1 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 3 2. OBJETIVOS ... 5 2.1. Geral ... 5 2.2. Específicos ... 5 3. REVISÃO DA LITERATURA ... 6 3.1. SIMBIOSE ECTOMICORRÍZICA ... 6 3.2. O EUCALIPTO ... 7 3.3. O GÊNERO Pisolithus ... 8 3.4. INOCULANTES ECTOMICORRÍZICOS ... 9 3.5. A TURFA ... 10
3.6. ATIVIDADE DA ÁGUA (Aw) ... 11
3.7. ISOTERMAS ... 12
3.8. COMPORTAMENTO DA SECAGEM ... 13
4. METODOLOGIA ... 15
4.1. MICRORGANISMO UTILIZADO ... 15
4.2. CARACTERIZAÇÃO DO SUBSTRATO COMERCIAL ... 15
4.2.1 EQUIPAMENTOS ... 15
4.2.2 MASSA SECA ... 15
4.2.3. MEDIDAS DE TEOR DE ÁGUA ... 16
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4.2.5. OBTENÇÃO DA ISOTERMA DE DESSORÇÃO... 17
4.2.6. CURVA DE SECAGEM ... 17
4.3. PRODUÇÃO DOS INOCULANTES ... 17
4.3.1. INOCULANTE EM SUBSTRATO TURFA-VERMICULITA-MEIO DE CULTURA... 17
4.3.2. INOCULANTE ENCAPSULADO EM GEL DE ALGINATO ... 18
4.3.4. SUBSTRATO COMERCIAL A BASE DE TURFA E FUNGO ECTOMICORRÍZICO ... 19
4.4. VIABILIDADE DO INOCULANTE NO SUBSTRATO ... 19
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 20 5.1. CARACTERIZACAO DO SUBSTRATO ... 20 5.1.1. TEOR DE UMIDADE ... 20 5.1.2. ATIVIDADE DA ÁGUA ... 20 5.1.3. ISOTERMAS DE DESSORÇÃO ... 21 5.1.4 CURVA DE SECAGEM ... 22
5.2 PRODUÇÕES DE INOCULANTE EM SUBSTRATO SÓLIDO E EM CÁPSULAS DE ALGINATO ... 24
5.2.1. VIABILIDADE DOS INOCULANTES INCORPORADOS AO SUBSTRATO TURFA FÉRTIL ... 26
7. CONCLUSÕES ... 29
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1 INTRODUÇÃO
O mercado de mudas florestais vem se expandido ao longo dos anos no território brasileiro. Assim, de modo a suprir a demanda de mudas de espécies florestais de interesse econômico, torna-se interessante o aprimoramento dos substratos de plantio, visando uma maior produtividade das mudas.
São conhecidos hoje diferentes tipos de substratos de plantio de mudas. Esses devem apresentar características físicas e químicas adequadas, como também uma proporção de nutrientes necessários para o desenvolvimento das mudas. O uso de substratos provenientes de materiais orgânicos como a turfa, vermiculita, cascas de pinus, entre outros, tem se demonstrado uma alternativa, porém, por si só, não apresentam a capacidade de suprir as necessidades das mudas, necessitando de uso de adubos químicos.
O uso de adubos químicos tornou-se a principal fonte de nutrientes em viveiros florestais, entretanto, os altos níveis de adubação utilizados têm se mostrado inadequados por causar um desiquilíbrio nutricional nas mudas. Além disso, ocorrem problemas ambientais decorrentes da lixiviação desses nutrientes que comprometem os ecossistemas aquáticos.
O fósforo é um dos elementos fundamentais para o crescimento das plantas, pois além de ser constituinte de diferentes moléculas como o DNA e ATP, apresenta uma função reguladora de várias atividades metabólicas. Devido a sua deficiência nos solos e baixa solubilidade, o uso excessivo de adubos fosfatados para aumentar a produtividade das mudas ganhou espaço nos viveiros. Todavia, o aumento da disponibilidade de fósforo compromete certos benefícios a plantas, como por exemplo, a micorrização, simbiose fundamental para o crescimento de espécies de interesse florestal, tais como o eucalipto.
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Muitas espécies de eucalipto são dependentes da simbiose ectomicorrízica para um bom crescimento. A associação com fungos ectomicorrízicos garante uma maior sobrevivência das mudas em viveiros, uma vez que permite uma maior absorção de nutrientes, resistência a patógenos e condições ambientais adversas. O fósforo é um determinante para formação de micorrizas, porém, quando presente em quantidades elevadas, reduz a associação do fungo simbionte, atuando de forma inversa, ou seja, inibe a formação das micorrizas, prejudicando o desenvolvimento da mesma.
Com o conhecimento das necessidades das mudas em consenso com a composição do substrato, a exploração da simbiose ectomicorrízica pode determinar benefícios aos viveiros florestais, estimulando o crescimento das mudas e diminuindo a necessidade do uso exagerado de adubos químicos.
Existe uma evidente necessidade de diminuição do uso de adubos químicos para o desenvolvimento de mudas em viveiros, visando processos mais sustentáveis e que interfiram menos no ambiente natural. Uma mudança de paradigma por parte das empresas, pela exploração das relações do microrganismo com o ecossistema, além de garantir praticidade e menor custo financeiro para o viveirista, pode culminar em uma melhor qualidade das mudas transplantadas. Neste contexo, o presente estudo visa desenvolver um inoculante de fungo ectomicorrízico e incorporá-lo ao substrato de plantio de modo a ter-se um produto comercial com propágulos fúngicos, indicado para aplicação na produção de mudas de eucaliptos com baixos níveis de adubação.
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2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Desenvolver um substrato a base de turfa e fungo ectomicorrízico para produção de mudas de Eucalyptus sp
2.2. Específicos
a) Caracterizar o substrato comercial de produção de mudas Turfa Fértil da FLORESTAL S.A (atividade de água, teor de umidade, velocidade de secagem);
b) Produzir inoculante em meio sólido vermiculita-meio de cultura e misturar ao substrato comercial de produção de mudas;
c) Produzir inoculante em meio líquido, encapsular em gel de alginato e misturar ao substrato comercial de produção de mudas;
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3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. SIMBIOSE ECTOMICORRÍZICA
Micorrizas são associações mutualísticas entre raízes e fungos (FRANK, 1885). O fungo como contrapartida pelos compostos carbonados provenientes da fotossíntese, propicia maior absorção de água e nutrientes para a planta ((SMITH e READ, 2008).
Essas associações apresentam um papel importante na promoção do crescimento e desenvolvimento de plantas. Esta importância foi demonstrada nas primeiras tentativas de implantação de espécies vegetais fora do seu habitat natural e na dificuldade de se estabelecerem em regiões de solos degradados que não existiam fungos compatíveis com as espécies introduzidas (VOZZO e HACKSKAYLO, 1971; MIKOLA, 1973).
Ectomicorrizas são caracterizadas pela penetração intercelular do micélio fúngico formando a rede de Hartig no interior do córtex e do manto ao redor dos segmentos das raízes, sendo que modificações morfológicas são observadas. Os fungos que formam este tipo de associação são, na sua maioria, do Filo Basidiomycota, embora existam alguns fungos do Filo Ascomycota capazes de formar ectomicorrizas (SMITH e READ, 2008).
Além da nutrição vegetal, a associação permite, através da expansão radicular, uma maior absorção de água e nutrientes de baixa mobilidade, aumenta a condutibilidade hidráulica, resistência a estresses e a patógenos, aumentando assim o crescimento e a produção das plantas (GLOWA et al., 2003; SAWYER et al., 2003, SMITH e READ, 2008).
Apesar da baixa diversidade de simbiontes, as ectomicorrizas apresentam alta diversidade de fungos associativos, com mais de 6000 espécies já descritas (SMITH e READ, 2008). A associação com fungos ectomicorrízicos é necessária para o desenvolvimento e sobrevivência de espécies dos gêneros Eucalyptus e Pinus, por exemplo, sendo
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indispensável para o último, pois sabe-se que a introdução do gênero em áreas exóticas só é possível na presença de fungos ectomicorrízicos compatíveis (VOZZO e HACKSKAYLO,1971).
Estudos relatam que a inoculação de espécies com fungos ectomicorrízicos em viveiros auxilia a sobrevivência das mudas quando transplantadas para campo e permite uma menor utilização de adubos químicos, o que culmina com a diminuição de potenciais contaminações dos corpos d’água e do lençol freático (CHEN et al., 2006, GANDINI, 2011).
3.2. O EUCALIPTO
O gênero Eucalyptus engloba diversas espécies de origem australiana. É uma das essências mais plantadas no mundo. O eucalipto foi introduzido no Brasil em 1868, no Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, sendo plantado primeiramente como árvore ornamental, pelo seu extraordinário desenvolvimento, capacidade de quebrar ventos, ou por supostas propriedades sanitárias. Para garantir o fornecimento de madeira para lenha e carvão, foram iniciados no século passado em São Paulo vários estudos que permitiram o cultivo de eucalipto em larga escala (REVISTA MADEIRA, 2001).
Com a crescente escassez de florestas nativas, em 1966 o governo brasileiro criou o programa de incentivos fiscais para aumentar a área plantada (HOEFLICH et al., 2000). O programa permitiu um aumento na área de plantação de eucaliptos de 400mil para 3,7 milhões de ha em 1986 (REVISTA MADEIRA, 2001).
Com o aumento das informações sobre as propriedades do eucalipto, o gênero vem sendo utilizado para diversos fins industriais. A madeira do eucalipto, utilizada em idade jovem, geralmente de oito a dez anos, tem importância na produção de celulose, chapas de
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fibras, painéis de madeira aglomerada, lenha e carvão. Além disso, as suas propriedades mecânicas, como a resistência, é um requisito básico para seu uso estrutural (REVISTA MADEIRA, 2003).
Várias são as características que garantem o sucesso do gênero no plantio em viveiros. Espécies deste gênero apresentam um rápido crescimento, adaptabilidade a diferentes ambientes e grande capacidade produtiva, o que permite atender as necessidades tecnológicas dos mais diferentes segmentos do setor industrial (REVISTA MADEIRA, 2001).
As perspectivas de uso de utilização de madeira oriunda de eucaliptos são promissoras e têm por base o conhecimento já acumulado sobre o manejo de várias espécies do gênero. A evolução no cultivo de eucalipto pelo Brasil depende de vários fatores, desde o substrato de plantio ao melhoramento genético, o que garante o seu potencial futuro na indústria florestal.
3.3. O GÊNERO Pisolithus
Espécies do gênero Pisolithus encontram-se entre as mais estudadas na formação de micorrizas. As espécies deste gênero apresentam uma ampla distribuição geográfica, crescendo nas diversas condições de solo e uma diversidade de simbiontes (MARX e CORDEL, 1990).
Estudos apresentam diferentes resultados sobre o efeito de Pisolithus na promoção do crescimento de plantas. Existem relatos sobre o aumento da taxa de sobrevivência e do melhor desenvolvimento das mudas transplantas devido à colonização com o gênero em questão. Além disso, constataram-se menos perdas por doenças e melhor adaptabilidade e
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produtividade das plantas inoculadas em locais com baixo teor de nutrientes ou condições adversas de pH do solo (MARX e CORDELL, 1988).
Devido as suas características peculiares e poder ser mantido em laboratórios em cultura pura, o gênero Pisolithus apresenta um grande potencial para aplicação biotecnológica como a promoção de crescimento de mudas em viveiros. A literatura apresenta estudos sobre as diferentes formas de inoculação do fungo em viveiros, variando da forma vegetativa ao uso em capsulas de gel de alginato.
3.4. INOCULANTES ECTOMICORRÍZICOS
De modo a garantir o sucesso de um programa de inoculação de mudas, a forma do inoculante tem fundamental importância. Este deve também ser de fácil aplicação, apresentar uma qualidade microbiológica e ausência de patógenos que comprometam a sua viabilidade. O armazenamento e transporte do inoculante devem ser adequados de modo a conservar os propágulos fúngicos, garantindo a infectividade mesmo após vários meses de armazenamento. Além disso deve ser compatível com a produção de mudas (BRUNDRETT; et al., 1996; ROSSI, 2006;).
Os inoculantes ectomicorrízicos apresentam formas variadas. Estes podem ser simples, como o solo procedente de florestas contendo propágulos, ou sofisticados,envolvendo processos de produção em biorreator a partir do micélio fúngico. É possível também encontrar na forma de esporos obtidos a partir das frutificações, porém estes apresentam a desvantagem de só poderem ser obtidos sazonalmente em basidiomas capazes de produzir uma grande quantidade de esporos, limitando o numero de espécies fúngicas a serem utilizadas. A literatura apresenta estudossobre a formação de micorrizas
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de Pisolithus tinctoriusem mudas de Pinus palustres, demonstrando que o uso do micélio é mais efetivo na colonização em relação aos esporos (THEODOROU,1971; CORDELL et al., 1988;MARX e CORDELL, 1990).
A produção de inoculantes micelianos é aplicável a qualquer fungo que possa ser cultivado em cultura pura, o que permite a utilização de fungos selecionados pela eficiência de promover o crescimento da planta simbionte (MARX, 1980, LAST et al., 1984; ALVES et al., 2001). Entretanto, de modo a garantir o sucesso produtivo do inoculante é necessária a seleção de fungos que sejam compatíveis à planta, garantindo um maior crescimento das mudas. Devem ser levadas em conta também questões relacionadas com a adaptação ao substrato de plantio, e a capacidade de auxiliar a sobrevivência das plantas durante o transplantio (BRUNDRETT et al, 1996; SOUZA, 2003; SMITH e READ, 2008).
A maioria dos substratos comercias disponíveis contêm esporos em suspensão ou propágulos fúngicos e não apresentam informações detalhadas definindo as quantidades ou concentrações de esposos e muito menos informações sobre a especificidade em relação a planta (ROSSI, 2006).
3.5. A TURFA
A turfa é caracterizada como o estágio inicial na formação do carvão. É formada pela decomposição parcial da matéria orgânica em ambientes lodosos e pântano sob condições de anaerobiose (PETRONI et al.,2000). O material orgânico, em contato com a água é oxidado por microrganismos, levando a formação da turfa. A composição da turfa depende
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de vários fatores como o clima da região, a acidez da água e natureza da vegetação (RADOVIC et al.,1997).
Inicialmente a turfa foi reconhecida como fonte de energia em países como a Rússia e Irlanda, sendo usada primariamente para aquecimento e uso doméstico. Posteriormente o seu uso se expandiu para o ferroviário e o agrícola em países como a Alemanha (AGUIAR, 1987).
A exploração da turfa no Brasil teve início no Estado do Sergipe, como fonte de combustível nas usinas de farinha. Posteriormente, companhias de energia e de cerâmica localizadas nos Estados de São Paulo e Santa Catarina utilizaram a turfa como substituinte da madeira (ARANOVICH e DONOHUE, 1998).
O Brasil apresenta vários depósitos de turfa espalhados por todo o território nacional, inclusive no estado de Santa Catarina. A turfa apresenta, além do seu potencial energético, aplicabilidade na agricultura. Isso deve-se ao fato de esta apresentar um elevado grau de matéria orgânica de alta qualidade, que incorporada ao solo aumenta a atividade microbiana, a retenção de água e nutrientes minerais, melhorando a estrutura dos solos e outros fatores, o que garante, quando usado como substrato, o desenvolvimento das plantas (ARANOVICH e DONOHUE, 1998, FLORESTAL S.A, 2011).
3.6. ATIVIDADE DA ÁGUA (Aw)
A quantidade de água em um substrato pode ser encontrada na forma “ligada” ou “livre”. Os microrganismos necessitam de água na forma “livre” para os seus processos metabólicos proporcionando, assim, o seu crescimento. Assim, de modo a quantificar a
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água”livre” foi proposta a expressão Aw, que é definida pela diminuição parcial do vapor de água (BROOKER et al., 1992):
Aw= P/P0
P = pressão de vapor da água no material P0 = pressão de vapor da água pura
Trata-se de um número adimensional constituindo uma medida relativa do estado padrão definida por termos de equilíbrio termodinâmico. A composição química presente no material pode diminuir a atividade devido à imobilização da água pelos seus constituintes, diminuindo a capacidade de vaporizar-se (YILDIZ, 2010).
O conhecimento sobre a Aw é fundamental em cultivo de fungos em fermentação sólida. No caso deste estudo, o conhecimento de Aw para diferentes conteúdos de umidade é importante para estabelecer condições de manutenção da viabilidade do inoculante no substrato de plantio de mudas.
3.7. ISOTERMAS
Define-se como isoterma uma curva que descreve a relação de equilíbrio a uma determinada temperatura entre a quantidade de água retida por um material em função da umidade relativa atmosférica (YILDIZ, 2010). Podem ser obtidas por simulação de diferentes atmosferas através de soluções salinas saturadas em recipientes fechados de modo a minimizar oscilação atmosférica interna e, medindo-se após o estabelecimento do equilíbrio, o conteúdo de água por pesagem.
Uma isoterma pode ser obtida em duas direções, caracterizadas pelo ganho ou perda de umidade, sendo denominadas isotermas de adsorção e dessorção, respectivamente. A
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defasagem entre as duas curvas é denominada histerese podendo ocorrer devido a vários fatores. Através da figura 1 pode-se notar que as curvas apresentam diferentes padrões, existindo vários modelos na literatura baseados em equações fundadas sobre conhecimentos teóricos que visam predizer o comportamento da isoterma (PARK e NOGUEIRA, 1992; PARK et al., 2007).
O conhecimento sobre o comportamento das isotermas de um determinado composto é de extrema importância, pois permite determinar fatores como o tempo de secagem.
Figura 1. Isoterma de adsorção e dessorção mostrando a histerese (PARK e NOGUEIRA, 1992).
3.8. COMPORTAMENTO DA SECAGEM
A secagem está entre as operações mais usuais na indústria química. Em uma boa parte das situações é o último processamento do produto antes de sua classificação e embalagem. A qualidade do produto seco, a quantidade de energia gasta e o tempo utilizado neste processo são parâmetros primordiais para a rentabilidade do bem submetido a esta operação (PARK et al., 2007; YILDIZ, 2010)
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Entende-se como secagem o processo de remoção de um líquido agregado a um sólido para uma fase gasosa através de vaporização térmica. Para que esta ocorra é necessário um sistema que não esteja em equilíbrio, ou seja, o meio secante deve estar a uma temperatura superior em relação ao sólido úmido, o que permite o fluxo de calor do ar para o sólido. Simultaneamente, a diferença de pressão parcial do vapor d’água existente entre o ar e a superfície do sólido determina a transferência de massa para o ar (PARK, et al.,2007)
Na secagem de um sólido úmido mediante um gás a uma temperatura e umidade fixa, a temperatura do mesmo e a velocidade de secagem podem aumentar ou diminuir de modo a atingir as condições de regime permanente. O aumento na temperatura do ar tem como consequência o correspondente aumento da velocidade de secagem. Assim, a temperatura no interior do sólido se iguala a temperatura do bulbo úmido do ar, caracterizando o período de secagem a taxa constante. Esse processo termina quando o sólido atinge o teor de umidade crítico. Entretanto, quando a taxa de secagem aproxima-se de zero denomina-se teor de umidade de equilíbrio, que no processo de denomina-secagem de sólidos é o menor teor de umidade atingível (PARK et al., 2007; YILDIZ, 2010).
Visto que os sólidos apresentam características e composição diferenciada, a seleção do processo de secagem deve ser feito de forma criteriosa e individual. Fatores como as propriedades do material a ser seco, os métodos de calor, sua hidrodinâmica e tamanho de partículas devem ser consideradas, bem como os tipos e processos de secagens oferecidos no mercado associado à oferta do beneficio do produtor (PARK et al., 2007).
A caracterização do substrato de plantio ao qual será incorporado a biomassa fúngica, é importante para compreender e estabelecer as condições que permitam a manutenção da viabilidade ao longo do tempo de armazenamento até sua aplicação.
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4. METODOLOGIA
4.1. MICRORGANISMO UTILIZADO
Foi utilizado o fungo ectomicorrízico Pisolithus sp., isolado UFSC-Pt198, proveniente de uma plantação de eucaliptos localizada no Estado de Santa Catarina. Os processos de repicagem e inoculação do fungo foram realizados assepticamente em capela de fluxo laminar, utilizando meio PGKM (ROSSI ,2006).
4.2. CARACTERIZAÇÃO DO SUBSTRATO COMERCIAL
O substrato para produção de mudas florestais utilizado neste estudo possui a marca comercial Turfa Fértil, sendo produzido pela FLORESTAL S.A.. Apresenta grande capacidade de retenção de água, adsorção de nutrientes minerais e uma elevada acidez (pH 3,2 a 3,7).
4.2.1 EQUIPAMENTOS
Foi utilizada uma estufa de incubação tipo BOD para obter os dados para as isotermas, uma estufa de secagem para obter a massa seca, e uma estufa de secagem com ventilação para obter a curva de secagem. As amostras foram pesadas em balança analítica com precisão de três casas decimais.
4.2.2 MASSA SECA
Para calcular os valores de umidade em base seca, ao fim de cada ensaio determinou-se a massa determinou-seca das amostras, onde o material foi deixado por 24 horas a uma temperatura de 105 °C. O fim do ensaio foi caracterizado pela constância das pesagens.
16 4.2.3. MEDIDAS DE TEOR DE ÁGUA
Para determinar o teor de água foram pesados 10 g do substrato em placa de Petri, em duplicata, e colocados em estufa a 105 C. Após 24 h as amostras foram novamente pesadas e expressou-se o teor de umidade em base base seca:
Xbu = mH2O/minicial e Xbs = mH2O/mss
bu = base úmida bs = base seca ss = sólidos secos
4.2.4. ATIVIDADE DA ÁGUA (Aw)
Para determinação da Aw foram pesadas amostras de 2 g do substrato em pequenos copos plásticos descartáveis que posteriormente foram colocados em frascos fechados com atmosferas de diferentes umidades relativas constantes, obtidas através de soluções saturadas de sais (Tabela 1). Os frascos foram colocados em estufa a 25 °C e, após um período de 4 horas, as amostras foram pesadas a fim de obter a variação de umidade. Com os dados obtidos, foi construído um gráfico com os ganhos e perdas de umidade contra a umidade relativa correspondente a cada solução salina. A atividade da água, ponto onde a amostra não ganha e nem perde peso, foi determinada através da regressão linear dos pontos experimentais (LANDROCK e PROCTOR, 1951).
Sais UR (%)
25 C Hidróxido de potássio (KOH) 8 Acetato de potássio (KCH3CO2) 23
Carbonato de potássio (K2CO3.2H2O) 43
Nitrito de sódio (NaNO2) 65
Cloreto de sódio (NaCl) 75 Sulfato de amônio ((NH4)2SO4) 79
Cloreto de potássio (KCl) 86 Sulfato de potássio (K2SO4) 97
17 4.2.5. OBTENÇÃO DA ISOTERMA DE DESSORÇÃO
Seguiu-se a mesma metodologia descrita anteriormente, sendo que neste caso as amostras permaneceram na estufa até a umidade equilibrar-se com a umidade relativa do interior dos frascos. Após a umidade atingir o equilíbrio, as amostras foram pesadas e então construiu-se um gráfico da umidade contida nas amostras contra a umidade relativa correspondente a cada solução salina.
4.2.6. CURVA DE SECAGEM
De modo a obter a curva de secagem foram pesados 10 g de amostra do substrato comercial em placas de Petri que posteriormente foram colocados em estufa ventilada para secagem a uma temperatura de 38 °C e umidade relativa de 39 %, simulando uma condição ambiental de dia quente e de baixa umidade do ar. A cada hora as amostras foram pesadas, acompanhando a perda de peso, até atingir a umidade de equilíbrio.
4.3. PRODUÇÃO DOS INOCULANTES
4.3.1. INOCULANTE EM SUBSTRATO TURFA-VERMICULITA-MEIO DE CULTURA
Visto que a turfa apresenta um caráter muito ácido (pH 3-4), impróprio para o crescimento do fungo, foi necessário elevar o pH da mesma para 5,8. Para isso, foram utilizadas três diferentes doses de calcário (0,5 g, 1 g e 2 g), que foram adicionadas a 500 mL de uma mistura turfa-vermiculita (1:4, V:V) previamente umidificados com 50 mL de água destilada. Após isso, a mistura passou por estudos relacionados ao tempo de esterilização, onde foi submetida a 121 °C por tempos de 30 min e 1h. Para cada tempo, foi verificada a eficiência da esterilização, através da verificação de ausência de contaminantes pela incubação de amostras em meio de cultura em placas.
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Após a padronização do calcário para 2 g e do tempo de esterilização para 1 h, foi produzido o inoculante do isolado utilizando o método de cultivo no estado sólido (ALVES et al., 2001; SOUZA et al.,2004), em sacos plásticos esterilizáveis e com filtros para passagem de ar. Para isso, a partir do micélio produzido em frascos erlenmeyers, foram preparadas suspensões micelianas com adição de carvão ativo (0,3 %). O substrato foi inicialmente umidificado com 60 mL de meio PGKM e posteriormente foram adicionados 0,7 g de suspensão miceliana para cada saco contendo 2L. Os sacos foram colocados em estufa BOD para crescimento do micélio e colonização do substrato.
O inoculante também foi produzido somente com vermiculita-meio de cultura. Para o preparo foram usados frascos do tipo conserva de 1000 mL, onde cada um recebeu 500 mL de vermiculita. Uma vez que a vermiculita apresenta um caráter básico, foi necessária a adição de solução de HCl 0,5 M para redução do pH, adequando assim, às condições de crescimento do fungo. Em seguida, foram adicionados 60 mL de água destilada e a mistura foi esterilizada por 1 hora. Após a mistura esfriar foi realizada a inoculação do fungo Pisolithus sp.. Nessa etapa, foram preparados 200 mL de meio PGKM concentrado, ressaltando que a glicose foi esterilizada a parte. O meio de cultura, a glicose e os discos de micélio-ágar, provenientes de uma placa mãe de ±20 dias foram adicionadas assepticamente na mistura, que posteriormente foi incubada em estufa BOD ±25°C.
4.3.2. INOCULANTE ENCAPSULADO EM GEL DE ALGINATO
A partir do micélio obtido após um período de crescimento (15-20 dias), foram produzidos discos de micélio-ágar que em seguida foram inoculados em frascos Erlenmeyer contendo 25 mL de meio, sendo este, em seguida, incubado em estufa BOD à 25±1 °C, na ausência de luz, por um período de 20 dias. Após esse período, a biomassa dos
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frascos formada foi fragmentada em liquidificador contendo uma solução salina (0,85 % NaCl) e carvão ativo neutralizado (0,3 %)
Para a produção das cápsulas, a suspensão miceliana foi misturada a uma solução de alginato de sódio 2 % (ROSSI, 2006) e gotejada, sob agitação, em uma solução de cloreto de cálcio (0.5 M) para polimerização e formação das cápsulas de gel de alginato de cálcio. Após a polimerização completa das cápsulas (30 minutos), foram feitas três lavagens com água destilada esterilizada e posteriormente acondicionada em frascos. Todas as etapas foram realizadas assepticamente em capela de fluxo laminar.
4.3.4. SUBSTRATO COMERCIAL A BASE DE TURFA E FUNGO ECTOMICORRÍZICO
Os inoculantes obtidos, conforme descrito nos itens 4.3.1 e 4.3.2, foram misturados ao substrato comercial à base de turfa, compondo dois tipos de substratos, em função do tipo do inoculante. Para o inoculante produzido em vermiculita foi utilizado 10 % do volume e, para o inóculo encapsulado, foi utilizado um número de cápsulas equivalente a 300 cápsulas por litro de substrato. O substrato foi previamente umedecido com 50-80 mL de água e posteriormente esterilizado em autoclave durante 60 minutos. Os dois inoculantes foram armazenados em local apropriado, em condições normais do ambiente.
4.4. VIABILIDADE DO INOCULANTE NO SUBSTRATO
Os substratos terão a viabilidade do fungo acompanhada durante um período de 6 meses. Para isso, a cada 15 dias serão retiradas amostras assépticas e espalhadas em meio de cultura PGKM em placas. Após um período de incubação de até uma semana, a viabilidade será confirmada através da emissão de hifas a partir das partículas do substrato.
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. CARACTERIZACAO DO SUBSTRATO
5.1.1. TEOR DE UMIDADE
O substrato de plantio apresentou um teor de água de 0,209 g.g-1 (21% de base
úmida).
5.1.2. ATIVIDADE DA ÁGUA
A figura 2 demonstra o resultado da determinação do valor da atividade da água (aw), que para esse caso, foi de 0,984, referente ao substrato comercial. Esse valor é relativamente alto, o que torna o inoculante presente no substrato propenso à contaminação por bactérias, visto que estas crescem em valores superiores a 0,85. Por ser de origem vegetal, o substrato a base de turfa apresenta um elevado teor de matéria orgânica, cerca de 90 %, o que impulsiona uma maior atividade microbiana. Isso, mais a presença de biomassa de fungos, aumenta a probabilidade de crescimento de microrganismos saprófitos indesejáveis, o que poderia inviabilizar o inoculante.
Figura 2. Variação da umidade em função da umidade relativa (UR = Aw) para o substrato Turfa Fértil da
Florestal S.A. y = 0.2062x - 0.203 R² = 0.9688 -0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 Per d a s e g a n h o s d e p e s o d a s a m o s tr a s , (g ) Aw
21 5.1.3. ISOTERMAS DE DESSORÇÃO
A figura 3 apresenta os resultados da umidade de equilíbrio do substrato em relação às diferentes umidades relativas. Foi obtida uma isoterma de dessorção visto que a Aw encontra-se acima da maior umidade relativa das soluções salinas. O substrato apresenta alta afinidade pela água, pois, mesmo para baixos teores de umidade, a atividade de água ainda é elevada. Com esse resultado, pode-se prever que mudas plantadas nesse substrato apresentarão uma maior demanda de rega em períodos de baixa umidade do ar, visto que a capacidade de retenção de água é baixa. Os intervalos entre as regas também deverá ser menor, pois a umidade próxima às raízes será mantida por um tempo menor, comprometendo a viabilidade do fungo. Na figura 4 observa-se o acompanhamento da dessorção até o estabelecimento do equilíbrio, que ocorreu num período de 3 dias. É possível notar que já no segundo dia (48 h) o equilíbrio estava praticamente estabelecido, em torno de 0,09 g de água por g de sólidos secos.
Figura 3. Teor de umidade (g água/g sólidos secos) de equilíbrio no composto Turfa Fértil Florestal S.A em função da atividade da água (Aw)
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0 0.5 1 te o r d e u m ida d e (x ), g d e a g u a /g d e s o lid o s s e c o s Aw
22 Figura 4. Evolução da isoterma de dessorção até atingir o equilíbrio para o composto Turfa Fértil Florestal S.A a 25 C
5.1.4 CURVA DE SECAGEM
A figura 5 apresenta a curva de secagem do substrato Turfa Fértil obtida nas condições descritas na metodologia. Observa-se que após um período de 9 h a umidade de equilíbrio ainda não havia sido alcançada. Entretanto, em condições de baixa umidade do ar, como naquelas do ensaio, o inoculante fica sujeito a baixas atividades de água o que pode comprometer sua viabilidade, tanto quando em armazenamento, quanto nas primeiras semanas do plantio, quando ainda não houver ocorrido a colonização das raízes. Nesse caso verifica-se a necessidade de uma embalagem plástica hermética (a embalagem atual do substrato é plástica mas contém pequenos furos para ventilação) para o substrato e regas mais periódicas nas plantas.
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0 20 40 60 80 100 Teo r d e u m ida d e ( X ), g d e á g u a / g s ó lid o s s e c o s Umidade relativa, % 1 dia 2 dias 3 dias
23 Figura 5 Curva de secagem em condições de temperatura de 38 °C e umidade relativa do ar de 39 %; teor de umidade em função do tempo.
A figura 6, obtida a partir dos dados da figura 4, representa a velocidade de secagem em função do teor de umidade. Pode se notar que nas primeiras três horas de secagem, quando o teor de umidade encontrava-se entre 1,25 e 1,07 g água/g sólido seco, a secagem ocorreu em regime permanente e na velocidade máxima, sendo que a água evaporada foi prontamente substituída pela umidade que vinha do interior do composto. Na sequência do processo, a partir da quarta hora, quando o teor de umidade era em torno de 1,0 g água/g sólido seco, a secagem ocorreu com velocidade decrescente. A partir deste ponto, a superfície fica cada vez mais pobre em líquido, pois a velocidade de evaporação é maior que a taxa de deslocamento do líquido para a superfície.
0.3 0.6 0.9 1.2 0 2 4 6 8 10 Teor de u mi d ad e ( X ), massa de l íq ./ massa d e só lid o sec o Tempo, h
24 Figura 6. Velocidade de secagem do composto comercial Turfa Fértil da Florestal S.A.
Essas informações reforçam a necessidade de uso de embalagens herméticas, pois a perda de umidade que ocorre em regime permanente (isto é, com velocidade máxima) já é suficiente para deixar o substrato em condições baixas de umidade e Aw.
5.2 PRODUÇÃOS DE INOCULANTE EM SUBSTRATO SÓLIDO E EM CÁPSULAS DE ALGINATO
A produção de inoculante em substrato sólido contendo turfa foi extremamente difícil, embora a literatura aponte esse como um método possível de aplicação. A maior dificuldade foi em fazer o fungo crescer nesse substrato, seguida de problemas de contaminações. Esse último foi contornado com a utilização de tempos de esterilização de 60 minutos, mas o crescimento foi inviabilizado, após várias tentativas. Uma provável explicação é que a autoclavagem do substrato contendo turfa pode ter criado condições tóxicas ao fungo, como por exemplo, a liberação de Mn na forma reduzida, visto que estudos comprovam a deposição de elementos traço nas camadas superficiais das turfeiras (KOUVO e BACKMAN, 2002; KRÓL et al., 2010). Sabe-se que o composto comercial Turfa
0.85 0.86 0.87 0.88 0.89 0.90 0.91 0.92 0.93 0.94 0.95 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 Tax a d e s e c a g e m , (m a s s a /t e mpo .á re a )
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Fértil já é submetido a uma autoclavagem. Assim, o substrato turfoso podia já apresentar componentes tóxicos ao fungo ectomicorrízico, situação essa que pode ter sido magnificada com a segunda esterilização. A segunda esterilização é necessária, pois o composto não é estéril no sentido estrito para uso em cultivo asséptico. O fato de diversos estudos (ALVES et al., 2003; ROSSI, 2006,) terem utilizado com sucesso substrato contendo turfa de procedência da mesma empresa Florestal S.A., revela que o produto não mantém as mesmas características ao longo do tempo, provavelmente pela variabilidade da composição em função das diferentes áreas de extração nas turfeiras. Esses resultados corroboram a difícil tarefa de se produzir inoculantes de fungos ectomicorrízicos em meio sólido utilizando-se turfa.
Como alternativa para a produção do inoculante em meio sólido, a turfa foi retirada da composição do substrato, e substituida por uma composição de meio de cultura-vermiculita. Assim, conseguiu-se produzir o inoculante (figura 7), que posteriormente foi incorporado ao substrato de plantio Turfa Fértil na proporção de 10 %, e acompanhado a viabilidade mostrada no item a seguir.
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A produção do inoculante em meio líquido e encapsulado em gel de alginato de cálcio transcorreu normalmente, com as cápsulas apresentando alta viabilidade em meio de cultura em placas (figura 8). A viabilidade desse inoculante ao incorporá-lo no substrato Turfa Fértil também é apresentada no item a seguir.
Figura 8. Viabilidade da suspensão miceliana antes do encapsulamento (a) e após o encapsulamento em gel de alginato de cálcio (b).
5.2.1. VIABILIDADE DOS INOCULANTES INCORPORADOS AO SUBSTRATO TURFA FÉRTIL
A figura 9 mostra a viabilidade do inoculante produzido por cultivo sólido incorporado ao substrato de plantio de mudas Turfa Fértil no tempo zero, isto é, através de amostra plaqueada em meio de cultura no mesmo dia em que foi misturado ao substrato comercial e após 15 dias após a execução desse procedimento. O inoculante apresentou 100% de viabilidade, isto é, todos os fragmentos de vermiculita contendo propágulos emitiram hifas. Entretanto, na segunda verificação da viabilidade feita após 15 dias de armazenamento, o inoculante não apresentou mais viabilidade.
27 Figura 9. Viabilidade do inoculante produzido em cultivo sólido incorporado no substrato comercial Turfa Fértil no tempo zero (a) e após 15 dias (b).
O mesmo resultado, onde se observou a perda de viabilidade, foi obtido com o inoculante produzido em meio líquido e encapsulado em gel de alginato de cálcio (Figura 10).
Figura 10. Viabilidade do inoculante produzido em cápsulas de alginato incorporado ao substrato comercial Turfa Fértil no tempo zero (a) e após 15 dias (b).
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Esses resultados, com relação a perda da viabilidade dos inoculantes, foi surpreendente, pois reforça a hipótese do substrato Turfa Fértil conter compostos tóxicos ao fungo. Também foi surpreendente porque Rossi (2006) avaliou positivamente a viabilidade de inoculantes produzidos na presença de turfa de seis isolados de fungos ectomicorrízicos, inclusive um do mesmo gênero utilizado neste estudo. Em seus estudos, os inoculantes embora não misturados ao substrato de plantio, apresentaram viabilidade excelente até um período de 6 meses. Além disso, o fungo ectomicorrízico utilizado neste estudo foi isolado de uma região afetada pela mineração de carvão, apresentando capacidade de crescimento em condições de elevada acidez e elevada contaminação com elementos traço. De qualquer modo, as condições de acidez no substrato turfoso foram alteradas para uma faixa mais apropriada para o fungo, de modo que as verdadeiras razões para a perda da viabilidade permanecem desconhecidas.
É notória a ausência de inoculantes de fungos ectomicorrízicos no mercado, e os resultados desse estudo revelam um dos principais motivos, que é a dificuldade de produção dos inoculantes e a manutenção de sua viabilidade. Evidenciou-se também uma questão importante a se considerar, mesmo quando um inoculante é produzido por outra técnica,mesmo quando misturado ao substrato de plantio, ainda que feito no momento do plantio, a condição do substrato poderá levar a perda de viabilidade do inoculante. Esse fato nunca foi mencionado na literatura e poderia ser a explicação para muitos estudos de inoculação de fungos ectomicorrízicos mal sucedidos, quando se utiliza substrato turfoso.
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7. CONCLUSÕES
1. O substrato Turfa Fértil apresenta pouca afinidade pela água, de modo que quando se adicionar algum tipo de inoculante será necessário a utilização de embalagens herméticas para garantir uma atmosfera de umidade adequada a manutenção do microrganismo.
2. A composição variável de substratos a base de turfa, associada com processos intensos de esterilização levam a uma condição tóxica para o crescimento e manutenção de viabilidade do fungo ectomicorrízicos, como observado para Pisolithus sp.
3. A produção de inoculantes ectomicorrízicos em substratos sólidos é laboriosa, lenta e sujeita a contaminação frequente.
4. Para utilização de substratos a base de turfa na produção de essências florestais onde processos simbióticos com fungos são importantes, recomenda-se avaliar a toxicidade contra esses, pois até mesmo as infecções por fungos naturalmente presentes nos viveiros poderão ser inibidas.
5. A preparação de substrato comercial contendo inoculantes de fungos ectomicorrízicos não é viável por diversas razões: processos complexos e sujeitos a contaminação, dificuldade de manutenção da viabilidade celular, custos maiores de transporte devido a necessidade de maior conteúdo de água no substrato.
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