086 13-16 dias 5 230 +15 156 + 22 7.090 + 0,089 19-23 dias 6 256 +13 177 +26 6,778 + 0,184 Adulto 12 232 +10 174 +15 6,692 + 0,097
A Rmax à NA foi significativamente menor no grupo 0-2 dias, correspondendo a 55% da Rmax do grupo adulto, como mostrado na Figura 4.2C. Já o pD2 foi
significativamente maior em átrios de animais imaturos, indicando supersensibilidade à NA (deslocamento da CCE à esquerda). Como pode ser observado na Figura 4.2D, os valores pD2 foram reduzidos progressivamente com o amadurecimento.
18 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 50 100 150 200 A Log [NA] (M) R e s p o s ta C ro n o tr ó p ic a ( b p m ) -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 20 40 60 80 100 0-2 dias 5-7 dias Adulto B Log [NA] (M) R e s p o s ta C ro n o tr ó p ic a ( % R m a x) 0-2 3-4 5-7 13-16 19-23 adulto 0 50 100 150 200 250 C Idades (dias) R m a x 0-2 3-4 5-7 13-16 19-23 adulto 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 D Idades (dias) pD 2
Figura 4.2: Resposta cronotrópica à noradrenalina (NA) obtidas em átrios direitos isolados de ratos
imaturos e adultos. A: Resposta expressa em batimentos por minuto (bpm); B: Resposta expressa como porcentagem da resposta máxima (%Rmax). C: Valores de Rmax à NA nas diferentes idades. D: Valores de pD2 da NA nas diferentes idades. Os pontos e colunas indicam as médias ± erro
padrão. Os parâmetros das curvas estão apresentados na Tabela 4.2.
A atuação da captação neuronal, ou captação 1 (por transportador de catecolaminas presente na membrana das terminações adrenérgicas) pode reduzir a sensibilidade atrial a agonistas que sejam seus substratos pois atua removendo-os da biofase, reduzindo assim a sua disponibilidade para os receptores pós-juncionais. A NA é o principal substrato deste transportador (70). Bassani & De Moraes (59, 60) observaram que a inibição da captação neuronal é capaz de aumentar significativamente a sensibilidade à NA em átrios direitos isolados de ratos adultos. Como há relatos de subdesenvolvimento da inervação adrenérgica cardíaca em ratos nas primeiras semanas após o nascimento (68, 71, 72), uma possível explicação para o aumento da sensibilidade à NA em átrio direito de ratos neonatos seria a baixa taxa de captação do agonista pelo transportador neuronal.
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Para explorar essa hipótese, os experimentos com NA foram repetidos, porém, após a determinação da primeira CCE, a preparação foi submetida ao tratamento in vitro com 6-OHDA e PBZ, e, a seguir, foi determinada a segunda CCE à NA na presença de DMI, que inibe o transportador neuronal. Como pode ser visto na Tabela 4.3, o tratamento in vitro aumentou significativamente a Fin (p<0,001, análise de variância) em todos os grupos etários, porém não houve efeito significativo da influência da idade e da interação idade x tratamento (p> 0,65). Não houve alteração estatisticamente significativa na Rmax após o tratamento (p>0,07).
Tabela 4.3: Resposta cronotrópica à noradrenalina em átrios direitos isolados de ratos imaturos e
adultos, antes (controle) e após desnervação adrenérgica seguida de inibição dos sistemas de captação neuronal e extraneuronal com fenoxibenzamina e desipramina (DMI), respectivament e. Apresentação dos dados, unidades e abreviaturas são os mesmos da tabela 4.1, exceto Δ pD2, que
é a diferença entre os valores pD2 depois e antes do bloqueio da captação de catecolaminas. *p<
0.05 vs. grupo adulto; # p< 0.05 para controle vs. DMI no mesmo grupo etário. (teste de Bonferroni
após análise de variância bifatorial para amostras pareadas).
IDADE n Fin (bpm) Rmax (bpm) pD2 Δ pD2
Controle
0-2 dias 6 242 ± 13 133 ± 8 * 7.446 ± 0.114* - 5-7 dias 5 232 ± 25 122 ± 11* 6.937 ± 0.159 - Adulto 5 226 ± 13 194 ± 9 6.728 ± 0.099 -
Bloqueio da Captação Neuronal (DMI)
0-2 dias 6 300 ± 10 # 117 ± 9 7.868 ± 0.142 0.422 ± 0.076
5-7 dias 5 319 ± 17 # 130 ± 30 7.645 ± 0.231 # 0.708 ± 0.371
Adulto 5 298 ± 15 # 133 ± 15 7.825 ± 0.156 # 1.098 ± 0.238
O valor pD2 da NA foi afetado tanto pela idade (p<0,05), quanto pelo bloqueio
da captação de catecolaminas (p<0,001). O impacto do bloqueio da captação neuronal pode ser avaliado quantitativamente pela diferença dos valores pD2 pós e pré-tratamento
(Δ pD2) apresentados na Tabela 4.3. Sabendo que o valor pD2 corresponde ao logaritmo
negativo da concentração do agonista que evoca 50% da resposta máxima (EC50), a partir
dos valores de ΔpD2, pode-se estimar que a inibição da captação neuronal causou uma
redução média nos valores de Ec50 de 2,6, 5,1 e 12,5 vezes para 0-2 dias, 5-7 dias e adulto,
respectivamente. Portanto, o aumento da sensibilidade à NA causado por este bloqueio foi tanto maior quanto maior a idade de animal (Figura 4.3A-C). Nota-se também que após o
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tratamento com DMI, a sensibilidade à NA não foi diferente nos 3 grupos estudados (Figura 4.3 D). 0-2 dias -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100 controle DMI log [NA] (M) R e s p o s ta c ro n o tr ó p ic a (% d e R m a x) 5-7 dias -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100 controle DMI log [NA] (M) R e s p o s ta c ro n o tr ó p ic a (% d e R m a x) Adulto -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100 controle DMI log [NA] (M) R e s p o s ta c ro n o tr ó p ic a (% d e R m a x) DMI -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100 adulto 0-2 dias 5-7 dias log [NA] R e s p o s ta c ro n o tr ó p ic a (% d e R m a x)
A
B
C
D
Figura 4.3: Resposta cronotrópica à noradrenalina (NA), obtidas em átrios direitos isolados de ratos
de 0-2 dias (A), 5-7 dias (B) e adultos (C) antes e depois bloqueio da captação neuronal com desipramina (DMI). D: curvas após o bloqueio da captação neuronal em todas as idades. A resposta foi expressa como porcentagem da resposta máxima (%Rmax), para melhor evidenciar as variações de sensibilidade. Os pontos indicam as médias ± erro padrão. Os parâmetros das curvas estão apresentados na tabela 4.3.
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4.2.2 – Resposta ao Isoproterenol e Captação Extraneuronal de Catecolaminas
Ao utilizar o agonista sintético ISO, que atua apenas em ARβ, sem seletividade para seus subtipos, observou-se que a Fin e Rmax não foram afetadas pela idade (p> 0.106). Portanto, não ocorreu redução de Rmax ao ISO em átrios de neonatos, como observado na resposta à NA. Quanto à sensibilidade ao ISO, o valor pD2 foi afetado pela
idade (p< 0.02), porém de maneira “oscilatória” e não monotônica, ao contrário do observado para a NA, e não foram detectadas diferenças significativas entre as médias com o teste post-hoc de Bonferroni (Tabela 4.4 e Figura 4.4).
Tabela 4.4: Resposta cronotrópica ao isoproterenol obtida em átrios direitos isolados de ratos
imaturos e adultos. Apresentação dos dados, unidades e abreviaturas são os mesmos que na Tabela 4.1. *p< 0.05 vs. grupo adulto (teste de Bonferroni).
IDADE n Fin (bpm) Rmax (bpm) pD2
0-2 dias 8 217 ± 31 144 ± 15 8,494 ± 0,091 3-4 dias 8 201 ± 11 159 ± 7 8,117 ± 0,126 5-7 dias 13 247 ± 14 168 ± 13 8,468 ± 0,093 13-16 dias 5 215 ± 20 208 ± 27 8,110 ± 0,084 19-23 dias 6 227 ± 17 175 ± 20 8,636 ± 0,070 Adulto 13 267 ± 15 164 ± 13 8,494 ± 0,103
O ISO não é substrato para a captação neuronal (28), porém é removido da biofase por transportadores presentes em membranas não neuronais (29, 32). Como não há informação na literatura quanto a possíveis diferenças dependentes de idade na função da captação extra-neuronal de catecolaminas no átrio direito, foram determinadas CCEs ao ISO após o tratamento in vitro com 6-OHDA e inibição da captação extraneuronal por PBZ. Porém, não foi possível realizar estes experimentos de maneira pareada, como aconteceu com o estudo da influência do bloqueio da captação neuronal, uma vez que, após a primeira CCE ao ISO, os valores de Fin foram excessivamente altos especialmente nos grupos de ratos imaturos. Por esta razão, os dados referentes ao controle na Tabela 4.5 são os mesmos apresentados na Tabela 4.4.
22 -11 -10 -9 -8 -7 -6 0 50 100 150 200 5-7 dias 0-2 dias Adulto log [ISO](M) R e s p o s ta Cr o n o tr ó p ic a ( b p m ) -11 -10 -9 -8 -7 -6 0 20 40 60 80 100 log [ISO] (M) R e s p o s ta C ro n o tr ó p ic a ( % R m a x) 0-2 3-4 5-7 13-16 19-23 Adulto 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 Idades (dias) p D2 0-2 3-4 5-7 13-16 19-23 Adulto 0 50 100 150 200 250 Idades (dias) R m a x
Figura 4.4: Resposta cronotrópica ao isoproterenol (ISO) obtidas em átrios direitos isolados de ratos
imaturos e adultos. A: Resposta expressa em valores absolutos, batimentos por minuto (bpm); B: Resposta expressa como porcentagem da respectiva resposta máxima (%Rm ax) para melhor evidenciar as variações de sensibilidade. C: Valores de Rmax ao ISO nas diferentes idades. D: Valores de pD2 do ISO. Os pontos indicam as médias ± erro padrão. Os parâmetros das curvas estão apresentados na Tabela 4.4.
A Fin foi significativamente maior após o tratamento in vitro, especialmente em átrios de animais imaturos (p< 0,05 para interação idade x tratamento), como frequentemente observado neste estudo, mesmo sem a determinação prévia de CCE. A Rmax ao ISO foi reduzida pelo tratamento (p<0,001), de modo mais evidente em átrios isolados de ratos imaturos, possivelmente devido ao maior aumento de Fin nestes grupos. O valor pD2 do ISO sofreu influência significativa do tratamento com PBZ (p<0,05), bem
como da idade (p< 0,05), e houve interação significativa entre idade e tratamento in vitro (p<0,01).
Como pode ser observado na Figura 4.5, o bloqueio da captação extraneuronal causou desvio da CCE ao ISO apenas em preparações de animais adultos (painel C), enquanto nenhum efeito visível foi observado em átrios de animais imaturos (painéis A e B). Nota-se ainda, que após o bloqueio da captação extraneuronal, as preparações imaturas mostraram-se subsensíveis ao ISO em comparação àquelas do grupo adulto,
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como pode ser visto na Figura 4.5D, devido à ocorrência de um deslocamento à esquerda da curva referente ao grupo adulto após o tratamento com PBZ.
Tabela 4.5: Resposta cronotrópica ao isoproterenol em átrios direitos isolados de ratos imaturos e
adultos não sujeitos a tratamento in vitro (Controle) e após desnervação adrenérgica seguida de inibição do sistema de captação extraneuronal com fenoxibenzamina (PBZ). Apresentação dos dados, unidades e abreviaturas são os mesmos que na Tabela 4.1.* p< 0.05 vs. grupo adulto; # p<
0.05 vs. controle na mesma idade. (teste de Bonferroni após análise de variância bifatorial para amostras não pareadas).
IDADE n Fin (bpm) Rmax (bpm) pD2
Controle
0-2 dias 8 217 ± 31 145 ± 15 8,494 ± 0,091
5-7 dias 13 247 ± 14 168 ± 13 8,468 ± 0,093
Adulto 13 267 ± 15 164 ± 14 8,494 ± 0,103
Bloqueio da Captação Extraneuronal (PBZ)
0-2 dias 4 295 ± 13 # 92 ± 12 8,647 ± 0,226* 5-7 dias 7 357 ±6* # 119 ± 8 # 8,404 ± 0,083* Adulto 10 281 ± 6 139 ± 10 9,167 ± 0,096# 0-2 dias -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 0 20 40 60 80 100 controle PBZ A log [ISO] (M) Re s p o s ta Cr o n o tr ó p ic a (% RM a x) 5-7 dias -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 0 20 40 60 80 100 controle PBZ B log [ISO] (M) R e s p o s ta C ro n o tr ó p ic a (% R M a x ) Adulto -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 0 20 40 60 80 100 PBZ controle C log [ISO] (M) R e s p o s ta c ro n o tr ó p ic a (% R m a x) PBZ -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 0 20 40 60 80 100 0-2 dias 5-7 dias Adulto D log [ISO] (M) R e s p o s ta C ro n o tr ó p ic a (% R M a x )
Figura 4.5: Resposta cronotrópica ao isoproterenol (ISO), obtida em átrios direitos isolados de ratos
