ANALÍTICA AVANÇADA 2S Prof. Rafael Sousa. Notas de aula:

(1)

ANALÍTICA AVANÇADA – 2S 2011

Aula 6 Aula 6

Espectrofotometria no

Espectrofotometria no UVUV--VisVis

FLUORESCÊNCIA MOLECULAR FLUORESCÊNCIA MOLECULAR

Prof. Rafael Sousa

Departamento de Química

Departamento de Química -- ICEICE rafael.arromba@ufjf.edu.br

rafael.arromba@ufjf.edu.br

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Luminescência

x

Fluorescência Molecular

Sal cozinha Sal cozinha

Espectro de emissão obtido para uma amostra de “sal de cozinha”

(3)

Perfil dos espectros de emissão

Espécies atômicas Espécies atômicas

(gasoso)

(gasoso) Espectro de linhasEspectro de linhas H H Hg Hg Ne Ne Espécies moleculares Espécies moleculares

(líquido, sólido ou gasoso)

(líquido, sólido ou gasoso) Espectro de bandasEspectro de bandas

Um espectro de emissão contínuas de bandas é constituído por muitas linhas Um espectro de emissão contínuas de bandas é constituído por muitas linhas

próximas que são muito difíceis de

próximas que são muito difíceis de serem serem resolvidasresolvidas

Um espectro de emissão (que pode ser de fluorescência) está Um espectro de emissão (que pode ser de fluorescência) está intimamente relacionado com a composição da amostra

intimamente relacionado com a composição da amostra (desde que as espécies emitam)

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Perfil dos espectros de emissão

SÓLIDOS

SÓLIDOS AQUECIDOS DÃO ORIGEM A AQUECIDOS DÃO ORIGEM A ESPECTROS DE EMISSÃO

ESPECTROS DE EMISSÃO CONTÍNUOS:CONTÍNUOS:

Fenômeno radiativo Fenômeno radiativo

do “corpo negro” do “corpo negro”

As emissões observadas devem

As emissões observadas devem--se mais à se mais à temperatura aplicadatemperatura aplicada do que do que à composição dos materiais

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Característica dos espectros de emissão

POTÊNCIA DA RADIAÇÃO EMITIDA É PROPORCIONAL À POTÊNCIA DA RADIAÇÃO EMITIDA É PROPORCIONAL À

CONCENTRAÇÃO DAS ESPÉCIES QUE EMITEM CONCENTRAÇÃO DAS ESPÉCIES QUE EMITEM

P = kC

P = kC Princípio da Princípio da análise quantitativa análise quantitativa

Tinta branca com

Tinta branca com 0,2 % m/v 0,2 % m/v

de

de branqueador ópticobranqueador óptico

Tinta branca com

Tinta branca com 0,4 % m/v 0,4 % m/v

de

de branqueador ópticobranqueador óptico

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(7)

Sistemas Luminescentes

• Fotoluminescência

Fluorescência e a fosforescência: processos

de excitação similares (absorção de fótons)

MAS com decaimentos diferentes

• Quimiluminescência

Emissão de luz formada no decorrer de uma

reação química

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ENTENDENDO a Fotoluminescência

Absorção: 10-14 _{a 10}-15 _s Fluorescência: 10-5 _{a 10}-8 _s Fosforescência: 10-4 _{a 10 s} Fluorescência Fosforescência Estado

Fundamental Estado Excitado SingletoSingleto

Estado Excitado Tripleto

Tripleto

Fluorescência Fosforescência

Transições eletrônicas “permitidas”

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A molécula pode voltar ao seu estado

fundamental por uma combinação de várias

etapas (processos de desativação):

Processos radiativos

• Fluorescência _{RELEVÂNCIA ANALÍTICA} Fosforescência

• Fosforescência

Processos não radiativos (aumento T do solvente)

• Relaxação vibracional

• Conversão interna

• Conversão externa (colisões)

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•• Pode ocorrer em sistemas químicos gasosos, líquidos e sólidosPode ocorrer em sistemas químicos gasosos, líquidos e sólidos TIPOS:TIPOS:

•• Fluorescência de ressonância:Fluorescência de ressonância:

λλλλλλλλemisemis = = λλλλλλλλabsabs

(mais observada mais para espécies

(mais observada mais para espécies atômicasatômicas que moleculares)que moleculares)

DETALHANDO a Fotoluminescência

(11)

•• Fluorescência com deslocamento StokesFluorescência com deslocamento Stokes: λ : λ emisemis > λ > λ absabs (fóton absorvido (fóton absorvido perde energia por inúmeras vibrações microscópicas)

perde energia por inúmeras vibrações microscópicas)

DETALHANDO a Fotoluminescência

Existem semelhanças Existem semelhanças entre os espectros de entre os espectros de Ex

Ex.: .: QuininaQuinina, tanto a absorção em 250 , tanto a absorção em 250 nmnm quanto em 350 quanto em 350 nmnm resultam na resultam na emissão em 450 emissão em 450 nmnm entre os espectros de entre os espectros de excitação e o de absorção excitação e o de absorção (“imagens especulares”) (“imagens especulares”) 11

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FOTOLUMINESCÊNCIA EM DIAGRAMAS DE

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Diagrama de Jablonski Simplificado

- “Overlap” de níveis eletrônicos - Não háNão há mudança de spin

- “Overlap” de níveis eletrônicos - HáHá mudança de spin

(14)

Fenantreno: T₁_S₀ lenta 10-5 _{-10 s (fosforescência)}

Outro

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Fatores que afetam a fluorescência

• Estrutura molecular

– conjugação, rigidez, ...

DETALHANDO

a Fotoluminescência

– conjugação, rigidez, ...

• Ambiente químico

– Concentração, pH, viscosidade, presença de O₂

• Temperatura

(16)

Ex.: Fluorescência e Estrutura

• A substituição em anéis aromáticos afeta a

intensidade relativa de fluorescência e os valores dos λmax de absorção/emissão

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• Empiricamente, observa-se que a rigidez da

estrutura favorece a fluorescência.

Bifenil, Φ ≅ 0,2

Ex.: Fluorescência e Estrutura

Bifenil, Φ ≅ 0,2

Fluoreno, Φ ≅ 1 Φ_Zn-complexo >>> Φ_{hidroxiquinolina}

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• Estruturas aromáticas condensadas e/ou com

alto grau de conjugação apresentam alta

eficiência quântica

Ex.: Fluorescência e Estrutura

Heterocíclicos: não fluorescem

Heterocíclicos

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• Solvente e Temperatura

– Aumento de T ouou diminuição de viscosidadediminuição de viscosidade do solvente levam a um aumento no número de colisões e portanto

aumenta a probabilidade de conversão externas (supressão colisional), diminuindo a “eficiência” da fluorescência

Sobre os outros farores que afetam:

colisional), diminuindo a “eficiência” da fluorescência

• pH

– A fluorescência de compostos aromáticos com funcionalidades ácidas ou básicas apresenta forte dependência com o pH.

• Ex.: anilina/anilínio e fenol/fenolato

(20)

• Oxigênio dissolvido

– Oxigênio e outras espécies paramagnéticas tendem a diminuir a fluorescência pelo aumento do

cruzamento intersistemas (fosforescência)

– Também é possível a oxidação da espécie

Sobre os outros farores que afetam:

– Também é possível a oxidação da espécie fluorescente

• Outras moléculas em solução

– Moléculas com átomos pesados (tetrabrometo de

carbono e iodeto de etila) aumentam a velocidade de inversão de spin

(21)

Característica da Moléculas

Luminescêntes

Rendimento quântico ou eficiência quântica

Φ

:

É a razão entre o número de moléculas luminescentes

e o número total de moléculas excitadas

(22)

Intensidade de

Fluorescência

e

Concentração

• A fluorescência é diretamente proporcional a

concentração da espécie fluorescente, desde

que em baixas concentrações (A < 0,05)

F = K.c

• Desvios da linearidade:

Altas concentrações Altas concentrações

- Auto-supressão (quenching) - Auto-absorção

(23)

Intensidade de

Fluorescência

e

Concentração

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Fluorescência e Análise Química

Métodos diretos Métodos diretos::

ANALITO + COMPLEXANTE

ANALITO + COMPLEXANTE _{COMPLEXO FLUORESCENTE}COMPLEXO FLUORESCENTE

Métodos

Métodos inindiretosdiretos::

ANALITO

ANALITO fluorecentefluorecente + REAGENTE + REAGENTE _{PRODUTO menos FLUORESCENTE}PRODUTO menos FLUORESCENTE

Determinações inorgânicas Determinações inorgânicas::

COMPLEMENTA a espectrofotometria no

COMPLEMENTA a espectrofotometria no UVUV--VisVis pois a maioria dos metais de pois a maioria dos metais de transição geralmente não foram complexos fluorescentes (decaimento não transição geralmente não foram complexos fluorescentes (decaimento não radiativo muito eficiente), enquanto os outros metais podem formar produtos radiativo muito eficiente), enquanto os outros metais podem formar produtos fluorescentes

fluorescentes

Aplicações para compostos orgânicos e inorgânicos: Aplicações para compostos orgânicos e inorgânicos:

(25)

Fluorescência e Análise Química

Alguns exemplos

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Fluorescência e Análise Química

Determinações orgânicas

Determinações orgânicas: PRINCIPAL APLICAÇÃO: PRINCIPAL APLICAÇÃO

Ácidos

Ácidos nucleicosnucleicos, alcalóides, aminoácidos, coenzimas, esteróis, , alcalóides, aminoácidos, coenzimas, esteróis,

fármacos

fármacos, flavonóides, metabólitos, porfirinas, proteínas, , flavonóides, metabólitos, porfirinas, proteínas, vitaminas, ... vitaminas, ... Aplicações: Aplicações: vitaminas, ... vitaminas, ... Na detecção

Na detecção de de cromatógrafoscromatógrafos e equipamentos de eletroforese e equipamentos de eletroforese capilar favorecendo a obtenção de

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Instrumentação: Esquema Geral

•• Os componentes dos instrumentos para medir a Os componentes dos instrumentos para medir a fotoluminescência são

fotoluminescência são similaressimilares aos encontrados nos aos encontrados nos fotômetros e espectrofotômetros UV/Vis

fotômetros e espectrofotômetros UV/Vis

•• MAS a fonte de radiação necessita ser MAS a fonte de radiação necessita ser mais intensa mais intensa que que aquelas utilizadas na absorção molecular

aquelas utilizadas na absorção molecular aquelas utilizadas na absorção molecular aquelas utilizadas na absorção molecular

–

– arco de mercúrioarco de mercúrio

–

– arco de xenônioarco de xenônio--mercúriomercúrio

–

– laserslasers

•• A maioria dos equipamentos emprega a ótica de duplo feixe A maioria dos equipamentos emprega a ótica de duplo feixe para compensar flutuações na potência da fonte

para compensar flutuações na potência da fonte

EspectrofluorímetrosEspectrofluorímetros corrigidoscorrigidos

(28)

Instrumentação: Esquema Geral

•

• ComponentesComponentes similaressimilares a um a um UV

UV--VisVis •

• “Detector” a 90 “Detector” a 90 oo _em_{em relação}_relação •

• “Detector” a 90 “Detector” a 90 emem relaçãorelação ao

ao feixefeixe incidenteincidente •

• ObservaObserva--se ambos se ambos osos espectros

espectros de de excitaçãoexcitação e e emissão

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Componentes da Instrumentação

•• Fontes de radiação Fontes de radiação -- LâmpadasLâmpadas

-- “Lasers” (sensibilidade)“Lasers” (sensibilidade)

•

• XenônioXenônio:: produzproduz umum

•

• XenônioXenônio:: produzproduz umum espectro

espectro continuocontinuo entreentre 250

250 ee 600600 nmnm tendotendo umum máximo

máximo aa 470470 nmnm

Espectro de emissão de uma lâmpada de Xenônio

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Fontes de radiação

•

• MercúrioMercúrio::

-- AltasAltas pressãopressão:: máximosmáximos emem 365365,, 398398 nm,nm, ……,, 734734 nmnm..

-- BaixaBaixa pressãopressão:: máximomáximo emem 254254 nmnm..

Componentes da Instrumentação

Espectro de emissão de uma lâmpada de Mercúrio de alta pressão

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Componentes da Instrumentação

•• Filtros e monocromadoresFiltros e monocromadores

–

– FluorímetrosFluorímetros x x EspectrofluorímetrosEspectrofluorímetros

•• Detectores (transdutores)Detectores (transdutores)

–

– FotomultiplicadorasFotomultiplicadoras

–

– Arranjo de diodos...Arranjo de diodos...

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Metodologias: Absorção vs Emissão

Método

Método LimiteLimite de de detecçãodetecção

(mol L (mol L--11₎₎

Custo

Custo VantagemVantagem

UV

UV--VisVis 1010--55 _{a 10}_{a 10}--88 _{“universal”}_{“universal”}

UV

UV--VisVis 1010--55 _{a 10}_{a 10}--88 _{“universal”}_{“universal”}

Fluorescência

Fluorescência 1010--77 _{a 10}_{a 10}--99 _Gama_{Gama seleta}_seleta

de

(33)

Para responder na aula

6.1)

6.1) Que fatores físicos levam uma espécie química Que fatores físicos levam uma espécie química (atômica ou molecular) emitir radiação?

(atômica ou molecular) emitir radiação?

6.2)

6.2) Por que a fluorescência é mais utilizada na análise Por que a fluorescência é mais utilizada na análise química do que a

química do que a fosforecênciafosforecência?? química do que a

química do que a fosforecênciafosforecência??

6.3)

6.3) O comprimento de onda de fluorescência é, exceto O comprimento de onda de fluorescência é, exceto na emissão de ressonância, sempre maior que o de na emissão de ressonância, sempre maior que o de excitação (ou de absorção)?

excitação (ou de absorção)?

(34)

Bibliografia consultada

“Análise Instrumental”“Análise Instrumental”

F Cienfuegos, D Vaitsman; 2000

““VogelVogel -- Análise Química Quantitativa” Análise Química Quantitativa”

GH Jeffrey e col., 6a _{ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2002}

““PrinciplesPrinciples ofof Instrumental Instrumental AnalysisAnalysis””

DA Skoog, FL Holler, TA Nieman; 5th _{ed., 1998}

“Análise Química Quantitativa”“Análise Química Quantitativa”

D. Harris; 7a _{ed., 2008}

Tutoriais de fabricantes de espectrofotômetrosTutoriais de fabricantes de espectrofotômetros