SAU-02
X Jornada de Iniciação Científica do PIBIC/INPA • 04 a 06 de Julho de 2001 • Manaus - AM
COMPORTAMENTO
HEMATOFÁGICO
DE
Lutzomyia
umbratilis
(DIPTERA:
PSYCHODIDAE),
VETOR
DE
Leishmania
guyanenst
s
(KINETOPLASTIDA:
TRYPANOSOMATIDAE)
NA
AMAZÔNIA
CENTRAL BRASILEIRA
Andrezza Campos Chagas'; Raul Guerra de Queiroz"; Sílvia Cássia B.Justiniano' 'Bolsista CNPq/PIBIC; 2Pesquisador INPAlCPCS; 3BoIsista CAPESIDOUTORADO
Os flebotomíneos são dípteros que pertencem à família Psychodidae, a qual inclui o
gênero Lutzomyia nas Américas (Young & Ducan, 1994). Algumas espécies deste gênero são
transmissoras de Leishmania, protozoário causador de leishmaniose. No norte da Amazônia
Brasileira o principal vetor de Leishmania guyanensis é Lutzomyia umbratilis (Arias &Freitas
1977, 1978). Seus principais reservatórios são mamíferos silvestres, tais como preguiça-real (Choloepus didactylus), tamanduá (Tamandua tetradactyla) e mucura (Didelphis marsupialis) (Shaw &Lainson, 1987).
O conhecimento sobre a biologia em laboratório de L. umbratilis é ainda escasso, e só recentemente sua colonização em cativeiro possibilitou o estudo de seu comportamento,
fecundidade, e fertilidade (Justiniano, 2000).
No presente trabalho objetivou-se investigar o comportamento hematofágico de
matrizes selváticas de L. umbratilis em condições de laboratório, analisando diferentes fontes
de repasto sanguíneo, para comparar o possível efeito do tipo de sangue ingerido pelas fêmeas sobre sua fecundidade e oviposição.
Os flebotomíneos foram coletados em bases de árvores de floresta alterada (bairro de
Vivenda Verde, Manaus). Após a coleta, as gaiolas foram mantidas em caixa de isopor (70x70x70 em), juntamente com bolsas de Glicol congelado para retardar o metabolismo dos insetos (Justiniano, 2000).
Os experimentos foram realizados no Insetário de Flebotomíneos, Laboratório de
Leishmaniose da Coordenação de Pesquisas em Ciências da Saúde (CPCS) do INP A, Manaus/ AM. No laboratório, retiraram-se com oauxílio de um capturador manual as fêmeas
que aparentemente estavam engorgitadas ou grávidas, ficando somente machos e fêmeas
provavelmente nulíparas. Foram realizados repastos em quatro fontes diferentes de sangue:
hamster (Mesocricetus auratus) anestesiado por via intraperitoneal com 0.5 ml de Ketalarêi;
mucura (Didelphis marsupialis) anestesiado por via intraperitoneal com 1.1 ml de Ketalar®; antebraço de um voluntário humano (sem anestesia); fontes desconhecidas (fêmeas
X Jornada de Iniciação Científica do PIBICIINPA • 04 a 06 de Julho de 2001 • Manaus - AM
realizados por uma hora, sendo as gaiolas mantidas aproximadamente sob temperatura de 27°C e umidade de 92% (as mesmas do local de coleta).
Após o repasto as fêmeas engorgitadas foram separadas juntamente com alguns machos e uma fatia de maçã que era trocada diariamente. Quando as fêmeas estavam aptas a ovipositar foram transferi das para tubos individuais. Em seguida, as fêmeas paridas foram dissecadas em microscópio estereoscópio, montadas em lâminas e examinadas em microscópio ótico e identificadas segundo Young & Duncan (1994). Foram contabilizadas as quantidades de óvulos retidos e de ovos postos por fêmea, sendo a produtividade estimada a partir de análise descritiva, na qual foi utilizado o teste-z (Zar, 1996) para comparar a fecundidade das populações estudadas.
Verificou-se no presente trabalho uma maior quantidade de ovos postos nas amostras alimentadas com sangue humano, sangue de hamster, e sangue da mucura respectivamente. Já em relação à quantidade de óvulos retidos, observou-se uma maior quantidade na amostra proveniente do campo seguido da população alimentada com o sangue da mucura (Tabela 1), sugerindo que as condições abióticas oferecidas pelo ambiente artificial do insetário não tenham permitido a maturação normal dos óvulos, visto que esperávamos por uma maior quantidade de ovos postos das populações alimentadas no campo e por mucura em laboratório. Estas são fontes de sangue naturalmente encontradas em Vivenda Verde.
A quantidade de ovos postos por L. umbratilis das amostras que fizeram repasto no
homem, no hamster e na mucura foi maior que a quantidade de óvulos retidos, demonstrando diferença significativa (P
<
0.001 - Z- TEST) entre a proporção de ovos postos e óvulos retidos. Enquanto que na população do campo, observou-se que a quantidade óvulos retidos foi maior que de ovos postos, apresentando também uma diferença (P < 0.001) (Tabela 2).Ao comparar a quantidade de ovos postos entre todas as populações, observou-se uma maior quantidade de ovos postos nas fêmeas alimentadas no homem e no hamster, apresentando uma diferença (P
=
0.004) em relação a quantidade de ovos postos das fêmeas de campo. Em relação à quantidade de óvulos retidos entre as populações, observou-se uma maior quantidade óvulos retidos nas fêmeas do campo, seguido das fêmeas que fizeram repasto na mucura e no hamster, apresentando uma diferença (P<
0.001) do número de óvulos retidos das fêmeas alimentadas no homem. A quantidade de óvulos retidos da população de campo também foi maior do que da população que fez repasto no hamster (P=
0.007) e na mucura (P = 0,01). Quanto à fecundidade total, a amostra alimentada com o hamster e mucura apresentaram maior fecundidade, porém sem diferença (P < 0.05) em comparação à fecundidade da outras populações. Segundo Miranda et al. (2000), queX Jornada de Iniciação Científica do PIBlc/INPA • 04 a 06 de Julho de 2001 • Manaus - AM
realizaram estudos com L. intermedia visando à manutenção de uma colônia utilizando
hamster e camudongo como fonte de alimentação, verificou-se que não existiu diferença significante na quantidade de ovos postos.
A fecundidade é um dos mais importantes parâmetros utilizados na avaliação da
produtividade de colônias de insetos. Em condições experimentais a quantidade de ovos
postos é extremamente variável, sendo quase sempre incompleta (Barreto, 1942). Para
f1ebotomíneos o substrato de oviposição é um importante estímulo para postura (Killick -Kendrick, 1987).
As populações estudadas não demonstraram diferença em relação à fecundidade,
embora tenha sido observado uma maior fecundidade na população alimentada com o hamster
e a mucura. Para fins de colonização desta espécie, este não é um fator importante, pois em
uma colônia a sua maior importância concentra-se na quantidade de ovos postos.
Visando a manutenção de uma colônia, apesar da quantidade de ovos postos ter sido maior em homem, este não é o repasto adequado em laboratório, principalmente devido estes
f1ebotomíneos serem selváticos e principais vetores de leishmaniose. Além de alto
investimento em tempo, esforço e dedicação por parte da equipe responsável, a utilização de
hamster para repasto, que é de fácil manuseio e tem praticamente o mesmo efeito na
quantidade de ovos postos, em muito contribuirá para a implementação de uma colônia
fechada de L. umbratilis.
.•
Arias, J. R.; Freitas, R.A .1977. On the vectors of cutaneous leishmaniasis in the central Amazon of Brazil. L Preliminary Findings. Acta Amaronica, 7(2): 293-294.
Arias, J. R.; Freitas, R.A .1978. Sobre os vetores da leishmaniose cutânea na Amazônia Central do Brasil. 2. Incidência de Flagelados em f1ebótomos selváticos. Acta Amazonica, 8:
387-396.
Barretto, M.P. 1942. Contribuição para o estudo da biologia dos f!ebótomos em condições
experimentais. Tese de Doutoramento. Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, I62pp.
Justiniano, S.c.B. 2000. Biologia de Lutzomyia umbratilis (Diptera: Psychodidae) vetor de
Leishmania guyanensis na Amazônia Central Brasileira. Dissertação de mestrado lNP AlUA,
89 p.
KiIlick-Kendrick, R. 1987. Methods for the study of phlebotomine sandflies. In: Peters, W. & Killick-Kendrick, R. (Eds). The Leishmaniases in Biology and Medicine. London: Academic Press, (2): 473-497.
X Jornada de Iniciação Científica do PIBICIINPA • 04 a 06 de Julho de 2001 • Manaus -AM
Miranda, l.C.; Machado, K.Q.; Fernandes, A.L.D.; Barral, A. 2001. Alimentação de
Lutzomyia intermedia (Lutz, Neiva, 1912) em hamster e camudongo para manutenção de uma
colônia em laboratório. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 198p.
Nieves. E. 1997. Fatores físicos e biológicos na oviposição de Lutzomyia migonei
(Diptera.Psychodidae) em laboratório, Belo Horizonte-MG-Brasil. Tese de disertação de
mestrado UFMG.
Shaw & Lainson 1987. Ecology and epidemiology. In: Peters, W..& Killick-Kendrick, R.
(Eds). The Leishmaniases in Biology and Medicine, Vol. 1.London: Academic Press, 292
-363.
Young, D.G.; Duncan, M.A. 1994. Guide to identification and geographic distribution of
Lutzomyia sand flies in Mexico, the West Indies, Central and South America
(Diptera:Psychodidae). Associated Publishers, Gainesville, Florida, (54):881 p.
Zar, l.H. 1996. Biostatistical Analysis, (third edition), 662 pp.
Tabela I - Fecundidade de fêmeas selváticas de Lutzomyia umbratilis alimentadas com sangue humano, do
hamster, mucura e docampo.
'Homem Hamster Campo Mucura
TOL Méd. Min Max. Tot Méd. M. Max. Tot. Méd. Min Max. Tot. Méd. M Max.
O.P. 2222 22,22 O 51,0 2221 22,21 O 59,0 930 9,30 O 48,0 1773 17,73 O 46,0
O.R. 208 2,08 O 36,0 808 8,08 O 49,0 1545 15,45 O 68,0 860 8,60 O 39,0 (O.P.==Ovospostos;O R.= Óvulos retidos;Tot=Total;Méd = Média; Min=Mínimo; Max = Máximo)
n=100 ( número de fêmeas observadas)
Tabela 2- Quantidade de ovos postos e óvulos retidos de amostras de Lutzomyia umbratilis.
Ovos postos Óvulos retidos Total Homem 2222 (91.4%)a 208(8.56%)B 2430 Hamster 2221 (73.3%)a 808(26.7%t 3029
Mucura 1773(67.34%)" 860(32.66%)A 2633
Campo 930 (37.57%)b 1445(62.43%t 2475
Total 7146 3321 10567
a, b:diferença estatisticamente significante (P = 0.004 -Z-TEST);
A, B:diferença estatisticamente significante (P<0.001 -Z-TEST); n=100(número defêmeas observadas)
X Jornada de Iniciação Científica do PIBIC/INPA • 04 a 06 de Julho de 2001 • Manaus - AM
BIOENSAIOS
-DE AVALIAÇÃO
DE ESTIRPES
BRASILEIRAS
DE
BACILLUS SPHAERICUS
CONTRA ANOPHELES
NUNEZTOVARI
EM
CONDIÇÕES DE LABORATÓRIO.
Caroline Dantas de Oliveiral & I1éa Brandão Rodrigues/. IBolsista do PIBICICNPq. 2Pesquisadora INPAlCPCS.
Atualmente, a malária incide no Brasil de maneira quase exclusiva na região da bacia amazônica, em áreas rurais e peri-urbanas. Na Amazônia, não se distribui homogeneamente, concentrando-se em localidades onde a população é instável recém-chegada, morando e/ou trabalhando em condições precárias. (Tauil, 2000). Em 1999, entre mais de 2,4 milhões de pessoas suspeitas de malária atendidas em todo país, foram confirmados 632.813 casos pelo exame parasitoscópico da gota espessa, e desse total, 630.985 encontravam-se na Amazônia Legal. O incremento de 34,2% no número de casos em relação a 1998, alertaram a FUNASA para a necessidade urgente de elaborar um plano de intensificação do Programa de Controle Integrado da Malária (PCIM) na Amazônia Legal (Mangabeira, 2000).
Nesse contexto, algumas estratégias como o uso de inseticidas químicos e o controle biológico visam amenizar essa situação atacando os vetores da doença nas suas formas imaturas e aladas. O uso desenfreado dos inseticidas químicos causaram a resistência aos insetos, tornando esse método insuficiente para algumas localidades. Já o controle biológico tornou-se um método alternativo e\ ou complementar para as formas imaturas de anofelinos.
O controle biológico consiste no uso de inimigos naturais tais como vírus, fungos, e o mais estudado, as bactérias entomopatogênicas-Bacillus sphaericus e Bacillus thuringiensis,
no controle dos vetores. Este método é seguro para outros organismos não-alvo, inclusive para o próprio homem e o meio ambiente.
Na continuidade de descoberta de novas estirpes potencialmente tóxicas contra vetores da malária na Amazônia, foram desenvolvidos ensaios em laboratório, com quatro estirpes de
Bacillus sphaericus extraídas de solo .brasileiro oriundas da cidade de Corumbá (MTS). O
objetivo é identificar cepas com maior potencial entomopatogênico que a estirpe 2362 (padrão segundo a OMS), para controle de formas imaturas do mosquito. Foram testadas em
. ..
laboratório as estirpes S 16, S23, S25 e S26, avaliando a sua toxicidade contra larvas de A. nuneztovari.
Inicialmente, fêmeas do mosquito foram capturadas na periferia de Manaus e postas para oviposição no insetário do INP A, seguindo a metodologia de Santos et ai (1981), até atingirem o terceiro estádio para serem utilizadas nos bioensaios. As estirpes testadas foram
X Jornada de Iniciação Científica do PIBIC/INPA • 04 a 06 de Julho de 2001 • Manaus - AM
cedidas pelo CENARGENIEMBRAPA (Brasília) do banco de germoplasma bacteriano. Os
bioensaios seguem o critérios de Dulmage et ai. (1990) e os resultados foram analisados pelo
programa POLO-PC. Foi feito o cálculo da atividade relativa (AR) comparando-se a CLso da
estirpe padrão com as estirpes testadas.
Os resultados apontaram maior concentração letal mediana (CLso) em ordem
descrecente para as estirpes S25=0,033ppm, S23 =0,067ppm e S 16=0, II ppm
respectivamente, na leitura de 48 horas. A estirpe que apresentou menor valor de CLso foi a
S26 com 0,46ppm na mesma leitura anterior (tabela1). A porcentagem (próbite) da
mortalidade causada pelas estirpes contra Anopheles nuneztovari constam no gráfico 1, com
as retas de regressão linear. Onde podemos observar que a estirpe S25 apresentou maior
mortalidade tanto para as doses mais altas testadas quanto para as menores doses. E a S26 foi a que apresentou menor valor de próbite nas diferentes doses testadas.
Na tabela 2 constam os valores da atividade relativa verificada para a S25 (AR=14,24) que foi 14 vezes mais eficiente que a padrão. As demais estirpes S23, S 16 e S26 foram
também mais efetivas que a estirpe 2362, apresentando AR= 7,01, AR= 4,27 e AR=I,02
respecti vamente.
O contínuo isolamento de novas estirpes extraídas de solos brasileiros têm mostrado que muitos isolados apresentam atividade larvicida superior à 2362 estirpe padrão da OMS (1985). Neste projeto, confirmou-se a existência de mais três estirpes com esta toxicidade, a
S25, S23 e S 16 contra A nuneztovari. Litaiff et al. (1998) e Litaiff & Rodrigues (1999),
testaram oito estirpes de B. sphaericus contra A. nuneztovari e destas, quatro mostraram-se
com atividade superior à padrão (SI2, S14, S42 e S58). A S14 e a S58 foram 8 e 4 vezes mais
efetivas que a 2362, respectivamente. Rodrigues et ai. (1998) trabalhou com 10 estirpes
brasileiras de B. sphaericus contra A. darlingi e A. nuneztovari, verificando à ocorrência de
seis estirpes com atividade relativa maior que a estirpe padrão da OMS (S2, SII, S15, S20, S24 e S46). Sendo a S2 com uma atividade cerca de cinco vezes mais efetiva que a padrão para larvas de 11. nuneztovari.
Vilarinhos et al. (1992) trabalharam corri 30 estirpes de B. sphaericus, contra larvas de
Culex quinquefasciatus. Dessas, a potência de quatro isolados (S 1, S 14, S21 e S36) foram
comparáveis à apresentada pela estirpe padrão 2362.
Schenkel et ai. (1992), realizaram bioensaios com algumas espécies de Culex e
Anopheles testando as estirpes SI, S2, S5 e L2 e verificaram que apenas a L2 não mostrou
X Jornada de Iniciação Científica do PIBIC/INPA • 04 a 06 de Julho de 2001 • Manaus - AM
Portanto, estes estudos continuam apontando estirpes de B. sphaericus potenciais para
controle de vetores de doenças na Amazônia tais como S25, S23 e S 16 as quais poderão ser industrializadas e posteriormente utilizadas nas campanhas de controle de vetores pela
FUNASA.
Dulmage, H. T.; Yousten, A. A.; Singer, S. &Lacey, L.A. 1990. Guidelines for production of
Bacillus thuringiensis H-14 and Bacillus sphaericus. UNDP/WorId Bank/WHO, Steering
Comittee to BiologicI Control of Vetores, Geneva. 59p.
Litaiff, E. C.; Rodrigues, I. B.; Tadei, W. P ..& Dias, J. M.,C. S. 1998. Ação larvicida de
quatro estirpes de Bacillus sphaericus contra Anopheles nuneztovari. XVII Congresso
Brasileiro de Entomologia e VIII Encontro Nacional de Fitossanitaristas, Rio de Janeiro,
1998.
Litaiff, E. C. & Rodrigues, I. B. 1999. Avaliação da atividade larvicida.de diferentes estirpes
brasileiras de Bacillus sphaericus contra Anopheles nuneztovari. Anais VIII Jornada de
Iniciação Científica PIBIC/CNPq/INPA. 21 a 23 de Julho, Manaus - AM, 159 - 162.
Mangabeira, C. J da S. 2000. Tratamento da Malária visto pela Fundação Nacional de Saúde.
7° Reunião Nacional de Pesquisa em Malária. Rio de Janeiro-RJ, 20 p.
OMS,1985, Biossay method for lhe titration of Bacillus sphsericus preparations with RB 80 standart. Informal consultations on the development of bacillus sphaericus as a microbial
larvicide. WorId HeaIth Organization, TDR/BVC/SPHAERICUS/85.3.24 p.
Santos, J. M. M.; Contei, E. P. B. &kerr, W.:E. 1981.Biologia de Anofelinos Amazônicos I-Ciclo biológico, postura e, estádios larvais de Anopheles darlingi Root, 1926 (Diptera:
Culicidae) da Rodovia Manaus/Boa Vista. Acta Amazon., J1(4): 789 -797.
Schenkel, R. O. M., Nicolas L., Frachon E., Hamon S. 1992. Charaterization and toxicity to
mosquito larvae of four Bacillus sphaericus.ssseuvs isolated from Brazilian soils. Invert Pathol 60: 10-14.
Tauil, P.L., 2000. Problemas do controle da malária no Brasil. 7° Reunião Nacional de
Pesquisa em Malária. Rio de Janeiro-RJ, 31 p.
Vilarinhos, P. T. R.; Dias, S.
c
.
;
Nogueira, R. G. &Lopes, J. B. 1992. Avaliação da potêncialarvicida de novos isolados de Bacillus sphaericus contra Culex quinquefasciatus. III
X Jornada de Iniciação Científica do PIBICIINPA • 04 a 06 de Julho de 2001 • Manaus - AM Leitura CLso SI6 S23 S25 S26 2362 24h 0,15 0,23 0,06 2,26 0,89 48h 0,11 0,06 0,03 0,46 0,47 72h 0,08 0,03 0,01 0,38 0,22
Tabela 1:Valores da concentração letal mediana (CLso) obtidos nos bioensaios com
estirpes de B. sphaericus contra larvas de A. nuneztovari.
Estirpes Leitura 24 h 48h SI6 5,93 4,27 S26 0,39 1,02 S25 13,09 14,24 S23 3,87 7,01
Tabela 2: Valores da atividade relativa apresentada pelas estirpes de B.sphaericus S 16 e S26, nos bioensaios contra A. nuneztovari.
Gráfico I: Valores de porcentagem em próbite das cepas S25, S23, S16, S26 em
